KR20150017149A

KR20150017149A - 약물 부작용과 관련된 ＨＬＡ 대립유전자의 ｔＳＮＰ를 이용한 고속 검출 방법

Info

Publication number: KR20150017149A
Application number: KR1020130093070A
Authority: KR
Inventors: 신재국; 김은영; 김호숙; 정혜은; 차은영; 김은경
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-06
Filing date: 2013-08-06
Publication date: 2015-02-16

Abstract

본 발명은 약물 부작용(adverse drug reaction, ADR)과 관련된 특정 HLA 대립유전자의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 약물 부작용과 관련된 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303의 특정의 HLA 대립유전자의 존재 여부를 tSNP를 이용하여 신속하게 결정하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 또는 과민 증후군 등의 약물 부작용의 발병 위험 여부를 평가하는 용도에 관한 것이다.

Description

약물 부작용과 관련된 ＨＬＡ 대립유전자의 ｔＳＮＰ를 이용한 고속 검출 방법{A Method for Quick-Detecting HLA alleles associated with Adverse Drug Reaction Using tSNP}

본 발명은 약물 부작용(adverse drug reaction, ADR)과 관련된 특정 HLA 대립유전자의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 약물 부작용과 관련된 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303의 특정의 HLA 대립유전자의 존재 여부를 tSNP를 이용하여 신속하게 결정하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 약물 부작용의 발병 위험 여부를 평가하는 용도에 관한 것이다.

다양한 약물과민반응 (drug hypersensitivity reactions, HSRs) 또는 약물부작용 (adverse drug reaction, ADR)이 약물 부작용은 예방, 치료 또는 진단을 위해 사용되는 복용량에 있어서 발생한다.

널리 인용된 메타 분석에 의하면, ADR은 흔한 사망 원인 중 4위부터 6위까지를 차지하고 있다(Lazarou et al., JAMA, 279(15):1200-1205, 1998). 피부 ADR은 전체 병원 입원의 약 2～3%을 차지한다(Bigby et al., JAMA,256(24):3358-3363, 1986). 이는 그 중증도를 더해가는 경증성 반점구진(mild maculopapular, MPE)으로부터, 과민 증후군(hypersensitivity syndrome, HSS), 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome, SJS) 및 독성 표피 괴사 용해(toxic epidermal necrolysis, TEN; Lyells syndrome) 등의 생명을 위협하는 ADR에까지 이른다. 후자의 치사율은 40%에 달할 수 있다.

HSS는 피부발진에 더하여 전신 소견(예, 열, 관절염, 호산구증가증 및 림프절병증)을 동반하는 다기관 병발(예,간 또는 신장)이 특징이다(Roujeau et al., N. Engl. J. Med., 331:1272-1285, 1994). SJS 및 TEN은, 자반성 반점의 수포성 발진과, 반점 병발 및 피부 박리를 동반하는 과녁 징후(target-like lesion)의 속발을 특징으로 하는, 면역 복합체 매개성 과민 질환이다(Roujeau et al. J Invest Dermatol, 1994, 102:28S-30S). 이들은 대부분 술폰아미드, 항경련제, 알로퓨리놀(allopurinol), 비스테로이드성 소염제, 및 항말라리아제 등의 약물에 기인한다(Roujeau et al., N. Engl. J. Med., 333(24):1600-1607, 1995). 항경련제(예, CBZ, 페니토인 및 페노바르비탈)와 알로퓨리놀은 SJS/TEN을 일으키는 가장 흔한 약물이다.

약리게놈학의 최근의 발전에 따라, 다양한 약물과민반응 (drug hypersensitivity reactions, HSRs) 또는 약물부작용 (adverse drug reaction, ADR)에 대한 감수성이 특정의 대립유전자와 관련되어 있음이 암시되었다. 예를 들면, 티오퓨린 메틸트랜스퍼라제 유전자의 유전자 다형(genomic polymorphism)은 류마티스 질환 또는 암에 대한 약물인 아자티오프린(azathioprine)에 의해 유발되는 ADR에 밀접하게 관련되어 있음이 밝혀졌다(Yates et al., Ann. Intern. Med., 126(8):608-614, 1997).

어떤 약물에 의해 유발되는 SJS/TEN/HSS에 대한 감수성은 유전적으로 결정된다는 것도 시사되었다(Gennis MA, Am. J. Med., 91(6):631-634, 1991; Edwards SG, Postgrad. Med. J., 75(889):680-681, 1999). 특히, 인간백혈구항원 (human leukocyte antigen, HLA)과 연관되어 있음이 최근 많은 연구들을 통해 밝혀지고 있다.

현재, HLA 등의 유전자의 분석을 위해서 가장 일반적으로 많이 사용되는 방법이 풀 시퀀싱(full sequencing) 인데, 이를 이용하여 각각의 서브타입(subtype)을 확인하는 것은 시간이 많이 소요되고 임상적 치료를 시작하기 전 이용하기에는 시간상으로 적절하지 않았다. 뿐만 아니라 각각의 서브타입을 선별하기 위해서는 고가의 특정 소프트웨어가 필요로 하고 HLA 타입을 결정하기 위해서는 높은 비용이 요구되었다. 현재 RT-PCR(real time PCR) 방법 및 대립 유전자 특이적(allele specific PCR) 방법 등이 사용되고 있지만 이는 위양성(false positive) 결과를 도출하는 위험성도 가지고 있다.

그러므로, 약물 과민성을 나타내는 특정 HLA 서브타입을, 보다 빠르고 저렴하게 확인할 수 있는 방법의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 한국인을 포함한 아시아인에게서 약물 과민 반응을 나타내는 특정 HLA-A와 B 서브타입들을 신속하고 효과적으로 진단하기 위해, 특정 HLA-A와 B의 tSNP(tagging SNP)를 이용함으로써 약물 과민반응 보이는 HLA-B*5701, HLA-B*5801 타입과 HLA-A*3101 HLA-A*3303 타입을 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

1.Gennis MA, Am. J. Med., 91(6):631-634, 1991; Edwards SG, Postgrad. Med. J., 75(889):680-681, 1999

본 발명의 목적은 HLA-A와 B의 특정 tSNP를 이용하여 HLA-B*5701, HLA-B *5801 Type과 HLA-A *3101 HLA-A*3303 서브타입을 신속하게 검출하는 방법 및 이를 위한 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 약물 부작용에 대한 위험도 예측 및 진단 정보를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 다양한 약물과민반응 (drug hypersensitivity reactions, HSRs) 또는 약물부작용 (adverse drug reaction, ADR)이, 특히 인간백혈구항원 ( human leukocyte antigen, HLA )과 연관되어 있는 사실을 근거로, HLA-A 및 HLA-B의 특정 서브타입, 즉, HLA-A 및 HLA-B의 특정 대립유전자의 존재를 신속하고 정확하게 분석하는 방법 및 이에 따른 약물 부작용 위험 평가방법을 제공한다.

특히, HLA-A*3101, *3303, HLA-B *5701,*5801를 확인하는 중요 서열(태깅 시퀀스)을 찾고 세부 타입들을 다시 결정하기 위해 SNP 표지자(tagger)를 이용하여 tSNP(tagging SNP)를 선별하여 사용한다.

일 구체예로서, 본 발명은

서열번호 13으로 표시되는 HLA-A 유전자의 369번째 뉴클레오티드, 537번째 뉴클레오티드, 594번째 뉴클레오티드, 954번째 뉴클레오티드; 및 서열번호 14으로 표시되는 HLA-B 유전자의 315번째 뉴클레오티드, 512번째 뉴클레오티드, 612번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 1이상의 뉴클레오티드를 확인하는 것을 특징으로 하는, 약물 부작용(ADR) 관련 유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 SNP 검출 방법을 제공한다.

특히, 신속하고 정확한 검출을 위해, HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 다형성 검출용 태깅 서열(tagging sequence) 및 tSNP(tagging SNP)을 이용하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 서열번호 13으로 표시되는 HLA-A 유전자의 369번째 뉴클레오티드, 537번째 뉴클레오티드, 594번째 뉴클레오티드, 954

번째 뉴클레오티드 확인을 위한 태깅 SNP는 HLA-A *3001.4, *3101, *3303, *3001.7, 및 이외의 다른 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합을 사용한다.

서열번호 14로 표시되는 서열번호 14로 표시되는 HLA-B 유전자의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오타이드 확인을 위한 태깅 SNP는 HLA-B *58, *57 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합일 수 있다.

본 발명의 상기 방법은 SNaPshot 분석법에 의해 수행될 수 있다. 이 때, SNaPshot 분석법 이용 시 서열번호 서열번호 5 내지 12로 구성된 군에서 프라이머 세트에서 선택되는 하나 이상의 프라이머쌍을 사용할 수 있다.

HLA-A와 HLA-B의 각 서브타입은 각각 별도로, 혹은 함께 검출 가능하다.

또한, 본 발명은 다른 구체예로써, 상기 방법을 수행하기 위한, 서열번호 5 내지 12로 구성된 군에서 선택되는 프라이머쌍을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 부작용(ADR) 관련 유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 SNP 검출용 키트를 제공한다.

상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 구체예로써, 약물 부작용 위험도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

이는 앞서 설명한 방법을 이용하여 약물 부작용(ADR) 관련 유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 존재를 확인하는 단계; 및 상기 HLA 대립유전자가 존재할 때 약물 부작용 위험이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함한다.

이 때, 상기 약물은 아바카비어, 알로퓨리놀, 카바마제핀 및 이들 유사 약물로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종일 수 있고, 약물 부작용은 스티브존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome) 또는 독성 표피괴사(toxic epidermal necrolysis)가 대표적인 예시이다.

또한, 유사한 관점에서, 본 발명은 약물 부작용과 관련된 HLA 대립유전자를 보유하는 환자의 시료로부터 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법도 제공할 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303의 신속 정확한 검출 방법 및 이러한 결과를 활용할 수 있는, 약물 부작용 평가, 약물 동정 등을 포함하는 모든 용도를 포함한다.

본 발명에 따른 HLA-B*5701, HLA-B *5801 Type과 HLA-A *3101 HLA-A*3303 subtype 결정하는 진단방법은 특히 한국인을 포함한 아시아인에 대해 높은 정확성을 나타내며, 신속하고 간편하게 진단할 수 있어, 약물성 과민 반응을 사전에 예방하고 대체 약물투여로 치료의 효과 및 성공률을 높이는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 따른 HLA-B *5701,*5801 검출 결과이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따른 HLA-A*3101, *3303 검출 결과(a) 및 이를 위한 태깅 SNP(tSNP)의 조합을 나타낸 것이다.
도 3 내지 6은 서열 상의 HLA-A*3101, *3303 검출 정보를 나타낸 것이다.
도 7 내지 8은 서열 상의 HLA-B *5701,*5801 검출 정보를 나타낸 것이다.
도 9는 본발명의 방법에따라 HLA-B *5701,*5801 HLA-A*3101, *3303
동시 분석하여 검출한 결과이다

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

'유전적 다형성(genetic polymorphism)'은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다.

'다형성'이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 "대립유전자"로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT). 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스(Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 ("기준 SNP", "refSNP" 또는 "rs#")이다.

'유전자형'이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다. '표현형'은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적,또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다.

'대립 인자' 또는 '대립 유전자'란 같은 염색체 위치(same chromosomal locus) 를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태(alternative forms) 중 하나를 뜻한다. 대립유전자의등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자에 연관된 유전 표지로서, 즉, 그것은 관심 대상의 대립유전자와 연관불균형을 나타낸다

'대립유전자 빈도'는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)을 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립유전자 빈도를, 계통 또는 집단으로부터의 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다.

'위험'은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.

'핵산'은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체(예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된대로, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 '핵산'이라는 용어와 '뉴클레오티드'가 병용하여 쓰이고 있다.

'프라이머'는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가진다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다.

'대상' 또는 '환자'는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.

'조직 또는 세포 샘플'은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

HLA - ADR 관련성

약리게놈학의 최근의 발전에 따라, 약물 부작용(Adverse Drug Reaction, ADR)은 대한 감수성이 특정의 대립유전자와 관련되어 있음이 밝혀졌고, 이에 환자에 있어서의 ADR-관련 대립유전자의 검출이 그 환자의 ADR 발병의 위험 여부를 평가함에 유용한 접근 방식임을 시사한다.

본 발명은 다양한 약물과민반응 (drug hypersensitivity reactions, HSRs) 또는 약물부작용 (adverse drug reaction, ADR)이, 특히 인간백혈구항원 ( human leukocyte antigen, HLA )과 연관되어 있는 사실을 근거로, HLA-A 및 HLA-B의 특정 서브타입, 즉, HLA-A 및 HLA-B의 특정 대립유전자의 존재를 신속하고 정확하게 분석하는 방법 및 이에 따른 약물 부작용 위험 평가방법에 관한 것이다.

HLA의 유전자 특성상 HLA-A는 1100여개 HLA-B는 1800개 이상의 서브타입(subtype)들이 존재하며 이들은 1개 이상의 서로 다른 HLA 서열의 변화를 가지고 타입을 결정하게 된다.(http://hla.alleles.org/nomenclature/g_groups.html ).

특히, 본 발명은 상기 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101, HLA-A*3303의 타입을 검출 대상으로 하는 것을 특징으로 한다.

(i) HLA-B*5701은 아바카비어(Abacavir)의 과민반응을 유발하고,

(ii)HLA-B*5801은 알로퓨리놀 유도 스티브존슨 증후군/독성표피괴사 (allopurinol induced SJS/TEN )와 밀접한 관련을 가진 타입이다. 특히, HLA-B*5801은 한국인에게서 발현율이 6.5 % 정도로 발현빈도가 높은 유전자이며, HLA-B*5801은 임상적으로 면역적 표현형(phenotype)의 중요한 예측 인자 중의 하나로써, 고요산혈증(hyperuricemia)과 재발성 통풍(recurrent gout)의 치료에 쓰이는 알로퓨리놀(allopurinol)의 고감수성(hypersensitivity)과 연관되어 있다. HLA-B*5801 양성인 사람은 음성인 환자에 비해 알로퓨리놀 투여시 스티브존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome)이나 독성 표피괴사(toxic epidermal necrolysis)같은 심각한 피부의 약물 부작용을 초래할 가능성이 현저하게 높아진다.

(iii) HLA-A*3101는 카바마제핀 유도 스티브존슨 증후군/독성 표피괴사 (carbamazepine-induced Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis, SJS/TEN)의 표지자 역할을 한다.

(iv) HLA-A*3303은 HLA-B*5801의 반수체형의 등가 유전 표지로서, 알로퓨리놀 복용시 HLA-B*5801을 가지지 않는 환자에서 HLA-A*3303 서브타입을 가지는 군에서 약물 과민반응이 관찰된다.

이처럼, HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303의 타입은 아바카비어, 알로퓨리놀, 카바마제핀 등의 약물 관련 부작용과 밀접한 관련을 나타내는 마커로서 기능하기 때문에, HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303의 분석을 통해 상기 약물들의 부작용 위험을 평가할 수 있는 지표로 사용할 수 있는 것이다. 예를 들어, HLA-B*5801의 존재는 알로퓨리놀 화합물, 알로퓨리놀에 구조적으로 유사한 다른 화합물, 또는 그 대사물에 의해 유발되는 SJS/TEN 또는 HSS의 위험의 지표이다.

분석방법

본 발명은 일 관점에서 약물 부작용(Adverse Drug Reaction, ADR)과 관련된 인간백혈구항원 (human leukocyte antigen, HLA)의 상기 특정 대립유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101, HLA-A*3303을 신속하고 정확하게 검출하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

대립유전자는 예를 들면 혈액, 타액, 소변 또는 모발 등의 생체 시료로부터 마련된 게놈 DNA를 사용하여 대립유전자 내의 영역/뉴클레오티드를 직접적으로 검출함으로써 검출할 수 있다. 대립유전자는 예를 들면 혈청학적 방법 또는 미세세포독성법에 의해서도 검출할 수 있다.

또한 그 대립유전자의 등가 유전 표지(equivalent genetic marker)의 검출에 의해 결정할 수도 있으며, 상기 등가 유전 표지는, 예를 들면, SNP(단일 염기 다형), 마이크로새털라이트 표지(microsatellite marker) 또는 다른 종류의 유전자 다형이다. 본 발명에서는 단일 염기 다형(SNP)의 사용이 바람직하다. 대립유전자의등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자에 연관된 유전 표지로서, 즉, 그것은 관심 대상의 대립유전자와 연관불균형을 나타낸다. 즉, 대립유전자 그 자체뿐만 아니라 HLA-B*5801 또는 HLA-B*5701 반수체형(haplotype)의 존재가 약물 부작용의 지표가 될 수도 있다. 예를 들어, HLA-B*5801의 등가 유전 표지의 예로는 HLA-A*3303, Cw*0302, DRB1*0301, 및 MICA*00201를 들 수 있다.

HLA 대립유전자 등의 유전 표지의 존재는 그 내부의 표지 또는 특정 영역의 직접적인 검출에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, Real time PCR 시스템을 이용하여 SNP 분석을 수행하거나, 디데옥시법에 의해 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통해 수행할 수 있으며, 또는 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법(allelespecific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘에세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 에세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism) 등을 이용하여 수행될 수 있다.

PCR로부터 얻어진 DNA 산물은 예를 들면, 가수분해 프로브(TaqMan, Beacons, Scorpions), 부합화 프로브와 같은 서열 특이적 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 이들 프로브는 예를 들면 HLA-B*5801의 관심 대상의 영역에 결합하도록 설계된다. 상기 PCR 산물은 DNA-결합제에 의해서도 검출될 수 있다

관심 대상의 대립유전자의 존재는 그 대립유전자의 등가 유전 표지의 검출에 의해서도 결정할 수 있다. 관심대상의 대립유전자에 가까운 유전 표지는 그 대립유전자와 공 분리(co-segregate)하거나 또는 연관 불균형을 나타내는 경향이 있다. 따라서, 이들 표지(등가 유전 표지)의 존재는 관심 대상의 대립유전자의 존재의 지표이며, 따라서 ADR 발병 위험의 지표이다. HLA-B*5801의 등가 유전 표지의 예로는 HLA-A*3303이다. 등가 유전 표지는, 예를 들면, HLA 대립유전자, 마이크로새털라이트 표지, 또는 단일 염기 다형(SNP) 표지 등의 어떤 타입의 것이라도 좋다. 본 발명에서는 단일 염기 다형(SNP) 표지의 사용이 바람직하다. 유용한 등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자로부터 보통 약 200 kb 또는 그 미만(예, 100 kb, 80 kb, 60 kb, 40 kb, 또는 20 kb)에 있다. 상술한 방법 또는 당 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 등가 유전 표지의 존재나 부재를 검출할 수 있다

또한, 관심 대상의 대립유전자의 RNA, cDNA, 또는 단백질 산물을, 그 대립유전자의 존재나 부재의 결정을 위해 검출할 수 있다.

tSNP 이용

이처럼, 관심 대상 HLA 대립유전자의 존재를 다양한 공지의 방법에 Sequence Based typing (SBT)또는 Allelic Specific PCR 등에 의해 검출할 수 있지만, SBT방법은 판독 시간이 많이 소용되며 판독에 특별한 프로그램을 요구하며 Alleclic Specific PCR을 오류가능성을 내포한다. 하지만, 본 발명에서 검출하고자 하는 특정 대립유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303의 서브타입은 tSNP(tag SNP)를 이용하여 분석하는 것으로 SBT를 축소한 것으로 정확도 및 시간단축에 있어 효율적이다

유전자 내 일배체형의 구조 및 각각의 일배체형을 대표하는 SNP를 파악하여 즉, 표지(tag) SNP(tSNP)를 파악하여 효과적인 전유전체(genome-wide) 연관 구조를 분석하는데 사용한다.

그러므로, 본 발명은 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303의 tSNP(tag SNP)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 상기 HLA 대립 유전자를 신속하게 분석할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 고속 분석 방법은 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303의 유전형(다형성)을 특이적으로 검출할 수 있는 태깅 시퀀스(표지 서열, tagging sequence)를 이용하여,

서열번호 13으로 표시되는 HLA-A 유전자의 369번째 뉴클레오티드, 537번째 뉴클레오티드, 594번째 뉴클레오티드 및 954번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 1이상의 위치에서의 뉴클레오티드의 유전형을 확인하고, 서열번호 14으로 표시되는 HLA-B 유전자의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 1이상의 위치에서의 뉴클레오티드의 유전형을 확인하여 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303 보유 여부를 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이 때, 서열번호 13으로 표시되는 HLA-A 유전자의 369번째 뉴클레오티드, 537번째 뉴클레오티드, 594번째 뉴클레오티드 및/또는 954번째 뉴클레오티드의 유전형 확인에 의해 HLA-A*3101 HLA-A*3303의 단일 염기 다형성(SNP) 보유 여부를 결정할 수 있고 서열번호 14로 표시되는 HLA-B 유전자의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오티드 구성된 군에서 선택되는 1이상의 위치에서의 뉴클레오티드의 유전형 확인에 의해 HLA-B*5701, HLA-B*5801의 단일 염기 다형성(SNP) 보유 여부를 결정할 수 있다.

상기 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303 보유 여부는 각각 별도로 또는 함께 검출할 수 있다.

일 구체예로서 다음과 같은 방법으로 수행될 수 있다.

(a) 태깅 시퀀스(표지 서열, tagging sequence)를 확정한다

HLA-A 노맨클러쳐를 (http://hla.alleles.org/alleles/index.html) 등의 공지 지노믹 DNA 서열을 참조하여 이용하여 HLA-A*3101,*3303, HLA-B *5701,*5801의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 태깅 시퀀스(표지 서열, tagging sequence)를 확정한다.

(b) 그리고, 목적하는 HLA- A와 HLA-B의 특정 부위를 증폭한다.

본 발명의 일 실시예에서는 특정 HLA-A와 B의 엑손 2-3번만을 증폭시켰다. 이 때, 적절한 공지의 방법을 선택하여 사용할 수 있는데, 예를 들어, 다중 중합효소연쇄반응(multiplex polymerase chine reaction, multiplex PCR) 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 특정 HLA-A와 B의 엑손 2-3번만을 증폭을 위해 하기와 같은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 사용하였다.

Bx1 F primer : GGG AGG AGC GAG GGG ACC (G/C)CA G(서열번호 1)

BINT3 R primer : GGA GGC CAT CCC CGG CGA CCT AT(서열번호 2)

HLA-AF3 primer : GAA ACS GCC TCT GYG GGG AGAAGCAA (서열번호 3)

HLA-AR3 primer :TGT TGG TCC CAA TTG TCT CCC CTC(서열번호 4)

상기 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍은 HLA- B 특이적 프라이머이고, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍은 HLA- A 특이적 프라이머이다.

본 발명은 이러한 프라이머 세트 및 이에 대한 용도를 포함한다.

(c) 다중 단일염기 프라이머 확장을 통한 SNaPshot 분석법을 수행하여 SNP를 분석한다.

이 단계에서 사용할 프라이머를, HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303가 구별될 수 있는 tSNP(tagging SNP)의 앞쪽에 정렬되도록 설계하고, 다중 단일염기 다형성(SNP) 부위에 상기 프라이머를 이용하여 확장반응을 수행한다.

본 발명의 일 실시예에서 사용한 다중 단일염기 프라이머는 서열번호 5 내지 12로서, 이들의 서열 및 용도 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

다중 단일염기 프라이머	서열(5'3')
HLA-B * 58F	CAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAC(서열번호 5)
HLA-B * 57F	AGTTGAGGCCAAAATCCCCGCGGGTTGGTC(서열번호 6)
HLA-A-A3R	TTTTTTTTTGGATCTCGGACCCGGAGACTGTGGG(서열번호 7)
HLA-A-A300R	TTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCGGG(서열번호 8)
HLA-A-A3303R	TTTTGCAGCGTCTCCTTCCCGTTCTCCAGGT(서열번호 9)
HLA-A3101F	GTGGATAGAGCAGGAG(서열번호 10)
HLA-B * 58F multi	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAC(서열번호 11)
HLA-B * 57F multi	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTTGAGGCCAAAATCCCCGCGGGTTGGTC(서열번호 12)

그리고, 생성 산물에 대한 단일 염기 다형성(SNP)에 대한 최고점을 분석하여 유전형을 확인함으로써 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303의 각 대립 유전자 여부를 결정한다.

본 발명의 일 실시예에서는 하기와 같은 결과를 수득하였다.

HLA-A 서열(서열번호 13) 중 369번째 뉴클레오티드에서 3101F의 대립인자 A 또는 G; 537번째 뉴클레오티드에서 3101, 3301, 3303 R의 대립인자 T 또는 C; 594번째 뉴클레오티드에서 3001, 3002, 3004 R의 대립인자 A 또는 G; 954번째 뉴클레오티드에서 *3301,3307 R의 대립인자 A 또는 C가 확인되었다(실시예 참조).

HLA-B*5701*5801 유전자의 384번째 뉴클레오티드가 C또는G, HLA-B*5701유전자의 667번째 뉴클레오티드가 G또는 A가 확인되었다

이처럼, HLA-A 서열(서열번호 13) 및 HLA-B 서열(서열번호 14) 중의 상기 특정의 위치에서의 유전형을 확인함으로써 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및/또는 HLA-A*3101 HLA-A*3303 보유 여부 또는 존재 여부를 결정할 수 있다.

그리고, HLA-A와 B 엑손 2, 3 영역에 존재하는 상기의 특정 대립 유전자(다형성 마커)의 존재는 해당하는 약물 부작용의 판단 기준이 될 수 있다.

따라서, 임의의 이용가능한 방법에 의한 이러한 tSNP 마커의 검출이 진단 목적, 예컨대, 약물 부작용에 대한 감수성의 조기 검출, 환자에 대한 예후, 진단 및 치료를 보조하는데 사용될 수 있다.

상기 방법에 의한 본 발명의 또 다른 측면은 약리게놈학 프로파일링의 방법이다. "약리게놈학 프로파일링은 질병 또는 의학적 상태, 특히 약물에 대한 부작용과 관련된, 대상자(subject)에 존재하는 유전 인자의 결정을 의미한다. 이 방법은 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 하나의 HLA 대립유전자의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 필요에 따라 다른 유전 인자(genetic factor)의 결정을 포함할 수 있다. 그러한 다른 유전 인자는 ADR을 포함하는 어떤 질병 또는 의학적 상태의 소인과도 관련될 수 있다.

키트

한편, 본 발명은 다른 관점에서, 상기의 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303의 특정 HLA 대립유전자 분석 방법 및 이들의 존재 여부를 결정하는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303로 구성된 군에서 1이상의 HLA 대립유전자 검출을 위한 프로브를 포함한다.

"프로브는 본원에서 다른 물질을 검출하는데 유용한 임의의 물질을 의미한다. 따라서, 프로브는 관심 대상의 대립유전자 내의 특정 영역에 특이적으로 부합화(hybridize)하는, 올리고뉴클레오티드 또는 접합 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 접합 올리고뉴클레오티드는 발색단 또는 리간드 함유 분자(예, 항원)에 공유적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 이는 수용체 분자에 고도로 특이적이다(예, 항원 특이적인 항체). 프로브는 다른 프라이머와 함께 관심 대상의 대립유전자 내의 특정 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머일 수 있다. 나아가, 상기 프로브는 관심 대상의 대립유전자나 그 대립유전자의 단백질 산물을 인식하는 항체일 수 있다.

상기 키트는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자용의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석중 용이하게 동정할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로서는 방사능 표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등이 있다.

특히, 본 발명에서는 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303로 구성된 군에서 1이상의 HLA 대립유전자의 tSNP(tagging SNP) 검출을 위한 다양한 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는데, HLA A 및 B 유전자 서열 중 관심 대상의 표지 서열(태깅 서열, tagging sequence) 및 표지 단일 염기 다형성 영역의 증폭을 위한 프라이머 세트, 예를 들어 서열번호 1 내지 12로 표시되는 프라이머 세트들을 포함하는 것이 바람직하다.

ADR 평가

또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 환자로부터의 생체 시료를 사용하여 HLA 형 결정(typing)을 포함하는, 환자의, 약물에 반응하여 약물 부작용을 일으킬 위험을 평가하는 방법에 관한 것이다.

즉, 상기 유전 표지, HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303의의 존재 또는 부재에 기초하여 환자의 약물 부작용(예, 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 또는 과민 증후군)의 발병 위험 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 이 때 대립유전자의 존재는 약물부작용의 위험의 지표이다.

그 약물은 바람직하게는 아바카비어, 알로퓨리놀, 카바마제핀 및 이들 유사 약물로 이루어지는 그룹에서 선택된다.

본원에서 약물 화합물은, 상기 약물 화합물 그 자체, 또는 그 약물 중의 적어도 하나의 수소가 할로, 히드록시, 아실아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴옥시, 아릴, 아릴옥시아릴, 카복시, 카복시알킬, 카복시-치환된 알킬, 카복시-사이클로알킬, 카복시 치환된 사이클로알킬, 카복시아릴, 카복시-치환된 아릴, 카복시헤테로아릴, 카복시-치환된 헤테로아릴, 카복시헤테로사이클릭, 카복시-치환된 헤테로사이클릭, 사이클로알킬, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 아릴, 치환된 아릴옥시, 치환된 아릴옥시아릴, 치환된 사이클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 또는 치환된 헤테로사이클릭기로 치환된 외에는 그 약물과 같은 화합물을 의미한다. 상기 치환기가 함유하는 탄소수는 0～10, 0～6, 0～4, 또는 0～2일 수 있다.

상기 약물에 대해 ADR 발병 확률이 일반집단(general population)의 ADR 발병 확률보다 높으면 그 환자는 ADR의 "위험"이 있다.

그 환자의 ADR 발병 확률은 일반집단의 ADR 발병 확률의 적어도 약 1.5배, 더 바람직하게는 적어도 약 2배, 그보다 더 바람직하게는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 10배이다. 그 확률은, 위험 인자의 발생 수(incidence)를 이용하는 등의, 당 기술분야에 알려진 어떤 방법을 사용하여 결정하여도 좋다.

ADR의 "위험 인자는 ADR과 관련된 인자이다. 위험 인자의 감도는 바람직하게는 적어도 약 40%, 더 바람직하게는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90%이다. 가장 바람직하게는, 그 감도는 적어도 95%이다. ADR을 예측하기 위한 위험 인자의 "감도(sensitivity)"는 그 위험 인자를 보유한 ADR 환자의 백분율이다.예를 들어, 만일 모든 SJS 환자가 대립유전자 A를 가지면, SJS를 예측하기 위한 그 대립유전자 A의 감도는 100%이다. 만일 40명의 SJS 환자 중 20명이 대립유전자 B를 갖는다면, 그때의 SJS를 예측하기 위한 그 대립유전자 B의 감도는 50%이다.

적어도 약 40%의 감도로 ADR과 관련된 HLA 대립유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303는 본 발명에 있어서의 위험 인자로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 그 위험 인자의 감도는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90%이다. 더 바람직하게는, 그 감도는 적어도 95%이다.

본 발명은 또한, ADR과 관련된 HLA 대립유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및/또는 HLA-A*3303를 보유하는 환자에 있어서 ADR(예, SJS/TEN 또는 HSS)을 유발하는 약물 화합물을 동정하는 방법을 포함한다.

약물은 T 림프구를 활성화하여 그 결과로서 ADR을 유발하는 어떤 HLA 복합체에 의해 제시될 수 있음이 시사되어 있다. 이들 약물에 반응성인 T 세포는 이들 약물에 의해 유발되는 ADR의 발병에 연루되어 있음이 시사되어 있다. 따라서 이들 T 세포를 활성화할 수 있는 화합물은 이들 ADR과 관련된 하나 또는 그 이상의 HLA 대립유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및/또는 HLA-A*3303를 보유하는 환자에 있어서 ADR을 유발하는 후보 화합물이다. 결과적으로, 이 방법을 신약 개발에 있어 스크리닝법으로 사용하여 그러한 ADR을 유발할 수 있는 약물 화합물을 찾아낼 수 있다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

실시예 1 : 태깅 서열( tagging sequence )의 확정

HLA-A 노맨클러쳐를 (http://hla.alleles.org/alleles/index.html) 이용하여 한국인에서 확인되는 HLA-A 및 B 서열(Release 3.11.0, 18th January 2013)을 정렬(alignment)하여 HLA-A*3101, *3303, HLA-B *5701,*5801,의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 태깅 서열(tagging sequence)을 확정하였다.

실시예 2: 다중 중합효소연쇄반응( multiplex polymerase chine reaction , multiplex PCR )

특정 HLA- A와 B 엑손 2-3번만을 증폭하기 위하여 여러 가지 HLA 클래스들과 구별할 수 있는 HLA- B 특이적 프라이머인 Bx1 Forward 프라이머와[5-GGG AGG AGC GAG GGG ACC ( G/C )CA G-3] BINT3 Reverse 프라이머 (5-GGA GGC CAT CCC CGG CGA CCT AT-3)를 사용하였고, HLA- A 특이적 프라이머인 HLA-AF3(GAA ACS GCC TCT GYG GGG AGA AGC AA) 및 HLA-AR3 (TGT TGG TCC CAA TTG TCT CCC CTC)를 사용하였다. 중합효소연쇄반응은 ABI 9700( Applied Biosystems, Foster, USA )을 이용하였다.

총 30 μL의 반응액은, 의뢰검체 100 ng, Mg² ⁺3 μL 함유 10X PCR 버퍼, MgCl₂ 1.6 μL, 2번과 3번 프라이머 0.5 μL, LATaq DNA polymerase ( 5 U/μL ) 0.2 μL, D.W 21.2 XμL로 구성하였다. 95℃에서 1분간 처리한 후에, 98℃에서 10초, 65℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 34회 반응시켰고, 최종연장반응은 72℃에서 5분간 시행하였다.

다음으로 중합효소 연쇄반응이 끝난 산물을 Ice bucket에 옮긴 후, 파라필름(parafilm)위에 PCR 산물 2 μL, 6X 로딩 버퍼 1 μL, 1~2% 아가로오스 겔, 100 bp Mixed DNA ladder 2 μL, 0.5X TBE 버퍼를 섞어서 100V, 30분간 전기영동 러닝을 하였다.

이후, 1% 아가로오스 겔을 형광 물질을 함유한 겔 레드(gel red)로 염색하여 DNA 크기를 확인하였다. PCR 산물 크기를 확인 후 샘플 내의 프라이머와 dNTP의 제거를 위해 ExoSAP-IT ( USB corp., Cleveland, USA ) 2 μL를 PCR 산물 5 μL에 첨가하고 37℃ 30분, 80℃ 15분간 반응시켰다.

실시예 3 :다중 단일염기 프라이머 확장 반응 ( multiplex single based primer extension , SNaPshot assay )을 이용한 유전자형 검사

3-1. 유형별 프라이머 설계

다중 단일염기 프라이머 확장반응 (multiplex single based primer extension, SNaPshot assay)을 위한 2개의 유형별 프라이머는 표 2와 같다.

프라이머들의 3 끝이 HLA 유전자에 있는 HLA-B *57/*58 , HLA-A*3101, *3303 구별할 수 있는 Tagging SNP들의 직전 뉴클레오티드와 정렬되도록 설계하였다(표 3).

3-2. SNaPshot 분석법

SNaPshot 분석을 위한 중합효소 연쇄반응 산물을 주형으로 이용하여, 2개의 단일염기다형성 부위에 대해 길이를 다르게 설계한 2개의 유형별 프라이머를 이용하여 다중 단일염기 프라이머 확장반응을 시행하였다.

Qiagen DNA Extraction Kit ( Qiagen, Valencia, CA, USA )를 이용하여 PTC-200 ( MJ Research Inc., Waltham, USA )으로 시행하였다. 검체 반응액 총 11 μL 반응액은 SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix 1 μL, 1/2 buffer 4 μL, 산물 1 μL, 중합연쇄 반응산물 각 1 μL, D.W 3 μL로 구성되었다.

5분간 준비한 90 ℃에 넣고, 96 ℃ 10 초 50 ℃ 5 초, 60 ℃ 30초를 40 회 반응시킨 후, SAP 1 unit ( 1 μL ) 첨가하여 37℃ 60분, 65℃ 15분 반응시켜 남아있는 ddNTP 제거하였다.

반응 산물 0.5μL에 GeneScan-120 LIZ size standard 0.15μL와 Hi-Di formamide 9.35μL를 넣어 ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster, USA )를 이용하여 분석하였다.

3-3. 단일 염기 다형성( SNP ) 분석

각 단일염기 다형성 위치에 상보적인 형광을 붙인 ddNTP가 각 프라이머 3' 끝에 오도록 조합하여 확장반응 산물을 얻어, 각 SNP에 대한 각각의 최고점을 분석하였다. 소프트웨어는 GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems, Foster, USA )을 이용하였으며 분석결과에 따라 HLA-B*57/5801의 존재 여부를 확인하였다.

그 결과를 도 1에 도시하였다.

그리고, 실험으로 통해 얻어진 결과를 표준검사법 (gold standard)[8] 으로 얻어진 유전자 서열 정보(sequencing data )와 비교하였다.

그 결과를 도 2 내지 도 9에 나타내었다.

도 2는 본 발명의 방법에 따른 HLA-A*3101, *3303 검출 결과(하기 표) 및 이를 위한 태깅 SNP(tSNP)의 조합을 나타낸 것이다.

도 3 내지 6은 서열 상의 HLA-A*3101, *3303 검출 정보를, 도 7 내지 9는 서열 상의 HLA-B *5701,*5801 검출 정보를 나타낸 것이다.

이러한 결과를 통해, 약물 부작용(ADR) 관련 유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 존재 여부를 빠르고 정확하게 확인할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명을 이용하여 상기 특정 HLA 대립유전자의 타입을 고속으로 검출하여 약물 부작용과 관련된 위험도 예측 및 진단 방법에 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Inje University <120> A Method for Quick-Detecting HLA alleles associated with Adverse Drug Reaction Using tSNP <130> pn1304-138 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bx1 F primer <400> 1 gggaggagcg aggggaccgc cag 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BINT3 R primer <400> 2 ggaggccatc cccggcgacc tat 23 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-AF3 primer <400> 3 gaaacsgcct ctgyggggag aagcaa 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-AR3 primer <400> 4 tgttggtccc aattgtctcc cctc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B 58F <400> 5 caggaggggc cggagtattg ggac 24 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B 57F <400> 6 agttgaggcc aaaatccccg cgggttggtc 30 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A-A3R <400> 7 tttttttttg gatctcggac ccggagactg tggg 34 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A-A300R <400> 8 tttttttttt ttttttttaa aggcgcctgg gcctctcccg gg 42 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A-A3303R <400> 9 ttttgcagcg tctccttccc gttctccagg t 31 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A3101F <400> 10 gtggatagag caggag 16 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B 58F multi <400> 11 tttttttttt tttttttttt caggaggggc cggagtattg ggac 44 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B 57F multi <400> 12 tttttttttt tttttttttt agttgaggcc aaaatccccg cgggttggtc 50 <210> 13 <211> 3416 <212> DNA <213> HLA-A sequence <400> 13 gagaagccaa tcagtgtcgt cgcggtcgct gttctaaagt ccgcacgcac ccaccgggac 60 tcagattctc cccagacgcc gaggatggcc gtcatggcgc cccgaaccct cctcctgcta 120 ctctcggggg ccctggccct gacccagacc tgggcgggtg agtgcggggt cgggagggaa 180 accgcctctg cggggagaag caaggggccc tcctggcggg ggcgcaggac cgggggagcc 240 gcgccgggag gagggtcggg caggtctcag ccactgctcg cccccaggct cccactccat 300 gaggtatttc ttcacatccg tgtcccggcc cggccgcggg gagccccgct tcatcgccgt 360 gggctacgtg gacgacacgc agttcgtgcg gttcgacagc gacgccgcga gccagaagat 420 ggagccgcgg gcgccgtgga tagagcagga ggggccggag tattgggacc aggagacacg 480 gaatatgaag gcccactcac agactgaccg agcgaacctg gggaccctgc gcggctacta 540 caaccagagc gaggacggtg agtgaccccg gcccggggcg caggtcacga cccctcatcc 600 cccacggacg ggccaggtcg cccacagtct ccgggtccga gatccacccc gaagccgcgg 660 gactccgaga cccttgtccc gggagaggcc caggcgcctt tacccggttt cattttcagt 720 ttaggccaaa aatccccccg ggttggtcgg ggcggggcgg ggctcggggg actgggctga 780 ccgcggggtc ggggccaggt tctcacacca tccagataat gtatggctgc gacgtggggc 840 cggacgggcg cttcctccgc gggtaccggc aggacgccta cgacggcaag gattacatcg 900 ccctgaacga ggacctgcgc tcttggaccg cggcggacat ggcagctcag atcaccaagc 960 gcaagtggga ggcggtccat gcggcggagc agcggagagt ctacctggag ggccggtgcg 1020 tggacgggct ccgcagatac ctggagaacg ggaaggagac gctgcagcgc acgggtacca 1080 ggggccacgg ggcgcctccc tgatcgccta tagatctccc gggctggcct cccacaagga 1140 ggggagacaa ttgggaccaa cactagaata tcaccctccc tctggtcctg agggagagga 1200 atcctcctgg gtttccagat cctgtaccag agagtgactc tgaggttccg ccctgctctc 1260 tgacacaatt aagggataaa atctctgaag gagtgacggg aagacgatcc ctcgaatact 1320 gatgagtggt tccctttgac accggcagca gccttgggcc cgtgactttt cctctcaggc 1380 cttgttctct gcttcacact caatgtgtgt gggggtctga gtccagcact tctgagtctc 1440 tcagcctcca ctcaggtcag gaccagaagt cgctgttccc ttctcaggga atagaagatt 1500 atcccaggtg cctgtgtcca ggctggtgtc tgggttctgt gctctcttcc ccatcccggg 1560 tgtcctgtcc attctcaaga tggccacatg cgtgctggtg gagtgtccca tgacagatgc 1620 aaaatgcctg aattttctga ctcttcccgt cagacccccc caagacacat atgacccacc 1680 accccatctc tgaccatgag gccaccctga ggtgctgggc cctgggcttc taccctgcgg 1740 agatcacact gacctggcag cgggatgggg aggaccagac ccaggacacg gagctcgtgg 1800 agaccaggcc tgcaggggat ggaaccttcc agaagtgggc ggctgtggtg gtgccttctg 1860 gagaggagca gagatacacc tgccatgtgc agcatgaggg tctgcccaag cccctcaccc 1920 tgagatgggg taaggaggga gatgggggtg tcatgtctct tagggaaagc aggagcctct 1980 ctggagacct ttagcagggt cagggcccct caccttcccc tcttttccca gagctgtctt 2040 cccagcccac catccccatc gtgggcatca ttgctggcct ggttctcctt ggagctgtga 2100 tcactggagc tgtggtcgct gccgtgatgt ggaggaggaa gagctcaggt ggagaagggg 2160 tgaagggtgg ggtctgagat ttcttgtctc actgagggtt ccaagcccca gctagaaatg 2220 tgccctgtct cattactggg aagcaccttc cacaatcatg ggccgaccca gcctgggccc 2280 tgtgtgccag cacttactct tttgtaaagc acctgttaaa atgaaggaca gatttatcac 2340 cttgattacg gcggtgatgg gacctgatcc cagcagtcac aagtcacagg ggaaggtccc 2400 tgaggacaga cctcaggagg gctattggtc caggacccac acctgctttc ttcatgtttc 2460 ctgatcccgc cctgggtctg cagtcacaca tttctggaaa cttctctggg gtccaagact 2520 aggaggttcc tctaggacct taaggccctg gctcctttct ggtatctcac aggacatttt 2580 cttcccacag atagaaaagg agggagttac actcaggctg caagtaagta tgaaggaggc 2640 tgatgcctga ggtccttggg atattgtgtt tgggagccca tgggggagct cacccacccc 2700 acaattcctc ctctagccac atcttctgtg ggatctgacc aggttctgtt tttgttctac 2760 cccaggcagt gacagtgccc agggctctga tgtgtctctc acagcttgta aaggtgagag 2820 cttggagggc ctgatgtgtg ttgggtgttg ggtggaacag tggacacagc tgtgctatgg 2880 ggtttctttg cgttggatgt attgagcatg cgatgggctg tttaaggtgt gacccctcac 2940 tgtgatggat atgaatttgt tcatgaatat ttttttctat agtgtgagac agctgccttg 3000 tgtgggactg agaggcaaga gttgttcctg cccttccctt tgtgacttga agaaccctga 3060 ctttgtttct gcaaaggcac ctgcatgtgt ctgtgttcgt gtaggcataa tgtgaggagg 3120 tggggagagc accccacccc catgtccacc atgaccctct tcccacgctg acctgtgctc 3180 cctctccaat catctttcct gttccagaga ggtggggctg aggtgtctcc atctctgtct 3240 caacttcatg gtgcactgag ctgtaacttc ttccttccct attaaaatta gaacctgagt 3300 ataaatttac tttctcaaat tcttgccatg agaggttgat gagttaatta aaggagaaga 3360 ttcctaaaat ttgagagaca aaattaatgg aacgcatgag aaccttccag agtcca 3416 <210> 14 <211> 3341 <212> DNA <213> HLA-B sequence <400> 14 agttctaaag tccccacgca cccacccgga ctcagagtct cctcagacgc cgagatgctg 60 gtcatggcgc cccgaaccgt cctcctgctg ctctcggcgg ccctggccct gaccgagacc 120 tgggccggtg agtgcgggtc gggagggaaa tggcctctgc cgggaggagc gaggggaccg 180 caggcggggg cgcaggacct gaggagccgc gccgggagga gggtcgggcg ggtctcagcc 240 cctcctcacc cccaggctcc cactccatga ggtatttcta cacctccgtg tcccggcccg 300 gccgcgggga gccccgcttc atctcagtgg gctacgtgga cgacacccag ttcgtgaggt 360 tcgacagcga cgccgcgagt ccgagagagg agccgcgggc gccgtggata gagcaggagg 420 ggccggagta ttgggaccgg aacacacaga tctacaaggc ccaggcacag actgaccgag 480 agagcctgcg gaacctgcgc ggctactaca accagagcga ggccggtgag tgaccccggc 540 ccggggcgca ggtcacgact ccccatcccc cacgtacggc ccgggtcgcc ccgagtctcc 600 gggtccgaga tccgcctccc tgaggccgcg ggacccgccc agaccctcga ccggcgagag 660 ccccaggcgc gtttacccgg tttcattttc agttgaggcc aaaatccccg cgggttggtc 720 ggggcggggc ggggctcggg ggactgggct gaccgcgggg ccggggccag ggtctcacac 780 cctccagagc atgtacggct gcgacgtggg gccggacggg cgcctcctcc gcgggcatga 840 ccagtacgcc tacgacggca aggattacat cgccctgaac gaggacctgc gctcctggac 900 cgccgcggac acggcggctc agatcaccca gcgcaagtgg gaggcggccc gtgaggcgga 960 gcagcggaga gcctacctgg agggcgagtg cgtggagtgg ctccgcagat acctggagaa 1020 cgggaaggac aagctggagc gcgctggtac caggggcagt ggggagcctt ccccatctcc 1080 tataggtcgc cggggatggc ctcccacgag aagaggagga aaatgggatc agcgctagaa 1140 tgtcgccctc cgttgaatgg agaatggcat gagttttcct gagtttcctc tgagggcccc 1200 ctcttctctc tagacaatta aggaatgacg tctctgagga aatggagggg aagacagtcc 1260 ctagaatact gatcaggggt cccctttgac ccctgcagca gccttgggaa ccgtgacttt 1320 tcctctcagg ccttgttctc tgcctcacac tcagtgtgtt tggggctctg attccagcac 1380 ttctgagtca ctttacctcc actcagatca ggagcagaag tccctgttcc ccgctcagag 1440 actcgaactt tccaatgaat aggagattat cccaggtgcc tgcgtccagg ctggtgtctg 1500 ggttctgtgc cccttcccca ccccaggtgt cctgtccatt ctcaggctgg tcacatgggt 1560 ggtcctaggg tgtcccatga aagatgcaaa gcgcctgaat tttctgactc ttcccatcag 1620 accccccaaa gacacacgtg acccaccacc ccatctctga ccatgaggcc accctgaggt 1680 gctgggccct gggtttctac cctgcggaga tcacactgac ctggcagcgg gatggcgagg 1740 accaaactca ggacactgag cttgtggaga ccagaccagc aggagataga accttccaga 1800 agtgggcagc tgtggtggtg ccttctggag aagagcagag atacacatgc catgtacagc 1860 atgaggggct gccgaagccc ctcaccctga gatggggtaa ggagggggat gaggggtcat 1920 atctcttctc agggaaagca ggagcccttc agcagggtca gggcccctca tcttcccctc 1980 ctttcccaga gccgtcttcc cagtccaccg tccccatcgt gggcattgtt gctggcctgg 2040 ctgtcctagc agttgtggtc atcggagctg tggtcgctgc tgtgatgtgt aggaggaaga 2100 gttcaggtag ggaaggggtg aggggtgggg tctgggtttt cttgtcccac tgggggtttc 2160 aagccccagg tagaagtgtt ccctgcctca ttactgggaa gcagcatgca cacaggggct 2220 aacgcagcct gggaccctgt gtgccagcac ttactctttt gtgcagcaca tgtgacaatg 2280 aaggatggat gtatcacctt gatggttgtg gtgttggggt cctgattcca gcattcatga 2340 gtcaggggaa ggtccctgct aaggacagac cttaggaggg cagttggtcc aggacccaca 2400 cttgctttcc tcgtgtttcc tgatcctgcc ctgggtctgt agtcatactt ctggaaattc 2460 cttttgggtc caagactagg aggttcctct aagatctcat ggccctgctt cctcccagtg 2520 ccctcacagg acattttctt cccacaggtg gaaaaggagg gagctactct caggctgcgt 2580 gtaagtggtg ggggtgggag tgtggaggag ctcacccacc ccataattcc tcctgtccca 2640 cgtctcctgc gggctctgac caggtcctgt ttttgttcta ctccaggcag cgacagtgcc 2700 cagggctctg atgtgtctct cacagcttga aaaggtgaga ttcttggggt ctagagtggg 2760 tggggtggcg ggtctggggg tgggtggggc agaggggaaa ggcctgggta atggggattc 2820 tttgattggg atgtttcgcg tgtgtggtgg gctgtttaga gtgtcatcgc ttaccatgac 2880 taaccagaat ttgttcatga ctgttgtttt ctgtagcctg agacagctgt cttgtgaggg 2940 actgagatgc aggatttctt cacgcctccc ctttgtgact tcaagagcct ctggcatctc 3000 tttctgcaaa ggcacctgaa tgtgtctgcg tccctgttag cataatgtga ggaggtggag 3060 agacagccca cccttgtgtc cactgtgacc cctgttccca tgctgacctg tgtttcctcc 3120 ccagtcatct ttcttgttcc agagaggtgg ggctggatgt ctccatctct gtctcaactt 3180 tacgtgcact gagctgcaac ttcttacttc cctactgaaa ataagaatct gaatataaat 3240 ttgttttctc aaatatttgc tatgagaggt tgatggatta attaaataag tcaattcctg 3300 gaatttgaga gagcaaataa agacctgaga accttccaga a 3341

Claims

서열번호 13으로 표시되는 HLA-A 유전자의 369번째 뉴클레오티드G>A, 537번째 뉴클레오티드G>A, 594번째 뉴클레오티드T>A, 954번째 뉴클레오티드T>C; 및 서열번호 14로 표시되는 HLA-B 유전자의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오티드로, 구성된 군에서 선택되는 1이상의 뉴클레오티드를 확인하는 것을 특징으로 하는,
약물 부작용(ADR) 관련 유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 SNP 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 HLA-B*5701, HLA-B*5801 및 HLA-A*3101 HLA-A*3303로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 다형성 검출용 태깅 서열(tagging sequence)를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
서열번호 13으로 표시되는 HLA-A 유전자의 369번째 뉴클레오티드, 537번째 뉴클레오티드, 594번째 뉴클레오티드, 954번째 뉴클레오티드 확인을 위한 태깅 SNP는 HLA-A *3001.4, *3101, *3303, *3001.7, 및 이외의 다른 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
서열번호 14로 표시되는 HLA-B 유전자의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오타이드 확인을 위한 태깅 SNP는 HLA-B *58, *57 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 SNaPshot 분석법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 SNaPshot 분석법 이용 시 서열번호 서열번호 5 내지 12로 구성된 군에서 프라이머 세트에서 선택되는 하나 이상의 프라이머쌍을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한, 서열번호 5 내지 12로 구성된 군에서 선택되는 프라이머쌍을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 부작용(ADR) 관련 유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 SNP 검출용 키트.
제1항의 방법을 이용하여 약물 부작용(ADR) 관련 유전자 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 존재를 확인하는 단계; 및
상기 HLA 대립유전자가 존재할 때 약물 부작용 위험이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 약물 부작용 위험도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 약물은 아바카비어, 알로퓨리놀, 카바마제핀 및 이들 유사 약물로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 약물 부작용은 스티브존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome) 또는 독성 표피괴사(toxic epidermal necrolysis)인 것을 특징으로 하는 방법.
약물 부작용과 관련된 HLA 대립유전자를 보유하는 환자의 시료로부터 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 HLA-B*5701, HLA-B*5801, HLA-A*3101, 및 HLA-A*3303으로 구성된 군에서 선택된 1이상의 HLA 대립유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법.