WO2016167408A1 - 차세대 염기서열 분석기법을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법 - Google Patents

차세대 염기서열 분석기법을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법 Download PDF

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이민섭
권순재
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이원 다이애그노믹스 게놈센타(주)
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Definitions

  • the present invention relates to a method for non-invasive prediction of organ transplant rejection by measuring the ratio between an organ donor and a recipient specific nucleic acid sequence in a biological sample of an organ transplant recipient.
  • the present invention relates to a method for determining a donor-derived marker sequence and a recipient-derived marker sequence by examining a biological sample (eg, blood) of an organ transplant recipient, and predicting organ transplant rejection based thereon.
  • organ transplant rejection assays have many disadvantages.
  • the gold standard for analyzing heart transplant rejection is a biopsy at each time, which requires surgery to be performed on the image, which is expensive, biopsy variability and severe Patient discomfort and the like (F. Saraiva et al., Transplant. Proc . Vol. 43, pp. 1098-1012, 2011).
  • non-invasive methods such as increasing gene expression signals and measuring immune protein levels have been used in the event of organ transplant rejection.
  • these methods have high false positives due to the complex cross-reactivity of various immune responses, and tissue specificity.
  • the disadvantage is that it is based on a gene expression signal having a.
  • cfdDNA cell-free donor-derived DNA
  • organ donors were present in the urine and blood of organ transplant recipients (J. Zhang et al., Clin. CHem. Vol. 45, pp. 1741-1746, 1999., YM Lo et al., Lancet , Vol. 351, pp. 1329-1330, 1998), using this method for non-invasive analysis of organ transplant rejection.
  • donor specific DNA can be analyzed using a variety of molecular chemistry methods to detect Y chromosomes (TK Sigdel et al., Transplantation , Vol. 96, pp. 97-101, 2013.).
  • TK Sigdel et al. Transplantation , Vol. 96, pp. 97-101, 2013.
  • Next generation sequencing which can solve this problem, has attracted much attention.
  • Next-generation sequencing technology unlike conventional methods, can produce large amounts of data quickly, dramatically reducing the time and cost required to decipher individual genomes.
  • Next-generation sequencing technology has evolved over time, sequencing platforms have evolved, and the cost of analysis has become less and less.
  • Mendelian genetic diseases, rare diseases, and cancers are using the next-generation sequencing to find the cause of the disease.
  • Next-generation sequencing is used for sequencing by extracting DNA from a sample, mechanically fragmenting it, and then preparing a library having a specific size.
  • Initial sequencing data is produced by repeating four kinds of complementary nucleotide binding and separation reactions using a single nucleotide unit using a large-scale sequencing device, and then processing and mapping the initial data.
  • Analytical steps using bioinformatics including identification of genome variations and annotation of mutation information, to discover genome variations that affect or are likely to affect diseases and various biological phenotypes It contributes to the creation of new value added through development and industrialization.
  • Next-generation sequencing can be applied not only to DNA but also to RNA and methylation translation, including full-length exo sequencing that captures and sequences only the exome region that encodes a protein.
  • sequencing WES
  • This method is used to sequence only the region coding for the protein that is most directly related to the occurrence of the disease, and is widely used because it is advantageous to sequence only the exome region rather than sequencing the full-length genome in terms of cost and efficiency.
  • next-generation sequencing method can analyze all nucleic acids present in a sample, which is very useful for the analysis of cfdDNA having a very low concentration of the desired sample.
  • Iwijin De Vlaminck et al. Analysis of 565 samples acquired over time in heart transplant patients revealed that the proportion of cfdDNA in the recipient's sample increased when organ transplant rejection occurred (Iwijin De Vlaminck et al., Sci. Transl. Med. Vol. 6, 241ra77, 2014).
  • the method has a drawback of using a marker specific to the heart and analyzing all the samples, which is very time and costly.
  • An object of the present invention is to predict a method for predicting organ transplant rejection using Next Generation Sequencing (NGS) or digital base amplification in a biological sample obtained from a recipient receiving an organ transplanted from an organ donor.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • digital base amplification in a biological sample obtained from a recipient receiving an organ transplanted from an organ donor.
  • Another object of the present invention is a method for predicting organ transplant rejection using Next Generation Sequencing (NGS) or digital base amplification in a biological sample obtained from a recipient receiving an organ transplanted from an organ donor
  • NGS Next Generation Sequencing
  • the present invention uses the Next Generation Sequencing (NGS) method in a biological sample obtained from a recipient receiving an organ transplanted from an organ donor, which includes the following steps.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • the present invention also predicts organ transplant rejection using Next Generation Sequencing (NGS) in biological samples obtained from recipients receiving organs transplanted from organ donors, comprising the following steps: Provide a way:
  • the present invention also provides a computer system comprising the following steps:
  • a computer system comprising a computer readable medium encrypted with a plurality of instructions for controlling the system,
  • the biological sample contains a cell free nucleic acid molecule of a donor and a recipient from a recipient transplanted with an organ from an organ donor,
  • the operation was obtained by analyzing three or more marker sequences selected from Tables 1 to 10 in a cell free nucleic acid molecule isolated from the biological sample using Next Generation Sequencing (NGS) or digital base amplification.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • the recipient's bowel predicts whether a transplant rejection response is present.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • Figure 2 is an example showing that when the amplification through a primer designed for one marker, the desired SNP site is present immediately after the primer can be carried out very quickly the rate of NGS.
  • Figure 3 is an analysis result of measuring the donor SNP marker ratio in transplant recipients by mixing DNA to artificially create organ transplant conditions for 2023 markers selected in Table 1.
  • Figure 4 is a result showing the measured value in the artificially mixed DNA samples for each SNP marker.
  • the method for predicting organ transplant rejection using Next Generation Sequencing (NGS) is applicable to a very small amount of samples, and is fast, inexpensive, and uses carefully selected markers. It is fast, applicable to all organ transplants of all races around the world, and can simultaneously detect sequencing error rates, which is useful for predicting organ transplant rejection non-invasively.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • next generation sequencing method in the present invention means Next generation sequencing or NGS. This refers to a technique for fragmenting the whole genome and sequencing the fragment at a large capacity based on chemical hybridization, and includes technologies from Agilent, Illumina, Roche, and Life Technologies, and has a broad meaning.
  • the furnace is defined as including a third generation technology such as Pacificbio, Nanopore Technology, and the fourth generation technology.
  • organ transplant rejection response in the present invention encompasses both acute and chronic organ rejection responses.
  • Acute rejection occurs when the donor's organ is judged to be external by the recipient's immune system.
  • Acute organ transplant rejection is defined as the infiltration of a recipient's immune cells into the transplanted organ, resulting in the destruction of the transplanted organ. This happens very quickly and usually occurs within a few weeks after organ transplantation.
  • acute organ transplant rejection may be inhibited or inhibited by immunosuppressive agents such as rampamycin, cyclosprin A, and anti-CD4 monoclonal antibodies.
  • “Chronic transplant rejection” (CR) usually occurs within months or years after transplantation.
  • organ fibrosis is a common phenomenon, and the function of each organ occurs.
  • a chronic organ transplant rejection occurs, a fibrotic reaction that destroys the airways occurs, leading to pneumonia (bronchiolitis obliterans).
  • a chronic organ transplant rejection occurs after a heart transplant, fibrotic atherosclerosis develops.
  • obstructive nephropathy or nephrosclerosis occurs.
  • tubulointerstitial nephropathy Chronic organ transplant rejection also manifests itself as ischemic insults, denervation of transplanted organs, hyperlipidemia associated with immunosuppressants and hypertension symptoms.
  • biological sample in the present invention means any sample obtained from a recipient and containing one or more nucleic acid molecules of interest.
  • nucleic acid or “polynucleotide” in the present invention means a single- or double-stranded form of deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) and polymers thereof. Unless specifically limited otherwise, the term includes nucleic acids that contain known analogues of natural nucleotides that have similar binding properties as the reference nucleic acid and are metabolized in a manner similar to natural nucleotides. Unless otherwise stated, certain nucleic acid sequences also include not only clearly written sequences but also implicitly conservatively modified variants thereof (eg, degenerate codon substitutions), alleles, orthologs, SNPs, and complementary sequences .
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • degenerate codon substitutions can be achieved by generating sequences in which the three positions of one or more selected (or all) codons are substituted with mixed bases and / or deoxyinosine residues (Batzer et al., Nucleic Acid Res 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem . 260: 2605-2608 (1985); and Rossolini et al, Mo I. Cell. Probes 8: 91-98 (1994).
  • nucleic acid is used interchangeably with gene, cDNA, mRNA, small non-coding RNA, micro RNA (miRNA), Piwi-interacting RNA and short hairpin RNA (shRNA) encoded by the gene or locus. do.
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • the term “cutoff value” means a value used to mediate classification between two or more states (eg, normal state and organ transplant rejection state) for a biological sample. For example, if the donor's marker ratio in the recipient's blood is greater than the cutoff value, the beneficiary is classified as an organ transplant rejection state, or if the donor's marker ratio in the recipient's blood is less than the cutoff value, the beneficiary is in a normal state. Classified as
  • the present invention provides a method of non-invasive obtaining a biological sample containing donor and recipient cell free nucleic acid molecules from a recipient transplanted with an organ from an organ donor;
  • NGS Next Generation Sequencing in biological samples obtained from recipients transplanted from an organ donor, comprising comparing said ratio with one or more cutoff values.
  • the present invention relates to a method for predicting organ transplant rejection response.
  • the marker sequences of Tables 1 to 10 are bi-allelic, characterized by a single base polymorphism (SNP), satisfy a Hardy-Weinberg distribution, and have a minor allele frequency (small allele ratio). ) Is a monobasic polymorphic marker of 0.4 or more.
  • the marker numbers (rs numbers) of Tables 1 to 10 are reference SNP numbers that can be searched in the dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) of the NCBI. You can do
  • the biological sample may be characterized in that blood, plasma, serum, urine, or saliva.
  • the marker sequence may have a genotype as shown in Table 11 for each SNP site, so that some SNP combinations (red) may not provide useful information for predicting organ transplant rejection response. Some SNP combinations (yellow and abstract) can provide useful information, which can be characterized solely by the random distribution of the SNP genes of the donor and recipient.
  • the ratio of each allele of the donor and the beneficiary calculated by the Heidiweinberg equilibrium is calculated as shown in Table 3 below.
  • the amplifying the marker sequence may be further characterized by further amplifying all the marker sequences disclosed in Tables 1 to 10.
  • the ratio of each marker sequence may be the ratio of the amount of the donor-derived marker sequence and the amount of the beneficiary-derived marker sequence for each marker in Tables 1 to 10.
  • NGS platforms used in the present invention are optimized for analyzing 100 bp sequence fragments.
  • factors to consider are the length of readings that can be read at one time, base error rate, analysis speed, and reaction efficiency.
  • the desired SNP site was present within 35 bp from the start of the sequencing analysis, and it was confirmed that the average of the amplified marker sequences was 70 bp ( 2).
  • the amplified marker sequence of the biological sample may be characterized in that less than 200bp.
  • the marker used in the present invention is a bi-allelic SNP site, it analyzes a marker in which both the position and the expected sequencing value are known. If the nucleotide sequence of the position is different from the known value (for example, G / T Must be read as A is read), which can be counted as an error.
  • the ratio of each marker sequence may be characterized by calculating the error rate as well.
  • the cutoff value may be a prediction method that is a reference value established in a normal biological sample.
  • the beneficiary who received the organ transplantation after receiving the biological sample before, immediately after receiving the organ transplantation, after a certain time interval after analysis, as a result of the analysis, the donor's SNP when the organ transplant rejection appears It was confirmed that the marker ratio was increased.
  • the present invention provides a method for producing a biological sample comprising, in a non-invasive manner, a biological sample containing donor and recipient cell free nucleic acid molecules from a recipient transplanted with an organ from an organ donor;
  • the present invention relates to a method for predicting organ transplant rejection using Next Generation Sequencing (NGS) or digital base amplification in biological samples obtained from recipients transplanted with organs from organ donors.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • the biological sample may be characterized in that blood, plasma, serum, urine, or saliva.
  • the amplifying the marker sequence may be further characterized by further amplifying all the marker sequences disclosed in Tables 1 to 10.
  • the ratio of each marker sequence may be characterized in that the ratio of the amount of the donor-derived marker sequence and the beneficiary-derived marker sequence for each marker in Tables 1 to 10 is a positive ratio.
  • the ratio of each marker sequence may be characterized by calculating the error rate as well.
  • the amplified marker sequence of the biological sample may be characterized in that less than 200bp.
  • the time is, but is not limited to, one day, two days, one week, one month, two months, three months, one year, two years, and ten years before organ transplantation, immediately after organ transplantation, and after organ transplantation. It may be characterized in that it is selected from the group.
  • the present invention also provides a method for predicting organ transplant rejection using Next Generation Sequencing (NGS) or digital nucleotide amplification in a biological sample obtained from a recipient receiving an organ transplanted from an organ donor.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • a computer system comprising a computer readable medium having a plurality of instructions encrypted thereon for controlling a computing system to perform.
  • the biological sample contains a cell free nucleic acid molecule of a donor and a recipient from a recipient transplanted with an organ from an organ donor,
  • the operation was obtained by analyzing three or more marker sequences selected from Tables 1 to 10 in a cell free nucleic acid molecule isolated from the biological sample using Next Generation Sequencing (NGS) or digital base amplification.
  • NGS Next Generation Sequencing
  • the ratio of male DNA in female DNA is mixed by 0%, 0.625%, 1.25%, 2.5%, 5%, and 10%, respectively. I created a sample.
  • Custom Amplicon was prepared to proceed with TruSeq Custom Amplicon (TSCA) Assay (Illumina, USA) using 100 ng of each gDNA. Heat block was set at 95 °C and DNA and CAT (Custom Amplicon Oligo Tube) were put in 1.7 ml tube with 5 ul each. At this time, 5 ul of control reagents ACD1 and ACP1 were also prepared. 40 ul of each group was added to mix well using a pipette of OHS1 (Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1), and the temperature was adjusted to 40 ° C. after 95 ° C. and 1 min, followed by Oligo Hybridization reaction for 80 min.
  • OHS1 Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1
  • SW1 stringent wash 1
  • UB1 Universal Buffer 1
  • ELM3 Extention-Ligation Mix 3
  • the reaction was carried out for 45 min in a 37 ° C incubator.
  • the foil was removed and centrifuged at 2,400 x g and 2 min.
  • 25 ⁇ l of 50 mM NaOH prepared beforehand was pipetted 5 to 6 times with a pipette and allowed to react at room temperature for 5 minutes.
  • PMM2 / TDP1 PCR Mster Mix 2 / TruSeq DNA Polymerase 1
  • the sample was able to uncover the sequencing using the sequencing equipment, it was confirmed that it is possible to monitor the organ transplant rejection through the algorithm and pipeline by counting the makers (Fig. 3 and 4).
  • the graph shows the number of alleles corresponding to the SNP markers obtained through Next Generation Sequencing, with the number of alleles (Reference allele or Major allele) counting on the horizontal axis and the number of alleles on the vertical axis. allele or Minor allele) counting numbers were taken as log2 values (FIG. 3).
  • the SNP marker was selected only for SNPs located on chromosomes 13, 18, and 21, and blue ( ⁇ ), green ( ⁇ ), and red ( ⁇ ) were distinguished using color and marking (Fig. 3).
  • An artificially created DNA phenotype can be represented by AA, Aa, aA, or aa, so its distribution can be represented in eight cases (AAaa, aaAA are considered to be the same phenotype). As the number of donors increased, the distribution of AaAA and Aaaa was confirmed to increase at a constant rate (FIG. 3).
  • the distribution is changed by the degree of mixing of the biomarker of the donor.
  • This distribution can be quantitatively measured and calculated to detect or measure the amount of genes in the donor's blood, and to predict or observe organ transplant rejection by measuring and observing the amount of genetic variation in the donor. .
  • the biomarkers of the next generation sequencing can be quantitatively analyzed to accurately measure the amount of mixed DNA even at a very low amount. Confirmed that it can.
  • counting the bases corresponding to AA and aa of each artificially mixed donor can be quantified as shown in Table 14 below. There is about a 2-fold difference between the mixed DNA value and the value obtained through analysis, but the measured DNA amount is not an absolute amount.
  • each marker shows individual differences but can be measured or observed very accurately when using multiple markers.
  • donor DNA When applied to actual patients, donor DNA can be quantified over time, and rejection of organ transplants can be monitored.
  • the method of the present invention can predict or monitor organ transplant rejection non-invasively, it is highly industrially applicable.

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Abstract

본 발명은 장기 이식 수혜자(recipient)의 생체 시료에서 장기 기증자(donor) 및 수혜자(recipient) 특이적 핵산 서열 간의 비율을 측정하여 장기 이식 거부반응을 비침습적으로 예측하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장기 이식 수혜자의 생체 시료(예를 들면, 혈액)의 검사를 통해 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3이상의 마커에 대하여, 기증자 유래 마커 서열 및 수혜자 유래 마커 서열의 비율을 측정하고, 이를 바탕으로 장기 이식 거부반응을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법은, 매우 적은 양의 샘플에도 적용 가능하고, 신속하고 저렴하며, 데이터 분석의 속도가 빠르고, 전세계 모든 인종의 모든 장기 이식에 적용 가능하며 서열분석 에러 확률을 동시에 검출할 수 있어, 비침습적으로 장기 이식 거부 반응을 예측하는데 유용하다.

Description

차세대 염기서열 분석기법을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법
본 발명은 장기 이식 수혜자(recipient)의 생체 시료에서 장기 기증자(donor) 및 수혜자(recipient) 특이적 핵산 서열 간의 비율을 측정하여 장기 이식 거부반응을 비침습적으로 예측하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장기 이식 수혜자의 생체 시료(예를 들면, 혈액)의 검사를 통해 기증자 유래 마커 서열 및 수혜자 유래 마커 서열의 비율을 측정하고, 이를 바탕으로 장기 이식 거부반응을 예측하는 방법에 관한 것이다.
정확하고 시기적절한 장기 이식 거부 반응에 대한 진단은 장기 이식 수혜자의 생존에 필수적인 요소이다. 그러나 현재 사용되고 있는 장기이식 거부반응 분석방법은 많은 단점이 있다. 예를 들어, 심장 이식 거부반응을 분석하기 위한 골드 스탠다드(gold standard)는 각 시기별 조직검사인데, 심상 조직 검사를 위해서는 수술이 동반되어야 하며, 높은 비용, 조직 검사 의사별 다양성(variability) 및 심각한 환자의 불편함 등의 문제가 있다(F. Saraiva et al., Transplant. Proc. Vol. 43, pp. 1098-1012, 2011). 이를 해결하기 위하여, 장기 이식 거부 반응 발생 시, 증가하는 유전자 발현 신호, 면역 단백질 양의 측정 등과 같은 비침습적인 방법이 사용되었으나, 상기 방법들은 다양한 면역 반응의 복잡한 교차 반응성 때문에 위양성이 높고, 조직 특이성을 가지는 유전자 발현 신호에 기반을 두고 있다는 단점이 있다.
1990년대 후반에 장기 이식 수혜자의 소변 및 혈액에 장기 기증자(donor)로부터 유래한 세포 유리 핵산(Cell-free donor-derived DNA, cfdDNA)이 존재한다는 것이 알려졌으며(J. Zhang et al., Clin. CHem. Vol. 45, pp. 1741-1746, 1999., Y. M. Lo et al., Lancet, Vol. 351, pp. 1329-1330, 1998), 이를 이용하여 비침습적으로 장기 이식 거부반응을 분석하는 방법이 제시되어 왔다. 예를 들어, 남성 기증자로부터 장기를 이식받은 여성 수혜자의 경우, 기증자 특이적 DNA는 Y 염색체를 검출하는 여러 가지 분자화학적인 방법을 이용하여 분석할 수 있다(T. K. Sigdel et al., Transplantation, Vol. 96, pp. 97-101, 2013.). 그러나 이러한 cfdDNA는 막대한 양의 background DNA에 비하여 매우 적은 양이 존재하여, 이를 분석하기 위한 특이성과 민감도가 높은 방법이 필요한 실정이다.
이러한 문제점을 해결할 수 있는 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing: NGS)이 많은 사람들의 관심을 받고 있다. 차세대 염기서열 분석 기술은 기존의 방법과 달리 대용량의 데이터를 빠른 시간에 생산할 수 있으므로 개인 유전체 해독에 필요한 시간과 비용을 획기적으로 절감시킨 기술이다. 차세대 염기서열 분석 기술은 시간이 지남에 따라 시퀀싱 플랫폼은 발전하고 분석 가격은 점점 저렴해지고 있으며 멘델성 유전질환과 희귀질환, 암등에서 차세대 염기서열 분석법을 이용해 질병의 원인 유전자를 찾는데 성공하고 있다. 차세대 염기서열 분석법은 검체로부터 DNA를 추출한 이후 기계적으로 조각화(fragmentation)을 시킨 이후 특정 크기를 가지는 라이브러리(library)를 제작하여 시퀀싱에 사용한다. 대용량 시퀀싱 장비를 사용하여 한 개의 염기단위로 4가지 종류의 상보적 뉴클레오타이드(nucleotide) 결합 및 분리 반응을 반복하면서 초기 시퀀싱 데이터를 생산하게 되고, 이후에 초기 데이터의 가공(Trimming), 매핑(Mapping), 유전체 변이의 동정 및 변이 정보의 해석(Annotation) 등 생물적보학(Bioinformatics)을 이용한 분석 단계를 수행하여 질병 및 다양한 생물학적 형태(phenotype)에 영향을 미치거나 가능성이 높은 유전체 변이를 발굴하여 혁신적인 치료제 개발 및 산업화를 통한 새로운 부가가치 창출에 기여하고 있다. 차세대 염기서열 분석법은 DNA 뿐만 아니라 RNA 및 메틸화 (Methylation) 해독에도 응용될 수 있으며, 이 중에는 단백질을 코25딩하는 엑솜(Exome) 영역만을 포획(Capture)하여 시퀀싱하는 전장 엑솜 시퀸싱(Whole-exome sequencing, WES)이 존재한다. 이 방법은 질병의 발생과 가장 직접적인 관련성을 가지는 단백질을 코딩하는 영역만을 시퀀싱하는 방법으로, 비용 측면이나 효율성면에서 전장 유전체를 시퀀싱하는 것보다는 엑솜 영역만을 시퀀싱하는 것이 유리하기 때문에 널리 이용되고 있다. 엑솜 시퀀싱 방법을 변형하여 원하는 유전자 영역만을 캡처하는 프로브를 제작하여 해당 영역의 유전체 변이를 검출할 수 있는 방법을 사용한다면 적은 비용으로 원하는 주요 암 유전자의 유전체 변이 검출을 용이하게 수행할 수 있다. 이러한 시퀀싱 방법을 Targeted sequencing이라고 한다.
이러한 차세대 염기서열 분석기법을 이용할 경우, 샘플 내에 존재하는 모든 핵산을 분석할 수 있으므로, 원하는 샘플의 농도가 매우 낮은 cfdDNA의 분석에 매우 유용하다는 것이 알려져 있으며, 예를 들어 Iwijin De Vlaminck 등은 65명의 심장 이식 환자에서 시간에 걸쳐 획득한 565개의 샘플을 분석한 결과, 장기 이식 거부 반응이 나타나게 되면, 수혜자의 샘플 내에서 cfdDNA의 비율이 증가한다고 발표하였다(Iwijin De Vlaminck et al., Sci. Transl. Med. Vol. 6, 241ra77, 2014).
하지만 상기 방법은 심장 특이적으로 마커를 사용하고, 모든 샘플을 분석하여 시간과 비용이 매우 많이 소모되는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 표1의 마커를 100bp미만으로 증폭하여 차세대 염기서열분석을 수행할 경우, cfDNA를 sample 그대로 이용할 수 있음과 동시에 민감도와 정확성은 유지되고, 시간 및 비용은 크게 감소하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 제공한다:
장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3 이상의 마커 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 제공한다:
장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3 이상의 마커 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
시간에 걸쳐 상기 비율을 측정하여, 기증자 유래 마커 서열의 비율이 증가하면 장기 이식 거부 반응(transplant rejection), 이식 기능 장애(graft dysfunction) 또는 장기 부전(organ failure) 인 것으로 예측하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템을 제공한다:
장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서,
상기 생체시료는 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유하고,
상기 연산은 상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3이상의 마커 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하여 얻은 데이터를 수신하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계;
상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계 및;
이러한 비교에 기초하여, 수혜자의 장이 이식 거부 반응이 존재하는지 여부를 예측하는 단계.
도 1은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법에 대한 개념도이다. 환자로부터 비침습적으로 획득한 생체 시료(예를 들면 혈액)에서, 순환 세포 유리 DNA(circulating cell free DNA)를 분리한다. 엄선된 마커 세트에 대하여 mutliplexed PCR로 증폭한 샘플을 짧은 판독 차세대 염기서열 분석기법(short read length next generation sequencing)으로 분석하여, 각 마커 대립인자에 대하여 비율을 계수(count)하여 장기 이식 거부 반응을 예측한다.
도 2는 하나의 마커에 대하여 설계한 프라이머를 통해 증폭하여 분석할 경우, 원하는 SNP site가 프라이머의 바로 뒤에 존재하여 NGS의 속도가 매우 빠르게 수행될 수 있다는 것을 나타내는 예시이다.
도 3은 표1에서 선택되는 2023개의 마커에 대하여 장기이식 조건을 인위적으로 만들기 위해 DNA를 혼합하여 이식 수혜자에서 기증자의 SNP 마커 비율을 측정한 분석 결과이다.
도 4는 각각의 SNP 마커 별로, 인위적으로 혼합한 DNA 샘플에서의 측정값을 나타낸 결과이다.
발명의 효과
본 발명에 따른 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법은, 매우 적은 양의 샘플에도 적용 가능하고, 신속하고 저렴하며, 엄선된 마커를 사용하므로 데이터 분석의 속도가 빠르고, 전세계 모든 인종의 모든 장기 이식에 적용 가능하며 서열분석 에러레이트를 동시에 검출할 수 있어, 비침습적으로 장기 이식 거부 반응을 예측하는데 유용하다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서의 용어 “차세대 염기서열 분석기법”은 Next generation sequencing 또는 NGS를 의미하는 것이다. 이는 전장유전체(Whole genome)를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 대용량으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미하고, Agilent, Illumina, Roche 및 Life Technologies사의 기술을 포함하고, 넓은 의미로는 제3세대 기술인 Pacificbio, Nanopore Technology 등의 기술 및 제 4세대 기술을 포함하는 것으로 정의한다.
본 발명에서의 용어 “장기 이식 거부 반응”은 급성 및 만성 장기 이식 거부 반응을 모두 포함한다. “급성 장기 이식 거부 반응(Acute rejection, AR)”은 기증자의 장기가 수혜자의 면역 시스템에 의해 외부의 것이라고 판단될 때 일어난다. 급성 장기 이식 거부 반응은 이식 받은 장기에 수혜자의 면역 세포가 침투하여, 이식 받은 장기를 결과적으로 파괴하는 것으로 정의된다. 이는 매우 빠르게 일어나며, 보통 장기 이식 수술이후, 몇 주안에 발생하게 된다. 일반적으로 급성 장기 이식 거부 반응은 rampamycin, cyclosprin A, anti-CD4 monoclonal antibody 등과 같은 면역억제제에 의해 억제되거나 저해될 수 있다. “만성 장기 이식 거부 반응(Chronic transplant rejection, CR)”은 일반적으로 장기 이식 후, 몇 달 또는 몇 년 이내에 발생한다. 모든 종류의 만성 장기 이식 거부 반응에서 장기의 섬유화는 공통적으로 발생하는 현상이며, 각 장기별로 기능의 저하가 발생하게 된다. 예를 들어, 폐를 이식 받았는데 만성 장기 이식 거부 반응이 발생하면, 기도가 파괴되는 섬유화 반응이 일어나 폐렴이 발생하게 된다(bronchiolitis obliterans). 또 심장 이식을 받았는데 만성 장기 이식 거부 반응이 발생하면, 경동맥경화증(fibrotic atherosclerosis)가 발생하게 되고, 신장 이식을 받았는데 만성 장기 이식 거부 반응이 발생하게 되면 폐색성 신장병(obstructive nephropathy), 신경화증(nephrosclerosis), 신세뇨관 간질 신병증 (tubulointerstitial nephropathy) 등이 발생하게 된다. 만성 장기 이식 거부 반응은 또한, 허혈성 공격(ischemic insult), 이식받은 장기의 신경제거(denervation), 면역 억제제와 관련된 고지혈증 및 고혈압 증상으로 나타나기도 한다.
본 발명에서의 용어 “생체 시료”는 수혜자(recipeint)로부터 입수되고, 관심있는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 임의의 시료를 의미한다.
본 발명에서의 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 의미한다. 달리 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합특성을 갖고 천연 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 기재되지 않은 한, 특정 핵산 서열은 또한 명확히 기재된 서열뿐만 아니라 암묵적으로 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들면, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오소로그, SNP 및 상보적 서열을 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환이 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al, MoI. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 상기 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 작은 비코딩 RNA, 마이크로 RNA(miRNA), 피위상호작용(Piwi-interacting) RNA 및 유전자 또는 유전자좌에 의해 코딩된 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)와 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서의 용어 “단일염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)”는 하나의 종내 다수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 말하는 것이다. 예를 들어, 장기 이식 기증자(donor)의 염색체 13에 존재하는 rs7988514 마커는 C/G인데, 장기 이식 수혜자(recipient)의 마커는 T/A일 경우, 본 발명의 방법을 사용하여 수혜자의 혈액에서 기증자의 마커 비율을 분석하여, 장기 이식 거부 반응을 예측하는데 사용할 수 있다.
본 발명에서의 용어 “컷오프 값”은 생체 시료에 대해 2 이상의 상태(예를 들면, 정상 상태 및 장기 이식 거부 반응 상태) 간의 분류의 중재에 사용되는 수치를 의미한다. 예를 들면, 수혜자의 혈액에서 기증자의 마커 비율이 컷오프 값보다 큰 경우, 수혜자는 장기 이식 거부 반응 상태로 분류 되고, 또는 수혜자의 혈액에서 기증자의 마커 비율이 컷오프 값보다 작은 경우, 수혜자는 정상 상태로 분류된다.
본 발명에서는 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3 이상의 마커를 사용하여 수혜자로부터 획득한 생체 시료를 짧은 판독 차세대 염기서열 분석기법(short read length next generation sequencing) 또는 디지털 염기 증폭 방식으로 분석할 경우(도 1), 생체 시료에서 장기 이식 거부 반응을 높은 정확도로 빠르게 예측할 수 있는 것을 확인하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3 이상의 마커 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 있어서, 상기 표 1 내지 표 10의 마커 서열은 단일염기 다형성(SNP)의 특징이 bi-allelic이고, 하디바인베르크 분포(Hardy-Weinberg distribution)를 만족하며 minor allele frequency(소대립유전자 비율)가 0.4 이상인 단일염기 다형성 마커인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표 1 내지 표 10의 마커 번호(rs숫자)는 NCBI의 dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)에서 검색할 수 있는 reference SNP number인 것을 특징으로 할 수 있다.
표 1 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs1000160 rs1483303 rs2296122 rs3773445 rs6565831 rs899968 rs9978408
rs1000501 rs1491658 rs2296348 rs377685 rs6565969 rs904654 rs9979609
rs1002460 rs1495816 rs2297256 rs378108 rs6565990 rs906629 rs9980589
rs1003092 rs1495965 rs2297291 rs3786203 rs6566067 rs912441 rs9980734
rs10035179 rs1498553 rs2298437 rs3786355 rs6566186 rs912697 rs9980852
rs10048391 rs1501230 rs2298583 rs3787732 rs6566286 rs914163 rs9980934
rs10048862 rs1501233 rs2318993 rs3788190 rs6566554 rs914231 rs9981016
rs10049125 rs1501871 rs2320747 rs3788200 rs6566669 rs914232 rs9982310
rs10057967 rs1506008 rs232374 rs378872 rs6566675 rs914532 rs9982473
rs1006757 rs1508494 rs232381 rs3795494 rs6566862 rs915800 rs9983057
rs10069510 rs1511151 rs2328975 rs379605 rs6567221 rs915876 rs9983351
rs1007300 rs1512473 rs2329327 rs3802981 rs6579927 rs918823 rs9983568
rs10074004 rs1518036 rs2330396 rs3803196 rs659897 rs924895 rs9984531
rs10075717 rs1519126 rs2330572 rs3805015 rs660207 rs926130 rs9985011
rs10078065 rs1526589 rs2332023 rs3806 rs660236 rs928299 rs9985019
rs10083274 rs1530330 rs2332026 rs3809346 rs660622 rs9285110 rs9985057
rs10085762 rs153119 rs2332240 rs3810590 rs660811 rs9285254 rs999104
rs1009823 rs153283 rs233616 rs3817 rs661100 rs9285297
rs10098835 rs1532846 rs233621 rs3819177 rs661293 rs9292170
rs1010392 rs1533434 rs2337483 rs3826616 rs662792 rs9300377
rs1010559 rs1535904 rs234787 rs3844038 rs6650458 rs9300518
rs1013059 rs1536780 rs235310 rs384901 rs6650723 rs9300569
rs10140137 rs1536807 rs235329 rs3850193 rs665479 rs9300647
rs1014209 rs1542578 rs236043 rs3853682 rs6662560 rs9300921
rs1014604 rs1545310 rs2362839 rs385501 rs6678950 rs9301149
rs1015820 rs1549060 rs2366188 rs3856791 rs6680365 rs9301441
rs10158288 rs1553108 rs2388919 rs3864997 rs671441 rs9301695
rs10164030 rs1553295 rs2390878 rs3865418 rs673220 rs930189
rs1018676 rs1554936 rs2390998 rs3865419 rs674929 rs9303869
rs10210 rs1556817 rs239340 rs3866900 rs6762432 rs9303900
rs10222177 rs1560669 rs2395891 rs386838 rs6769917 rs9304336
표 2 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs1058396 rs1682914 rs2571764 rs4268850 rs703505 rs946228 rs10915584
rs10742709 rs1690551 rs2575177 rs428424 rs7062 rs946231 rs10935501
rs10744938 rs169332 rs2576036 rs4284535 rs706466 rs949741 rs1757889
rs1075906 rs16943649 rs2576038 rs4284740 rs7067226 rs949931 rs17591231
rs1077550 rs16950864 rs2581732 rs429133 rs7067297 rs950408 rs277665
rs10780042 rs16951141 rs2585481 rs430043 rs7099777 rs9506275 rs2779134
rs10781417 rs16951664 rs2585495 rs4306614 rs7139787 rs9506919 rs445593
rs10790400 rs16978368 rs2586776 rs431864 rs7139997 rs9507577 rs4456612
rs1079139 rs16980558 rs2586778 rs4319623 rs7140005 rs9507631 rs7234111
rs1079174 rs16980586 rs2586779 rs432294 rs714831 rs950772 rs7234383
rs10799636 rs16980588 rs2587428 rs4329028 rs716117 rs9508080 rs9521192
rs10840837 rs17041964 rs25876 rs4346468 rs716510 rs9508327 rs952134
rs10851201 rs17069898 rs2591518 rs4346469 rs7186326 rs9508716 rs10903035
rs10853392 rs17070149 rs2628125 rs4349043 rs7206898 rs9509249 rs10915311
rs10853603 rs17071467 rs2641114 rs4349054 rs721247 rs9509441 rs1754514
rs10854400 rs17080696 rs2641962 rs435081 rs7226953 rs9509516 rs17550441
rs10856953 rs17084208 rs2687899 rs4372773 rs7226979 rs9510334 rs2776341
rs10858469 rs170962 rs269286 rs4375553 rs7227268 rs9510340 rs2776344
rs10866988 rs17184424 rs2699323 rs4380323 rs7228099 rs9510597 rs4452046
rs10869149 rs1720839 rs271374 rs438064 rs7228812 rs9510775 rs4454841
rs10869157 rs17232531 rs271397 rs4383238 rs7229278 rs9512046 rs7233802
rs10870724 rs17248234 rs2729429 rs4384683 rs7229644 rs9512063 rs7233985
rs10870932 rs1725235 rs2736084 rs4389803 rs7229967 rs9514560 rs9520400
rs10871180 rs17307670 rs273696 rs439146 rs722998 rs9514663 rs9521146
rs10871550 rs17326281 rs273701 rs4398676 rs7230288 rs9515124
rs10871620 rs1734848 rs2747740 rs4402665 rs7230661 rs9515621
rs10871641 rs17351137 rs275948 rs4402842 rs7230860 rs9515774
rs10871815 rs17363863 rs2762171 rs4407150 rs7231029 rs9516644
rs10875612 rs174047 rs2764618 rs4409964 rs7231046 rs9516904
rs10880836 rs1748124 rs2765327 rs4428160 rs7231112 rs9518743
rs10889256 rs17513940 rs2774494 rs4430618 rs7231366 rs9518903
rs10889523 rs17518254 rs2775138 rs4440160 rs7232672 rs9518972
rs10899035 rs17533 rs2775537 rs444435 rs7233515 rs9520132
표 3 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs10937406 rs17591266 rs2780746 rs446716 rs7234990 rs9521472 rs11151454
rs10937408 rs17686332 rs2782462 rs4468699 rs7235005 rs9521488 rs11151514
rs10942130 rs17711702 rs2783084 rs448247 rs7235160 rs9521801 rs1790428
rs10955093 rs1772587 rs2786712 rs448503 rs7235654 rs9521832 rs1790584
rs10955174 rs17740268 rs2793734 rs4495668 rs7235891 rs9521853 rs2825610
rs10955420 rs1774918 rs2793736 rs4497518 rs7235930 rs9522262 rs2825688
rs10972552 rs17754863 rs2794243 rs4508511 rs7235989 rs9523648 rs466448
rs1102617 rs17765723 rs2794247 rs4510132 rs7236090 rs9524400 rs467140
rs1105513 rs17781378 rs2803220 rs451826 rs7236427 rs9525095 rs7277441
rs1105856 rs1778797 rs2803348 rs4520729 rs7236653 rs9525149 rs7277926
rs11069237 rs17794801 rs2807441 rs4522508 rs7237517 rs9525158 rs9532436
rs11071215 rs1779843 rs2821796 rs4525375 rs7237577 rs9525300 rs9533146
rs11080646 rs17800754 rs2822618 rs4539677 rs7237747 rs9525641 rs11151426
rs11081004 rs17804894 rs2822648 rs4544336 rs7237774 rs9525643 rs11151452
rs11081037 rs1783099 rs2822661 rs455508 rs7239234 rs9526222 rs1788648
rs11081555 rs1783305 rs2822809 rs455921 rs723940 rs9526312 rs1788658
rs11082705 rs1783395 rs2822965 rs4573787 rs7240004 rs9526400 rs2825583
rs11083008 rs1783404 rs2822973 rs4576968 rs7240257 rs9526792 rs2825608
rs11083386 rs17836226 rs2822975 rs458029 rs7240294 rs9527084 rs4661514
rs1108522 rs1785739 rs2823145 rs4583369 rs7240363 rs9527138 rs466277
rs11088040 rs1785745 rs2823152 rs4588087 rs7240404 rs9527905 rs7276176
rs11088302 rs1786388 rs2823169 rs4588273 rs7240429 rs9528696 rs7277076
rs11088405 rs1786427 rs2823795 rs4611350 rs7241051 rs9528931 rs9531615
rs11088861 rs1786648 rs2823809 rs4613170 rs7241461 rs9529287 rs9532420
rs11096435 rs1787013 rs2823983 rs4617713 rs7241510 rs9529809
rs11096453 rs1787186 rs2824133 rs461853 rs7241718 rs9529814
rs1111937 rs1787292 rs2824238 rs4628 rs7242966 rs9530505
rs11135235 rs1787301 rs2824376 rs4638449 rs7243620 rs9530604
rs1114342 rs1787337 rs2824762 rs4650520 rs7244347 rs9530721
rs11148802 rs1787435 rs2825516 rs4653036 rs7245332 rs9530981
rs11150946 rs1787557 rs2825560 rs465353 rs725040 rs953109
rs11151009 rs1787577 rs2825576 rs465446 rs7260507 rs9531243
rs11151180 rs1788002 rs2825578 rs4661295 rs7275842 rs9531587
표 4 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs11151657 rs1790649 rs2825824 rs4677496 rs7278004 rs9533177 rs11662474
rs11151684 rs1790875 rs2826117 rs4685212 rs7278137 rs9533397 rs11662612
rs11151698 rs1792668 rs2826259 rs4686407 rs7278676 rs9533738 rs1890306
rs11151892 rs1792674 rs2826390 rs4687889 rs7279020 rs9534174 rs1891132
rs11152060 rs1792687 rs2826392 rs468837 rs7279626 rs9534262 rs2828798
rs11152170 rs1806487 rs2826395 rs468849 rs7280367 rs9534330 rs2828800
rs11152242 rs1807783 rs2826396 rs469303 rs7280538 rs9534515 rs4799055
rs11152264 rs1808693 rs2826399 rs469353 rs7280591 rs9534596 rs4799198
rs11164166 rs1810129 rs2826506 rs470490 rs7280941 rs9534638 rs732569
rs11167694 rs1817141 rs2826718 rs4747351 rs7281206 rs9535880 rs7326426
rs11208377 rs1819894 rs2826721 rs4750494 rs7281674 rs9536346 rs9545554
rs1125807 rs1826318 rs2826737 rs4757240 rs728174 rs9536415 rs9545559
rs1143914 rs1829651 rs2826803 rs4761518 rs7281853 rs9538268 rs11661072
rs1145560 rs1830926 rs2826807 rs4770032 rs7282582 rs9538278 rs11661849
rs1146888 rs1832265 rs2826949 rs4770463 rs7282876 rs9539175 rs1888469
rs1152991 rs1833277 rs2826959 rs4770597 rs7283077 rs9539877 rs1888514
rs1153294 rs1833304 rs2827038 rs4770601 rs7283399 rs9539893 rs2828506
rs1153295 rs1833486 rs2827433 rs4770771 rs729809 rs9540071 rs2828793
rs1156026 rs1834545 rs2827527 rs4771157 rs7304820 rs9540450 rs4798412
rs115750 rs1834547 rs2827528 rs4771638 rs7310809 rs9540451 rs4798479
rs11595762 rs1851043 rs2827530 rs4771695 rs7317338 rs9540627 rs7325068
rs11617291 rs1854100 rs2827874 rs4771833 rs7317341 rs9540642 rs7325529
rs11617562 rs1855259 rs2827965 rs4771904 rs7317430 rs9541479 rs9545224
rs11617606 rs1864469 rs2827987 rs4772278 rs7319926 rs9541813 rs9545244
rs11618168 rs1866337 rs2828001 rs4772857 rs7319976 rs9542105
rs11619265 rs1866986 rs2828023 rs4772937 rs7320145 rs9542137
rs11619462 rs1870592 rs2828055 rs4773212 rs7321115 rs9542383
rs11620473 rs1874864 rs2828061 rs4773395 rs7321584 rs9542852
rs11659206 rs1874921 rs2828089 rs4773402 rs7322458 rs9542951
rs11659463 rs1876583 rs2828151 rs4773838 rs7322868 rs9542969
rs11659969 rs188446 rs2828155 rs4784207 rs7323182 rs9543171
rs11660213 rs1886969 rs2828263 rs4784376 rs7323558 rs9544749
rs11660737 rs1887718 rs2828500 rs4796869 rs7324970 rs9544845
표 5 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs11664190 rs1891948 rs2828802 rs4799910 rs7326820 rs9545852 rs12184876
rs11664478 rs189204 rs2829066 rs4800786 rs7326944 rs9545853 rs12185460
rs11664727 rs1892681 rs2829115 rs4800967 rs7327180 rs9545861 rs1970678
rs11665106 rs1893455 rs2829214 rs4800970 rs7327256 rs9545903 rs1972415
rs11665385 rs1893654 rs2829432 rs4800973 rs7327729 rs9546633 rs2833935
rs11701849 rs1893657 rs2829445 rs4816597 rs7329520 rs9546677 rs2834208
rs11701901 rs1893673 rs2829614 rs4816610 rs7330025 rs9547087 rs4886217
rs11702340 rs1895076 rs2829674 rs4816681 rs7331003 rs9547646 rs4890312
rs1176270 rs1898165 rs2829887 rs4817097 rs7331794 rs9548869 rs9561936
rs1183856 rs1904177 rs2830048 rs4817371 rs7332180 rs9548880 rs9561953
rs11839815 rs1908593 rs2830194 rs4817609 rs7333280 rs9548930 rs1217618
rs11872146 rs1910660 rs2830424 rs4817685 rs7333503 rs9549172 rs1218307
rs11872403 rs191482 rs2830437 rs4817890 rs7333648 rs9549293 rs195700
rs11872509 rs1920083 rs2830604 rs4817891 rs733398 rs9551135 rs1970668
rs11872828 rs1923732 rs2830643 rs4818015 rs7334111 rs9551233 rs2833846
rs11873161 rs1923771 rs2830811 rs4818108 rs7334546 rs9551406 rs2833916
rs11876001 rs1923886 rs2830841 rs4818144 rs7334805 rs9552733 rs4885878
rs11876772 rs1924417 rs2830856 rs4818160 rs7335163 rs9552874 rs4885880
rs11877050 rs1925857 rs2831057 rs4818179 rs7335426 rs9553022 rs735862
rs11877617 rs1926264 rs2831350 rs4818561 rs7335836 rs9553390 rs736081
rs11910048 rs1926614 rs2831378 rs4819090 rs7335944 rs9554579 rs9561532
rs11910807 rs1926616 rs2831699 rs4819128 rs7336089 rs9554641 rs9561935
rs11910832 rs1927014 rs2831702 rs4819130 rs733610 rs9555119
rs11919425 rs1927807 rs2831706 rs4819201 rs7336348 rs9555266
rs11939712 rs1927830 rs2831755 rs4835587 rs7336658 rs9555581
rs11948061 rs1930586 rs2832155 rs483712 rs7337326 rs9555714
rs11959584 rs1932917 rs2832236 rs4841972 rs7337382 rs9556425
rs11960564 rs1933187 rs2832916 rs4845953 rs7337528 rs9560166
rs12018498 rs1937443 rs2833117 rs486285 rs7337915 rs9560339
rs12020398 rs1942399 rs2833123 rs487812 rs7338544 rs9560797
rs12037545 rs1942531 rs2833153 rs4884402 rs7339162 rs9560800
rs12136961 rs1942803 rs2833523 rs4884905 rs7339250 rs9560807
rs12149 rs1949593 rs2833636 rs4884906 rs734747 rs9561254
표 6 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs12185828 rs1972598 rs2834295 rs4890333 rs742276 rs9562045 rs12584118
rs12287199 rs1972917 rs2834297 rs4890698 rs743446 rs9562457 rs12584427
rs1231048 rs1979613 rs2834337 rs4890876 rs7441242 rs9562501 rs2027667
rs12326252 rs1980080 rs2834339 rs4891097 rs747781 rs9562637 rs2031446
rs12327010 rs1980942 rs2834694 rs4891098 rs748607 rs9563028 rs2836404
rs1236411 rs1980950 rs2834709 rs4891160 rs7504436 rs9563770 rs2836488
rs12420519 rs1981084 rs2834712 rs4891325 rs7504842 rs9564167 rs4941643
rs12427782 rs1981390 rs2834756 rs4891576 rs7509953 rs9564355 rs4941715
rs12428610 rs1982837 rs2834782 rs4891734 rs7544781 rs9564535 rs7735484
rs12428798 rs1986899 rs2834796 rs4907464 rs754777 rs9564577 rs7799930
rs12454023 rs1988657 rs2834884 rs4907552 rs756040 rs9564626 rs9574824
rs12454180 rs1991753 rs2834908 rs4910359 rs760345 rs9564747 rs9574897
rs12454706 rs1993355 rs2835035 rs4911045 rs7614 rs9564791 rs12583161
rs12455429 rs199667 rs2835043 rs4920104 rs7616178 rs9565398 rs12583202
rs12456484 rs1997353 rs2835103 rs4920520 rs7618973 rs9565654 rs2026744
rs12457067 rs1998956 rs2835104 rs492338 rs762173 rs9565661 rs2027605
rs12457191 rs2000416 rs2835121 rs492346 rs762227 rs9565968 rs2836338
rs12458066 rs2000490 rs2835169 rs492597 rs7624098 rs9566836 rs2836358
rs12458637 rs2000833 rs2835293 rs4927236 rs7624366 rs9567448 rs4941183
rs12458713 rs2004000 rs2835349 rs492781 rs762438 rs9567700 rs4941388
rs12482086 rs2005187 rs2835567 rs4939701 rs7626725 rs9568497 rs7728402
rs12482146 rs2006089 rs2835695 rs4939702 rs7633784 rs9568684 rs7733022
rs12482714 rs200680 rs2835704 rs4939735 rs7634577 rs9568713 rs9573927
rs12482786 rs2009879 rs2835722 rs4940009 rs7639145 rs9569550 rs9574740
rs12483578 rs2012898 rs2835723 rs4940235 rs7639867 rs9570226
rs12490235 rs2012982 rs2835735 rs4940498 rs7651989 rs9570290
rs12513430 rs2013669 rs2835790 rs4940563 rs765557 rs9570447
rs12514412 rs2014509 rs2835802 rs4940615 rs7661729 rs9571811
rs1253809 rs2014678 rs2835823 rs4940791 rs7702862 rs9571821
rs1253811 rs2018093 rs2835955 rs4940955 rs7711972 rs9572020
rs12561781 rs2019006 rs2835965 rs4940957 rs7716283 rs9572196
rs12565445 rs2025951 rs2835971 rs4940960 rs7717101 rs9572308
rs125810 rs2026263 rs2835975 rs4941085 rs7721965 rs9573824
표 7 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs12585235 rs2031546 rs2836656 rs4941939 rs7807853 rs9574898 rs12960453
rs12586094 rs2032313 rs2836661 rs4942060 rs7822979 rs9574900 rs12961253
rs12604515 rs203332 rs2836706 rs4942169 rs7831906 rs9575364 rs2104632
rs12604519 rs2037920 rs2836837 rs4942242 rs7856187 rs9575369 rs2111299
rs12605543 rs2037921 rs2836840 rs4942416 rs786018 rs9575372 rs2837751
rs12605917 rs2039056 rs2836842 rs4942486 rs7914609 rs9579214 rs2837801
rs12605932 rs2039281 rs2836943 rs4942642 rs794185 rs9581121 rs525776
rs12606001 rs2039622 rs2836956 rs4942769 rs7967526 rs9583190 rs526057
rs12626853 rs2043428 rs2836958 rs4942830 rs797517 rs9583537 rs7997078
rs12626876 rs2044800 rs2836975 rs4942931 rs7981995 rs9583996 rs7997881
rs12627315 rs2046845 rs2836980 rs4943119 rs7982563 rs958687 rs977660
rs12627610 rs2051121 rs2836985 rs4943694 rs7982833 rs9592665 rs9783885
rs12627745 rs2051189 rs2837129 rs4943696 rs7983168 rs9593922 rs12959212
rs12630707 rs2051382 rs2837302 rs4949256 rs7983218 rs9597134 rs12960451
rs12637291 rs2057529 rs2837381 rs495737 rs7984225 rs9600079 rs2099255
rs12659620 rs2058276 rs2837393 rs496627 rs7984261 rs9601268 rs2100750
rs12724092 rs2059757 rs2837395 rs4986223 rs7984523 rs9601567 rs2837738
rs1274749 rs2060816 rs2837399 rs4989135 rs7984835 rs9604328 rs2837747
rs12756081 rs2063222 rs2837403 rs499416 rs7986681 rs9617452 rs522505
rs1276034 rs2065280 rs2837411 rs4998815 rs7988095 rs962267 rs524566
rs12763013 rs2065288 rs2837490 rs500910 rs7988209 rs9634593 rs7995700
rs128365 rs2067741 rs2837494 rs501062 rs7989235 rs9636883 rs7996275
rs1284419 rs2068051 rs2837512 rs5023173 rs798963 rs9636977 rs970705
rs12858753 rs2070535 rs2837529 rs508151 rs7989798 rs9637300 rs975336
rs12859190 rs2071754 rs2837553 rs509215 rs7990298 rs9646522
rs12864209 rs2073425 rs2837592 rs509741 rs7992072 rs9646629
rs12876644 rs2076237 rs2837637 rs512699 rs7992416 rs9647139
rs12925084 rs208932 rs2837655 rs513775 rs7993087 rs9647235
rs12936110 rs2090036 rs2837701 rs514556 rs7993804 rs9647276
rs12953319 rs2094186 rs2837705 rs514669 rs7994585 rs9652107
rs12955787 rs2096507 rs2837712 rs515391 rs7994654 rs9675925
rs12957246 rs2096905 rs2837717 rs515551 rs7995283 rs9676063
rs12957256 rs2097096 rs2837736 rs515920 rs7995306 rs968906
표 8 본원 발명에서 사용하는 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs12961631 rs2113462 rs2837865 rs532095 rs7997893 rs9785659 rs1326056
rs12961741 rs2115980 rs2838004 rs532625 rs7997966 rs9785716 rs13275667
rs12961750 rs2116378 rs2838081 rs535923 rs7998641 rs9785897 rs2187091
rs12962651 rs211962 rs2838104 rs536419 rs7999126 rs9786101 rs2188584
rs12963212 rs2120204 rs2838125 rs537435 rs7999812 rs9786111 rs2849977
rs12963466 rs212315 rs2838304 rs545723 rs8000390 rs9786121 rs2850125
rs12965753 rs2136681 rs2838361 rs550801 rs8001960 rs9786140 rs608382
rs12966281 rs2137492 rs2838438 rs556046 rs8002541 rs9786194 rs608713
rs12966492 rs214054 rs2838441 rs558700 rs803815 rs9786276 rs8091446
rs12967515 rs214341 rs2838568 rs559372 rs8083067 rs9786291 rs8091825
rs12967616 rs2146442 rs2838724 rs560169 rs8083437 rs9786386 rs9909561
rs12968141 rs2148443 rs2838799 rs561418 rs8083682 rs9786773 rs991045
rs12968648 rs2149436 rs2838806 rs569216 rs8084206 rs9786824 rs1325798
rs12969413 rs2150419 rs2838813 rs575936 rs8084711 rs9786876 rs1325968
rs12969725 rs2151277 rs2838815 rs5761308 rs8084792 rs9786885 rs2183557
rs12971228 rs2154487 rs2838820 rs5764891 rs8085054 rs9788296 rs2186557
rs13046156 rs2154549 rs2838887 rs576808 rs8085056 rs9789153 rs2849697
rs13046342 rs2154550 rs2838890 rs578835 rs8085222 rs9805596 rs2849865
rs1304747 rs2154723 rs2838893 rs581394 rs8086286 rs9805694 rs607127
rs13049234 rs2155797 rs2839287 rs582547 rs8086449 rs9805804 rs6072085
rs13049853 rs2156187 rs2839377 rs582853 rs8086752 rs9813365 rs8091123
rs13050660 rs2156384 rs2839386 rs585632 rs8086807 rs9818400 rs8091380
rs13052088 rs2156650 rs2839392 rs591173 rs8087052 rs982328 rs9891988
rs13087163 rs2160043 rs2839468 rs591498 rs8087127 rs9828270 rs990557
rs13152923 rs2161775 rs2839470 rs593340 rs8087403 rs9835007
rs13159598 rs2166029 rs2839508 rs595106 rs8087551 rs9837159
rs13162651 rs2174524 rs2839520 rs596778 rs8087849 rs9845467
rs13163878 rs2174571 rs2842906 rs599551 rs8088596 rs984659
rs13168731 rs2174896 rs28468602 rs599881 rs8088779 rs985035
rs13178296 rs2178841 rs2848957 rs6014601 rs8088832 rs985198
rs13200025 rs2178848 rs2848958 rs602212 rs8089359 rs9853755
rs1323556 rs2181753 rs2848961 rs6047745 rs8089613 rs9861671
rs1325453 rs2182957 rs2849253 rs607020 rs8090831 rs9869577
표 9 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs1328368 rs2198683 rs2850542 rs6108022 rs8092218 rs993930 rs1378492
rs1328926 rs220128 rs2852146 rs612573 rs8092926 rs9944568 rs1378800
rs13304168 rs220149 rs2861624 rs6137476 rs8094161 rs9945284 rs2246422
rs13304202 rs220171 rs28649411 rs614290 rs8094280 rs9945648 rs2247021
rs1331948 rs220268 rs287355 rs616669 rs8095071 rs9945969 rs3121808
rs1331951 rs2203754 rs2873580 rs619542 rs8095250 rs9947210 rs3127637
rs1333023 rs2205533 rs2878293 rs625028 rs8095514 rs9947426 rs6492589
rs1333027 rs2206747 rs2878901 rs625090 rs8095747 rs9947829 rs6506138
rs1333072 rs2211681 rs2885243 rs626519 rs8096263 rs9948368 rs8131559
rs1334384 rs2211845 rs2887596 rs627527 rs8096542 rs9948679 rs8132424
rs1335282 rs2211869 rs2892463 rs628221 rs8096605 rs9948733 rs9959180
rs1335787 rs2211938 rs2897977 rs630706 rs8096830 rs9948841 rs9959555
rs1335788 rs2211973 rs2901821 rs6311 rs8097023 rs9948974 rs1370079
rs13380936 rs2212624 rs2921452 rs632324 rs8097306 rs9949020 rs1377341
rs13381153 rs2212626 rs293105 rs632678 rs8097433 rs9949323 rs2245411
rs13381188 rs2212809 rs2933307 rs632683 rs8097467 rs9949565 rs2246122
rs1340312 rs2212828 rs2941782 rs632986 rs8097792 rs9949574 rs3106603
rs1340333 rs2217442 rs2946523 rs634293 rs8097822 rs9949868 rs3118045
rs1340562 rs2222370 rs2953258 rs634760 rs8098182 rs9949882 rs6492379
rs13433508 rs2222999 rs2953261 rs639862 rs8098925 rs9950906 rs6492586
rs1345492 rs2223079 rs2969931 rs640254 rs8099616 rs9951809 rs8130781
rs1348466 rs2226356 rs2993502 rs641366 rs8099832 rs9951893 rs8131481
rs1349094 rs2226358 rs2997116 rs6426721 rs8127266 rs9952107 rs9958812
rs1349936 rs2226798 rs3011522 rs6439686 rs8127332 rs9952148 rs9958938
rs13503 rs2226859 rs3014944 rs6442180 rs8127569 rs9952357
rs1351407 rs2236483 rs3015419 rs645539 rs8127634 rs9952908
rs13554 rs2236944 rs3019879 rs645699 rs8128478 rs9953136
rs1358368 rs2241585 rs304838 rs6469456 rs8128523 rs9954012
rs1361029 rs2242661 rs306395 rs6483561 rs8128650 rs9954208
rs1361768 rs2242752 rs3091601 rs6490683 rs8129332 rs9954439
rs1364416 rs2242753 rs3096835 rs6490713 rs8129919 rs9955860
rs1365251 rs2243936 rs3101866 rs6490946 rs8130292 rs9957425
rs1369348 rs2244188 rs3106556 rs6491350 rs8130587 rs9957591
표 10 본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs1379823 rs2247221 rs3171532 rs6506332 rs8132865 rs9959597 rs1472406
rs1380332 rs2248218 rs326046 rs6506837 rs8132870 rs9959723 rs1473279
rs1382394 rs2249360 rs328125 rs6507196 rs8133195 rs9960454 rs1474092
rs1385338 rs2250226 rs329027 rs6507440 rs8134612 rs9961499 rs1478526
rs1389561 rs2250494 rs331018 rs6507719 rs8134986 rs9963406 rs2284636
rs1390431 rs2250926 rs331020 rs6507783 rs8181861 rs9963983 rs2287434
rs1412819 rs2251085 rs334458 rs6507967 rs8184900 rs9964749 rs2289152
rs1412822 rs2251210 rs336214 rs6508168 rs825977 rs9964911 rs229441
rs1413021 rs2252046 rs336279 rs6508266 rs844974 rs9964940 rs375484
rs1413158 rs2252776 rs340966 rs6508351 rs844975 rs9965174 rs375886
rs1413435 rs2252828 rs341237 rs6508502 rs844978 rs9965410 rs3760582
rs1415019 rs225383 rs341499 rs651029 rs844986 rs9965900 rs377191
rs1417313 rs225396 rs341506 rs651407 rs844990 rs9966050 rs6562599
rs1417907 rs2254368 rs347128 rs6516794 rs844999 rs9966798 rs6562888
rs1421182 rs2255059 rs349714 rs6516819 rs845015 rs9967142 rs6563329
rs1424406 rs2255332 rs352247 rs6517605 rs845017 rs9967277 rs6565830
rs1430378 rs2256000 rs35379414 rs6518100 rs845018 rs9967440 rs892430
rs1430381 rs2256417 rs355708 rs6518252 rs845022 rs9967534 rs894050
rs1437650 rs2269145 rs367841 rs652539 rs845024 rs996906 rs896036
rs1442134 rs2269161 rs369906 rs6550169 rs845969 rs9974136 rs898484
rs1445728 rs2269173 rs372883 rs6550215 rs857569 rs997416 rs9976426
rs1446770 rs2274328 rs373037 rs655209 rs858044 rs9974225 rs9977055
rs1447740 rs2274403 rs3736867 rs6555064 rs863075 rs9974317 rs9977610
rs1451940 rs2274463 rs3736972 rs6561105 rs864674 rs9974879 rs9977815
rs1452670 rs2274774 rs3737893 rs6561326 rs875625 rs9974970
rs1455514 rs2276218 rs3742188 rs6561605 rs876165 rs9975304
rs1455872 rs2277798 rs3744877 rs6561644 rs877786 rs9975452
rs1464236 rs2279962 rs3744998 rs6561709 rs877856 rs9975831
rs1465509 rs2281767 rs3746897 rs6561727 rs878971 rs997587
rs1467756 rs2284214 rs3746924 rs6561900 rs883868 rs9976123
rs1471171 rs2284514 rs3751405 rs6561924 rs888789 rs9976168
본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열은 각각의 SNP site에 대하여 하기의 표 11과 같은 유전자형을 가질 수 있고, 이에 따라 어떤 SNP 조합(빨강)은 장기 이식 거부 반응 예측에 유용한 정보를 제공하지 못할 수 있으며, 어떤 SNP 조합(노랑 및 초록)은 유용한 정보를 제공할 수 있고, 이는 전적으로 기증자 및 수혜자의 SNP 유전자의 무작위 분포에 따라 결정되는 것을 특징으로 할 수 있다.
표 11 선별된 마커 세트를 이용해 분석 시, 예상되는 기증자/수혜자의 SNP 조합
기증자/수혜자 X:X X:Y Y:Y
X:X: NI MI HI
X:Y HI NI HI
Y:Y HI MI NI
HI: Highly Informative
MI: Moderately Informative
NI: No Informative
예를 들어, 45%의 minor allele frequency를 가지는 SNP 마커 조합을 분석에 이용할 경우, 하디바인베르크 평형에 의해 계산한 기증자 및 수혜자의 각 대립유전자별 비율을 계산하면 하기 표 3과 같다.
표 12 Minor allele frequency 45%인 SNP 마커 조합을 이용해 분석시 예상되는 대립 유전자 비율
X=55% Y=45% X:X (30%) X:Y (49%) Y:Y (21%)
X:X (30%) 9.0% 14.7% 6.3%
X:Y (49%) 14.7% 24.0% 10.3%
Y:Y (21%) 6.3% 10.3% 4.4%
HIGH 37.6%, MEDIUM 25.0%, LOW 37.4%
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열을 증폭하는 단계는 표 1 내지 표 10에 개시된 마커 서열을 추가로 모두 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 표 1 내지 표 10의 마커 별로, 서열분석 결과 기증자 유래 마커 서열의 양과 수혜자 유래 마커 서열의 양의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 사용되는 NGS platform은 대부분 100bp 크기의 서열 조각을 분석하는 데 최적화 되어 있다. NGS platform을 선택할 때, 고려해야 할 요소는 한 번에 읽을 수 있는 판독의 길이, 기본 에러 레이트, 분석 속도 및 반응 효율 등이다.
본 발명에서는, 상기 요소들을 최적화 하기 위하여 상기 표 1 내지 표 10의 마커를 증폭할 경우, 원하는 SNP 사이트는 서열 분석 시작지점으로부터 35bp이내에 존재하게 되며, 증폭되는 마커 서열도 평균 70bp인 것을 확인하였다(도 2).
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 생체 시료의 증폭된 마커 서열은 200bp 미만인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 마커는 bi-allelic SNP site이므로, 위치와 기대되는 염기서열 값이 모두 알려져 있는 마커를 분석하는 것이므로, 그 위치의 염기서열이 알려진 값과 다를 경우(예를 들어, G/T로 읽혀야 하는데 A가 읽힘), 이는 에러로 카운트 할 수 있다.
도 3에서 표시된 바와 같이 본 발명의 방법으로 2023개의 마커에 대하여 분석한 결과, 에러 레이트도 손쉽게 계산 가능하다는 것을 확인 할 수 있었다.
따라서 본 발명에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 에러 비율도 같이 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 컷오프 값은 정상 생체 시료에서 확립된 참조 값인 예측 방법인 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 장기 이식 거부 반응의 경우, 장기를 이식 받은 수혜자에서 시간에 따라, 기증자의 DNA 양의 변화를 관찰함으로서 거부 반응을 예상 할 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 장기를 이식 받은 수혜자에서 생체 시료를 장기 이식 받기 전, 받은 직후, 그 뒤 일정 시간 간격에 따라 획득한 후, 이를 분석한 결과, 장기 이식 거부 반응이 나타날 때는 기증자의 SNP 마커 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3 이상의 마커 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
시간에 걸쳐 상기 비율을 측정하여, 기증자 유래 마커 서열의 비율이 증가하면 장기 이식 거부 반응(transplant rejection), 이식 기능 장애(graft dysfunction) 또는 장기 부전(organ failure) 인 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열을 증폭하는 단계는 표 1 내지 표 10에 개시된 마커 서열을 추가로 모두 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 표 1 내지 표 10의 마커 별로, 서열분석 결과 기증자 유래 마커 서열의 양과 수혜자 유래 마커 서열을 양의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 에러 비율도 같이 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체 시료의 증폭된 마커 서열은 200bp 미만인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시간은, 이에 한정되지 않으나, 장기 이식 전, 장기 이식 직후 및 장기 이식 후 하루, 이틀, 일주일, 한 달, 두 달, 세 달, 1년, 2년 및 10년으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서,
상기 생체시료는 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유하고,
상기 연산은 상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3이상의 마커 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하여 얻은 데이터를 수신하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계;
상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계 및;
이러한 비교에 기초하여, 수혜자의 장기 이식 거부 반응이 존재하는지 여부를 예측하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1:
인위적으로 만든 장기 이식 수혜자에서 장기 이식 거부 반응 예측
1.1 장기 이식 수혜자의 인위적인 DNA 샘플 제작 및 분석을 위한 전처리
남성 DNA와 (기증자) 여성 DNA (수여자)를 이용하여 여성 DNA에서의 남성 DNA 비율을 각각 0%, 0.625%, 1.25%, 2.5%, 5%, 10%로 혼합하여 인위적인 장기이식환자 genomic DNA sample을 만들었다.
각각의 gDNA 100 ng을 이용하여 TruSeq Custom Amplicon(TSCA) Assay (Illumina, USA)를 진행하기 위해 Custom Amplicon을 제작하였다. Heat block을 95℃로 맞추어 놓고 DNA 와 CAT(Custom Amplicon Oligo Tube)를 각각 5 ul씩 1.7 ml 튜브에 넣어주었다. 이때 control 시약인 ACD1과 ACP1도 5 ul 씩 함께 준비하였다. 그리고 각 그룹에 40 ul 씩 OHS1(Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1)씩 파이펫을 이용하여 잘 섞이도록 넣어주고 95℃, 1 min 후 온도를 40℃로 맞추어 주고 80min 동안 Oligo Hybridization 반응을 시켰다. 온도가 내려간 것을 확인한 뒤에 FPU(Filter Plate Unit) plate membrane에 SW1(stringent Wash 1) 시약 45 ul 씩 넣어주고 원심분리기에 넣어 2,400 x g, 20℃, 10min 하여 전처리 준비를 마치고, Hybridization을 마친 샘플튜브를 spin-down한 뒤 파이펫을 이용하여 FPU plate로 옮긴 후, 2,400 x g, 20℃, 2min하고 SW1 시약을 45 ul 넣어 2번 세척과정을 반복하고, UB1(Universal Buffer 1)시약 45 ul씩 넣고 동일한 조건에서 원심 분리하여 반응 하지 않은 Unbound Oligo를 제거하였다.
Hybridized Oligo의 Extension-Ligation을 위하여 ELM3(Extention-Ligation Mix 3)를 45 ul씩 넣고 호일을 씌워서 37℃ incubator 에서 45 min 반응 시켰다. 반응을 마치면 호일을 제거하고 2,400 x g, 2 min 원심분리 한 뒤에 미리 만들어 놓은 50 mM NaOH를 25ul씩 넣고 파이펫으로 5-6차례 파이펫팅 하고 5분간 room temperature에서 반응시켰다. 반응 시간 동안에 PMM2/TDP1(PCR Mster Mix 2 / TruSeq DNA Polymerase 1) Mixture를 만들어 P5, P7index가 각각 4 ul씩 담긴 PCR tube에 넣어주었다. 반응을 마친 NaOH 에 녹은 DNA 20 ul를 혼합하여 총 50 ul의 PCR Amplification 샘플준비를 마치고 아래 조건의 PCR program으로 반응시켰다.
<PCR 조건>
-95℃, 3min
-28 cycles
95℃, 30sec
66℃, 30sec
72℃, 60sec
-72℃, 5min
-Hold at 10℃
반응을 마친 샘플은 QIAxcel 장비를 이용하여 밴드를 확인하고 60 ul의 bead를 이용한 purification과정을 거쳐 30 ul의 Resuspention Buffer(RS)를 수득하였다.
1.2 장기 이식 수혜자의 인위적인 DNA 샘플 분석
상기 샘플은 시퀀싱 장비를 이용하여 염기서열을 밝혀낼 수 있고, 해당 Maker들을 counting하여 자체 알고리즘과 파이프라인을 통하여 장기이식 거부반응에 대한 모니터링이 가능함을 확인할 수 있었다(도 3 및 도4).
차세대 염기 해독 장치 (Next Generation Sequencing)를 통해서 얻은 SNP 마커에 대응하는 각각의 allele의 수를 그래프에 표시하되, 가로축에는 다수 대립유전자 (Reference allele 또는 Major allele)counting 수, 세로축에는 소수 대립유전자 (Alternate allele 또는 Minor allele) counting 수를 log2값으로 취하여 표시하였다 (도 3). 특히 본 SNP 마커는 염색체 13, 18, 21번에 위치한 SNP만을 선별한 것이어서, 각각 파랑(●), 초록(■), 빨강(×)으로 색깔과 표시를 이용하여 구분하였다(도 3).
하단의 표로 볼 수 있듯이 본 혼합된 DNA의 표현형은 총 9가지로 나올 수 있다.
표 13 혼합된(장기이식 환자) DNA의 표현형들
M F AA Aa aa
AA AAAA AAAa AAaa
Aa AaAA AaAa Aaaa
aa aaAA aaAa aaaa
인위적으로 만든 DNA 표현형은 AA, Aa, aA, aa로 나타날 수 있으므로 그 분포가 8가지 경우로 나타날 수 있다 (AAaa, aaAA는 같은 표현형으로 간주). 기증자의 DNA가 많아질수록 AaAA, Aaaa 분포가 일정한 비율로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
도 3에서 기재된 바와 같이, 기증자의 바이오마커의 혼합정도에 의해 분포도가 바뀌는 것을 확인 할 수 있다. 이 분포도를 정량적으로 측정 계산하여 공여자의 혈액 내에 존재하는 미세한 양의 기증자의 유전자를 검출하거나 측정할 수 있고, 기증자의 유전자 변이의 양을 측정하고 관찰함으로서 장기이식 거부반응을 예측 또는 관찰 할 수 있다.
또한, 표 14에 개시된 바와 같이 다른 비율로 두 개의 혼합한 DNA를 실제로 차세대 염기서열 분석 방식으로 측정하면, 차세대 염기서열의 바이오 마커를 정량적으로 분석하여 혼합된 DNA 양을 아주 낮은 양에서도 정확하게 측정 할 수 있는 것을 확인 하였다.
표 14 각각의 혼합된 DNA양의 실험적인 비율과 SNP counting을 이용한 비율
Background(0%) 10% 5% 2.50% 1.25% 0.63%
Fraction Homo 0.001395983 0.221443 0.123786 0.063688 0.035009 0.015802
Fraction Hetero 0.001495645 0.110112 0.060944 0.032425 0.017551 0.010921
Actual Fraction 22.08% 12.28% 6.43% 3.51% 1.88%
이와 같은 맥락으로 각각의 인위적으로 혼합된 기증자의 AA와 aa에 해당하는 염기를 counting하면 다음 표 14와 같이 수치화 할 수 있다. 실험상 혼합된 DNA 수치와 분석을 통하여 나온 수치와는 약 2배 차이가 있으나, 측정한 DNA 양은 절대량이 아니므로 차이가 날 수 있다.
도 4에 개시된 바와 같이, 각각의 마커는 개별적인 차이를 보여주고 있지만 여러 개의 마커를 사용 시 아주 정확하게 측정하거나 관찰할수 있다.
실제 환자에 적용 시 시간별로 기증자의 DNA를 수치화 할 수 있으며, 장기이식에 대한 거부반응을 모니터링 할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 방법은 비침습적으로 장기 이식 거부 반응을 예측 또는 모니터링 할 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (15)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법:
    장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
    상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3 이상의 마커 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 분석하는 단계;
    이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
    상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액인 예측 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 마커 서열을 증폭하는 단계는 표 1 내지 표 10에 개시된 마커 서열을 추가로 모두 증폭하는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 표1의 마커 별로, 서열분석 결과 기증자 유래 마커 서열의 양과 수혜자 유래 마커 서열의 양의 비율인 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 에러 비율도 같이 계산하는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생체 시료의 증폭된 마커 서열은 200bp 미만인 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 컷오프 값은 정상 생체 시료에서 확립된 참조 값인 예측 방법.
  8. 다음의 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법:
    장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
    상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1 내지 표 10에서 선택되는 3 이상의 마커 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭방식을 이용하여 분석하는 단계;
    이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
    시간에 걸쳐 상기 비율을 측정하여, 기증자 유래 마커 서열의 비율이 증가하면 장기 이식 거부 반응(transplant rejection), 이식 기능 장애(graft dysfunction) 또는 장기 부전(organ failure) 인 것으로 예측하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액인 예측 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 마커 서열을 증폭하는 단계는 표 1 내지 표 10에 개시된 마커 서열을 추가로 모두 증폭하는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 표1의 마커 별로, 서열분석 결과 기증자 유래 마커 서열의 양과 수혜자 유래 마커 서열을 양의 비율인 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 에러 비율도 같이 계산하는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 생체 시료의 증폭된 마커 서열은 200bp 미만인 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 시간은, 장기 이식 전, 장기 이식 직후 및 장기 이식 후 하루, 이틀, 일주일, 한 달, 두 달, 세 달, 1년, 2년 및 10년으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  15. 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서,
    상기 생체시료는 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유하고,
    상기 연산은 상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 내지 표 10에서 선택되는 3이상의 마커 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하여 얻은 데이터를 수신하는 단계;
    이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계;
    상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계 및;
    이러한 비교에 기초하여, 수혜자의 장기 이식 거부 반응이 존재하는지 여부를 예측하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템.
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