KR20160122563A - 차세대 염기서열 분석기법을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 장기 이식 수혜자(recipient)의 생체 시료에서 장기 기증자(donor) 및 수혜자(recipient) 특이적 핵산 서열 간의 비율을 측정하여 장기 이식 거부반응을 비침습적으로 예측하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장기 이식 수혜자의 생체 시료(예를 들면, 혈액)의 검사를 통해 표1에서 선택되는 3이상의 마커에 대하여, 기증자 유래 마커 서열 및 수혜자 유래 마커 서열의 비율을 측정하고, 이를 바탕으로 장기 이식 거부반응을 예측하는 방법 관한 것이다.
본 발명에 따른 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법은, 매우 적은 양의 샘플에도 적용 가능하고, 신속하고 저렴하며, 데이터 분석의 속도가 빠르고, 전세계 모든 인종의 모든 장기 이식에 적용 가능하며 서열분석 에러 확률을 동시에 검출할 수 있어, 비침습적으로 장기 이식 거부 반응을 예측하는데 유용하다.

Description

차세대 염기서열 분석기법을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법{Method for predicting transplantation rejection using next generation sequencing}
본 발명은 장기 이식 수혜자(recipient)의 생체 시료에서 장기 기증자(donor) 및 수혜자(recipient) 특이적 핵산 서열 간의 비율을 측정하여 장기 이식 거부반응을 비침습적으로 예측하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장기 이식 수혜자의 생체 시료(예를 들면, 혈액)의 검사를 통해 기증자 유래 마커 서열 및 수혜자 유래 마커 서열의 비율을 측정하고, 이를 바탕으로 장기 이식 거부반응을 예측하는 방법 관한 것이다.
정확하고 시기적절한 장기 이식 거부 반응에 대한 진단은 장기 이식 수혜자의 생존에 필수적인 요소이다. 그러나 현재 사용되고 있는 장기이식 거부반응 분석방법은 많은 단점이 있다. 예를 들어, 심장 이식 거부반응을 분석하기 위한 골드 스탠다드(gold standard)는 각 시기별 조직검사인데, 심상 조직 검사를 위해서는 수술이 동반되어야 하며, 높은 비용, 조직 검사 의사별 다양성(variability) 및 심각한 환자의 불편함 등의 문제가 있다(F. Saraiva et al., Transplant. Proc. Vol. 43, pp. 1098-1012, 2011). 이를 해결하기 위하여, 장기 이식 거부 반응 발생 시, 증가하는 유전자 발현 신호, 면역 단백질 양의 측정 등과 같은 비침습적인 방법이 사용되었으나, 상기 방법들은 다양한 면역 반응의 복잡한 교차 반응성 때문에 위양성이 높고, 조직 특이성을 가지는 유전자 발현 신호에 기반을 두고 있다는 단점이 있다.
1990년대 후반에 장기 이식 수혜자의 소변 및 혈액에 장기 기증자(donor)로부터 유래한 세포 유리 핵산(Cell-free donor-derived DNA, cfdDNA)이 존재한다는 것이 알려졌으며(J. Zhang et al., Clin. CHem. Vol. 45, pp. 1741-1746, 1999., Y. M. Lo et al., Lancet, Vol. 351, pp. 1329-1330, 1998), 이를 이용하여 비침습적으로 장기 이식 거부반응을 분석하는 방법이 제시되어 왔다. 예를 들어, 남성 기증자로부터 장기를 이식받은 여성 수혜자의 경우, 기증자 특이적 DNA는 Y 염색체를 검출하는 여러 가지 분자화학적인 방법을 이용하여 분석할 수 있다(T. K. Sigdel et al., Transplantation, Vol. 96, pp. 97-101, 2013.). 그러나 이러한 cfdDNA는 막대한 양의 background DNA에 비하여 매우 적은 양이 존재하여, 이를 분석하기 위한 특이성과 민감도가 높은 방법이 필요한 실정이다.
이러한 문제점을 해결할 수 있는 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing: NGS)이 많은 사람들의 관심을 받고 있다. 차세대 염기서열 분석 기술은 기존의 방법과 달리 대용량의 데이터를 빠른 시간에 생산할 수 있으므로 개인 유전체 해독에 필요한 시간과 비용을 획기적으로 절감시킨 기술이다. 차세대 염기서열 분석 기술은 시간이 지남에 따라 시퀀싱 플랫폼은 발전하고 분석 가격은 점점 저렴해지고 있으며 멘델성 유전질환과 희귀질환, 암 등에서 차세대 염기서열 분석법을 이용해 질병의 원인 유전자를 찾는데 성공하고 있다. 차세대 염기서열 분석법은 검체로부터 DNA를 추출한 이후 기계적으로 조각화(fragmentation) 시킨 이후 특정 크기를 가지는 라이브러리(library)를 제작하여 시퀀싱에 사용한다. 대용량 시퀀싱 장비를 사용하여 한 개의 염기단위로 4가지 종류의 상보적 뉴클레오타이드(nucleotide) 결합 및 분리 반응을 반복하면서 초기 시퀀싱 데이터를 생산하게 되고, 이후에 초기 데이터의 가공(Trimming), 매핑(Mapping), 유전체 변이의 동정 및 변이 정보의 해석(Annotation) 등 생물적보학(Bioinformatics)을 이용한 분석 단계를 수행하여 질병 및 다양한 생물학적 형태(phenotype)에 영향을 미치거나 가능성이 높은 유전체 변이를 발굴하여 혁신적인 치료제 개발 및 산업화를 통한 새로운 부가가치 창출에 기여하고 있다. 차세대 염기서열 분석법은 DNA 뿐만 아니라 RNA 및 메틸화 (Methylation) 해독에도 응용될 수 있으며, 이 중에는 단백질을 코25딩하는 엑솜(Exome) 영역만을 포획(Capture)하여 시퀀싱하는 전장 엑솜 시퀸싱(Whole-exome sequencing, WES)이 존재한다. 이 방법은 질병의 발생과 가장 직접적인 관련성을 가지는 단백질을 코딩하는 영역만을 시퀀싱하는 방법으로, 비용 측면이나 효율성면에서 전장 유전체를 시퀀싱하는 것보다는 엑솜 영역만을 시퀀싱하는 것이 유리하기 때문에 널리 이용되고 있다. 엑솜 시퀀싱 방법을 변형하여 원하는 유전자 영역만을 캡처하는 프로브를 제작하여 해당 영역의 유전체 변이를 검출할 수 있는 방법을 사용한다면 적은 비용으로 원하는 주요 암 유전자의 유전체 변이 검출을 용이하게 수행할 수 있다. 이러한 시퀀싱 방법을 Targeted sequencing이라고 한다.
이러한 차세대 염기서열 분석기법을 이용할 경우, 샘플 내에 존재하는 모든 핵산을 분석할 수 있으므로, 원하는 샘플의 농도가 매우 낮은 cfdDNA의 분석에 매우 유용하다는 것이 알려져 있으며, 예를 들어 Iwijin De Vlaminck 등은 65명의 심장 이식 환자에서 시간에 걸쳐 획득한 565개의 샘플을 분석한 결과, 장기 이식 거부 반응이 나타나게 되면, 수혜자의 샘플 내에서 cfdDNA의 비율이 증가한다고 발표하였다(Iwijin De Vlaminck et al., Sci. Transl. Med. Vol. 6, 241ra77, 2014).
하지만 상기 방법은 심장 특이적으로 마커를 사용하고, 모든 샘플을 분석하여 시간과 비용이 매우 많이 소모되는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 표1의 마커를 200bp 미만으로 증폭하여 차세대 염기서열분석을 수행할 경우, cfDNA를 sample 그대로 이용할 수 있음과 동시에 민감도와 정확성은 유지되고, 시간 및 비용은 크게 감소하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3 이상의마커 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3 이상의마커 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
시간에 걸쳐 상기 비율을 측정하여, 기증자 유래 마커 서열의 비율이 증가하면 장기 이식 거부 반응(transplant rejection), 이식 기능 장애(graft dysfunction) 또는 장기 부전(organ failure) 인 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을제공한다.
본 발명은 또한, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서,
상기 생체시료는 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유하고,
상기 연산은 상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3이상의 마커 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하여 얻은 데이터를 수신하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계;
상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계 및;
이러한 비교에 기초하여, 수혜자의 장이 이식 거부 반응이 존재하는지 여부를 예측하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템을 제공한다.
본 발명에 따른 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법은, 매우 적은 양의 샘플에도 적용 가능하고, 신속하고 저렴하며, 엄선된 마커를 사용하므로 데이터 분석의 속도가 빠르고, 전세계 모든 인종의 모든 장기 이식에 적용 가능하며 서열분석 에러레이트를 동시에 검출할 수 있어, 비침습적으로 장기 이식 거부 반응을 예측하는데 유용하다.
도 1은 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법에 대한 개념도이다. 환자로부터 비침습적으로 획득한 생체 시료(예를 들면 혈액)에서, 순환 세포 유리 DNA(circulating cell free DNA)를 분리한다. 엄선된 마커 세트에 대하여 mutliplexed PCR로 증폭한 샘플을 짧은 판독 차세대 염기서열 분석기법(short read length next generation sequencing)으로 분석하여, 각 마커 대립인자에 대하여 비율을 계수(count)하여 장기 이식 거부 반응을 예측한다.
도 2는 하나의 마커에 대하여 설계한 프라이머를 통해 증폭하여 분석할 경우, 원하는 SNP site가 프라이머의 바로 뒤에 존재하여 NGS의 속도가 매우 빠르게 수행될 수 있다는 것을 나타내는 예시이다.
도 3은 표1에서 선택되는 2023개의 마커에 대하여 장기이식 조건을 인위적으로 만들기 위해 DNA를 혼합하여 이식 수혜자에서 기증자의 SNP 마커 비율을 측정한 분석 결과이다.
도 4는 각각의 SNP 마커 별로, 인위적으로 혼합한 DNA 샘플에서의 측정값을 나타낸 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서의 용어 “차세대 염기서열 분석기법”은 Next generation sequencing 또는 NGS를 의미하는 것이다. 이는 전장유전체(Whole genome)를 조각내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 대용량으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미하고, Agilent, Illumina, Roche 및 Life Technologies사의 기술을 포함하고, 넓은 의미로는 제3세대 기술인 Pacificbio, Nanopore Technology 등의 기술 및 제 4세대 기술을 포함하는 것으로 정의한다.
본 발명에서의 용어 “장기 이식 거부 반응”은 급성 및 만성 장기 이식 거부 반응을 모두 포함한다. “급성 장기 이식 거부 반응(Acute rejection, AR)”은 기증자의 장기가 수혜자의 면역 시스템에 의해 외부의 것이라고 판단될 때 일어난다. 급성 장기 이식 거부 반응은 이식 받은 장기에 수혜자의 면역 세포가 침투하여, 이식 받은 장기를 결과적으로 파괴하는 것으로 정의된다. 이는 매우 빠르게 일어나며, 보통 장기 이식 수술이후, 몇 주안에 발생하게 된다. 일반적으로 급성 장기 이식 거부 반응은 rampamycin, cyclosprin A, anti-CD4 monoclonal antibody 등과 같은 면역억제제에 의해 억제되거나 저해될 수 있다. “만성 장기 이식 거부 반응(Chronic transplant rejection, CR)”은 일반적으로 장기 이식 후, 몇 달 또는 몇 년 이내에 발생한다. 모든 종류의 만성 장기 이식 거부 반응에서 장기의 섬유화는 공통적으로 발생하는 현상이며, 각 장기별로 기능의 저하가 발생하게 된다. 예를 들어, 폐를 이식 받았는데 만성 장기 이식 거부 반응이 발생하면, 기도가 파괴되는 섬유화 반응이 일어나 폐렴이 발생하게 된다(bronchiolitis obliterans). 또 심장 이식을 받았는데 만성 장기 이식 거부 반응이 발생하면, 경동맥경화증(fibrotic atherosclerosis)가 발생하게 되고, 신장 이식을 받았는데 만성 장기 이식 거부 반응이 발생하게 되면 폐색성 신장병(obstructive nephropathy), 신경화증(nephrosclerosis), 신세뇨관 간질 신병증 (tubulointerstitial nephropathy) 등이 발생하게 된다. 만성 장기 이식 거부 반응은 또한, 허혈성 공격(ischemic insult), 이식받은 장기의 신경제거(denervation), 면역 억제제와 관련된 고지혈증 및 고혈압 증상으로 나타나기도 한다.
본 발명에서의 용어 “생체 시료”는 수혜자(recipeint)로부터 입수되고, 관심있는 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 임의의 시료를 의미한다.
본 발명에서의 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 의미한다. 달리 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합특성을 갖고 천연 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 기재되지 않은 한, 특정 핵산 서열은 또한 명확히 기재된 서열뿐만 아니라 암묵적으로 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들면, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오소로그, SNP 및 상보적 서열을 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환이 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al, MoI. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 상기 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 작은 비코딩 RNA, 마이크로 RNA(miRNA), 피위상호작용(Piwi-interacting) RNA 및 유전자 또는 유전자좌에 의해 코딩된 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)와 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서의 용어 “단일염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)”는 하나의 종내 다수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 말하는 것이다. 예를 들어, 장기 이식 기증자(donor)의 염색체 13에 존재하는 rs7988514 마커는 C/G인데, 장기 이식 수혜자(recipient)의 마커는 T/A일 경우, 본 발명의 방법을 사용하여 수혜자의 혈액에서 기증자의 마커 비율을 분석하여, 장기 이식 거부 반응을 예측하는데 사용할 수 있다.
본 발명에서의 용어 “컷오프 값”은 생체 시료에 대해 2 이상의 상태(예를 들면, 정상 상태 및 장기 이식 거부 반응 상태) 간의 분류의 중재에 사용되는 수치를 의미한다. 예를 들면, 수혜자의 혈액에서 기증자의 마커 비율이 컷오프 값보다 큰 경우, 수혜자는 장기 이식 거부 반응 상태로 분류 되고, 또는 수혜자의 혈액에서 기증자의 마커 비율이 컷오프 값보다 작은 경우, 수혜자는 정상 상태로 분류된다.
본 발명에서는 표 1에서 선택되는 3 이상의 마커를 사용하여 수혜자로부터 획득한 생체 시료를 짧은 판독 차세대 염기서열 분석기법(short read length next generation sequencing) 또는 디지털 염기 증폭 방식으로 분석할 경우(도 1), 생체 시료에서 장기 이식 거부 반응을 높은 정확도로 빠르게 예측할 수 있는 것을 확인하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3 이상의마커 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 있어서, 상기 표 1의 마커 서열은 단일염기 다형성(SNP)의 특징이 bi-allelic이고, 하디바인베르크 분포(Hardy-Weinberg distribution)를 만족하며 minor allele frequency(소대립유전자 비율)가 0.4 이상인 단일염기 다형성 마커인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표 1의 마커 번호(rs숫자)는 NCBI의 dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)에서 검색할 수 있는 reference SNP number인 것을 특징으로 할 수 있다.
본원 발명에서 사용한 마커
마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호 마커 번호
rs1000160 rs1483303 rs2296122 rs3773445 rs6565831 rs899968 rs9978408
rs1000501 rs1491658 rs2296348 rs377685 rs6565969 rs904654 rs9979609
rs1002460 rs1495816 rs2297256 rs378108 rs6565990 rs906629 rs9980589
rs1003092 rs1495965 rs2297291 rs3786203 rs6566067 rs912441 rs9980734
rs10035179 rs1498553 rs2298437 rs3786355 rs6566186 rs912697 rs9980852
rs10048391 rs1501230 rs2298583 rs3787732 rs6566286 rs914163 rs9980934
rs10048862 rs1501233 rs2318993 rs3788190 rs6566554 rs914231 rs9981016
rs10049125 rs1501871 rs2320747 rs3788200 rs6566669 rs914232 rs9982310
rs10057967 rs1506008 rs232374 rs378872 rs6566675 rs914532 rs9982473
rs1006757 rs1508494 rs232381 rs3795494 rs6566862 rs915800 rs9983057
rs10069510 rs1511151 rs2328975 rs379605 rs6567221 rs915876 rs9983351
rs1007300 rs1512473 rs2329327 rs3802981 rs6579927 rs918823 rs9983568
rs10074004 rs1518036 rs2330396 rs3803196 rs659897 rs924895 rs9984531
rs10075717 rs1519126 rs2330572 rs3805015 rs660207 rs926130 rs9985011
rs10078065 rs1526589 rs2332023 rs3806 rs660236 rs928299 rs9985019
rs10083274 rs1530330 rs2332026 rs3809346 rs660622 rs9285110 rs9985057
rs10085762 rs153119 rs2332240 rs3810590 rs660811 rs9285254 rs999104
rs1009823 rs153283 rs233616 rs3817 rs661100 rs9285297
rs10098835 rs1532846 rs233621 rs3819177 rs661293 rs9292170
rs1010392 rs1533434 rs2337483 rs3826616 rs662792 rs9300377
rs1010559 rs1535904 rs234787 rs3844038 rs6650458 rs9300518
rs1013059 rs1536780 rs235310 rs384901 rs6650723 rs9300569
rs10140137 rs1536807 rs235329 rs3850193 rs665479 rs9300647
rs1014209 rs1542578 rs236043 rs3853682 rs6662560 rs9300921
rs1014604 rs1545310 rs2362839 rs385501 rs6678950 rs9301149
rs1015820 rs1549060 rs2366188 rs3856791 rs6680365 rs9301441
rs10158288 rs1553108 rs2388919 rs3864997 rs671441 rs9301695
rs10164030 rs1553295 rs2390878 rs3865418 rs673220 rs930189
rs1018676 rs1554936 rs2390998 rs3865419 rs674929 rs9303869
rs10210 rs1556817 rs239340 rs3866900 rs6762432 rs9303900
rs10222177 rs1560669 rs2395891 rs386838 rs6769917 rs9304336
rs1022417 rs1563410 rs239677 rs3899318 rs677594 rs9305481
rs1022425 rs1567443 rs2404869 rs390 rs677675 rs9305582
rs1022461 rs1567612 rs2408381 rs3908747 rs6777784 rs9305620
rs1022554 rs1569538 rs2408982 rs3912319 rs6781197 rs9305711
rs1023113 rs1570614 rs2409416 rs3943258 rs6785780 rs9305712
rs10232758 rs1570736 rs2409520 rs394608 rs6792367 rs9305733
rs1023868 rs1571063 rs2409943 rs3991109 rs6796507 rs9306015
rs1025099 rs1571660 rs2410100 rs3998144 rs6798026 rs9313730
rs10252 rs1571671 rs241237 rs400187 rs6799546 rs9315761
rs1026123 rs1571719 rs241403 rs403093 rs680253 rs9316285
rs1027280 rs1571727 rs2419027 rs4048109 rs6806238 rs9316294
rs1029204 rs1573362 rs2419041 rs4058287 rs680840 rs9317034
rs1030133 rs1573409 rs2425427 rs407133 rs681190 rs9317536
rs1040313 rs1573442 rs242635 rs4085005 rs681903 rs9317566
rs10439045 rs1575518 rs243594 rs409989 rs683109 rs9317588
rs1044910 rs1576602 rs243601 rs4101383 rs685553 rs9317882
rs10451160 rs1577342 rs2440196 rs4121787 rs6862930 rs9317963
rs10454522 rs1578490 rs244187 rs4128646 rs6864481 rs9318974
rs10460155 rs1579272 rs2448796 rs4132047 rs6864800 rs9319651
rs10461609 rs1582619 rs2455146 rs413245 rs6869688 rs9319766
rs1046310 rs1591135 rs2472150 rs4132695 rs6873382 rs9319895
rs10467643 rs1593579 rs2477912 rs413285 rs687781 rs9319971
rs10468983 rs1598439 rs2480530 rs4133291 rs6879470 rs9319973
rs10469140 rs1598441 rs2487257 rs41341253 rs689164 rs9321934
rs10470201 rs1598848 rs2497654 rs4143412 rs6892469 rs9324254
rs10478 rs1601002 rs2535310 rs4144407 rs689358 rs9325629
rs10489650 rs160106 rs2543034 rs4144559 rs6898467 rs934418
rs10493058 rs1605973 rs254763 rs4148542 rs6928101 rs9350450
rs10500828 rs160823 rs2554108 rs4148553 rs694182 rs9364939
rs10502290 rs1613854 rs2554136 rs4149609 rs6947796 rs939139
rs10502903 rs1616739 rs2554830 rs416083 rs694808 rs943049
rs10503032 rs1619903 rs256835 rs4239334 rs694935 rs943560
rs10506759 rs162379 rs2569188 rs4245302 rs69686 rs943799
rs10507416 rs166181 rs2569218 rs4246736 rs701112 rs943832
rs1051266 rs1662304 rs2571020 rs4253945 rs701286 rs944413
rs1051296 rs166936 rs2571021 rs425989 rs701565 rs944899
rs1054016 rs168020 rs2571030 rs4266927 rs701734 rs945972
rs1058396 rs1682914 rs2571764 rs4268850 rs703505 rs946228
rs10742709 rs1690551 rs2575177 rs428424 rs7062 rs946231
rs10744938 rs169332 rs2576036 rs4284535 rs706466 rs949741
rs1075906 rs16943649 rs2576038 rs4284740 rs7067226 rs949931
rs1077550 rs16950864 rs2581732 rs429133 rs7067297 rs950408
rs10780042 rs16951141 rs2585481 rs430043 rs7099777 rs9506275
rs10781417 rs16951664 rs2585495 rs4306614 rs7139787 rs9506919
rs10790400 rs16978368 rs2586776 rs431864 rs7139997 rs9507577
rs1079139 rs16980558 rs2586778 rs4319623 rs7140005 rs9507631
rs1079174 rs16980586 rs2586779 rs432294 rs714831 rs950772
rs10799636 rs16980588 rs2587428 rs4329028 rs716117 rs9508080
rs10840837 rs17041964 rs25876 rs4346468 rs716510 rs9508327
rs10851201 rs17069898 rs2591518 rs4346469 rs7186326 rs9508716
rs10853392 rs17070149 rs2628125 rs4349043 rs7206898 rs9509249
rs10853603 rs17071467 rs2641114 rs4349054 rs721247 rs9509441
rs10854400 rs17080696 rs2641962 rs435081 rs7226953 rs9509516
rs10856953 rs17084208 rs2687899 rs4372773 rs7226979 rs9510334
rs10858469 rs170962 rs269286 rs4375553 rs7227268 rs9510340
rs10866988 rs17184424 rs2699323 rs4380323 rs7228099 rs9510597
rs10869149 rs1720839 rs271374 rs438064 rs7228812 rs9510775
rs10869157 rs17232531 rs271397 rs4383238 rs7229278 rs9512046
rs10870724 rs17248234 rs2729429 rs4384683 rs7229644 rs9512063
rs10870932 rs1725235 rs2736084 rs4389803 rs7229967 rs9514560
rs10871180 rs17307670 rs273696 rs439146 rs722998 rs9514663
rs10871550 rs17326281 rs273701 rs4398676 rs7230288 rs9515124
rs10871620 rs1734848 rs2747740 rs4402665 rs7230661 rs9515621
rs10871641 rs17351137 rs275948 rs4402842 rs7230860 rs9515774
rs10871815 rs17363863 rs2762171 rs4407150 rs7231029 rs9516644
rs10875612 rs174047 rs2764618 rs4409964 rs7231046 rs9516904
rs10880836 rs1748124 rs2765327 rs4428160 rs7231112 rs9518743
rs10889256 rs17513940 rs2774494 rs4430618 rs7231366 rs9518903
rs10889523 rs17518254 rs2775138 rs4440160 rs7232672 rs9518972
rs10899035 rs17533 rs2775537 rs444435 rs7233515 rs9520132
rs10903035 rs1754514 rs2776341 rs4452046 rs7233802 rs9520400
rs10915311 rs17550441 rs2776344 rs4454841 rs7233985 rs9521146
rs10915584 rs1757889 rs277665 rs445593 rs7234111 rs9521192
rs10935501 rs17591231 rs2779134 rs4456612 rs7234383 rs952134
rs10937406 rs17591266 rs2780746 rs446716 rs7234990 rs9521472
rs10937408 rs17686332 rs2782462 rs4468699 rs7235005 rs9521488
rs10942130 rs17711702 rs2783084 rs448247 rs7235160 rs9521801
rs10955093 rs1772587 rs2786712 rs448503 rs7235654 rs9521832
rs10955174 rs17740268 rs2793734 rs4495668 rs7235891 rs9521853
rs10955420 rs1774918 rs2793736 rs4497518 rs7235930 rs9522262
rs10972552 rs17754863 rs2794243 rs4508511 rs7235989 rs9523648
rs1102617 rs17765723 rs2794247 rs4510132 rs7236090 rs9524400
rs1105513 rs17781378 rs2803220 rs451826 rs7236427 rs9525095
rs1105856 rs1778797 rs2803348 rs4520729 rs7236653 rs9525149
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rs1284419 rs2068051 rs2837512 rs5023173 rs798963 rs9636977
rs12858753 rs2070535 rs2837529 rs508151 rs7989798 rs9637300
rs12859190 rs2071754 rs2837553 rs509215 rs7990298 rs9646522
rs12864209 rs2073425 rs2837592 rs509741 rs7992072 rs9646629
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rs12925084 rs208932 rs2837655 rs513775 rs7993087 rs9647235
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rs12961741 rs2115980 rs2838004 rs532625 rs7997966 rs9785716
rs12961750 rs2116378 rs2838081 rs535923 rs7998641 rs9785897
rs12962651 rs211962 rs2838104 rs536419 rs7999126 rs9786101
rs12963212 rs2120204 rs2838125 rs537435 rs7999812 rs9786111
rs12963466 rs212315 rs2838304 rs545723 rs8000390 rs9786121
rs12965753 rs2136681 rs2838361 rs550801 rs8001960 rs9786140
rs12966281 rs2137492 rs2838438 rs556046 rs8002541 rs9786194
rs12966492 rs214054 rs2838441 rs558700 rs803815 rs9786276
rs12967515 rs214341 rs2838568 rs559372 rs8083067 rs9786291
rs12967616 rs2146442 rs2838724 rs560169 rs8083437 rs9786386
rs12968141 rs2148443 rs2838799 rs561418 rs8083682 rs9786773
rs12968648 rs2149436 rs2838806 rs569216 rs8084206 rs9786824
rs12969413 rs2150419 rs2838813 rs575936 rs8084711 rs9786876
rs12969725 rs2151277 rs2838815 rs5761308 rs8084792 rs9786885
rs12971228 rs2154487 rs2838820 rs5764891 rs8085054 rs9788296
rs13046156 rs2154549 rs2838887 rs576808 rs8085056 rs9789153
rs13046342 rs2154550 rs2838890 rs578835 rs8085222 rs9805596
rs1304747 rs2154723 rs2838893 rs581394 rs8086286 rs9805694
rs13049234 rs2155797 rs2839287 rs582547 rs8086449 rs9805804
rs13049853 rs2156187 rs2839377 rs582853 rs8086752 rs9813365
rs13050660 rs2156384 rs2839386 rs585632 rs8086807 rs9818400
rs13052088 rs2156650 rs2839392 rs591173 rs8087052 rs982328
rs13087163 rs2160043 rs2839468 rs591498 rs8087127 rs9828270
rs13152923 rs2161775 rs2839470 rs593340 rs8087403 rs9835007
rs13159598 rs2166029 rs2839508 rs595106 rs8087551 rs9837159
rs13162651 rs2174524 rs2839520 rs596778 rs8087849 rs9845467
rs13163878 rs2174571 rs2842906 rs599551 rs8088596 rs984659
rs13168731 rs2174896 rs28468602 rs599881 rs8088779 rs985035
rs13178296 rs2178841 rs2848957 rs6014601 rs8088832 rs985198
rs13200025 rs2178848 rs2848958 rs602212 rs8089359 rs9853755
rs1323556 rs2181753 rs2848961 rs6047745 rs8089613 rs9861671
rs1325453 rs2182957 rs2849253 rs607020 rs8090831 rs9869577
rs1325798 rs2183557 rs2849697 rs607127 rs8091123 rs9891988
rs1325968 rs2186557 rs2849865 rs6072085 rs8091380 rs990557
rs1326056 rs2187091 rs2849977 rs608382 rs8091446 rs9909561
rs13275667 rs2188584 rs2850125 rs608713 rs8091825 rs991045
rs1328368 rs2198683 rs2850542 rs6108022 rs8092218 rs993930
rs1328926 rs220128 rs2852146 rs612573 rs8092926 rs9944568
rs13304168 rs220149 rs2861624 rs6137476 rs8094161 rs9945284
rs13304202 rs220171 rs28649411 rs614290 rs8094280 rs9945648
rs1331948 rs220268 rs287355 rs616669 rs8095071 rs9945969
rs1331951 rs2203754 rs2873580 rs619542 rs8095250 rs9947210
rs1333023 rs2205533 rs2878293 rs625028 rs8095514 rs9947426
rs1333027 rs2206747 rs2878901 rs625090 rs8095747 rs9947829
rs1333072 rs2211681 rs2885243 rs626519 rs8096263 rs9948368
rs1334384 rs2211845 rs2887596 rs627527 rs8096542 rs9948679
rs1335282 rs2211869 rs2892463 rs628221 rs8096605 rs9948733
rs1335787 rs2211938 rs2897977 rs630706 rs8096830 rs9948841
rs1335788 rs2211973 rs2901821 rs6311 rs8097023 rs9948974
rs13380936 rs2212624 rs2921452 rs632324 rs8097306 rs9949020
rs13381153 rs2212626 rs293105 rs632678 rs8097433 rs9949323
rs13381188 rs2212809 rs2933307 rs632683 rs8097467 rs9949565
rs1340312 rs2212828 rs2941782 rs632986 rs8097792 rs9949574
rs1340333 rs2217442 rs2946523 rs634293 rs8097822 rs9949868
rs1340562 rs2222370 rs2953258 rs634760 rs8098182 rs9949882
rs13433508 rs2222999 rs2953261 rs639862 rs8098925 rs9950906
rs1345492 rs2223079 rs2969931 rs640254 rs8099616 rs9951809
rs1348466 rs2226356 rs2993502 rs641366 rs8099832 rs9951893
rs1349094 rs2226358 rs2997116 rs6426721 rs8127266 rs9952107
rs1349936 rs2226798 rs3011522 rs6439686 rs8127332 rs9952148
rs13503 rs2226859 rs3014944 rs6442180 rs8127569 rs9952357
rs1351407 rs2236483 rs3015419 rs645539 rs8127634 rs9952908
rs13554 rs2236944 rs3019879 rs645699 rs8128478 rs9953136
rs1358368 rs2241585 rs304838 rs6469456 rs8128523 rs9954012
rs1361029 rs2242661 rs306395 rs6483561 rs8128650 rs9954208
rs1361768 rs2242752 rs3091601 rs6490683 rs8129332 rs9954439
rs1364416 rs2242753 rs3096835 rs6490713 rs8129919 rs9955860
rs1365251 rs2243936 rs3101866 rs6490946 rs8130292 rs9957425
rs1369348 rs2244188 rs3106556 rs6491350 rs8130587 rs9957591
rs1370079 rs2245411 rs3106603 rs6492379 rs8130781 rs9958812
rs1377341 rs2246122 rs3118045 rs6492586 rs8131481 rs9958938
rs1378492 rs2246422 rs3121808 rs6492589 rs8131559 rs9959180
rs1378800 rs2247021 rs3127637 rs6506138 rs8132424 rs9959555
rs1379823 rs2247221 rs3171532 rs6506332 rs8132865 rs9959597
rs1380332 rs2248218 rs326046 rs6506837 rs8132870 rs9959723
rs1382394 rs2249360 rs328125 rs6507196 rs8133195 rs9960454
rs1385338 rs2250226 rs329027 rs6507440 rs8134612 rs9961499
rs1389561 rs2250494 rs331018 rs6507719 rs8134986 rs9963406
rs1390431 rs2250926 rs331020 rs6507783 rs8181861 rs9963983
rs1412819 rs2251085 rs334458 rs6507967 rs8184900 rs9964749
rs1412822 rs2251210 rs336214 rs6508168 rs825977 rs9964911
rs1413021 rs2252046 rs336279 rs6508266 rs844974 rs9964940
rs1413158 rs2252776 rs340966 rs6508351 rs844975 rs9965174
rs1413435 rs2252828 rs341237 rs6508502 rs844978 rs9965410
rs1415019 rs225383 rs341499 rs651029 rs844986 rs9965900
rs1417313 rs225396 rs341506 rs651407 rs844990 rs9966050
rs1417907 rs2254368 rs347128 rs6516794 rs844999 rs9966798
rs1421182 rs2255059 rs349714 rs6516819 rs845015 rs9967142
rs1424406 rs2255332 rs352247 rs6517605 rs845017 rs9967277
rs1430378 rs2256000 rs35379414 rs6518100 rs845018 rs9967440
rs1430381 rs2256417 rs355708 rs6518252 rs845022 rs9967534
rs1437650 rs2269145 rs367841 rs652539 rs845024 rs996906
rs1442134 rs2269161 rs369906 rs6550169 rs845969 rs9974136
rs1445728 rs2269173 rs372883 rs6550215 rs857569 rs997416
rs1446770 rs2274328 rs373037 rs655209 rs858044 rs9974225
rs1447740 rs2274403 rs3736867 rs6555064 rs863075 rs9974317
rs1451940 rs2274463 rs3736972 rs6561105 rs864674 rs9974879
rs1452670 rs2274774 rs3737893 rs6561326 rs875625 rs9974970
rs1455514 rs2276218 rs3742188 rs6561605 rs876165 rs9975304
rs1455872 rs2277798 rs3744877 rs6561644 rs877786 rs9975452
rs1464236 rs2279962 rs3744998 rs6561709 rs877856 rs9975831
rs1465509 rs2281767 rs3746897 rs6561727 rs878971 rs997587
rs1467756 rs2284214 rs3746924 rs6561900 rs883868 rs9976123
rs1471171 rs2284514 rs3751405 rs6561924 rs888789 rs9976168
rs1472406 rs2284636 rs375484 rs6562599 rs892430 rs9976426
rs1473279 rs2287434 rs375886 rs6562888 rs894050 rs9977055
rs1474092 rs2289152 rs3760582 rs6563329 rs896036 rs9977610
rs1478526 rs229441 rs377191 rs6565830 rs898484 rs9977815
본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열은 각각의 SNP site에 대하여 하기의 표 2와 같은 유전자형을 가질 수 있고, 이에 따라 어떤 SNP 조합(빨강)은 장기 이식 거부 반응 예측에 유용한 정보를 제공하지 못할 수 있으며, 어떤 SNP 조합(노랑 및 초록)은 유용한 정보를 제공할 수 있고, 이는 전적으로 기증자 및 수혜자의 SNP 유전자의 무작위 분포에 따라 결정되는 것을 특징으로 할 수 있다.
선별된 마커 세트를 이용해 분석시, 예상되는 기증자/수혜자의 SNP 조합
기증자/수혜자 X:X X:Y Y:Y
X:X NI MI HI HI Highly Informative
X:Y HI NI HI MI Moderately Informative
Y:Y HI MI NI NI No Informative
예를 들어, 45%의 minor allele frequency를 가지는 SNP 마커 조합을 분석에 이용할 경우, 하디바인베르크 평형에 의해 계산한 기증자 및 수혜자의 각 대립유전자별 비율을 계산하면 하기 표 3과 같다.
Minor allele frequency 45%인 SNP 마커 조합을 이용해 분석시 예상되는 대립 유전자 비율
X=55% Y=45% X:X (30%) X:Y (49%) Y:Y (21%)
X:X (30%) 9.0% 14.7% 6.3% HIGH 37.6%
X:Y (49%) 14.7% 24.0% 10.3% MEDIUM 25.0%
Y:Y (21%) 6.3% 10.3% 4.4% LOW 37.4%
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열을 증폭하는 단계는 표 1에 개시된 마커 서열을 추가로 모두 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 표1의 마커 별로, 서열분석 결과 기증자 유래 마커 서열의 양과 수혜자 유래 마커 서열의 양의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 사용되는 NGS platform은 대부분 100bp 크기의 서열 조각을 분석하는 데 최적화 되어 있다. NGS platform을 선택할 때, 고려해야 할 요소는 한 번에 읽을 수 있는 판독의 길이, 기본 에러 레이트, 분석 속도 및 반응 효율 등이다.
본 발명에서는, 상기 요소들을 최적화 하기 위하여 상기 표 1의 마커를 증폭할 경우, 원하는 SNP 사이트는 서열 분석 시작지점으로부터 35bp이내에 존재하게 되며, 증폭되는 마커 서열도 평균 70bp인 것을 확인하였다(도 2).
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 생체 시료의 증폭된 마커 서열은 200bp 미만인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 마커는 bi-allelic SNP site이므로, 위치와 기대되는 염기서열 값이 모두 알려져 있는 마커를 분석하는 것이므로, 그 위치의 염기서열이 알려진 값과 다를 경우(예를 들어, G/T로 읽혀야 하는데 A가 읽힘), 이는 에러로 카운트 할 수 있다.
도 3에서 표시된 바와 같이 본 발명의 방법으로 2023개의 마커에 대하여 분석한 결과, 에러 레이트도 손쉽게 계산 가능하다는 것을 확인 할 수 있었다.
따라서 본 발명에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 에러 비율도 같이 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 컷오프 값은 정상 생체 시료에서 확립된 참조 값인 예측 방법인 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 장기 이식 거부 반응의 경우, 장기를 이식 받은 수혜자에서 시간에 따라, 기증자의 DNA 양의 변화를 관찰함으로서 거부 반응을 예상 할 수 있을 것으로 예측하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 장기를 이식 받은 수혜자에서 생체 시료를 장기 이식 받기 전, 받은 직후, 그 뒤 일정 시간 간격에 따라 획득한 후, 이를 분석한 결과, 장기 이식 거부 반응이 나타날 때는 기증자의 SNP 마커 비율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3 이상의마커 서열을 증폭하는 단계;
상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
시간에 걸쳐 상기 비율을 측정하여, 기증자 유래 마커 서열의 비율이 증가하면 장기 이식 거부 반응(transplant rejection), 이식 기능 장애(graft dysfunction) 또는 장기 부전(organ failure) 인 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열을 증폭하는 단계는 표 1에 개시된 마커 서열을 추가로 모두 증폭하는 것을 특징으로 할 수 있다
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 표 1의 마커 별로, 서열분석 결과 기증자 유래 마커 서열의 양과 수혜자 유래 마커 서열을 양의 비율인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 에러 비율도 같이 계산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체 시료의 증폭된 마커 서열은 200bp 미만인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시간은, 이에 한정되지 않으나, 장기 이식 전, 장기 이식 직후 및 장기 이식 후 하루, 이틀, 일주일, 한 달, 두 달, 세 달, 1년, 2년 및 10년으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서,
상기 생체시료는 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유하고,
상기 연산은 상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3이상의 마커 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하여 얻은 데이터를 수신하는 단계;
이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계;
상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계 및;
이러한 비교에 기초하여, 수혜자의 장기 이식 거부 반응이 존재하는지 여부를 예측하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:
인위적으로 만든 장기 이식 수혜자에서 장기 이식 거부 반응 예측
1.1 장기 이식 수혜자의 인위적인 DNA 샘플 제작 및 분석을 위한 전처리
남성 DNA와 (기증자) 여성 DNA (수여자)를 이용하여 여성 DNA에서의 남성 DNA 비율을 각각 0%, 0.625%, 1.25%, 2.5%, 5%, 10%로 혼합하여 인위적인 장기이식환자 genomic DNA sample을 만들었다.
각각의 gDNA 100 ng을 이용하여 TruSeq Custom Amplicon(TSCA) Assay (Illumina, USA)를 진행하기 위해 Custom Amplicon을 제작하였다. Heat block을 95℃로 맞추어 놓고 DNA 와 CAT(Custom Amplicon Oligo Tube)를 각각 5 ul씩 1.7 ml 튜브에 넣어주었다. 이때 control 시약인 ACD1과 ACP1도 5 ul 씩 함께 준비하였다. 그리고 각 그룹에 40 ul 씩 OHS1(Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1)씩 파이펫을 이용하여 잘 섞이도록 넣어주고 95℃, 1 min 후 온도를 40℃로 맞추어 주고 80min 동안 Oligo Hybridization 반응을 시켰다. 온도가 내려간 것을 확인한 뒤에 FPU(Filter Plate Unit) plate membrane에 SW1(stringent Wash 1) 시약 45 ul 씩 넣어주고 원심분리기에 넣어 2,400 x g, 20℃, 10min 하여 전처리 준비를 마치고, Hybridization을 마친 샘플튜브를 spin-down한 뒤 파이펫을 이용하여 FPU plate로 옮긴 후, 2,400 x g, 20℃, 2min하고 SW1 시약을 45 ul 넣어 2번 세척과정을 반복하고, UB1(Universal Buffer 1)시약 45 ul씩 넣고 동일한 조건에서 원심 분리하여 반응 하지 않은 Unbound Oligo를 제거하였다.
Hybridized Oligo의 Extension-Ligation을 위하여 ELM3(Extention-Ligation Mix 3)를 45 ul씩 넣고 호일을 씌워서 37℃ incubator 에서 45 min 반응 시켰다. 반응을 마치면 호일을 제거하고 2,400 x g, 2 min 원심분리 한 뒤에 미리 만들어 놓은 50 mM NaOH를 25ul씩 넣고 파이펫으로 5-6차례 파이펫팅 하고 5분간 room temperature에서 반응시켰다. 반응 시간 동안에 PMM2/TDP1(PCR Mster Mix 2 / TruSeq DNA Polymerase 1) Mixture를 만들어 P5, P7index가 각각 4 ul씩 담긴 PCR tube에 넣어주었다. 반응을 마친 NaOH 에 녹은 DNA 20 ul를 혼합하여 총 50 ul의 PCR Amplification 샘플준비를 마치고 아래 조건의 PCR program으로 반응시켰다.
<PCR 조건>
-95℃, 3min
-28 cycles
95℃, 30sec
66℃, 30sec
72℃, 60sec
-72℃, 5min
-Hold at 10℃
반응을 마친 샘플은 QIAxcel 장비를 이용하여 밴드를 확인하고 60 ul의 bead를 이용한 purification과정을 거쳐 30 ul의 Resuspention Buffer(RS)를 수득하였다.
1.2 장기 이식 수혜자의 인위적인 DNA 샘플 분석
상기 샘플은 시퀀싱 장비를 이용하여 염기서열을 밝혀낼 수 있고, 해당 Maker들을 counting하여 자체 알고리즘과 파이프라인을 통하여 장기이식 거부반응에 대한 모니터링이 가능함을 확인할 수 있었다(도 3 및 도4).
차세대 염기 해독 장치 (Next Generation Sequencing)를 통해서 얻은 SNP 마커에 대응하는 각각의 allele의 수를 그래프에 표시하되, 가로축에는 다수 대립유전자 (Reference allele 또는 Major allele)counting 수, 세로축에는 소수 대립유전자 (Alternate allele 또는 Minor allele) counting 수를 log2값으로 취하여 표시하였다 (도 ). 특히 본 SNP 마커는 염색체 13, 18, 21번에 위치한 SNP만을 선별한 것이어서, 각각 파랑(●), 초록(■), 빨강(×)으로 색깔과 표시를 이용하여 구분하였다(도 3).
하단의 표로 볼 수 있듯이 본 혼합된 DNA의 표현형은 총 9가지로 나올 수 있다.
혼합된(장기이식 환자) DNA의 표현형들
M F AA Aa aa
AA AAAA AAAa AAaa
Aa AaAA AaAa Aaaa
aa aaAA aaAa aaaa
인위적으로 만든 DNA 표현형은 AA, Aa, aA, aa로 나타날 수 있으므로 그 분포가 8가지 경우로 나타날 수 있다 (AAaa, aaAA는 같은 표현형으로 간주). 기증자의 DNA가 많아질수록 AaAA, Aaaa 분포가 일정한 비율로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
도 3에서 기재된 바와 같이, 기증자의 바이오마커의 혼합정도에 의해 분포도가 바뀌는 것을 확인 할 수 있다. 이 분포도를 정량적으로 측정 계산하여 공여자의 혈액 내에 존재하는 미세한 양의 기증자의 유전자를 검출하거나 측정할 수 있고, 기증자의 유전자 변이의 양을 측정하고 관찰함으로서 장기이식 거부반응을 예측 또는 관찰 할 수 있다.
또한, 표 5에 개시된 바와 같이 다른 비율로 두 개의 혼합한 DNA를 실제로 차세대 염기서열 분석 방식으로 측정하면, 차세대 염기서열의 바이오 마커를 정량적으로 분석하여 혼합된 DNA 양을 아주 낮은 양에서도 정확하게 측정 할 수 있는 것을 확인 하였다.
각각의 혼합된 DNA양의 실험적인 비율과 SNP counting을 이용한 비율
Background(0%) 10% 5% 2.50% 1.25% 0.63%
Fraction Homo 0.001395983 0.221443 0.123786 0.063688 0.035009 0.015802
Fraction Hetero 0.001495645 0.110112 0.060944 0.032425 0.017551 0.010921
Actual Fraction 22.08% 12.28% 6.43% 3.51% 1.88%
이와 같은 맥락으로 각각의 인위적으로 혼합된 기증자의 AA와 aa에 해당하는 염기를 counting하면 다음 표 6과 같이 수치화 할 수 있다. 실험상 혼합된 DNA 수치와 분석을 통하여 나온 수치와는 약 2배 차이가 있으나, 측정한 DNA 양은 절대량이 아니므로 차이가 날 수 있다.
도 4에 개시된 바와 같이, 각각의 마커는 개별적인 차이를 보여주고 있지만 여러 개의 마커를 사용 시 아주 정확하게 측정하거나 관찰할수 있다.
실제 환자에 적용 시 시간별로 기증자의 DNA를 수치화 할 수 있으며, 장기이식에 대한 거부반응을 모니터링 할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법:
    장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
    상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3 이상의마커 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS)을 이용하여 분석하는 단계;
    이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
    상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액인 예측 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 마커 서열을 증폭하는 단계는 표 1에 개시된 마커 서열을 추가로 모두 증폭하는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 표1의 마커 별로, 서열분석 결과 기증자 유래 마커 서열의 양과 수혜자 유래 마커 서열의 양의 비율인 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 에러 비율도 같이 계산하는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 생체 시료의 증폭된 마커 서열은 200bp 미만인 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 컷오프 값은 정상 생체 시료에서 확립된 참조 값인 예측 방법.
  8. 다음의 단계를 포함하는, 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법:
    장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유한 생체시료를 비침습적으로 입수하는 단계;
    상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3 이상의마커 서열을 증폭하는 단계;
    상기 증폭된 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭방식을 이용하여 분석하는 단계;
    이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계 및;
    시간에 걸쳐 상기 비율을 측정하여, 기증자 유래 마커 서열의 비율이 증가하면 장기 이식 거부 반응(transplant rejection), 이식 기능 장애(graft dysfunction) 또는 장기 부전(organ failure) 인 것으로 예측하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 생체시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 또는 타액인 예측 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 마커 서열을 증폭하는 단계는 표 1에 개시된 마커 서열을 추가로 모두 증폭하는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 표1의 마커 별로, 서열분석 결과 기증자 유래 마커 서열의 양과 수혜자 유래 마커 서열을 양의 비율인 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 마커 서열 별 비율은 에러 비율도 같이 계산하는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 생체 시료의 증폭된 마커 서열은 200bp 미만인 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 시간은, 장기 이식 전, 장기 이식 직후 및 장기 이식 후 하루, 이틀, 일주일, 한 달, 두 달, 세 달, 1년, 2년 및 10년으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 예측 방법.
  15. 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 얻은 생체시료에서 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용한 장기 이식 거부 반응 예측 방법을 수행할 수 있도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 복수의 명령이 암호화된 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 컴퓨터 시스템으로서,
    상기 생체시료는 장기 기증자(donor)로부터 장기를 이식받은 수혜자(recipient)로부터 기증자 및 수혜자의 세포 유리 핵산 분자를 함유하고,
    상기 연산은 상기 생체시료로부터 분리한 세포 유리 핵산 분자에서 표 1에서 선택되는 3이상의 마커 서열을 차세대 염기서열 분석기법(Next Generation Sequencing, NGS) 또는 디지털 염기 증폭 방식을 이용하여 분석하여 얻은 데이터를 수신하는 단계;
    이러한 서열분석에 기초하여, 기증자와 수혜자의 마커 서열 별 비율을 결정하는 단계;
    상기 비율을 하나 이상의 컷오프 값(cutoff value)과 비교하는 단계 및;
    이러한 비교에 기초하여, 수혜자의 장기 이식 거부 반응이 존재하는지 여부를 예측하는 단계를 포함하는 것인 컴퓨터 시스템.
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