WO2018026039A1 - 단일염기다형 검출용 키트 및 방법 - Google Patents

단일염기다형 검출용 키트 및 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to kits and methods for detecting DNA, and more particularly, to kits and methods for detecting monobasic polymorphisms.
  • the human genome map can be completed to make it more extensive to measure risks for disease, diagnose or predict disease, and predict response to drugs. Are revealed.
  • the various genes for example, by analyzing the mutation of a specific gene of a specific person can predict the degree of risk for the disease can be induced to prevent the disease in advance.
  • genetic variation analysis of other infectious agents such as viruses, that cause infections in living organisms, may be used to analyze whether the virus is resistant to a particular therapeutic drug, and the genotyping may be used to identify specific infectious agents.
  • the patient can develop a personalized treatment.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • NGS next generation sequencing
  • conventional PCR eg, AS-PCR-based
  • AS-PCR-based AS-PCR-based
  • real-time PCR using Taq-man probes has limitations of light sources and fluorescent materials.
  • POCT point-of-care-testing
  • the present invention is to solve the various problems including the above problems, it is an object of the present invention to provide a new single base polymorphism detection kit and method easy to develop a multi-SNP analysis POCT device.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a 5'-terminal tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions, and an allele specific nucleotide of the mononucleotide polymorphic region capable of specific hybridization with the 5'-terminal tag oligonucleotide.
  • a monobasic polymorphic specific forward primer consisting of a monobasic polymorphic specific oligonucleotide comprising a '-terminus;
  • kits for detecting a monobasic polymorphism comprising an extension primer.
  • a 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions and the first allele specific to a single nucleotide polymorphic site capable of specific hybridization with the nucleic acid to be amplified
  • a monobasic polymorphic first allele specific forward primer consisting of a monobasic polymorphic first allele specific oligonucleotide comprising a red nucleotide at the 3'-terminus;
  • a monobasic polymorphic second allele specific forward primer composed of a monobasic polymorphic second allele specific oligonucleotide comprising a 3'-terminal mononucleotide polymorphic allele specific nucleotide;
  • a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the template nucleic acid to be amplified, the monobasic polymorphic first allele specific forward primer, the monobasic polymorphic second allele specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a single-base polymorphism detection kit comprising an extension primer consisting of a phosphorus extension polynucleotide and a) the first tag oligonucleotide and b) the tag oligonucleotide of any one of the second tag oligonucleotide.
  • a 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with a nucleic acid to be amplified under PCR conditions, and is capable of specific hybridization with a single nucleic acid to be amplified.
  • Wild-type specific forward primers consisting of wild-type specific oligonucleotides comprising 3'-terminus of wild-type nucleotides of a nucleotide polymorphism site;
  • a specific hybridization of the 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of the nucleic acid sequence which does not hybridize with the amplification target template nucleic acid and the first tag oligonucleotide under PCR conditions and the amplification target nucleic acid.
  • Mutant specific forward primers consisting of a mutant specific oligonucleotide comprising a mutant nucleotide of a monobasic polymorphic site 3'-terminus;
  • a first extended polynucleotide and the first tag which is a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a first extension primer composed of oligonucleotides
  • a single nucleotide polymorphism detection kit including; a second extension polynucleotide having a length distinguished from and a second extension primer consisting of the second tag oligonucleotide.
  • a 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions and a wild type nucleotide capable of hybridizing with the nucleic acid to be amplified specifically and having a single nucleotide polymorphism.
  • a wild type specific forward primer consisting of a wild type specific oligonucleotide consisting of a wild type specific nucleic acid sequence comprising a terminal;
  • a specific hybridization of the 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of the nucleic acid sequence which does not hybridize with the amplification target template nucleic acid and the first tag oligonucleotide under PCR conditions and the amplification target nucleic acid.
  • Mutant specific forward primers consisting of a mutant specific oligonucleotide comprising a mutant nucleotide of a monobasic polymorphic site 3'-terminus;
  • a first extended polynucleotide and the first tag which is a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a first extension primer composed of oligonucleotides
  • a second extension primer comprising a second extension polynucleotide having a length distinct from that and the second tag oligonucleotide;
  • a single-base polymorphism detection kit comprising; a forward primer for extension product amplification composed of a common nucleic acid sequence selected from the first extended polynucleotide and the second extended polynucleotide.
  • an extension polynucleotide consisting of the nucleic acid sequence not hybridized with any of the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer, and an extension primer consisting of the tag oligonucleotide and d) the extension poly.
  • Nucleic acid sequence selected from nucleotides Mixing the extended product amplification forward primers to the reaction solution containing the sample containing the nucleic acid to be amplified, the dNTP mixture, the thermostable DNA polymerase and the reaction buffer;
  • a monobasic polymorphism detection method includes performing a PCR.
  • a 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence that does not hybridize with a first tag oligonucleotide and a specific hybridization of the single allelic polymorphic second allele specific nucleotide is possible.
  • An extended polynucleotide that is a nucleic acid sequence that does not hybridize with the monobasic second allele specific forward primer, and the reverse primer, and 1) the first tag oligonucleotide and 2) the second tag oligonucleotide.
  • Extension primer consisting of any one tag oligonucleotide, and e) a forward primer for amplification of the extension product consisting of a nucleic acid sequence selected from the extension polynucleotide, a sample containing the nucleic acid to be amplified, dNTP mixture, heat stable DNA Mixed with a reaction solution containing a polymerase and a reaction buffer step;
  • a monobasic polymorphism detection method includes performing a PCR.
  • a wild type specific forward primer consisting of a wild type specific oligonucleotide consisting of a wild type specific nucleic acid sequence comprising a 3'-terminus, and b) not hybridizing with the amplification target template nucleic acid and the first tag oligonucleotide under PCR conditions 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence and a mutant specific oligonucleotide capable of specific hybridization with the nucleic acid to be amplified and comprising a mutant nucleotide of the monobasic polymorphic region at the 3'-terminus
  • Mutant specific forward primers consisting of nucleotides, c) the above symptoms
  • a common reverse primer for amplifying a width target template nucleic acid d) not hybridizing to any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a first extension primer consisting of a
  • the first extended polynucleotide A forward primer for amplifying a first extension product consisting of a nucleic acid sequence selected from the list;
  • a reaction comprising a sample containing a nucleic acid to be amplified, a dNTP mixture, a thermostable DNA polymerase, and a reaction buffer comprising a nucleic acid sequence selected from the second extended polynucleotide. Mixing with the liquid;
  • a monobasic polymorphism detection method includes performing a PCR.
  • a 5'-terminal tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions, and an allele specific nucleotide of the mononucleotide polymorphic region capable of specific hybridization with the 5'-terminal tag oligonucleotide.
  • a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer to the product of the allele specific PCR reaction Provided is a monobasic polymorphism detection method comprising performing a primer extension reaction using an extension primer consisting of a phosphorus extension polynucleotide and the tag oligonucleotide.
  • a 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions and the first allele specific to a single nucleotide polymorphic site capable of specific hybridization with the nucleic acid to be amplified
  • a monobasic polymorphic first allele specific forward primer consisting of a monobasic polymorphic first allele specific oligonucleotide comprising a red nucleotide at the 3'-end, the amplification target template nucleic acid and the first tag oligo under PCR conditions
  • a 5'-terminated second tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence that does not hybridize with a nucleotide and a specific hybridization capable of hybridizing with the nucleic acid to be amplified and the monobasic polymorphic second allele specific nucleotide to the 3'-terminus.
  • Single base consisting of a single base polymorphic second allele specific oligonucleotide comprising Performing a monobasic polymorph allele specific PCR reaction using a polymorphic second allele specific forward primer and a common reverse primer for amplifying the template nucleic acid to be amplified;
  • An extension primer consisting of a phosphorus extension polynucleotide and a) a tag oligonucleotide of a) the first tag oligonucleotide and b) the second tag oligonucleotide is used to generate the monobasic polymorph allele-specific PCR reaction product.
  • a monobasic polymorphism detection method comprising the step of performing a primer extension reaction.
  • 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the genome to be amplified under PCR conditions and the nucleic acid to be amplified specifically, and a wild type of monobasic polymorphic site Wild-type specific forward primers composed of wild-type sequence amplification oligonucleotides consisting of wild-type specific nucleic acid sequences comprising 3'-terminal nucleotides; Under PCR conditions, the 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of the nucleic acid sequence which does not hybridize with the amplification target template nucleic acid and the first tag oligonucleotide and the amplification target nucleic acid can be specifically hybridized to the single base.
  • a mutant specific forward primer consisting of a mutant sequence amplification oligonucleotide consisting of a mutant specific nucleic acid sequence comprising a mutant nucleotide of a polymorphic region at the 3'-end; And performing a monobasic polymorphic specific PCR reaction using a common reverse primer for amplifying the template nucleic acid to be amplified.
  • a first extended polynucleotide and the first tag which is a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a first extension primer composed of oligonucleotides; And a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions.
  • the kit and method for detecting adiabatic polymorphism provides companion diagnostics that provide important information for diagnosis of various diseases including cancer, in particular, reactivity to a specific drug and selection of an alternative drug. Can be very useful.
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • FIG. 1 is a schematic diagram schematically showing a single nucleotide polymorphism to be detected of a single nucleotide polymorphism detection kit and various primers for amplifying the same according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing an allele specific nucleic acid amplification reaction performed by a monobasic polymorphism detection kit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating an allele-specific asymmetric primer extension reaction and an amplification reaction of the allele-specific asymmetric primer extension product according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram schematically illustrating a detection target monobasic polymorphism and various primers for amplifying the monobasic polymorphism detection kit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an allele-specific nucleic acid amplification reaction performed by a monobasic polymorphism detection kit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic diagram schematically showing an allele-specific bidirectional primer extension reaction according to an embodiment of the present invention performed using an allele specific extension primer after allele-specific nucleic acid amplification reaction shown in FIG. to be.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a nucleic acid amplification reaction for amplifying the allele specific asymmetric primer extension product by PCR reaction.
  • FIG. 8 illustrates agarose gel electrophoresis results of conventional allele-specific PCR (AS-PCR) and allele-specific bidirectional primer amplification reactants or amplification products amplified according to an embodiment of the present invention. It is a schematic diagram shown.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of an allele-specific PCR reaction performed in accordance with one embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of an allele-specific bidirectional primer extension PCR reaction performed in accordance with one embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of multiplex allele specific PCR (top) and multiplex allele specific bidirectional primer extension PCR reaction (bottom) performed according to an embodiment of the present invention.
  • nucleotide refers to a monomer molecule constituting a nucleic acid, and is composed of a base, an pentose sugar, and a phosphoric acid.
  • the base is adenine, guanine, and cytosine in the case of DNA.
  • thymine Four kinds of thymine exist, and in the case of RNA, uracil is used instead of the thymine.
  • the pentose sugar is 2'-deoxyribose in the case of DNA, ribose is used in the case of RNA.
  • oligonucleotide refers to a short single-stranded nucleic acid chain consisting of 13 to 25 nucleotides as a polymer of the nucleotide monomer molecule, in some cases 6-mer, 7 It may refer to a nucleic acid chain consisting of less than 13 nucleotides or more than 25 nucleotides, such as -mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer, and 12-mer.
  • polynucleotide generally refers to a polymer chain of nucleotide units longer than the oligonucleotide, but is also used interchangeably with the oligonucleotide. Polynucleotides include both single-stranded or double-stranded nucleic acid chains.
  • sense strand refers to a single-stranded nucleic acid molecule in the same direction as the direction of the code of the gene of the double-stranded DNA molecule
  • antisense strand is another single strand complementary to the sense strand.
  • it refers to a nucleic acid molecule, it is also possible to define a strand in which the nucleic acid sequence is first identified as a “sense strand” and its complementary strand as an “antisense strand” irrespective of the direction of the gene coding.
  • polymerase chain reaction or “nucleic acid amplification reaction” refers to a reaction that amplifies a particular target nucleic acid molecule using a thermostable DNA polymerase.
  • PCR the DNA in addition to the polymerase target nucleic acid oligonucleotide that can specifically hybridize to a nucleotide of the primer (forward primer, reverse primer), deoxy-nucleotide mixture (dNTP mixture), Mg 2 +, such as divalent reaction buffer containing ions such as This is used.
  • the DNA molecules produced by the PCR reactions are referred to herein as "amplification products”.
  • primer extension refers to a non-chain reaction in which a DNA polymerase terminates at the 5'-terminus of the template nucleic acid by extending a primer complementarily hybridized to a template nucleic acid of limited length. Means.
  • extension products The DNA molecules produced by the primer extension reactions are referred to herein as "extension products”.
  • primer refers to an oligonucleotide or polynucleotide that complementarily hybridizes to template DNA, which is used for initiation of a PCR reaction or a primer extension reaction.
  • the primer for the PCR reaction is a pair of forward primers (or sense primers) selected from the same sense strand as the gene code direction of the nucleic acid molecule to be amplified and reverse primers (or antisense primers) selected from the antisense strands complementary to the sense strands.
  • forward primers or sense primers
  • reverse primers or antisense primers
  • the term “tag” refers to an oligonucleotide added to the 5′-end of an allele specific primer to specifically identify a particular monobasic polymorph, wherein the tag is the corresponding monobase. It has a unique nucleic acid sequence according to the polymorphic nucleotide, the nucleic acid sequence may be designed to minimize the non-specific amplification reaction because there is no homology with the primers other than the amplification target nucleic acid and the extension primer.
  • single nucleotide polymorphism refers to a genetic change or variation that differs from one nucleotide sequence (A, T, G, C) in the DNA sequence.
  • the location where two or more alleles occur in the population at 1% or more is called SNP.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • common polymorphism When the allele is present at a frequency of 5% or more, it is usually called common polymorphism. In the case of%, it is classified as rare polymorphism.
  • the term "allele” refers to either the same gene or a group of selective forms in the same genetic locus. Sometimes different alleles can result in other observable phenotypic traits. However, most genetic variations rarely produce observable variations.
  • “single base polymorphic first allele” and “single base polymorphic second allele” are a plurality of alleles generated by variation of the base of a single base polymorphic site in an arbitrary order. If one is a major allele (high frequency allele or wild type), the other may be a minor allele (low frequency allele or mutant).
  • ASBPE allele specific bidirectional primer extension
  • a 5'-terminal tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions, and an allele specific nucleotide of the mononucleotide polymorphic region capable of specific hybridization with the 5'-terminal tag oligonucleotide.
  • a monobasic polymorphic specific forward primer consisting of a monobasic polymorphic specific oligonucleotide comprising a '-terminus;
  • kits for detecting a monobasic polymorphism comprising an extension primer.
  • the monobasic polymorphism detection kit may further include iv) an extension product amplification forward primer consisting of a nucleic acid sequence selected from the extension polynucleotide.
  • the monobasic polymorph may be wild type or mutant.
  • a 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions and the first allele specific to a single nucleotide polymorphic site capable of specific hybridization with the nucleic acid to be amplified
  • a monobasic polymorphic first allele specific forward primer consisting of a monobasic polymorphic first allele specific oligonucleotide comprising a red nucleotide at the 3'-terminus;
  • a monobasic polymorphic second allele specific forward primer consisting of a monobasic polymorphic second allele specific oligonucleotide comprising a mononucleotide polymorphic second allele specific nucleotide at the 3′-end;
  • a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the template nucleic acid to be amplified, the monobasic polymorphic first allele specific forward primer, the monobasic polymorphic second allele specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a single-base polymorphism detection kit comprising an extension primer consisting of a phosphorus extension polynucleotide and a) the first tag oligonucleotide and b) the tag oligonucleotide of any one of the second tag oligonucleotide.
  • the monobasic polymorphism detection kit may further include v) an extension product amplification forward primer consisting of a nucleic acid sequence selected from the extension polynucleotide.
  • the length of the extension polynucleotide may be 20 to 200 nt, 30 to 150 nt, or 40 to 100 nt.
  • the first allele may be wild type and the second allele may be mutant.
  • a 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with a nucleic acid to be amplified under PCR conditions, and is capable of specific hybridization with a single nucleic acid to be amplified.
  • a wild type specific forward primer consisting of a wild type specific oligonucleotide consisting of a wild type specific nucleic acid sequence comprising a wild type nucleotide of the nucleotide polymorphism at the 3'-terminus;
  • a specific hybridization of the 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of the nucleic acid sequence which does not hybridize with the amplification target template nucleic acid and the first tag oligonucleotide under PCR conditions and the amplification target nucleic acid.
  • Mutant specific forward primers consisting of a mutant specific oligonucleotide comprising a mutant nucleotide of a monobasic polymorphic site 3'-terminus;
  • a first extended polynucleotide and the first tag which is a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a first extension primer composed of oligonucleotides
  • a single nucleotide polymorphism detection kit including; a second extension polynucleotide having a length distinguished from and a second extension primer consisting of the second tag oligonucleotide.
  • the monobasic polymorphism detection kit comprises vi) a first primer for amplification of a first extension product consisting of a nucleic acid sequence selected from the first extended polynucleotide and vii) a nucleic acid sequence selected from the second extended polynucleotide. It may further include a forward primer for amplifying the second extension product.
  • the length of the first extended polynucleotide and the second extended polynucleotide may be different enough to distinguish the size after electrophoresis.
  • the size of the first extended polynucleotide is 20 to 50 nt
  • the size of the second extended polynucleotide may be 70 to 200 nt.
  • a 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions and a wild type nucleotide capable of hybridizing with the nucleic acid to be amplified specifically and having a single nucleotide polymorphism.
  • a wild type specific forward primer consisting of a wild type specific oligonucleotide consisting of a wild type specific nucleic acid sequence comprising a terminal;
  • a specific hybridization of the 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of the nucleic acid sequence which does not hybridize with the amplification target template nucleic acid and the first tag oligonucleotide under PCR conditions and the amplification target nucleic acid.
  • Mutant specific forward primers consisting of a mutant specific oligonucleotide comprising a mutant nucleotide of a monobasic polymorphic site 3'-terminus;
  • a first extended polynucleotide and the first tag which is a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a first extension primer composed of oligonucleotides
  • a second extension primer comprising a second extension polynucleotide having a length distinct from that and the second tag oligonucleotide;
  • a single-base polymorphism detection kit comprising; a forward primer for extension product amplification composed of a common nucleic acid sequence selected from the first extended polynucleotide and the second extended polynucleotide.
  • the monobasic polymorphism detection kit may further include a reaction buffer, a dNTP mixture, and a thermostable DNA polymerase.
  • an extension polynucleotide consisting of the nucleic acid sequence not hybridized with any of the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer, and an extension primer consisting of the tag oligonucleotide and d) the extension poly.
  • Nucleic acid sequence selected from nucleotides Mixing the extended product amplification forward primers to the reaction solution containing the sample containing the nucleic acid to be amplified, the dNTP mixture, the thermostable DNA polymerase and the reaction buffer;
  • a monobasic polymorphism detection method includes performing a PCR.
  • a 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence that does not hybridize with a first tag oligonucleotide and a specific hybridization of the single allelic polymorphic second allele specific nucleotide is possible.
  • An extended polynucleotide that is a nucleic acid sequence that does not hybridize with the monobasic second allele specific forward primer, and the reverse primer, and 1) the first tag oligonucleotide and 2) the second tag oligonucleotide.
  • Extension primer consisting of any one tag oligonucleotide, and e) a forward primer for amplification of the extension product consisting of a nucleic acid sequence selected from the extension polynucleotide, a sample containing the nucleic acid to be amplified, dNTP mixture, heat stable DNA Mixed with a reaction solution containing a polymerase and a reaction buffer step;
  • a monobasic polymorphism detection method includes performing a PCR.
  • a wild type specific forward primer consisting of a wild type specific oligonucleotide consisting of a wild type specific nucleic acid sequence comprising a 3'-terminus, and b) not hybridizing with the amplification target template nucleic acid and the first tag oligonucleotide under PCR conditions 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence and a mutant specific oligonucleotide capable of specific hybridization with the nucleic acid to be amplified and comprising a mutant nucleotide of the monobasic polymorphic region at the 3'-terminus
  • Mutant specific forward primers consisting of nucleotides, c) the above symptoms
  • a common reverse primer for amplifying a width target template nucleic acid d) not hybridizing to any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a first extension primer consisting of a
  • the first extended polynucleotide A forward primer for amplifying a first extension product consisting of a nucleic acid sequence selected from the list;
  • a reaction comprising a sample containing a nucleic acid to be amplified, a dNTP mixture, a thermostable DNA polymerase, and a reaction buffer comprising a nucleic acid sequence selected from the second extended polynucleotide. Mixing with the liquid;
  • a monobasic polymorphism detection method includes performing a PCR.
  • Performing the PCR may be carried out in a plurality of reactions having a gradient of the annealing temperature in order to find the optimal hybridization conditions.
  • a 5'-terminal tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions, and an allele specific nucleotide of the mononucleotide polymorphic region capable of specific hybridization with the 5'-terminal tag oligonucleotide.
  • a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer to the product of the allele specific PCR reaction Provided is a monobasic polymorphism detection method comprising performing a primer extension reaction using an extension primer consisting of a phosphorus extension polynucleotide and the tag oligonucleotide.
  • extension product consisting of a nucleic acid sequence selected from the extension polynucleotide.
  • a 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the nucleic acid to be amplified under PCR conditions and the first allele specific to a single nucleotide polymorphic site capable of specific hybridization with the nucleic acid to be amplified
  • a monobasic polymorphic first allele specific forward primer consisting of a monobasic polymorphic first allele specific oligonucleotide comprising a red nucleotide at the 3'-end, the amplification target template nucleic acid and the first tag oligo under PCR conditions
  • a 5'-terminated second tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence that does not hybridize with a nucleotide and a specific hybridization capable of hybridizing with the nucleic acid to be amplified and the monobasic polymorphic second allele specific nucleotide to the 3'-terminus.
  • Single base consisting of a single base polymorphic second allele specific oligonucleotide comprising Performing a monobasic polymorph allele specific PCR reaction using a polymorphic second allele specific forward primer and a common reverse primer for amplifying the template nucleic acid to be amplified;
  • An extension primer consisting of a phosphorus extension polynucleotide and a) a tag oligonucleotide of a) the first tag oligonucleotide and b) the second tag oligonucleotide is used to generate the monobasic polymorph allele-specific PCR reaction product.
  • a monobasic polymorphism detection method comprising the step of performing a primer extension reaction.
  • extension product consisting of a nucleic acid sequence selected from the extension polynucleotide.
  • 5'-terminal first tag oligonucleotide consisting of a nucleic acid sequence which does not hybridize with the genome to be amplified under PCR conditions and the nucleic acid to be amplified specifically, and a wild type of monobasic polymorphic site Wild-type specific forward primers composed of wild-type sequence amplification oligonucleotides consisting of wild-type specific nucleic acid sequences comprising 3'-terminal nucleotides; Under PCR conditions, the 5'-terminal second tag oligonucleotide consisting of the nucleic acid sequence which does not hybridize with the amplification target template nucleic acid and the first tag oligonucleotide and the amplification target nucleic acid can be specifically hybridized to the single base.
  • a mutant specific forward primer consisting of a mutant sequence amplification oligonucleotide consisting of a mutant specific nucleic acid sequence comprising a mutant nucleotide of a polymorphic region at the 3'-end; And performing a monobasic polymorphic specific PCR reaction using a common reverse primer for amplifying the template nucleic acid to be amplified.
  • a first extended polynucleotide and the first tag which is a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions
  • a first extension primer composed of oligonucleotides; And a nucleic acid sequence which does not hybridize with any of the amplification target template nucleic acid, the wild type specific forward primer, the mutant specific forward primer, and the reverse primer under PCR conditions.
  • a forward primer for amplifying a first extension product comprising a nucleic acid sequence selected from the first extended polynucleotide
  • a forward primer for amplifying a second extension product consisting of a nucleic acid sequence selected from the second extended polynucleotide
  • a PCR reaction step for amplifying a primer extension product for amplifying the product of the primer extension reaction using the common reverse primer.
  • Steps i and ii may be performed in a single step in a single reaction vessel, and steps i to iii may be performed in a single step in a single reaction vessel.
  • the monobasic polymorphic specific PCR reaction may be carried out in a plurality of reactions with a gradient of annealing temperature in order to search for optimal hybridization conditions.
  • the monobasic polymorphism detection method may further include the step of confirming the band pattern after performing electrophoresis by loading the product of the primer extension reaction or the product of the PCR reaction for amplification of the extension reaction product on the gel.
  • the PCR reaction for amplification of the extended reaction product may be performed by conventional PCR or real-time PCR.
  • the real time PCR is the first extended polynucleotide and be performed using the TaqMan r probes, each specifically binding to the second extended polynucleotide, a fluorescent intercalating agent (fluorescent interchelate) such as SyBr Green in addition a pair of primers Can be performed.
  • the extension product may be specifically detected according to the type of fluorescence.
  • the amplification product forming step may be performed in a plurality of reactions having a gradient of annealing temperature in order to search for an optimum hybridization condition.
  • nucleic acid molecules composed of a plurality of oligonucleotides and / or polynucleotides are described in the order of 5'-end to 3'-end.
  • FIG. 1 to 3 is a single nucleotide polymorphism detection kit of the single nucleotide polymorphism detection kit according to an embodiment of the present invention and various primers for amplifying the same (Fig. 1) and a single nucleotide polymorphism detection according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 An exemplary schematic diagram showing allele-specific nucleic acid amplification reactions performed by the kid (FIG. 2) and allele-specific asymmetric primer extension reactions and amplification reactions of the allele-specific asymmetric primer extension products (FIG. 3).
  • FIG. 1 a heterozygote in which both a wild type and a mutant exist in a specific monobasic polymorphic site of a specific gene in the genome can be assumed.
  • FIG. 1 is a single nucleotide polymorphism detection kit of the single nucleotide polymorphism detection kit according to an embodiment of the present invention and various primers for amplifying the same (Fig. 1) and a single nucleot
  • an embodiment of the present invention is similar to the conventional allele specific PCR (AS-PCR) in that allele-specific primers (110 and 120) are used, in one embodiment of the invention allele specific
  • AS-PCR allele specific PCR
  • allele-specific primers 110 and 120
  • allele specific By using the unique identification tags 112 and 122 which do not exist in the template nucleic acid to be amplified at the 5'-end of the red primer, the presence and type of SNP can be confirmed without using a fluorescent probe or real-time PCR.
  • the actual wild type specific forward primer 110 is Only wild type alleles can be selectively amplified and the mutant specific forward primer 120 can selectively amplify only mutant alleles (FIG. 2).
  • the common reverse primer 130 enables amplification of both wild type alleles and mutant alleles.
  • PCR is performed to distinguish whether it has a wild-type monobasic polymorphism or a mutant monobasic polymorphism.
  • the reaction should be carried out separately, and it was not possible to determine whether homozygous or heterozygous for the single base polymorphic site in a single reaction.
  • a gene-specific amount "allele-specific bidreactional primer extension (ASBPE) is performed (top of FIG. 3). The allele-specific amount”? " Once the primer extension reaction is complete, it is possible to confirm this immediately by agarose gel electrophoresis.
  • the optimum detection conditions can be established by appropriately adjusting the concentration of the primers used when detecting only the ASBPE reaction and performing extended product amplification.
  • FIG. 9 the experimental result of specifically amplifying the heterozygous single base polymorphic site is shown in FIG. 9.
  • AS-PCR allele specific PCR
  • the mutant allele was amplified by the allele specific bidirectional primer extension PCR reaction of the present invention. (115 + 117 bp).
  • FIG. 4-7 illustrate another embodiment of the present invention.
  • 4 is different from FIG. 1 in that the extension primer is applied to the mutant as well as the wild type, and two extension primers are used. Therefore, both wild type and mutant types are amplified by allele specific bidirectional primer extension PCR after allele specific PCR.
  • Figure 5 is a schematic diagram showing an allele-specific PCR process
  • Figure 6 is a schematic diagram showing an allele-specific amount " ⁇ ? Primer extension process
  • Figure 7 is the allele specific bidirectional primer extension reaction
  • Figure 8 is a schematic diagram showing the PCR process for the product of Figure 8 shows agarose after amplifying the wild-type and mutant allele by AS-PCR and allele specific bidirectional primer extension PCR according to an embodiment of the present invention When gel electrophoresis is shown the expected band pattern.
  • the 5′-terminal sequence of the wild type specific forward primer 110 and the mutant specific forward primer 120 is a wild type specific as a unique nucleic acid sequence not present in the template nucleic acid to be amplified. It serves as a tag unique to amplification products and mutant specific amplification products.
  • the tag included in the wild type specific forward primer is defined as a first tag oligonucleotide 112
  • the tag included in the mutant specific forward primer is defined as a second tag oligonucleotide 122.
  • mutant specific forward primer is a second mutant specific forward primer (not shown) for the purpose of distinguishing it from the mutant specific forward primer (not shown), and the mutant specific forward primer including the fourth tag oligonucleotide is It is defined as a third mutant specific forward primer (not shown).
  • the mutant specific forward primer including the fourth tag oligonucleotide is It is defined as a third mutant specific forward primer (not shown).
  • FIG. 5 common to the wild type specific forward primer 110 and the mutant specific forward primer 120 comprising the first tag oligonucleotide 112 and the second tag oligonucleotide 122, respectively.
  • the PCR reaction by the reverse primer 130 yields the wild-type amplification product 140 and the mutant-type amplification product 150 (two PCR-Products at this stage have the same size, so that the bands overlap each other on gel electrophoresis). Is not available).
  • the first tag oligonucleotide 112 and the second tag oligonucleotide 122 are used as the 3'-terminal sequences of the first extension primer and the second extension primer, respectively, used for the primer extension reaction. Accordingly, as shown in FIG. 6, the denatured and single-stranded wild type amplification product antisense strand 141 may be formed of the first tag oligonucleotide 112 positioned at the 3′-end of the first extension primer 161.
  • the mutant amplification product antisense strand 151 is specifically hybridized with the second tag oligonucleotide 122 located at the 3'-end of the second extension primer 170, thereby extending first.
  • the product 180 and the second extension product 190 are produced.
  • the first extension product 180 and the second extension product 190 have a band pattern through gel electrophoresis.
  • the identification can be made by checking.
  • this allele specific primer extension reaction as an allele specific bidirectional primer extension (ASBPE).
  • the single base polymorphism can be detected by the ASBPE alone, but when the concentration of the template nucleic acid molecule is low, it may be difficult to detect allele-specific nucleic acid molecules only by primer extension reaction.
  • the extension product amplification primer 200 prepared using a unique nucleic acid sequence selected from each of the first extension primer and the second extension primer and the common reverse primer described above. By amplifying the first extension product and the second extension product using 130, it is possible to enable more reliable detection of a single base polymorph.
  • the extension product amplification forward primer 200 to be used may be manufactured using a sequence that is common to the first extension primer and the second extension primer, and manufactured using a unique nucleic acid sequence. May be 4 and 7 exemplarily illustrating one embodiment of the present invention, the extension product amplification using the sequences commonly present in the first extension primer 160 and the second extension primer 170. Only forward primer 200 is shown.
  • FIG. 10 Actual experimental results according to the embodiment are shown in FIG. 10.
  • an allele-specific bidirectional primer extension PCR reaction of the present invention was performed on a homozygous or heterozygous UGT1A1 * 28.
  • the wild type (181) was used as a wild type specific forward primer and an extension primer.
  • bp was detected only, and only mutant (231 bp) was detected as the mutant specific forward primer and the extension primer, and both alleles were detected in the heterozygous.
  • FIG. 11 illustrates multiplex PCR results of simultaneously detecting a plurality of alleles according to an embodiment of the present invention.
  • both alleles were able to accurately distinguish between wild type and mutant types.
  • Example 1 Allele specific amplification of amplification target nucleic acid molecule
  • the present inventors first of all, in order to investigate whether the presence and type of single base polymorphism (SNP) can be quickly determined by the allele-specific bidirectional primer extension reaction described above, first, the BCR-ABL gene, which is known to have SNP, is templated. We examined whether allele-specific PCR performed properly.
  • SNP single base polymorphism
  • An allele-specific PCR reaction using a primer and a T specific primer represented by SEQ ID NO: 3 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 4 generated an amplification product having a size of 115 bp.
  • both forward primers introduced an intentional mismatch (C> A) from the 3'-end to the third base. This is known to allow more stable amplification of allele specific primers (Liu et al . Plant Methods 2012, 8:34, 2012).
  • a temperature gradient PCR reaction was performed in which the annealing temperatures of the plurality of reactants were sequentially adjusted to optimize annealing temperatures of the primers. The reaction was carried out three times.
  • the composition and reaction conditions of the PCR reaction solution are shown in Tables 1 and 2, respectively.
  • Allele-specific PCR reaction solution composition PCR composition Sample # ( ⁇ l) End-Conc. 5X PCR Buffer 10 1X Go tag DNA polymerase 0.25 1.25U dNTP Mix (10 mM) One 200 ⁇ M Template C, T One 10 5 copy Primer F One 100nM R One 100nM DI water Total Vol. 50
  • the C-specific forward primer and the T-specific forward primer formed specific amplification products only in the wild type and the mutant type, respectively. Therefore, it was confirmed that the allele specific primers according to one embodiment of the present invention functioned properly.
  • the temperature gradient PCR reaction to the annealing temperature to investigate the optimum annealing temperature was confirmed that the temperature of about 57 °C is optimal in both wild type and mutant type.
  • the present inventors prepared an extension primer to be used for allele specific PCR followed by allele specific bidirectional primer extension reaction. Specifically, using a pBR322 plasmid (Promega, USA) represented by SEQ ID NO: 5 having low sequence homology with human genomic DNA as a template DNA, a forward primer represented by SEQ ID NO: 6 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 7 were used. 117 bp of amplification products were generated by amplification.
  • the forward primer is a second tag complementary oligonucleotide which is a sequence complementary to a homologous sequence present in the pBR322 plasmid DNA described in SEQ ID NO: 8 and a second tag oligonucleotide to be described later added to its 5'-end. It is composed.
  • the inventors devised a tag oligonucleotide having a unique nucleic acid sequence that would not exhibit false positives due to lack of homology with any sequence in the human genome at the 5'-end of the forward primer used in the AS-PCR. PCR was performed.
  • the tag oligonucleotide is also known in the art as a ZIP code sequence, which is a nucleotide oligomer having a sequence that is not in the base sequence of genomic DNA and is designed to not hybridize non-specifically with genomic DNA. .
  • ZIP code sequence is a nucleotide oligomer having a sequence that is not in the base sequence of genomic DNA and is designed to not hybridize non-specifically with genomic DNA.
  • the primers can be modified using various code sequences known in the art, in addition to the zip codes used in the examples described below (Slentz-Kesler). et al ., Genome Res ., 10: 549-557, 2010).
  • mutant allele specific primer is the second tag complementary oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 8 at the 5'-end of the mutant specific forward primer used in Example 1 above. It was prepared by adding a unique tag oligonucleotide (second tag oligonucleotide) capable of identifying the mutant allele represented by the complementary sequence SEQ ID NO: 10.
  • the inventors of the present invention use the genotype of UGT1A1 * 28, the SNP of UDP glucuronosyltransferase family 1 member A1 (UGT1A1), which is known to correlate with adverse effects on irinotecan, an anticancer agent, as an ASBPE kit according to an embodiment of the present invention. Analyzed.
  • primer extension reactions were performed using wild type specific extension primers (SEQ ID NO: 14) and mutant specific extension primers (SEQ ID NO: 15) for wild-type alleles and mutant alleles, respectively.
  • extension product amplification was performed using the common extension specific forward primer (SEQ ID NO: 16) and the reverse primer (SEQ ID NO: 13) for the wild type extension product and the mutant extension product.
  • the inventors of the present invention to determine whether the multiplex analysis that can detect the genotype of the two alleles at the same time with the ASBPE kit according to an embodiment of the present invention, UGT1A1 * 6 and UGT1A1 * 28 alone or wild type genomic DNA Allele specific PCR was performed alone or in multiplex by mixing, and mutant genomic DNA alone or mixed was performed in multiplex using ASBPE kit according to one embodiment of the present invention.
  • the present inventors after mixing or mixing UGT1A1 * 6 mutant and UGT1A1 * 28 mutant genomic DNA, respectively, each of the mutant allele specific forward primers (SEQ ID NOs: 19 and 12), and common reverse primers (SEQ ID NO: 13). ), UGT1A1 * 6 mutant and UGT1A1 * 28 mutant specific extension primers (SEQ ID NOs: 20 and 15) and the 5'-terminus of the mutant allele specific extension primers of the UGT1A1 * 6 and UGT1A1 * 28, respectively Mutant allele-specific extension PCR (ASBPE-PCR) reactions were carried out using forward primers (SEQ ID NO: 16) for amplification of extension products using a common sequence that is commonly present in Table 3 above.
  • the allele specific extension PCR kit according to one embodiment of the present invention clearly identifies the mutant allele of each of UGT1A1 * 6 and UGT1A1 * 28, both alone or in multiplex. could be detected. Furthermore, the above results are allele-specific PCR, allele-specific bidirectional primer extension reaction and PCR amplification of the product of the extension reaction as obtained through one PCR process, the method and kit according to an embodiment of the present invention Demonstrates that multiplexes can be distinguished between wild type and mutant at the same time as conventional AS-PCR as well as used to detect various SNPs simultaneously.
  • an allele-specific bidirectional primer extension reaction according to an embodiment of the present invention can be effectively used to accurately determine the presence and type of SNP at a specific position in a specific nucleic acid molecule to be amplified.
  • the method according to an embodiment of the present invention can be used easily and inexpensively by checking the band pattern after simple gel electrophoresis without using expensive equipment, as well as performing a single reaction in a single tube. It is very economical in that it is.
  • the method and kit according to an embodiment of the present invention can be used not only for detecting SNPs in various plants and animals, especially humans, but also for predicting the diagnostic drug reactivity of diseases using the same.
  • SEQ ID NO: 1 to 20 is a nucleic acid sequence of the primers used in the kit and method according to an embodiment of the present invention.

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Abstract

본 발명은 단일염기다형 검출 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 방법을 이용한 단일염기다형 검출 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

단일염기다형 검출용 키트 및 방법
본 발명은 DNA 검출용 키트 및 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 단일염기다형 검출용 키트 및 방법에 관한 것이다.
인간의 게놈(genome) 지도가 완성되어 질병에 대한 위험도의 측정, 질병의 진단 또는 예진, 그리고 약물에 대한 반응의 예측을 보다 광범위하게 할 수 있다는 가능성이 제시되었고, 최근에는 다양한 유전자들에 대한 기능들이 밝혀지고 있다. 다양한 유전자들에 대한 기능 규명에 따라 예를 들어, 특정인의 특정 유전자에 대한 변이분석을 통하여 질병에 대한 위험도가 어느 정도인지 예측하여 질병을 사전에 예방하도록 유도할 수 있다. 또한, 생명체에 감염을 일으키는 다른 감염체, 예를 들어, 바이러스 등의 유전자 변이 분석을 통하여 해당 바이러스가 특정 치료 약물에 대해 내성을 갖는지 여부를 분석할 수 있고, 이러한 유전자형 분석을 통하여 감염체의 특정 치료 약물에 대한 반응, 예를 들어 내성반응을 예측함으로써 환자 개인별 맞춤형 치료방법을 개발할 수 있다. 이러한 개인맞춤형의료 및 치료동반진단의 핵심 기반 기술인 단일염기다형성(SNP; single Nucleotide Polymorphism) 분석에 새로운 PCR 기술을 이용하여 SNP를 분석하여 개인맞춤형 의료진단 및 환자의 유전형에 따른 약물의 효용성을 진단하는 동반진단에 있어서의 기존의 PCR 및 NGS(Next Generation Sequencing)의 한계와 고가 분석기기의 필요 그리고 분석까지의 많은 시간 소요 등의 문제를 해결할 수가 있다. 구체적으로 기존의 PCR(e.g AS-PCR기반)등은 이형접합체(heterotype)의 점돌연변이 분석의 어려움의 한계 등이 있으며, Taq-man Probe 등을 사용하는 Real-Time PCR은 광원 및 형광물질의 한계에 따른 분석 채널(channel)의 제한 및 현장진단(point-of-care-testing, POCT) 기기로의 개발의 어려움이 존재한다. NGS를 이용한 Sequencing은 그 분석 비용 및 기기의 고가 그리고 복잡한 프로세스 및 소요 시간이 오래 걸리며, 또한 POCT로서 적용이 불가능하다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 다중 SNP 분석 POCT 기기로 개발이 용이한 새로운 단일염기다형 검출용 키트 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머;
ii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머; 및
iii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머;
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형제 2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머;
iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머; 및
iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 a) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 b) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머; 및
v) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머;
v) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머; 및
vi) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 공통의 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머;를 포함하는, 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머, b) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머, c) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머 및 d) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, b) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, c) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머, d) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 1) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 2) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머, 및 e) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머, b) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, c) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머, d) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머, e) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머, f) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 포워드 프라이머; 및 g) 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제2연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머, 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머를 이용하여 증폭 대상 핵산분자의 대립유전자 특이적인 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
ii) 상기 대립유전자 특이적인 PCR 반응의 산물에 대하여 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머를 이용하여 프라이머 연장반응을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 단일염기다형 대립유전자 특이적 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 a) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 b) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머를 이용하여 상기 단일염기다형 대립유전자 특이적 PCR 반응 산물에 대한 프라이머 연장반응을 수행하는 단계;를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) 증폭 대상 주형 핵산을 PCR 조건에서 증폭 대상 게놈과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머; PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 핵산서열로 구성되는 돌연변이형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머; 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 단일염기다형 특이적 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1연장용 프라이머; 및 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 겔 전기영동상 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머를 이용하여 상기 단일염기다형 특이적 PCR 반응의 반응 산물에 대한 프라이머 연장반응을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 특정 유전자의 단일염기다형의 유무 및 종류를 정확하고 신속하게 검출하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 단열염기다형 검출용 키트 및 방법은 암을 비롯한 각종 질병의 진단, 특히 특정 약물에 대한 반응성 여부 및 대체 약물의 선택에 중요한 정보를 제공하는 동반진단(companion diagnostics)에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단일염기다형 검출키트의 검출 대상 단일염기다형과 이를 증폭하기 위한 각종 프라이머들을 개략적으로 도시한 개요도이가.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일염기다형 검출키드에 의해 수행되는 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응을 예시적으로 도시한 개요도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장반응 및 상기 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장산물의 증폭반응을 예시적으로 도시한 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일염기다형 검출키트의 검출 대상 단일염기다형과 이를 증폭하기 위한 각종 프라이머들을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 단일염기다형 검출키드에 의해 수행되는 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 6은 상기 도 5에 도시된 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응 이후 대립유전자 특이적 연장 프라이머를 이용하여 수행되는 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 7은 상기 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장반응 산물을 PCR 반응으로 증폭하는 핵산 증폭반응을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 8은 통상의 대립유전자 특이적 PCR(AS-PCR) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 증폭반응물 또는 이를 증폭한 증폭산물에 대한 아가로스 겔 전기영동 결과를 예시적으로 도시한 개요도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 대립유전자 특이적 PCR 반응의 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 PCR 반응의 결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 수행된 멀티플렉스 대립유전자 특이적 PCR(상단) 및 멀티플렉스 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 PCR 반응(하단) 결과를 나타내는 사진이다.
용어의 정의:
이하 본 문서에서 사용되는 용어를 정의한다:
본 문서에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 핵산을 구성하는 단위체 분자로 염기, 오탄당 및 인산으로 구성되어 있으며, 상기 염기는 DNA의 경우 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 및 티민(thymine)의 네 가지가 존재하고, RNA의 경우에는 상기 티민 대신 우라실(uracil)이 사용된다. 상기 오탄당은 DNA의 경우 2'-디옥시리보스(2'-deoxyribose), RNA의 경우 리보스(ribose)가 사용된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 상기 뉴클레오티드 단위체 분자의 중합체로서 일반적으로 13 내지 25개까지의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 단일쇄 핵산 사슬을 의미하는데, 경우에 따라서는 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer 및 12-mer 등 13개미만의 뉴클레오티드로 구성되거나 25개 초과의 뉴클레오티드로 구성된 핵산 사슬을 지칭할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 통상적으로 상기 올리고뉴클레오티드 보다 더 긴 뉴클레오티드 단위체의 중합체 사슬을 의미하나, 상기 올리고뉴클레오티드와 혼용되어 사용되기도 한다. 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 또는 이중가닥 핵산사슬 모두를 포함한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "센스 가닥"은 이중가닥 DNA 분자 중 유전자의 코드의 진행방향과 동일한 방향의 단일가닥 핵산분자를 의미하고, "안티센스 가닥"은 상기 센스 가닥과 상보결합을 하는 다른 단일가닥 핵산분자를 의미하나, 유전자의 코드 진행방향과 무관하게, 최초로 핵산서열이 규명된 가닥을 "센스 가닥"으로 정의하고 그의 상보가닥을 "안티센스 가닥"으로 정의하는 것도 무방하다.
본 문서에서 사용되는 용어 "PCR(polymerase chain reaction)" 또는 "핵산증폭반응"은 열안정성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 표적 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. PCR에는 DNA 중합효소 외에 표적 핵산 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 프라이머(포워드 프라이머, 리버스 프라이머), 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture), Mg2 + 등의 2가이온을 포함하는 반응 완충액 등이 사용된다. 상기 PCR 반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "증폭산물"이라고 지칭하였다.
본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머 연장반응(primer extension)"은 DNA 중합효소가 제한된 길이의 주형 핵산에 상보적으로 혼성화된 프라이머를 연장시켜 상기 주형 핵산의 5'-말단에서 종료가 되는 비연쇄반응을 의미한다. 상기 프라이머 연장반응에 의해 생성된 DNA 분자를 본 문서에서는 "연장산물"이라고 지칭하였다.
본 문서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 PCR 반응 또는 프라이머 연장반응(primer extension) 반응의 개시를 위해 사용되는, 주형 DNA에 상보적으로 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. PCR 반응을 위한 프라이머는 증폭되는 핵산분자의 유전자 코드 진행방향과 동일한 센스 가닥으로부터 선택되는 포워드 프라이머(또는 센스 프라이머) 및 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로부터 선택되는 리버스 프라이머(또는 안티센스 프라이머)의 쌍이 사용되고, 프라이머 연장반응의 경우 통상적으로 단일한 연장용 프라이머가 사용된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "태그(tag)"는 특정 단일염기다형을 특이적으로 구분하기 위해 대립유전자 특이적 프라이머의 5'-말단에 부가되는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 상기 태그는 대응되는 단일염기다형 뉴클레오티드에 따른 고유의 핵산서열을 가지고 있으며, 상기 핵산서열은 증폭 대상 핵산과 연장용 프라이머를 제외한 다른 프라이머와 상동성이 존재하지 아니하여 비특이적 증폭반응을 최소화하도록 고안될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "단일염기다형(single nucleotide polymorphism, SNP"는 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A,T,G,C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미한다. 통상적으로 인구집단에서 1% 이상의 빈도로 존재하는 2개 이상의 대립 유전자(allele)가 발생하는 위치를 SNP라고 하는데, 대립유전자형이 5%이상의 빈도로 존재하는 경우 보통 다형(common polymorphism)이라고 하고, 1~5%인 경우 희박 다형(rare polymorphism)으로 분류한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "대립유전자(allele)"란 동일 유전자 또는 동일 유전학적 좌위(genetic locus)에서의 일군의 선택적인 형태 중의 어느 하나를 의미한다. 때때로 다른 대립유전자들은 다른 관찰 가능한 표현형적 특성을 야기할 수 있다. 그러나 대부분의 유전학적 변이는 관찰 가능한 변이를 거의 유발하지 않는다. 본 문서에서 사용되는 "단일염기다형 제1대립유전자" 및 "단일염기다형 제2대립유전자"는 단일염기다형 부위의 염기의 변이에 의해 발생하는 복수의 대립유전자를 임의의 순서로 구분한 것으로서, 어느 하나가 주요 대립유전자(빈도수가 높은 대립유전자 또는 야생형)일 경우 다른 하나는 소수 대립유전자(빈도수가 낮은 대립유전자 또는 돌연변이형)일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "ASBPE(allele specific bidirectional primer extension)"은 SNP 상의 변이 여부 및 종류를 확인할 수 있는 대립유전자 특이적 양"눰? 프라이머 연장 반응을 의미하며 상기 연장반응에 의해 연장된 핵산 분자를 연장에 사용한 연장용 프라이머 내에서 선택되는 프라이머쌍으로 증폭함으로써 SNP 상의 변이 여부 및 종류를 확인하는 것이 가능하다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머;
ii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머; 및
iii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
상기 단일염기다형 검출용 키트는 iv) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
상기 단일염기다형 검출용 키트에 있어서, 상기 단일염기다형은 야생형 또는 돌연변이형일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머;
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머;
iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머; 및
iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 a) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 b) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
상기 단일염기다형 검출용 키트는 v) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
상기 연장 폴리뉴클레오티드의 길이는 20 내지 200 nt, 30 내지 150 nt, 또는 40 내지 100 nt일 수 있다.
상기 단일염기다형 검출용 키트에 있어서, 상기 제1대립유전자는 야생형이고 상기 제2대립유전자는 돌연변이형일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머; 및
v) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
상기 단일염기다형 검출용 키트는 vi) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 포워드 프라이머 및 vii) 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제2연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드는 전기영동 후 크기를 구분할 수 있을 정도로 그 길이가 차이가 날 수 있다. 예컨대, 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드의 크기가 20 내지 50 nt일 경우 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드의 크기는 70 내지 200 nt일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머;
v) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머; 및
vi) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 공통의 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머;를 포함하는, 단일염기다형 검출용 키트가 제공된다.
상기 단일염기다형 검출용 키트는 반응완충액, dNTP 혼합물 및 열안정성 DNA 폴리머라제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머, b) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머, c) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머 및 d) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, b) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, c) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머, d) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 1) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 2) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머, 및 e) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머, b) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, c) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머, d) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머, e) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머, f) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 포워드 프라이머; 및 g) 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제2연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
상기 단일염기다형 검출 방법에 있어서,
상기 PCR을 수행하는 단계는 최적의 혼성화 조건을 탐색하기 위해, 어닐링 온도의 구배를 둔 복수의 반응으로 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머, 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머를 이용하여 증폭 대상 핵산분자의 대립유전자 특이적인 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
ii) 상기 대립유전자 특이적인 PCR 반응의 산물에 대하여 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머를 이용하여 프라이머 연장반응을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
상기 단일염기다형 검출 방법은,
iii) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머 및 상기 리버스 프라이머를 이용하여 상기 연장반응 산물을 증폭하는 연장반응물 증폭용 PCR 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 단일염기다형 대립유전자 특이적 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 a) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 b) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머를 이용하여 상기 단일염기다형 대립유전자 특이적 PCR 반응 산물에 대한 프라이머 연장반응을 수행하는 단계;를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
상기 단일염기다형 검출 방법은,
iii) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머 및 상기 리버스 프라이머를 이용하여 상기 연장반응 산물을 증폭하는 연장반응물 증폭용 PCR 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
i) 증폭 대상 주형 핵산을 PCR 조건에서 증폭 대상 게놈과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머; PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 핵산서열로 구성되는 돌연변이형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머; 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 단일염기다형 특이적 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1연장용 프라이머; 및 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 겔 전기영동상 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머를 이용하여 상기 단일염기다형 특이적 PCR 반응의 반응 산물에 대한 프라이머 연장반응을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법이 제공된다.
상기 단일염기다형 검출 방법은,
iii) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 포워드 프라이머, 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제2연장산물 증폭용 포워드 프라이머 및 상기 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 상기 프라이머 연장반응의 산물을 증폭하는 프라이머 연장반응 산물 증폭용 PCR 반응 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 단일염기다형 검출방법에 있어서,
상기 단계 i 및 ii은 단일 반응용기 내에서 단일 단계로 수행될 수 있고, 상기 단계 i 내지 iii은 단일 반응용기 내에서 단일 단계로 수행될 수 있다.
상기 단일염기다형 검출방법에 있어서,
상기 단일염기다형 특이적 PCR 반응은 최적의 혼성화 조건을 탐색하기 위해, 어닐링 온도의 구배를 둔 복수의 반응으로 수행될 수 있다.
상기 단일염기다형 검출 방법은 상기 프라이머 연장반응의 산물 또는 연장반응 산물 증폭용 PCR 반응의 상물을 겔 상에 로딩하여 전기영동을 수행한 후 밴드 패턴을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로 상기 단일염기다형 검출 방법에 있어서, 상기 연장반응 산물 증폭용 PCR 반응은 통상의 PCR 또는 실시간 PCR에 의해 수행될 수 있다. 상기 실시간 PCR은 프라이머쌍 외에 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드에 각각 특이적으로 결합하는 TaqManⓡ 프로브를 사용하여 수행되거나, SyBr Green과 같은 형광 삽입제(fluorescent interchelate)를 이용하여 수행될 수 있다. 이 경우 형광 종류에 따라 상기 연장산물을 특이적으로 검출할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 증폭산물 형성 단계는 최적의 혼성화 조건을 탐색하기 위해, 어닐링 온도의 구배를 둔 복수의 반응으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 특별히 언급되지 않은 한, 복수의 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로 구성된 핵산분자는 5'-말단에서 3'-말단의 순서로 설명된다.
이하 본 발명의 일 실시예에 따른 키트 및 방법을 첨부된 도면을 통해 보다 상세히 설명한다.
도 1 내지 도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 단일염기다형 검출키트의 검출 대상 단일염기다형과 이를 증폭하기 위한 각종 프라이머들(도 1) 및 본 발명의 일실시예에 따른 단일염기다형 검출키드에 의해 수행되는 대립유전자 특이적 핵산 증폭반응(도 2) 및 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장반응 및 상기 대립유전자 특이적 비대칭 프라이머 연장산물의 증폭반응(도 3)을 예시적으로 도시한 개요도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 게놈 내에 특정 유전자의 특정 단일염기다형 부위에 있어서 야생형과 돌연변이형이 모두 존재하는 이형접합체의 경우를 상정할 수 있다. 도 1에 예시된 바와 같이, 야생형 대립유전자에는 C:G 염기쌍이 돌연변이형 대립유전자에는 C > A(상보가닥 측면에서는 G > T) 변이가 존재할 경우, 통상의 대립유전자 특이적 PCR 방법을 사용할 경우, 대립유전자 특이적인 형광 탐침을 이용한 프라이머의 사용 및 실시간 PCR을 통해 SNP의 유무를 확인할 수 있다. 이 경우 고가의 형광 탐침과 실시간 PCR 기기를 사용한다는 측면에서 비용상 불리하다. 반면 본 발명의 일 실시예에 따르면 대립유전자 특이적 프라이머(110 및 120)를 사용한다는 점에서는 통상의 대립유전자 특이적 PCR(AS-PCR)과 유사하나, 본 발명의 일 실시예에서는 대립유전자 특이적 프라이머의 5'-말단에 증폭 대상 주형 핵산에 존재하지 않는 고유의 식별 태그(112 및 122)를 사용함으로써, 형광 탐침이나 실시간 PCR의 사용 없이도, SNP의 유무 및 종류까지 확인할 수 있다. 야생형 특이적 포워드 프라이머(110) 및 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(120)의 경우 각각 3'-말단이 상기 단일염기다형에 있어서 야생형 및 돌연변이형 뉴클레오티드이기 때문에, 실제 야생형 특이적 포워드 프라이머(110)는 야생형 대립유전자만 선택적으로 증폭할 수 있고 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(120)는 돌연변이형 대립유전자만 선택적으로 증폭할 수 있다(도 2). 이 때, 공통의 리버스 프라이머(130)은 야생형 대립유전자 및 돌연변이형 대립유전자를 모두 증폭할 수 있게 해준다. 한편, 종래의 AS-PCR의 경우 야생형 특이적 프라이머 또는 돌연변이형 특이적 프라이머만 사용하여 단일 반응으로 PCR을 수행하기 때문에 야생형 단일염기다형을 가지고 있는지 아니면 돌연변이형 단일염기다형을 가지고 있는지 구분하기 위해 PCR 반응을 분리하여 수행하여야 하며, 단일반응으로 해당 단일염기다형 부위에 대하여 동형접합인지 이형접합인지 여부를 확인할 수 없었다. 도 2 및 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 키트에서는 두 대립유전자 특이적 포워드 프라이머(110 및 120) 중 어느 하나(도 1에서는 야생형 특이적 프라이머, 110)의 5'-말단의 식별 핵산서열인 태그 올리고뉴클레오티드(112, 상기 태그올리고뉴클레오티드는 증폭 대상 핵산분자를 포함한 게놈 DNA 및 리버스 프라이머와는 상보결합을 하지 않는다)를 3'-말단으로 포함하고 상기 AS-PCR에 의해 증폭된 PCR 산물의 길이를 연장하기 위한 연장 올리고뉴클레오티드(161)를 5'-말단으로 포함하는 연장용 프라이머(160)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 연장 프라이머(160)의 태그 올리고뉴클레오티드와 대립유전자 특이적 PCR 반응 산물 중 야생형 증폭 산물의 안티센스 가닥(141)의 상기 태그 올리고뉴클레오티드와 상보결합 서열 사이의 상보결합 후 프라이머 연장반응을 수행할 경우, 대립유전자 특이적 양"눰? 프라이머 연장반응(allele-specific bidreactional primer extension, ASBPE)이 수행된다(도 3의 상단). 상기 대립유전자 특이적 양"눰? 프라이머 연장반응이 완료되면, 이를 곧바로 아가로스 젤 전기영동에 의해 확인하는 것이 가능하다. 선택적으로 연장 올리고뉴클레오티드(161)의 5'-말단의 고유의 핵산서열 중에서 선택되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머(200)과 상기 대립유전자 특이적 증폭에 사용되었던 리버스 프라이머(130)를 이용하여 연장산물을 증폭할 경우 상기 ASBPE 산물에 대한 증폭을 통해 보다 확실하게 특정 대립유전자 특이적 연장산물을 검출할 수 있다. 이때, ASBPE 반응만으로 검출하는 경우와 연장산물 증폭반응까지 수행하여 검출하는 경우 사용되는 프라이머의 농도를 적절히 조절함으로써 최적의 검출 조건을 수립할 수 있다.
실제 상기 도 1 내지 3에 도시된 본 발명의 일 실시예의 방법에 따라 이형접합인 단일염기다형 부위를 특이적으로 증폭한 실험결과가 도 9에 도시되어 있다. 도 9에 도시된 바와 같이, 야생형 대립유전자는 대립유전자 특이적 PCR(AS-PCR)로 증폭되었고(115 bp), 돌연변이형 대립유전자는 본 발명의 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 PCR 반응으로 증폭되었다(115 + 117 bp).
도 4 내지 7은 본 발명의 다른 일 실시태양을 도시한 것이다. 도 4이 도 1과 다른 점은 연장용 프라이머가 야생형 뿐만 아니라 돌연변이형에도 적용되어 두 개의 연장용 프라이머가 사용되고 있다는 점이다. 따라서, 야생형 및 돌연변이형 모두 대립유전자 특이적 PCR 이후 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 PCR을 통해 증폭이 된다는 점이다. 도 5는 대립유전자 특이적 PCR 과정을 도식적으로 나타낸 개요도이고, 도 6은 대립유전자 특이적 양"눰? 프라이머 연장반응 과정을 도식적으로 나타낸 개요도이며, 도 7은 상기 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응의 산물에 대한 PCR 과정을 도식적으로 나타낸 개요도이다. 도 8은 AS-PCR와 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 PCR에 의해 야생형 및 돌연변이형 대립유전자를 증폭한 후 아가로스 겔 전기영동을 할 경우 예상되는 밴드패턴을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4에 도시된 바와 같이, 야생형 특이적 포워드 프라이머(110) 및 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(120)의 5'-말단 서열은 상기 증폭 대상 주형 핵산에 존재하지 않는 고유의 핵산서열로서 야생형 특이적 증폭산물 및 돌연변이형 특이적 증폭산물 고유의 태그 역할을 수행한다. 편의상 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머에 포함된 태그는 제1태그 올리고뉴클레오티드(112)로 정의하고, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머에 포함된 태크는 제2태그 올리고뉴클레오티드(122)로 정의한다. 만약, 해당 단일염기다형 부위에 복수의 돌연변이가 존재하는 경우 제3태그 올리고뉴클레오티드(미도시) 및/또는 제4태그 올리고뉴클레오티드(미도시)가 각각 추가될 수 있으며, 상기 제3태그 올리고뉴클레오티드가 포함된 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머는 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머와 구분을 위해 편의상 제2돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(미도시), 상기 제4태그 올리고뉴클레오티드가 포함된 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머는 제3돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(미도시)로 정의한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 제1태그 올리고뉴클레오티드(112) 및 제2태그 올리고뉴클레오티드(122)를 각각 포함하는 야생형 특이적 포워드 프라이머(110) 및 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(120)와 공통의 리버스 프라이머(130)에 의한 PCR 반응에 의해 야생형 증폭산물(140) 및 돌연변이형 증폭산물(150)이 산출된다(이 단계에서의 두 PCR-Product는 사이즈가 동일하여 겔 전기영동 상에서 밴드가 겹쳐 구분이 안됨). 제1태그 올리고뉴클레오티드(112) 및 제2태그 올리고뉴클레오티드(122)는 각각 프라이머 연장반응을 위해 사용되는 제1연장용 프라이머 및 제2연장용 프라이머의 3'-말단 서열로 사용된다. 따라서, 도 6에 도시된 바와 같이, 변성되어 단일가닥화된 야생형 증폭산물 안티센스 가닥(141)은 제1연장용 프라이머(161)의 3'-말단에 위치하는 제1태그 올리고뉴클레오티드(112)와 특이적으로 혼성화되고, 돌연변이형 증폭산물 안티센스 가닥(151)은 제2연장용 프라이머(170)의 3'-말단에 위치하는 제2태그 올리고뉴클레오티드(122)와 특이적으로 혼성화됨으로써 각각 제1연장산물(180) 및 제2연장산물(190)을 생성한다. 이 경우 제1연장용 프라이머(160)와 제2연장용 프라이머(170)는 그 길이가 상이하기 때문에, 제1연장산물(180)과 제2연장산물(190)은 겔 전기영동을 통해 밴드 패턴을 확인함으로써 구분이 가능하게 된다. 본 발명자는 이와 같은 대립유전자 특이적 프라이머 연장반응을 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응(allele specific bidirectional primer extension, ASBPE)로 명명하였다. 상기 ASBPE만으로도 단일염기다형을 검출할 수 있으나, 주형 핵산 분자의 농도가 낮을 경우 프라이머 연장반응만으로는 대립유전자 특이적 핵산분자의 검출이 어려울 수 있다. 이 경우 도 4에 도시된 바와 같이, 제1연장용 프라이머 및 상기 제2연장용 프라이머에서 각각 선택되는 고유의 핵산서열을 이용하여 제작된 연장산물 증폭용 프라이머(200)와 상술한 공통의 리버스 프라이머(130)를 이용하여 제1연장산물 및 제2연장산물을 증폭함으로써 보다 확실한 단일염기다형의 검출을 가능하게 할 수 있다. 이 경우 사용되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머(200)는 상기 제1연장용 프라이머 및 제2연장용 프라이머에 공통적으로 존재하는 서열을 이용하여 제작될 수 있고, 구분되는 고유의 핵산서열을 이용하여 제작될 수도 있다. 본 발명의 일 실시예를 예시적으로 도시하고 있는 도 4 및 도 7에는 제1연장용 프라이머(160) 및 제2연장용 프라이머(170)에 공통적으로 존재하는 서열을 이용하여 제작된 연장산물 증폭용 포워드 프라이머(200)만이 도시되어 있다.
상기 실시예에 따른 실제 실험결과는 도 10에 도시되어 있다. 도 10에 도시된 바와 같이, 동형접합 또는 이형접합의 UGT1A1*28을 대상으로 본 발명의 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 PCR 반응을 수행한 결과, 야생형 특이적 포워드 프라이머 및 연장 프라이머로는 야생형(181 bp)만이 검출되었고, 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머 및 연장 프라이머로는 돌연변이형(231 bp)만이 검출되었으며, 이형접합인 경우에는 두 대립유전자 모두 검출이 되었다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 복수의 대립유전자를 동시에 검출한 멀티플렉스 PCR 결과를 나타낸 것이다. UGT1A1*6과 UGT1A1*28을 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 PCR로 증폭한 결과, 두 대립유전자 모두 야생형과 돌연변이형을 정확히 구분하여 증폭할 수 있었다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
실시예 1: 증폭 대상 핵산분자의 대립유전자 특이적 증폭
본 발명자는 상술한 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응에 의해 단일염기다형(SNP)의 유무 및 종류를 신속하게 판정할 수 있는지 조사하기 위해, 우선, SNP가 있는 것으로 잘 알려진 BCR-ABL 유전자를 주형으로 대립유전자 특이적 PCR이 제대로 수행하는지 조사하였다.
구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 주형 DNA(인간 c-abl oncogene)의 318번째 뉴클레오티드에 해당되는 SNP(C > T)를 검출하기 위해 대립유전자 특이적 프라이머로 서열번호 2로 표시되는 C 특이적 프라이머 및 서열번호 3으로 표시되는 T 특이적 프라이머와 서열번호 4로 표시되는 리버스 프라이머를 이용한 대립유전자 특이적 PCR 반응을 통해 115 bp 크기의 증폭 산물을 생성하였다. 이때, 상기 두 포워드 프라이머는 모두 3'-말단으로부터 3번째 염기에 의도적인 미스매치(C > A)를 도입하였다. 이는, 대립유전자 특이적 프라이머의 증폭을 더욱 안정적으로 수행하도록 해주는 것으로 알려져 있다(Liu et al. Plant Methods 2012, 8:34, 2012). 아울러, 프라이머의 어닐링 온도의 최적화를 위해 복수의 반응물의 어닐링 온도를 순차적으로 조절한 온도 구배 PCR 반응을 수행하였다. 상기 반응은 세 번 수행되었다. PCR 반응액의 조성 및 반응조건은 표 1 및 2에 각각 표시되어 있다.
대립유전자 특이적 PCR 반응액 조성
PCR 조성
Sample # (μl) End-Conc.
5X PCR Buffer 10 1X
Go tag DNA polymerase 0.25 1.25U
dNTP Mix (10 mM) 1 200 μM
Template C, T 1 105 copy
Primer F 1 100nM
R 1 100nM
DI water 　
Total Vol. 50
대립유전자 특이적 PCR 반응 조건
온도 시간
95℃ 2 min
95℃ 30 sec 35cycle
53,55,57,59,61,63℃ 30 sec
72℃ 30 sec
72℃ 5 min
4℃ ∞
상기 온도 구배 AS-PCR 결과 도 9에 도시된 바와 같이, C 특이적 포워드 프라이머 및 T 특이적 포워드 프라이머는 각각 야생형 및 돌연변이형에서만 특이적인 증폭산물을 형성하였다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 프라이머는 제대로 작동을 하고 있음을 확인하였다. 한편, 최적의 어닐링 온도를 조사하기 위해 어닐링 온도에 대하여 온도 구배 PCR 반응을 수행한 결과 57℃ 정도의 온도가 야생형 및 돌연변이형 모두에서 최적인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 연장용 프라이머의 제작
본 발명자는 대립유전자 특이적 PCR에 이은 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응에 사용될 연장용 프라이머를 제조하였다. 구체적으로 주형 DNA로 인간 게놈 DNA와 서열 상동성이 낮은 서열번호 5로 표시되는 pBR322 플라스미드(Promega, USA)를 주형으로 하여 서열번호 6으로 표시되는 포워드 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 리버스 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 117 bp의 증폭산물을 생성하였다. 이 때, 상기 포워드 프라이머는 서열번호 8로 기재되는 상기 pBR322 플라스미드 DNA에 존재하는 상동서열과 이의 5'-말단에 부가되는 후술할 제2태그 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열인 제2태그 상보 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
실시예 3: 태그 포함 프라이머의 제작 및 이를 이용한 ASBPE 반응
본 발명자는 이에 상기 AS-PCR에 사용된 포워드 프라이머의 5'-말단에 인간 게놈 내의 어떠한 서열과도 상동성이 떨어져서 위양성을 나타내지 않을 고유의 핵산서열을 갖는 태그 올리고뉴클레오티드를 고안하여 대립유전자 특이적 PCR을 수행하였다. 상기 태그 올리고뉴클레오티드는 본 기술분야에서 집코드(ZIP Code) 서열로도 알려져 있는데, 상기 집코드 서열은 게놈 DNA의 염기서열에 없는 서열을 갖는 뉴클레오티드 올리고머로서 게놈 DNA와 비특이적으로 혼성화되지 않도록 설계된 서열이다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 후술하는 실시예들에서 사용된 집코드 서열들 이외에도 당업계에 알려진 다양한 코드 서열들을 사용하여 프라이머를 변형시킬 수 있음을 용이하게 이해할 것이다(참고문헌: Slentz-Kesler et al., Genome Res., 10: 549-557, 2010).
구체적으로 본 발명자들은 돌연변이형 대립유전자 특이적 프라이머(서열번호 9)는 상기 실시예 1에서 사용된 돌연변이 특이적 포워드 프라이머의 5'-말단에 상기 서열번호 8로 표시되는 제2태그 상보 올리고뉴클레오티드의 상보서열인 서열번호 10으로 표시되는 상기 돌연변이형 대립유전자를 식별할 수 있는 고유의 태그 올리고뉴클레오티드(제2태그 올리고뉴클레오티드)를 부가함으로써 제조하였다. 실시예 1에서 제조된 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기에서 제조된 돌연변이 대립유전자 특이적 프라이머, 상기 실시예 2에서 연장용 프라이머 제작을 위해 사용된 서열번호 7로 표시되는 리버스 프라이머(본 PCR에서는 연장산물의 증폭을 위한 포워드 프라이머로 작용함) 및 상기 실시예 1에서 사용된 공통의 리버스 프라이머를 이용하여, 어닐링 온도가 57℃로 고정된 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 도 10에서 나타난 것과 같이, 야생형 특이적 포워드 프라이머와 공통의 리버스 프라이머에 의해 대립유전자 특이적 PCR에 의해 증폭된 115 bp 크기의 단편과 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 반응에 의해 생성된 232 bp 크기의 단편이 모두 검출되었다.
실시예 4: UGT1A1 유전자의 SNP 분석
본 발명자들은 항암제인 이리노테칸에 대한 부작용과 상관관계가 있는 것으로 알려진 UDP 글루쿠로노실트랜스퍼레이즈 계열 1 구성원 A1(UGT1A1)의 SNP인 UGT1A1*28의 유전자형을 본 발명의 일 실시예에 따른 ASBPE 키트로 분석하였다.
구체적으로, UGT1A1*28에 대한 야생형 특이적 포워드 프라이머(서열번호 11) 및 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머(서열번호 12) 그리고 UGT1A1*28에 대한 리버스 프라이머(서열번호 13)를 이용하여, 대립유전자 특이적 PCR을 수행하였다.
그런 다음 야생셩 대립유전자 및 돌연변이형 대립유전자에 대하여 각각 야생형 특이적 연장 프라이머(서열번호 14) 및 돌연변이형 특이적 연장 프라이머(서열번호 15)를 이용하여 프라이머 연장반응을 수행하였다.
마지막으로 상기 야생형 연장산물 및 돌연변이형 연장산물을 대상으로 공통의 연장산물 특이적 포워드 프라이머(서열번호 16) 및 상기 리버스 프라이머(서열번호 13)를 이용하여 연장산물 증폭을 수행하였다.
그러나 상기 세 가지 반응은 순차적으로 일어나는 게 아니라 하나의 반응튜브 내에서 하나의 단계로 하기의 조건을 이용하여 수행되었다.
대립유전자 특이적 ASBPE-PCR 반응 조건
95℃ 10min 사이클수
95℃ 30sec 35 cycle
58℃ 30sec
72℃ 30sec
72℃ 5min
4℃ ∞
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 ASBPE 키트를 이용하여 돌연변이형 대립유전자를 증폭할 수 있고 AS-PCR을 이용하여 야생형 대립유전자를 동시에 증폭하면서 이 둘을 명확하게 구분할 수 있음을 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: UGT1A1 유전자의 SNP 멀티플렉스 분석
아울러, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 ASBPE 키트로 두 가지 대립유전자의 유전자형을 동시에 검출할 수 있는 multiplex 분석이 가능한지 확인하기 위해, UGT1A1*6 및 UGT1A1*28의 야생형 게놈 DNA를 단독 또는 혼합하여 대립유전자 특이적 PCR을 단독 또는 멀티플렉스로 수행하였고, 돌연변이형 게놈 DNA를 단독 또는 혼합하여 본 발명의 일 실시예에 따른 ASBPE 키트를 이용하여 멀티플렉스로 수행하였다.
구체적으로 UGT1A1*6 야생형 및 UGT1A1*28 야생형 게놈 DNA를 단독 또는 혼합한 후 각각의 야생형 대립유전자 특이적 포워드 프라이머(서열번호 17 및 11)와 리버스 프라이머(서열번호 18 및 서열번호 13 )로 표 4에 기재된 조건을 이용하여 대립유전자 특이적 PCR를 수행하였다. 그 결과, 도 11의 상단에 나타난 바와 같이, AS-PCR로도 UGT1A1*6 야생형 및 UGT1A1*28 야생형 게놈 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있었다. 아울러, 본 발명자들은 UGT1A1*6 돌연변이형 및 UGT1A1*28 돌연변이형 게놈 DNA를 단독 또는 혼합한 후 각각의 돌연변이형 대립유전자 특이적 포워드 프라이머(서열번호 19 및 12), 공통의 리버스 프라이머(서열번호 13), UGT1A1*6 돌연변이형 및 UGT1A1*28 돌연변이형 특이적 연장용 프라이머(서열번호 20 및 15) 및 상기 UGT1A1*6 및 UGT1A1*28 각각의 돌연변이형 대립유전자 특이적 연장용 프라이머의 5'-말단에 공통적으로 존재하는 공통서열을 이용한 연장산물 증폭용 포워드 프라이머(서열번호 16)를 이용하여 돌연변이형 대립유전자 특이적 연장 PCR(ASBPE-PCR) 반응을 상기 표 3에 나타난 조건을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 11의 하단에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 연장 PCR 키트는 단독 또는 멀티플렉스 모두에서 UGT1A1*6 및 UGT1A1*28 각각의 돌연변이형 대립유전자를 명확하게 검출할 수 있었다. 더구나 상기 결과는 대립유전자 특이적 PCR, 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장 반응 및 상기 연장 반응의 산물에 대한 PCR 증폭을 하나의 PCR 공정을 통해 수득된 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법 및 키트가 종래의 AS-PCR과 동일한 시간에 멀티플렉스로 야생형과 돌연변이형을 구분할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 SNP를 동시에 검출하는데 사용될 수 있음을 입증하였다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 대립유전자 특이적 양방향 프라이머 연장반응은 특정 증폭 대상 핵산분자 내의 특정 위치의 SNP의 존재 여부 및 종류를 정확하게 판정하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 더구나, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법은 단일한 튜브 내에서 단일한 반응으로 수행될 수 있을 뿐만 아니라고 고가의 기기를 사용하지 않고서도 간단한 겔 전기영동 후 밴드 패턴을 확인함으로써 손쉽고 저렴하게 사용될 수 있다는 점에서 매우 경제적인 방법이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 방법 및 키트는 다양한 동식물 특히 인간에서의 SNP 검출에 이용될 수 있을 뿐만 아니라 이를 이용한 질병의 진단 약물 반응성의 예측 등에 사용될 수 있다.
서열번호 1 내지 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 키트 및 방법에 사용되는 프라이머들의 핵산서열이다.

Claims (23)

  1. i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머;
    ii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머; 및
    iii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    iv) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 추가로 포함하는 단일염기다형 검출용 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단일염기다형은 야생형 또는 돌연변이형인, 단일염기다형 검출용 키트.
  4. i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머;
    ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형제2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머;
    iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머; 및
    iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 a) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 b) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트.
  5. 제3항에 있어서,
    v) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 추가로 포함하는 단일염기다형 검출용 키트.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 제1대립유전자는 야생형이고 상기 제2대립유전자는 돌연변이형인, 단일염기다형 검출용 키트.
  7. i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
    ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리핵산서열로 구성되는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
    iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
    iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머; 및
    v) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머;를 포함하는 단일염기다형 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    vi) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 포워드 프라이머 및 vii) 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제2연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 추가로 포함하는, 단일염기다형 검출용 키트.
  9. i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머;
    ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리핵산서열로 구성되는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머;
    iii) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머;
    iv) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머;
    v) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머; 및
    vi) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 공통의 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머;를 포함하는, 단일염기다형 검출용 키트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    반응완충액, 디뉴클레오티드 혼합물 및 열안정성 DNA 폴리머라제를 추가로 포함하는, 단일염기다형 검출용 키트.
  11. i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머, b) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머, c) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머 및 d) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
    ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법.
  12. i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, b) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, c) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머, d) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 1) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 2) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머, 및 e) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
    ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법.
  13. i) a) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머, b) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 올리핵산서열로 구성되는 돌연변이형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, c) 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머, d) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제1연장용 프라이머, e) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서, 겔 전기영동상 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머, f) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 포워드 프라이머; 및 g) 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제2연장산물 증폭용 포워드 프라이머를 증폭대상 핵산이 포함된 시료, dNTP 혼합물, 열안정 DNA 폴리머라제 및 반응 완충액이 포함된 반응액에 혼합하는 단계; 및
    ii) PCR을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PCR을 수행하는 단계는 최적의 혼성화 조건을 탐색하기 위해, 어닐링 온도의 구배를 둔 복수의 반응으로 수행되는, 단일염기다형 검출 방법.
  15. i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 특이적 포워드 프라이머, 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 리버스 프라이머를 이용하여 증폭 대상 핵산분자의 대립유전자 특이적인 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
    ii) 상기 대립유전자 특이적인 PCR 반응의 산물에 대하여 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머를 이용하여 프라이머 연장반응을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    iii) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머 및 상기 리버스 프라이머를 이용하여 상기 연장반응 산물을 증폭하는 연장반응물 증폭용 PCR 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 단일염기다형 검출 방법.
  17. i) PCR 조건에서 증폭 대상 핵산과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 제1대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 단일염기다형 대립유전자 특이적 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
    ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 단일염기다형 제1대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 상기 단일염기다형 제2대립유전자 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 연장 폴리뉴클레오티드 및 a) 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 b) 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 연장용 프라이머를 이용하여 상기 단일염기다형 대립유전자 특이적 PCR 반응 산물에 대한 프라이머 연장반응을 수행하는 단계;를 포함하는 단일염기다형 검출 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    iii) 상기 연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 연장산물 증폭용 포워드 프라이머 및 상기 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 상기 프라이머 연장반응 산물을 증폭하는 연장산물 증폭용 PCR 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 단일염기다형 검출 방법.
  19. i) 증폭 대상 주형 핵산을 PCR 조건에서 증폭 대상 게놈과 혼성화화지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제1태그 올리고뉴클레오티드 및 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 단일염기다형 부위의 야생형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 야생형 특이적 핵산서열로 구성되는 야생형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 야생형 특이적 포워드 프라이머; PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드와 혼성화하지 않는 핵산서열로 구성되는 5'-말단의 제2태그 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 대상 핵산과 특이적으로 혼성화가 가능하고 상기 단일염기다형 부위의 돌연변이형 뉴클레오티드를 3'-말단으로 포함하는 돌연변이형 특이적 핵산서열로 구성되는 돌연변이형 서열 증폭용 올리고뉴클레오티드로 구성되는 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머; 및 상기 증폭 대상 주형 핵산을 증폭하기 위한 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 단일염기다형 특이적 PCR 반응을 수행하는 단계; 및
    ii) PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열인 제1연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1태그 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1연장용 프라이머; 및 PCR 조건에서 상기 증폭 대상 주형 핵산, 상기 야생형 특이적 포워드 프라이머, 상기 돌연변이형 특이적 포워드 프라이머, 및 상기 리버스 프라이머 중 어느 것과도 혼성화하지 않는 핵산서열로서 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드와 겔 전기영동상 구분되는 길이를 갖는 제2연장 폴리뉴클레오티드 및 상기 제2태그 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제2연장용 프라이머를 이용하여 상기 단일염기다형 특이적 PCR 반응의 반응 산물에 대한 프라이머 연장반응을 수행하는 단계를 포함하는 단일염기다형 검출 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    iii) 상기 제1연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제1연장산물 증폭용 포워드 프라이머, 및 상기 제2연장 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되는 핵산서열로 구성되는 제2연장산물 증폭용 포워드 프라이머 및 상기 공통의 리버스 프라이머를 이용하여 상기 프라이머 연장반응의 산물을 증폭하는 프라이머 연장반응 산물 증폭용 PCR 반응 단계를 추가로 포함하는 단일염기다형 검출 방법.
  21. 제15항, 제17항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 i 및 ii은 단일 반응용기 내에서 단일 단계로 수행되는, 단일염기다형 검출 방법.
  22. 제16항, 제18항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 i 내지 iii은 단일 반응용기 내에서 단일 단계로 수행되는, 단일염기다형 검출 방법.
  23. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일염기다형 특이적 PCR 반응은 최적의 혼성화 조건을 탐색하기 위해, 어닐링 온도의 구배를 둔 복수의 반응으로 수행되는, 단일염기다형 검출 방법.
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