KR20230077422A - 무세포 dna 검출용 유니버셜 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 무세포 DNA 검출용 유니버셜 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 시료 내에 적은 양으로 존재하는 무세포 DNA를 높은 민감도로 경제적으로 검출하고, 무세포 DNA의 농도가 수술 후 암 환자에서 림프관, 신경 및 혈관 등으로의 전이에 따라 달라짐으로써, 암 환자의 수술 후 전이 여부를 확인하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 무세포 DNA 검출용 유니버셜 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포의 괴사, 세포자살, 분비에 의해 혈액, 림프액, 소변 등에서 세포의 존재 여부와 관계없이 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)가 검출된다. 일반적으로 건강한 사람의 혈액 속 무세포 DNA는 매우 낮은 농도로 존재하지만 암 환자에서는 5~10배 이상 높게 나타나며, 만성 염증을 비롯한 다른 요인에 의해서도 증가한다고 알려져 있다. 차세대염기서열분석법(NGS)과 디지털 PCR(dPCR) 기술의 발전으로 미량의 DNA 분석이 가능해지면서 무세포 DNA의 분석연구가 가속화되고 있다.
혈액 속에 존재하는 무세포 DNA는 1948년에 알려졌으나, 혈액에 미량 존재하기 때문에 초기 서열분석 기술로는 분석이 어려웠고, 이를 종양의 생체지표로 이용하기에는 분석의 일관성이나 신뢰성이 부족하였다. 하지만 최근 분자진단기술이 발전함에 따라 BEAMing 기법이나, PAP, 디지털 PCR(dPCR), TAM-Seq 등의 고감도 분석 기법들이 개발되어 미량의 무세포 DNA를 검출하거나 정량하는 것이 가능해졌다. 따라서, 무세포 DNA를 임상적으로 적용하기 위한 연구들이 다수 진행되고 있다.
무세포 DNA 분석의 임상적 적용 분야는 조기검진, 진단, 동반진단, 예후추적 등으로 나뉘는데, 현재 동반진단과 치료의 예후 분석 분야가 가장 활발히 연구되고 있다. 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-2029393호는 무세포 DNA에서 순환종양 DNA(circulating tumor DNA)를 검출하는 방법에 관한 것으로, 차세대염기서열분석법을 이용하여 순환종양 DNA 검출의 정확도를 높이고, 매우 낮은 농도의 순환종양 DNA를 검출하여 암의 발병 여부, 발병 위험성 및 예후 판단에 사용될 수 있음을 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 무세포 DNA 검출용 유니버셜 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 8로 기재된 염기서열(5'-GAGCATCCAGAGACTTCCANNNNNN-3')로 구성되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 포함하는 무세포 DNA 검출용 유니버셜 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 무세포 DNA 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 무세포 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 무세포 DNA 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수술 후 종양 세포 침윤 확인용 조성물 및 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 개체로부터 분리된 수술 전과 후 시료에서 무세포 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 수술 후 종양 세포의 침윤 확인 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 시료 내에 적은 양으로 존재하는 무세포 DNA를 높은 민감도로 경제적으로 검출하고, 무세포 DNA의 농도가 수술 후 암 환자에서 림프관, 신경 및 혈관 등으로의 전이에 따라 달라짐으로써, 암 환자의 수술 후 전이 여부를 확인하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제작된 2세트의 유니버셜 프라이머 세트를 이용하여 인플루엔자 A 바이러스의 유전자를 증폭시킨 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제작된 두번째 유니버셜 프라이머 세트를 이용하여 293T 세포주의 DNA를 무작위 증폭한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제작된 첫번째 유니버셜 프라이머 세트를 이용하여 293T 세포주의 DNA를 무작위 증폭한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 암 환자의 수술 전과 후의 혈장시료로부터 무세포 DNA의 농도 변화를 확인한 결과 그래프이다(cfDNA kit: 나노 드랍 정량 결과, cfDNA kit+qPCR: qPCR 방법 정량 결과).
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 암 환자의 수술 전과 후의 혈장시료로부터 종양 세포의 침윤 여부에 따른 무세포 DNA의 농도 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제작된 두번째 유니버셜 프라이머 세트를 이용하여 293T 세포주의 DNA를 무작위 증폭한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제작된 첫번째 유니버셜 프라이머 세트를 이용하여 293T 세포주의 DNA를 무작위 증폭한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 암 환자의 수술 전과 후의 혈장시료로부터 무세포 DNA의 농도 변화를 확인한 결과 그래프이다(cfDNA kit: 나노 드랍 정량 결과, cfDNA kit+qPCR: qPCR 방법 정량 결과).
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 암 환자의 수술 전과 후의 혈장시료로부터 종양 세포의 침윤 여부에 따른 무세포 DNA의 농도 변화를 확인한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 8로 기재된 염기서열(5'-GAGCATCCAGAGACTTCCANNNNNN-3') 구성되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 포함하는 무세포 DNA 검출용 유니버셜 프라이머 세트를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유니버셜 프라이머(universal primer)"는 검출하고자 하는 표적 서열이 알려지지 않거나, 다양한 표적 서열로 구성된 염기를 검출하기 위한 프라이머를 의미한다. 상기 유니버셜 프라이머는 유니버셜 프라이머 부분과 랜덤 서열로 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 유니버셜 프라이머는 프라이머를 구성하는 랜덤 서열이 무작위 증폭을 위한 표적 서열에 결합하여 상보적인 서열을 제작하면, 제작된 서열은 유니버셜 프라이머 부분을 포함하여 다음 증폭이 수행될 수 있도록 할 수 있다.
즉, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 유니버셜 프라이머 부분에, 상기 서열의 3'-말단에 랜덤 서열이 연결된 것일 수 있다. 이때, 상기 랜덤 서열은 6개의 염기로 구성되는 무작위 서열일 수 있고, 일례로, 상기 랜덤 서열은 서열번호 5로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 6으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 정방향 프라이머를 구성하는 염기 중, N은 A, T, G 또는 C일 수 있고, M은 A 또는 C일 수 있다. 유니버셜 프라이머 부부분에 랜덤 서열을 연결하는 방법은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다.
한편, 상기 정방향 프라이머는 유니버셜 프라이머 부분 및 랜덤 서열 사이에 필요에 따라 링커를 더 포함할 수 있다. 상기 링커는 0 내지 3개, 0 내지 2개, 1 내지 3개, 또는 2 내지 3개의 염기로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)"는 세포핵 안에 존재하지 않고 혈액에 떠돌아 다니는 DNA 조각을 의미하는 것으로, 세포유래 DNA, 세포프리 DNA 등으로도 불린다. 무세포 DNA는 정상인의 혈액 내에서는 낮은 농도를 유지하는 반면, 급성 외상, 뇌경색, 운동, 이식, 감염, 질병 등에 의해 농도가 증가하는 것으로 알려져 있어 태아의 성별, 유전자 변이나 염색체 수 이상을 검출하기 위한 비침습적 산전검사에 사용되고 있다.
상기 무세포 DNA는 유래된 조직에 따라 다양한 염기서열로 구성될 수 있고, 체내에 미량으로 존재할 수 있다. 즉, 본 발명은 이와 같은 무세포 DNA를 프라이머를 사용하여 증폭 후, 검출함으로써 미량으로 존재하더라도 경제적으로 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 8로 기재된 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머는 증폭능력을 유지하는 한, 이들 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 또한, 상기 프라이머를 구성하는 염기가 치환, 결실 또는 삽입된 변이체를 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 무세포 DNA 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 무세포 DNA 검출용 조성물 및 키트에 포함되는 프라이머 세트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 8로 기재된 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 본 발명에 따른 프라이머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 무세포 DNA 검출용 키트는 이에 포함되는 프라이머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 무세포 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 무세포 DNA 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 무세포 DNA 검출 방법에 사용되는 프라이머 세트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 8로 기재된 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 시료는 무세포 DNA를 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물, 구체적으로 인간 유래의 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한, 상기 등온 증폭은 통상적인 방법으로 제조된 반응물을 사용하여 수행될 수 있다. 일례로, 상기 반응물은 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 반응물에 포함되는 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등은 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수술 후 종양 세포 침윤 확인용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 수술 후 종양 세포 침윤 확인용 조성물 및 키트에 포함되는 프라이머 세트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 8로 기재된 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물 및 키트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 침윤은 원발성 종양의 세포가 다른 조직으로 이동한 것을 의미하며, 침윤, 전이 등의 용어로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 종양은 악성 종양일 수 있다. 일례로, 상기 침윤은 원발성 종양이 림프관, 신경 또는 혈관 등으로 침윤된 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 개체로부터 분리된 수술 전과 후 시료에서 무세포 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 수술 후 종양 세포의 침윤 확인 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 수술 후 종양 세포의 침윤 확인 방법에 사용되는 프라이머 세트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 8로 기재된 염기서열로 구성되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 포함할 수 있다.
또한, 상기 시료는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 시료는 수술 후 암 환자의 종양 세포 침윤을 확인하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물, 구체적으로 인간 유래의 시료일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예
1.
유니버셜
프라이머의
제작
2세트의 유니버셜 프라이머를 제작하고, 제작된 프라이머의 증폭능력을 다음과 같이 비교하였다.
먼저, 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 19개 염기로 구성되는 서열번호 2 및 4로 기재되는 유니버셜 프라이머를 제작하고, 제작된 유니버셜 프라이머에 인플루엔자 A 바이러스에 특이적인 서열을 연결하여 서열번호 1 및 3으로 기재되는 유니버셜-랜덤 프라이머를 제작하였다. 상기 제작된 유니버셜 프라이머를 역방향 프라이머로, 유니버셜-랜덤 프라이머를 정방향 프라이머로 사용하여 인플루엔자 A 바이러스를 다음과 같이 증폭시켰다.
| 프라이머 | 서열(5'→3') | 서열번호 | |
| 세트 1 | 유니버셜-랜덤 프라이머-1 | GAGCATCCAGAGACTTCCACCTTGCAGTCCAACGGTAGGCAC | 서열번호 1 |
| 유니버셜 프라이머-1 | GAGCATCCAGAGACTTCCA | 서열번호 2 | |
| 세트 2 | 유니버셜-랜덤 프라이머-2 | GACCATCTAGCGACCTCCACCTTGCAGTCCAACGGTAGGCAC | 서열번호 3 |
| 유니버셜 프라이머-2 | GACCATCTAGCGACCTCCA | 서열번호 4 | |
구체적으로, 8 ㎕의 인플루엔자 A 바이러스 DNA, 3.75 μM의 정방향 유니버셜 프라이머, 87.5 μM의 역방향 유니버셜 프라이머, 0.4 ㎕의 NFW(nuclease free water), 및 10 ㎕의 SensiFAST SYBR® No-ROX 믹스(Bioline, 미국)를 혼합하여 실시간 PCR을 위한 조성물을 준비하였다. 준비된 조성물로 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조건으로 1회 고해상도 용융 분석(high resolution melting) 수행을 LightCycler® 장치를 이용하여 실시간 PCR을 수행하고, 결과 데이터는 LightCycler® 96 어플리케이션 소프트웨어로 분석한 결과와, PCR 산물을 아가로스겔에 전기영동한 결과를 도 1에 나타내었다.
| 단계 | 온도 | 시간 | 반복횟수 |
| 전변성 | 95℃ | 3분 | 1회 |
| 변성 | 95℃ | 5초 | 40회 |
| 어닐링/신장 | 50℃ | 30초 |
도 1에 나타난 바와 같이, 첫번째 유니버셜 프라이머 세트를 이용한 경우에는 인플루엔자 A 바이러스의 유전자가 특이적으로 증폭되었으나, 두번째 유니버셜 프라이머 세트는 인플루엔자 A 바이러스의 유전자를 증폭시키지 못했다.
실시예
2. 무작위 서열 증폭 효과 확인
상기 실시예에서 제작된 2세트의 유니버셜 프라이머를 이용하여 293T 세포주의 유전자를 주형으로 사용하여 무작위 서열 증폭 효과를 확인하였다.
먼저, 서열번호 2 또는 4로 기재되는 유니버셜 프라이머의 3'-말단에 랜덤 서열로서, 6개의 염기(서열번호 5: 5'-MNNMNM-3')가 결합된 프라이머를 통상적인 방법으로 제작하였다. 이후, 유니버셜-랜덤 프라이머를 정방향 프라이머로, 유니버셜 프라이머를 역방향 프라이머로 사용하여 무작위 서열에 대한 증폭 효과를 확인하였다. 한편, 293T 세포주를 배양한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 QIAamp® DNA 미니 키트(QIAGEN, 독일)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 10배씩 연속희석하여 주형으로 사용하고 상기 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다. 그 결과, 수득된 실시간 PCR 결과를 3회 반복 수행한 평균값으로 도 2 및 3에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열(5'→3') | 서열번호 | |
| 세트 1 | 유니버셜-랜덤 프라이머2-1 | GAGCATCCAGAGACTTCCAMNNMNM | 서열번호 6 |
| 유니버셜 프라이머-1 | GAGCATCCAGAGACTTCCA | 서열번호 2 | |
| 세트 2 | 유니버셜-랜덤 프라이머2-2 | GACCATCTAGCGACCTCCAMNNMNM | 서열번호 7 |
| 유니버셜 프라이머-2 | GACCATCTAGCGACCTCCA | 서열번호 4 | |
그 결과, 도 2 및 3에 나타난 바와 같이, 첫번째 유니버셜 프라이머 세트를 사용하여 실시간 PCR을 수행한 경우가 두번째 세트를 사용한 경우보다 Cq 값이 유의적으로 낮아 더 우수한 증폭 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실험예
1.
무세포
DNA 검출 효과 확인
상기에서 무작위 증폭 효과가 확인된 첫번째 유니버셜 프라이머 세트를 사용하여 혈액 내 무세포 DNA의 검출 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 24명의 암환자로부터 수술 전(prepop)과 수술 2일 후(postop)에 혈장을 각각 수득하여, 상기 서술한 바와 같이 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 주형으로 서술한 바와 같이 첫번째 유니버셜 프라이머 세트를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 이용하여 윌콕슨 순위합 검정(wilcoxon rank sum test) 방법으로 p값을 나타내었다. 한편, 대조군으로서는 나노 드랍(nano drop) 분석을 DS-11FX 분광광도계(DeNovix, 미국)를 사용하여 통상적인 방법으로 수행하여 무세포 DNA의 농도를 확인하였다. 그 결과, 확인된 무세포 DNA의 농도를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 실시간 PCR로 무세포 DNA의 농도를 정량한 경우가 나노드랍 방법으로 확인한 경우와 비교하여 더 미량의 무세포 DNA도 검출할 수 있엇다. 따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 유니버셜 프라이머가 무세포 DNA를 효과적으로 검출하고, 무세포 DNA를 정확하게 정량할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예
2. 수술 후
환자에서의
무세포
DNA 농도변화 확인
상기 첫번째 유니버셜 프라이머 세트를 사용하여 수술 후 환자에서의 무세포 DNA 농도변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실험은 상기 실험예 1에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 실시간 PCR 결과를 이용하여 윌콕슨 부호 순위 검정법(wilcoxon matched pairs signedranks test) 방법으로 p값을 나타내었다. 그 결과, 종양의 침윤 부위에 따른 무세포 DNA의 농도변화를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 림프관, 신경 또는 혈관까지 종양이 침윤된 경우(positive)에는 수술 전과 후에 무세포 DNA 농도에 큰 변화가 없었으나, 침윤되지 않은 경우(negative)에는 수술 후에 무세포 DNA 농도가 유의적으로 증가하였다.
따라서, 상기 결과로부터 환자의 혈장에 존재하는 무세포 DNA의 농도를 수술 전과 후에 정량함으로써 종양의 전이를 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> UNIVERSAL PRIMER SET FOR DETECTING CELL FREE DNA AND USE THEREOF
<130> DP210559
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal random primer-1
<400> 1
gagcatccag agacttccac cttgcagtcc aacggtaggc ac 42
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal primer-1
<400> 2
gagcatccag agacttcca 19
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal random primer-2
<400> 3
gaccatctag cgacctccac cttgcagtcc aacggtaggc ac 42
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal primer-2
<400> 4
gaccatctag cgacctcca 19
<210> 5
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> random sequence
<400> 5
mnnmnm 6
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal random primer2-1
<400> 6
gagcatccag agacttccam nnmnm 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal random primer2-2
<400> 7
gaccatctag cgacctccam nnmnm 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 8
gagcatccag agacttccan nnnnn 25
Claims (9)
- 서열번호 8로 기재된 염기서열(5'-GAGCATCCAGAGACTTCCANNNNNN-3')로 구성되는 정방향 프라이머, 및
서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머를 포함하는 무세포 DNA 검출용 유니버셜 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 6으로 기재된 염기서열로 구성되는, 무세포 DNA 검출용 유니버셜 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 무세포 DNA 검출용 조성물.
- 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 무세포 DNA 검출용 키트.
- 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 시료에서 무세포 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 무세포 DNA 검출 방법.
- 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 수술 후 종양 세포 침윤 확인용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 종양은 악성 종양인, 수술 후 종양 세포 침윤 확인용 조성물.
- 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 수술 후 종양 세포 침윤 확인용 키트.
- 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 개체로부터 분리된 수술 전과 후 시료에서 무세포 DNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 수술 후 종양 세포의 침윤 확인 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210164656A KR20230077422A (ko) | 2021-11-25 | 2021-11-25 | 무세포 dna 검출용 유니버셜 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR20230077422A true KR20230077422A (ko) | 2023-06-01 |
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ID=86771220
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102029393B1 (ko) | 2018-01-11 | 2019-10-07 | 주식회사 녹십자지놈 | 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도 |
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2021
- 2021-11-25 KR KR1020210164656A patent/KR20230077422A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102029393B1 (ko) | 2018-01-11 | 2019-10-07 | 주식회사 녹십자지놈 | 무세포 dna를 포함하는 샘플에서 순환 종양 dna를 검출하는 방법 및 그 용도 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |