TWI661199B

TWI661199B - 檢測膀胱癌之尿液標記物

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Publication number: TWI661199B
Application number: TW106101998A
Authority: TW
Inventors: 派利約翰吉爾福特; 納塔麗貞奇爾; 羅伯特普洛克
Original assignee: 太平洋愛吉生技股份有限公司
Priority date: 2004-07-23
Filing date: 2005-07-22
Publication date: 2019-06-01
Also published as: PT2444505T; CA3147177A1; JP6248297B2; US20100273148A1; JP2012185173A; CN101027412A; EP2444505B1; TW201525463A; EP2434023A1; KR20160105914A; US11130789B2; ES2612197T3; PT2434024T; KR101514582B1; JP2017060489A; BRPI0513692B1; TW201734454A; BR122020001099B1; TWI540321B; KR20140122285A

Abstract

腫瘤之早期檢測係罹患腫瘤(包括膀胱腫瘤)之患者存活的主要決定因素。BTM或UBTM家族之成員可高度且持續積累於膀胱腫瘤組織及其它腫瘤組織中，及/或可積累於患者之尿液中，且因此係膀胱及其它類型癌症之標記物。在某些實施例中，BTM或UBTM可積累於尿液中且UBTM家族成員之檢測可為一種有效的診斷方法。在一些實施例中，定量PCR方法比微陣列方法有利。在其它實施例中，複數個BTM或UBTM之檢測及定量可增加膀胱癌檢測之敏感性及特異性，且因此提供用於判定膀胱癌階段及類型之方法。套組提供進行本發明方法的簡單便利之手段。

Description

檢測膀胱癌之尿液標記物

本發明係關於癌症之檢測。具體言之，本發明係關於使用標記物檢測膀胱癌。更具體言之，本發明係關於使用尿液標記物檢測膀胱癌。更具體言之，本發明係關於使用尿液中之寡核苷酸、蛋白質及/或抗體標記物對膀胱癌進行檢測、定類型及分階段。

介紹

當早期治療癌症時，癌症患者之存活率極大增強。在膀胱癌之狀況下，與診斷為晚期疾病之患者5年存活率約15-30%相比，診斷為早期疾病之患者具有>90%之5年存活率。因此，膀胱癌早期診斷之進展可導致患者預後改良。使用尿液樣品檢測膀胱癌之已建立的方法為細胞學。然而，已知細胞學對檢測侵入性膀胱癌僅為約75%敏感性且對檢測淺表性膀胱癌僅為約25%敏感性(Lotan及Roehrborn,Urology 61,109-118(2003))。

將膀胱癌大致分為兩類：侵入性及淺表性。侵入型滲入皮下組織層，而淺表型趨於如息肉樣生長而主要發育於膀胱腔中。

尿液中癌症特定標記物之識別可提供一種早期診斷癌症之有價值的方式，從而導致早期治療及預後改良。特定癌症標記物亦提供監測疾病進度、確保待監測之外科、放射性治療及化學治療處理之功效的手段。然而，對於許多主要癌症而言，可獲得之標記物敏感性及特異性不夠。

目前，檢測膀胱癌之最可靠方法為膀胱鏡檢查伴隨活組織檢查之損傷的組織學。然而，此項技術為耗時、侵入性的且其敏感性僅為約90%，意謂約10%的癌症不能使用該等方法來檢測。對於非侵入性方法學，顯微檢測鱗片狀剝落之惡性細胞的尿液細胞學為當前較佳之方法。雖然細胞學具有約95%之特異性，但其對低級損傷具有較差敏感性(9-25%)，其極其依賴樣品品質且經受高的觀察者間可變性。

最近，已試圖檢測膀胱之活組織檢查中之遺傳標記物。最常用之方法為微陣列分析，其中含有對推定之遺傳標記物部分互補的寡核苷酸之陣列暴露於自患者樣品獲得之mRNA或cDNA樣品。使用該等方法，若干近期報導已識別許多膀胱癌之推定標記物。然而，陣列技術相對不定量且高度可變。

表明膀胱癌存在之血液或尿液標記物之檢測提供一種改良此疾病之檢測的有效方法。雖然已取得少許進步來發展膀胱癌之血液標記物，但若干尿液蛋白質標記物係可利用的。該等標記物之測試提供比細胞學更佳之敏感性，但趨於具有非最佳之敏感性，因為升高含量之該等標記物亦在患有非惡性疾病(包括炎症、尿石症及良性前列腺增生)之患者中普遍觀察到。例如，檢測特定核基質蛋白之NMP22具有47-87%之敏感性及58-91%之特異性。NMP22之高度可變性意謂其在用於膀胱癌之快速簡易檢測方面不理想。

其它尿液測試包括基因轉錄物(諸如尿液樣品細胞球之端粒酶酶hTERT)之RT-PCR擴增。RT-PCR測試提供高敏感性之潛力，雖然現有RT-PCR標記物之特異性依然不清楚。

需要用於癌症之早期檢測及診斷的其它工具。本發明提供基於癌症標記物(具體言之膀胱癌標記物)之其它方法、組合物、套組及設備以輔助癌症之早期檢測及診斷。

使用微陣列分析及定量聚合酶鏈式反應(qPCR)之組合，吾人已能夠識別對膀胱癌具有選擇性之特定基因標記物。在一些實施例中，吾人已發現可用於區分膀胱癌之階段的標記物，且在其它實施例中，吾人已識別可區別腫瘤類型之標記物。在其它實施例中，吾人已意外發現兩種或兩種以上標記物之組合可提供膀胱癌之高度可靠及敏感的檢測。在另外的實施例中，吾人已識別於膀胱癌細胞中而非血液細胞中高度表現之標記物。因此，在許多實施例中，膀胱癌之測試意外地優於先前技術之測試。

在某些實施例中，微陣列分析係用於識別較之非惡性膀胱組織於膀胱腫瘤組織中高度表現的基因。該等基因及由彼等基因編碼之蛋白質在本文中被定義為膀胱腫瘤標記物(BTM)。應瞭解術語BTM不需要標記物僅對膀胱腫瘤特異。相反，BTM之表現可在其它類型腫瘤(包括惡性腫瘤)中增加。亦應瞭解BTM包括不高度表現於血液細胞中之標記物。藉由自尿液取樣，不存在通常存在於先前技術活組織檢查樣品中之其它類型細胞之表現。術語BTM亦包括適用於檢測膀胱癌之個別標記物之組合。

在其它實施例中，提供識別樣品中標記物之存在的方法包括免疫組織化學及定量聚合酶鏈式反應(qPCR)。qPCR方法較少受到微陣列方法中常見之人工因素的影響。該等人工因素包括置於陣列點上之配位體寡核苷酸之數目、陣列點上染料與雜交寡核苷酸不均勻且不可預知之結合、陣列點之非特異材料之不均勻洗滌及其它問題之差異。

本文所揭示之某些基因編碼自細胞分泌、細胞裂解或在細胞死亡時自細胞釋放之蛋白質。該等mRNA轉錄物及其蛋白質具有作為膀胱癌診斷之標記物或作為監測所確定疾病進展之標記物的增加作用。該等標記物可單獨或互相組合使用。此外，其它基因、RNA轉錄物及所編碼之蛋白質依然在細胞內或與細胞相關且可單獨或互相組合用作尿液標記物。

治療淺表性及侵入性膀胱癌之策略可不同。侵入性膀胱癌更迫切需要外科切除術且與淺表型膀胱癌相比允許更少替代治療。相反，淺表性膀胱癌可成功地以泡內化學療法或泡內BCG免疫療法治療。

然而，目前除了膀胱鏡檢查外，不存在簡易及可靠辨別淺表性及侵入性膀胱癌類別之方法。使用諸如尿液測試之非侵入性方法辨別該等類別之能力應允許臨床醫生選擇適當治療策略而不依靠昂貴、不便利且患者常常很難接受之膀胱鏡檢查。

吾人已意外地發現某些尿液標記物(尤其係彼等未在血液中發現以高含量存在的)在組合或單獨使用時可提供高度可靠、敏感及特異之膀胱癌診斷。

圖1描述了一描述qPCR分析中所用之樣品數目及來源之表。

圖2描述了用於本發明膀胱癌之qPCR分析之標記物及標記物之寡核苷酸探針之表。

圖3描述了使用微陣列方法識別侵入性膀胱癌樣品之BTM之表。

圖4描述了使用微陣列方法識別淺表性膀胱癌樣品之BTM之表。

圖5描述了使用定量PCR分析特定BTM進行研究所獲得之結果之表。

圖6a-6af描述了顯示自侵入性及淺表性膀胱腫瘤之各種腫瘤標記物之定量PCR研究所獲得之相對頻率對log2倍性變化數據之直方圖。圖6a：SPAG5，侵入性；圖6b：SPAG5，淺表性；圖6c：TOP2a，侵入性；圖6d：TOP2a，淺表性；圖6e：CDC2，侵入性；圖6f：CDC2，淺表性；圖6g：ENG，侵入性；圖6h：ENG，淺表性；圖6i：IGFBP5，淺表性；圖6j：NOV，淺表性；圖6k：NRP1，侵入性；圖6l：NRP1，淺表性；圖6m：SEMA3F，淺表性；圖6n：EGFL6，侵入性；圖6o：EGFL6，淺表性；圖6p：MGP，侵入性；圖6q：SEM2，侵入性；圖6r：SEM2，淺表性；圖6s：CHGA，侵入性；及圖6t：CHGA，淺表性；圖6u：BIRC5，侵入性；圖6v：BIRC5，淺表性；圖6w：UBE2C，侵入性；圖6x：UBE2C，淺表性；圖6y：HoxA13，侵入性；圖6aa：MDK，侵入性；圖6ab：MDK，淺表性；圖6ac：Thy1，侵入性；圖6ad，Thy1，淺表性；圖6ae：SMC4L1，侵入性；6af：SMC4L1，淺表性。

圖7描述了使用尿液樣品使用定量PCR分析特定BTM進行之研究中所獲得之結果之表。

圖8描述了顯示患者及健康對照之尿液中膀胱癌標記物相對累積之盒鬚圖。12種BTM之數據各成對顯示；各對中上盒代表健康對照患者之尿液樣品且下盒代表患有膀胱癌之患者尿液樣品。盒子定義第25、第50及第75個百分點。所有數據為相對於中值健康對照組之log2倍性變化。點代表離群值。

圖9描述了與膀胱癌組織之RNA相比自全血提取之總RNA之定量PCR分析之條形圖。

圖10描述了膀胱癌患者尿液中標記物轉錄物之中值過度積累。分別顯示患者與健康對照及患者與非惡性對照之間log2差異。

圖11描述顯示與健康及非惡性對照相比癌症患者尿液中標記物轉錄物過度積累之盒鬚圖。盒子定義第25、第50及第75個百分點。所有數據係相對於中值健康對照。填充墨點之盒子對應於健康受驗者之樣品。填充陰影之盒子對應於患有非惡性泌尿疾病之患者的樣品，且填充雜湊之盒子對應於患有癌症之患者樣品。a.HOXA13；b.IGFBP5；c.MDK；d.MGP；e.NRP1；f.SEMA3F；g.SMC4L1；h. TOP2A；i.UBE2C。點代表離群值。

圖12a-12b分別描述對侵入型及淺表型腫瘤具有比中值正常表達第95個百分點更高表達之標記物之數目的直方圖。結果係基於12個標記物之qPCR數據且分別顯示各腫瘤樣品。

圖13a-13b描述顯示多種標記物在準確區分腫瘤組織及非惡性組織之能力之效用的表。已自源於qPCR數據之正態分佈構建該表。圖13a描述在95%之特異性下多種標記物準確區分侵入性膀胱癌組織及非惡性組織之能力的效用。圖13b描述了在95%之特異性下多種標記物準確區分淺表性膀胱癌組織及非惡性組織之能力的效用。

圖14a-14b描述顯示在95%之特異性下標記物組合對侵入性移行細胞癌(TCC)之敏感性的表，該敏感性係自qPCR數據之正態分佈計算出。圖14a：侵入性移行細胞癌(TCC)。圖14b：淺表性TCC。

圖15描述了顯示多種標記物對準確區分自膀胱癌(TCC)患者獲得之尿液樣品及自患有非惡性泌尿疾病患者之尿液樣品能力之效用的表。已自qPCR尿液分析獲得之數據之正態分佈構建該表。

圖16描述了顯示在95%之特異性下檢測TCC之尿液中標記物組合之敏感性的表，該敏感性係自尿液qPCR數據之正態分佈計算出。

圖17描述了顯示自患有淺表性及侵入性膀胱癌兩者之患者尿液中所提取之RNA中BTM比率之盒鬚圖。盒子定義第25、第50及第75個百分點。灰色陰影盒子代表患有淺表性膀胱癌患者之樣品，且影線盒子代表患有侵入性膀胱癌患者之樣品。a.TOP2A/HOXA13組合；b.TOP2A/IGFBP5組合；且c.TOP2A/SEMA3F組合。點代表離群值。

圖18描述了顯示患有不同階段膀胱癌患者尿液中BTM比率之盒鬚圖。盒子定義第25、第50及第75個百分點。填充墨點之盒子對應於患有淺表性腫瘤患者之樣品，灰色陰影盒子對應於患有1階段侵入性腫瘤患者之樣品且影線盒子對應於患有2-3階段腫瘤患者之樣品：a. TOP2A/HOXA13組合；b.TOP2A/IGFBP5組合；且c.TOP2A/SEMA3F組合。點代表離群值。

圖19描述了顯示自淺表性及侵入性膀胱腫瘤兩者所提取之RNA中BTM比率之盒鬚圖。盒子定義第25、第50及第75個百分點。灰色陰影盒子代表淺表性膀胱腫瘤樣品，且影線盒子代表侵入性膀胱腫瘤樣品：a.TOP2A/HOXA13組合；b.TOP2A/IGFBP5組合；且c.TOP2A/SEMA3F組合。點代表離群值。

圖20描述了顯示一應用於膀胱癌檢測之標記物的盒鬚圖。圖顯示與健康及非惡性對照相比四種標記物之群在癌症患者尿液中之過度呈現。盒子定義第25、第50及第75個百分點。所有數據係相對於中值健康對照。填充墨點之盒子對應於健康受驗者之樣品。填充灰色陰影之盒子對應於患有非惡性泌尿疾病之患者之樣品，且填充雜湊之盒子對應於患有膀胱癌之患者之樣品：a.HOXA13、b.MGP：c.SEMA3F且d.TOP2A。點代表離群值。

圖21描述了顯示判定膀胱癌組織學類型之標記物組合之盒鬚圖。圖顯示自患有淺表性及侵入性膀胱癌兩者之患者尿液中所提取之RNA中之BTM比率。盒子定義第25、第50及第75個百分點。灰色陰影盒子代表患有淺表性膀胱癌之患者之樣品，且影線盒子代表患有侵入性膀胱癌之患者之樣品：a.TOP2A/SEMA3F組合、b.TOP2A/HOXA13組合。點代表離群值。

定義

在詳細描述本發明之實施例之前，提供本文所用之一些術語之定義將為有用的。

術語"標記物"意謂數量上或品質上與生物學現象之存在相關的分子。"標記物"之實例包括基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白質或蛋白質片段、相關代謝物、副產物或其它識別分子，不管是否與現象潛在之機制直接或間接相關。

術語"敏感性"意謂測試為陽性之患有疾病之個體的比例。因此，增加之敏感性意謂較低之假陰性測試結果。

術語"特異性"意謂測試為陰性之無疾病之個體的比例。因此，增加之特異性意謂較低之假陽性測試結果。

術語"BTM"或"膀胱腫瘤標記物"或"BTM家族成員"意謂與膀胱癌相關之標記物。術語BTM亦包括個體標記物之組合，該等組合改良檢測膀胱癌之敏感性及特異性。在本申請案之一些部分中，出於便利，術語BTM可包括UBTM(本文所定義)。BTM之非限制性實例係包括於本文圖3及4中。

BTM可藉由自疑似患有膀胱癌之患者之組織樣品所提取RNA、將RNA施用於其上具有許多寡核苷酸之微陣列、允許樣品RNA與陣列上之寡核苷酸雜交且隨後定量結合至各陣列點之經量測之RNA的含量來識別。若使用微陣列方法在正常、非惡性組織中發現之標記物的存在高於至少約1.2倍之臨限值，則認為該標記物為BTM。或者，臨限值可高於正常值約2倍，高於正常值約3倍，高於正常值約4倍或甚至約5倍。"正常值"意謂高於正常群體第90個百分點。在其它狀況下，正常值可意謂第95個百分點存在之水平(意即自中值約2個標準差(SD))，且在其它狀況下，大於約第97.5個百分點(意即約3 SD)或第99個百分點。

在其它狀況下，可選擇大體程度上存在於腫瘤組織但不存在於血液中之BTM。"大體程度上"意謂如由qPCR所量測腫瘤組織中之量大於血液中所發現之量至少約5個週期。

術語"UBTM"或"尿膀胱腫瘤標記物"或"UBTM家族成員"意謂尿液中發現之與膀胱癌相關但不包括TOP2A、MDK或BIRC5之BTM標記物。術語UBTM亦包括兩種標記物之組合及三種標記物之組合，該等組合改良尿液樣品中檢測膀胱癌之敏感性及選擇性。UBTM之非限制性實例係包括於本文之圖14a及14b中。

在其它狀況下，UBTM可使用微陣列方法或使用qPCR方法使用基於待評估之標記物所選擇之正向引子、反向引子及探針在尿液中識別。尿液中膀胱癌檢測之臨限值可大於患有膀胱癌之正常受驗者尿液中標記物之含量約1週期(2倍)、2週期(4倍)、3週期(8倍)、4週期(16倍)、5週期(32倍)或更高。

術語"qPCR"意謂定量聚合酶鏈式反應。

術語"表現"包括自基因或基因之部分產生mRNA，且包括產生由RNA或基因或基因之部分編碼之蛋白質，且包括與表現相關之可檢測材料之出現。例如，諸如抗體之結合配位體至基因或其它寡核苷酸、蛋白質或蛋白質片段之結合及結合配位體之觀測係包括於術語"表現"之範圍內。因此，諸如西方墨點之免疫墨點上增加之點密度係包括於潛在生物學分子之術語"表現"中。

術語"表現速率"意謂轉錄物或蛋白質之量的時間依賴性變化。

在每個限定時間期，標記物在一個細胞或細胞類型中之表現速率大於在另一細胞或細胞類型中之表現速率時，使用術語"過度表現"。

術語"積累"意謂與正常平均值相比樣品中標記物之增加量。"增加量"意謂使用微陣列方法量測時標記物之量高於正常範圍第90、第95、第97.5、第99或更高百分點至少約1.2倍、2倍、3倍、4倍或5倍。當使用qPCR量測時，"增加量"意謂標記物之量高於正常範圍第90、第95、第97.5或第99個百分點至少約1週期(2倍)、2週期(4倍)、3週期(8倍)、4週期(16倍)、5週期(32倍)或更多。

積累包括在一細胞中(以每細胞單位計)增加之標記物量或可意謂具有特殊標記物之樣品中增加之細胞數。因此，積累可意謂與不具有膀胱癌特徵之病症相比尿液(以每體積單位計)中標記物增加之總量。積累亦可反映於給定細胞類型中BTM表現速率之增加，及/或正常表現速率下表現BTM之細胞數之增加。此外，由於細胞膜完整性之喪失或細胞死亡及破壞，積累亦可反映存在之游離mRNA。

本發明實施例之描述

提供檢測及評估腫瘤(包括膀胱腫瘤)之標記物。已發現眾多基因及蛋白質與膀胱腫瘤相關。取自患有膀胱腫瘤之患者之樣品及自正常膀胱上皮之非惡性樣品之微陣列分析導致驚人發現：在許多膀胱腫瘤中，尿液中某些基因過度表現或基因產物積累之特定模式與疾病相關。最令人驚訝地，已分離出以高含量存在於患有膀胱癌之患者尿液樣品中但低含量存在於健康個體(且尤其患有非惡性泌尿疾病之個體，包括彼等呈現血尿症之個體)中之標記物。因此，例如基因產物(例如，諸如mRNA之寡核苷酸)及自寡核苷酸轉譯之蛋白質及肽之標記物之檢測為腫瘤尤其膀胱腫瘤存在之指示。

應瞭解，與存在之標記物之量相比，一特定標記物或一批標記物之含量可視所產生之尿液量而定。因此，在具有減少尿液產出量(例如減少之尿液體積)特徵之病症中，可增加標記物之濃度(雖然可不反映膀胱癌)。因此，在一些實施例中，標記物之量可隨於給定時間由總尿液產出量來校正。或者，標記物濃度可由尿液樣品中總細胞數來校正，且在其它實施例中可由尿液樣品中所存在之總蛋白質來校正。另一方面，增加之尿液產出量可稀釋腫瘤標記物，且因而趨於掩蓋膀胱癌之存在。該等病症可與增加之水攝取、減少之鹽攝取、利尿劑之增加使用或抗利尿激素產生或活性之抑制相關。

在一些實施例中，可使用此項技術中已知之方法量測腎臟功能。該等方法包括(以實例說明)肌胺酸酐清除率之量測。然而，應瞭解有許多適當方法來量測腎臟功能。在發現異常腎臟功能之病症下，可使用適當校正來調整標記物之積累的量測。因此，可更準確地診斷膀胱癌。

癌症標記物可使用任何適當技術在樣品中檢測且可包括(但不限於)寡核苷酸探針、qPCR或抗癌症標記物之抗體。

應瞭解待測試樣品不受限於疑為腫瘤之組織之樣品。標記物可分泌至血清中，脫離細胞膜或與尿液中損失之細胞相關。因此，樣品可包括任何身體樣品且包括血液、血清、腹膜洗液、腦脊髓流體、尿液及糞便樣品。

樣品中之一癌症標記物之檢測將為該受驗者腫瘤之存在的指示。然而，應瞭解藉由分析複數個癌症標記物之存在及表現量，診斷敏感性將增加，同時假陽性及/或假陰性結果發生次數降低。因此，根據本發明之多種標記物可用於增加癌症之早期檢測及診斷。

癌症檢測之一般方法

下列方法為使用BTM或UBTM家族成員可用於檢測癌症包括膀胱癌之非限制性方法。

使用對一種標記物具有選擇性之核酸探針之雜交方法

該等方法包括將核酸探針結合至載體且在具有源於測試樣品之RNA或cDNA之適當條件下雜交(Sambrook,J.、E Fritsch,E.及T Maniatis,Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3^rd.Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor(2001))。適當時，該等方法可應用於源於腫瘤組織或流體樣品之BTM或UBTM。RNA或cDNA製備物通常係以螢光或放射性分子來標記以使得能夠檢測及定量。在一些申請案中，雜交之DNA可以分枝螢光標記之結構來標記以增強訊號強度(Nolte,F.S.,Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens.Adv.Clin. Chem.33,201-35(1998))。在藉由凝膠圖像螢光檢測或密度計量定量雜交量之前，未雜交之標記物係藉由在低鹽溶液諸如0.1×SSC、0.5% SDS中廣泛洗滌來移除。載體可為固體，諸如耐綸或硝化纖維膜，或由液體懸浮液中雜交之微孔或珠粒組成。為了允許洗滌及純化，珠粒可為磁性(Haukanes,B-I及Kvam,C.,Application of magnetic beads in bioassays.Bio/Technology 11,60-63(1993))或螢光標記以使得能夠進行流式血細胞計數(參見例如Spiro,A.、Lowe,M.及Brown,D.,A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry.Appl.Env.Micro.66,4258-4265(2000))。額外方法在此項技術中係熟知的且本文無需進一步描述。

定量PCR(qPCR)

定量PCR(qPCR)可在腫瘤樣品、血清、血漿及尿液樣品上使用BTM特異性引子及探針來進行。在受控反應中，一PCR反應(Sambrook,J.、E Fritsch,E.及T Maniatis,Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor(2001))中所形成之產物之量與起始模板之量有關。PCR產物之定量可在其進入log相時在試劑開始限制之前藉由中止PCR反應來進行。PCR產物隨後在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠中電泳，以溴化乙錠或相當之DNA染色劑染色，且染色之強度係藉由密度計量法來量測。或者，PCR反應之進度可使用PCR機器諸如即時量測產物積累之Applied Biosystems' Prism 7000 a the Roche LightCycler來量測。即時PCR量測插入染料諸如Sybr綠至合成之PCR產物中之DNA螢光性或自淬滅分子裂解時由報導分子所釋放之螢光性；報導及淬滅分子在DNA自引子寡核苷酸螺旋延伸之後併入與靶向DNA分子雜交之寡核苷酸探針。寡核苷酸探針係藉由Taq聚合酶之酶作用在下一PCR週期中替代及退化，自淬滅分子釋放報導子。

在一些實施例中，正向引子、反向引子及探針組分別包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：27。或者組分別包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：28。在其它實施例中，組分別包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：29，分別SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：30，分別SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：31，分別SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：32，分別SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：33，分別SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：34，分別SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：35，分別SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：36，分別SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：37，分別SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：38及分別SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：39。

酶聯結免疫分析(ELISA)

簡言之，在夾層ELISA分析中，抗BTM/UBTM之多株或單株抗體結合至一固體載體(Crowther,J.R.The ELISA guidebook.Humana Press：New Jersey(2000)；Harlow,E.and Lane,D.,Using antibodies：a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor(1999))或懸浮珠粒上。其它方法在此項技術中係已知的且本文無需進一步描述。單株抗體可為雜交瘤起源或選自噬菌體抗體庫(Hust M.及Dubel S.,Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments.Methods Mol Biol.295：71-96(2005))。以非目標蛋白質製備物及清潔劑阻滯非特異性結合位點。隨後以含有BTM/UBTM抗原之尿液或組織之製備物來培養俘獲抗體。在以檢測目標BTM/UBTM之二次抗體培養抗體/抗原複合物之前，洗滌混合物。二次抗體通常與螢光分子或可在酶反應中檢測之其它報導分子共軛或與三次抗體共軛為一報導子(Crowther,Id.)。或者，在直接ELISA 中，含有BTM/UBTM之製備物可結合至載體或珠粒上且直接以抗體報導子共軛物來檢測目標抗原(Crowther,Id.)。

產生單株抗體及多株抗血清之方法在此項技術中係熟知的且本文無需進一步描述。

免疫組織化學

腫瘤標記物之識別及定位可在膀胱腫瘤、淋巴結或遠端轉移上使用抗標記物抗體來進行。該等方法亦可用於檢測例如結腸直腸、胰腺、卵巢、黑素瘤、肝臟、食導、胃、子宮內膜及大腦。

一般而言，可使用免疫組織化學在組織中檢測BTM(Harlow,E.及Lane,D.,Using antibodies：a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor(1999))。簡言之，將石蠟包埋或冷凍OCT包埋之組織樣品在玻片上切割成4-8um區段、固定且浸潤，隨後以抗BTM之一次單株或多株抗體培養。一次抗體可共軛至一檢測分子或報導子以用於直接抗原檢測或者一次抗體自身可以共軛至一報導子或檢測分子之二次抗體來檢測。洗滌且活化任何報導分子之後，BTM之存在可在顯微鏡中觀測。

該等方法亦可用於移除腫瘤之外科手術之前或之後取用之膀胱癌患者血清或血漿中標記物家族成員之免疫檢測、患有其它癌症(包括但不限於結腸直腸、胰腺、卵巢、黑素瘤、肝臟、食導、胃、子宮內膜及大腦)之患者中標記物家族成員之免疫檢測及膀胱癌患者尿液及糞便中標記物家族成員之免疫檢測。

BTM及UBTM亦可使用其它標準免疫檢測技術諸如免疫墨點法或免疫沉澱法於組織或尿液中檢測(Harlow,E.及Lane,D.,Using antibodies：a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor(1999))。在免疫墨點法中，含有BTM/UBTM之組織或流體之蛋白質製備物通過聚丙烯醯胺凝膠在變性或非變性條件下電泳。蛋白質隨後轉移至諸如耐綸之膜載體上。BTM/UBTM隨後直接或間接與免疫組織化學中所述之單株或多株抗體反應。或者，在一些製備物中，蛋白質可直接點於膜上而無需先前之電泳分離。訊號可藉由密度計量法來量化。

在免疫沉澱法中，以抗BTM/UBTM之單株或多株抗體培養含有BTM或UBTM之可溶性製備物。反應隨後以由瓊脂糖或聚丙烯醯胺與共價吸附之蛋白質A或蛋白質G組成之惰性珠粒來培養。蛋白質A或G珠粒與抗體特異性相互作用形成結合至珠粒之抗體-BTM/UBTM-抗原之固定複合物。洗滌結合物之後，BTM/UBTM可藉由免疫墨點法或ELISA來檢測及定量。

使用電腦分析陣列或qPCR數據

收集初級數據且倍數變化分析藉由比較膀胱腫瘤基因表現與在非腫瘤組織中相同基因表現之水平來執行。提供確定表現增加之臨限值(例如1.5 x增加、2倍增加及替代實施例中3倍增加、4倍增加或5倍增加)。應瞭解在不脫離本發明之範疇情況下可選擇確定已出現表現增加之其它臨限值。腫瘤基因表現之進一步的分析包括匹配彼等呈現增加表現之基因與已知膀胱腫瘤之表現曲線以提供腫瘤之診斷。

BTM及UBTM用於監測TCC治療之進展

除了TCC之迅速診斷及早期檢測之外，組織、血清或尿液中所檢測之BTM及UBTM標記物可用於監測患者對治療之反應。在該等申請案中，可在全身、泡內或血管內化學療法、放射療法或免疫療法開始之後對尿液及/或血清樣品進行定期取樣。標記物積累之下降可指示腫瘤尺寸之減小，指示有效治療。下降之速率可用於預測各患者或治療之最佳治療劑量。

所評估之標記物係選自已知人類基因。所評估之基因係顯示於圖3及4中。圖3及4中包括基因名稱、HUGO識別符、MWG寡號、 NCBI mRNA參考序列號及蛋白質參考號。全長序列可在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/上找到。

所確認的適用於診斷及評估膀胱癌之標記物係確認於圖2中及本申請案所附加之序列清單中。

本發明之態樣

因此，在某些態樣中，本發明包括用於檢測膀胱癌之方法，其包含檢測尿液中UBTM家族成員之積累。

在其它態樣中，UBTM家族成員在大體程度上與血液不相關。

在額外態樣中，UBTM係選自圖3或4所示之群。

此外，在某些態樣中，藉由檢測BTM或UBTM mRNA之積累來進行檢測步驟。

在一些態樣中，使用微陣列來進行檢測步驟。

在其它態樣中，使用定量聚合酶鏈式反應或雜交方法來進行檢測步驟。

在進一步態樣中，藉由檢測UBTM蛋白質之積累來進行檢測步驟。

在進一步態樣中，藉由檢測UBTM肽之積累來進行檢測步驟。

在該等態樣中之一些中，使用可為多株或單株之UBTM抗體來進行檢測步驟。

在額外態樣中，方法包括檢測該樣品中兩種或兩種以上UBTM家族成員之積累。

在該等額外態樣中之某些中，方法包括檢測TOP2A、MDK或BIRC5。

其它態樣包括檢測選自由TOP2A-HOXA13、TOP2A-IGFBP5及TOP2A-SEMA3F組成之群中之一或多對標記物。

在本發明之其它態樣中，用於檢測膀胱癌之方法包含檢測在疑似患有膀胱癌之患者生物樣品中由圖14a或14b選出之兩種或兩種以上BTM家族成員組合之積累。

在該等態樣中之一些中，生物樣品係選自由血液、血清、血漿、組織、尿液、糞便、腦脊髓流體及腹膜洗液組成之群。

其它態樣包括對BTM或UBTM具有特異性之抗體及其製造方法，作為多株或作為單株抗體。

在該等態樣中之某些中，單株抗體可直接針對選自圖3或4所示之群的BTM或UBTM。

在其它該等態樣中，方法進一步包含針對抗另一BTM或UBTM之另一抗體。

本發明之額外態樣包括用於檢測BTM之設備，該設備包含其上具有BTM或UBTM俘獲試劑組合之基板，該組合係選自圖14a或14b；及與該基板相關之檢測器，該檢測器可檢測與該俘獲試劑相關之BTM或UBTM之該組合。

在該等態樣中之某些中，俘獲試劑包含寡核苷酸。

在額外態樣中，俘獲試劑包含抗體。

在一些態樣中，BTM或UBTM係選自圖3或4指定之群。

本發明亦包括用於檢測癌症之套組，該套組包含一基板；其上有至少兩種BTM或UBTM俘獲試劑之組合，該組合係選自圖14a或14b；及使用說明書。

一些套組包括BTM-或UBTM-特異性寡核苷酸或BTM-特異性抗體之俘獲試劑。

在一些套組中，BTM或UBTM係選自圖3或4中所述之群。

在某些套組中，標記物係選自由IGFBP5、MGP、SEMA3F及HOXA13組成之群。

額外態樣包括用於檢測膀胱癌存在之方法，該方法包含測定尿液樣品中選自由BIRC2、CDC2、HOXA13、IGFBP5、MDK、MGP、NOV、NRP1、SEMA3F、SPAG5、TOP2A組成之群之一或多種標記物之存在且其中該標記物大體上不存在於血液中。

本發明之其它態樣包括用於辨別惡性膀胱疾病與非惡性膀胱疾病之方法，該方法包含測定該患者尿液中選自由HOXA13、IGFBP5、MDK、MGP、NRP1、SEMA3F、SMC4L1、TOP2A及UBE2C組成之群之一或多種標記物之積累；及測定該等標記物在該樣品中之比率，該比率與膀胱癌之存在相關。

在該等態樣中之某些中，方法包含量測尿液中至少一種第二BTM之積累。

在該等實施例中之一些中，第一標記物為TOP2A且第二標記物係選自由HOXA13、IGFBP5及SEMA3F組成之群。

在額外態樣中，本發明包括使標記物積累之比率與淺表性膀胱癌、第1階段侵入性膀胱癌或第2-3階段侵入性膀胱癌之指示相關。

在進一步態樣中，本發明包括用於判定膀胱癌治療效用之方法，該方法包含比較選自圖3或4之一或多種標記物在患者之第一樣品中之存在與一段治療時期之後選自圖3或4之一或多種標記物在患者之第二樣品中之存在。

如本文所述，腫瘤之檢測可藉由量測一或多種腫瘤標記物之表現來完成。已意外地發現複數個BTM或UBTM之表現增加與診斷膀胱癌之存在之間的關聯極高。所檢測之最小顯著關聯具有約0.018之p值。許多關聯在小於10^-10之p值下顯著。具有如此高之顯著性，可無需檢測一個以上BTM或UBTM中增加的表現或積累。然而，本發明之BTM中之冗餘可允許以增加之可靠性檢測膀胱癌。

本文所提供之方法亦包括高敏感性之分析。qPCR極其敏感且可用於檢測樣品中十分低的複本數(例如1-100)之基因產物。具有該敏感性，使極早期檢測與膀胱癌相關之事件成為可能。

方法 腫瘤收集

膀胱腫瘤樣品及非惡性膀胱上皮樣品係自日本京都大學醫院及其它合作之日本醫院所切除之外科樣本收集。

尿液收集

非惡性對照及膀胱癌患者之尿液樣品係自日本京都大學醫院獲得(圖1)。健康對照樣品係自高加索及日本志願者獲得。

RNA提取

將腫瘤組織在Tri試劑：水(3：1)混合器中勻化，接著氯仿提取。隨後使用RNeasy^TM程序(Qiagen)自水相純化總RNA。亦自16個癌症細胞株提取RNA且合併以用作參照RNA。

藉由混合尿液樣品與等體積溶解緩衝液(5.64M胍-HCl、0.5% N-十二烷基肌胺酸鈉、50mM醋酸鈉(pH 6.5)及1mM β-巰基乙醇；以1.5M Hepes pH 8將pH值調整至7.0)自尿液提取RNA。隨後使用Trizol及RNeasy^TM程序提取總RNA。在cDNA合成之前使用Qiagen QIAquick^TM PCR純化套組進一步純化RNA製備物。

於3.6%右旋糖苷中使用沉降法由全血所富集之細胞上藉由執行Trizol/RNeasy^TM提取自三個健康志願者血液提取RNA。

微陣列載片之製備

根據產商之方法，使用基因機器微陣列機器人以約30,000個50 mer寡核苷酸(MWG Biotech)來壓印塗布環氧物之玻璃載片(MWG Biotech)。

RNA標記及雜交

使用上標II^TM反轉錄酶(Invitrogen)在含有5-(3-胺基烯丙基)-2'脫氧尿苷-5'-三磷酸鹽之反應中自5μg總RNA轉錄cDNA。隨後在室溫下在碳酸氫鹽緩衝液中以Cy3或Cy5培養歷時1小時之前於Microcon管柱中去離子化該反應。使用Qiaquick管柱(Qiagen)移除未合併之染料且將樣品於SpeedVac中濃縮至15μl。經Cy3及Cy5標記之cDNA隨後與Ambion ULTRAhyb^TM緩衝液混合，在100℃下變性2分鐘且在42℃下於雜交室中雜交至微陣列載片中歷時16小時。隨後洗滌該等載片且在兩個動力設置下於Axon 4000A^TM掃描儀中掃描兩次。

癌症標記物基因之微陣列分析

將來自53個膀胱腫瘤及20個非惡性("正常")膀胱組織樣品之RNA以Cy5標記且與經Cy3標記之參照RNA二倍或三倍雜交。歸一化之後，在29,718個基因中各表現之變化隨後係由倍性變化及統計概率來估計。

歸一化程序

藉由Genepix^TM軟件所檢測之中值螢光強度係由扣除局部背景強度來校正。排除具有小於零之背景校正強度之點。為了方便歸一化，將強度比及所有點強度進行對數轉換。使用LOCFIT^TM套件中所建構之局部回歸來校正染料及空間偏差之對數強度比。同時使全部點強度及定位之對數強度比回歸。局部回歸之殘餘提供經校正之對數倍性變化。對於品質對照，根據點強度及定位繪出各歸一化微陣列之比率。隨後視覺檢查各圖之任何剩餘人工因素。此外，將ANOVA模型應用於檢測pin-tip偏差。將歸一化之所有結果及參數插入Postgres-數據庫供統計分析。

統計分析

為了改良陣列之間量測出的倍性變化之對比度，定標log2(比率)以使每陣列具有相同的總標準差。此標準化在組織分類可變性中減小平均值。進一步轉換log2(比率)以使各寡核苷酸具有零之中值以便於結果之視覺檢查。隨後將基於倍性變化之秩測試用於改良雜訊穩定性。此測試係由兩步驟組成：(i)計算陣列內倍性變化之秩(Rfc)及ii)自腫瘤組織中值(Rfc)減去正常組織中值(Rfc)。兩個中秩值之差異界定了倍性變化秩之計分。亦對標準化數據執行三種額外統計測試：1)兩個樣品學生之t-測試、2)Wilcoxon測試及3)微陣列之統計分析(SAM)。給出藉由各種統計方法(秩倍性變化、t-測試、Wilcoxon測試及SAM)所判定之300個最顯著上調基因的各測試之秩計分。若一基因出現於一清單(而非一或多種其它清單)上，則將其計分加上500之加權因子上。隨後將所有秩計分加至一求和秩計分中。

標記物組合之統計分析

為了測定區分腫瘤及非惡性樣品所用之兩種或三種標記物組合之值，對腫瘤及非惡性樣品之qPCR數據進行下列分析。使用樣品中值及標準差產生非惡性及腫瘤樣品之正態分佈。接著測定取自腫瘤表現數據之值在正態分佈中應超過所界定之臨限值(例如大於50%、70%、75%、80%、90%、95%或99%)的概率(意即敏感性)。對於標記物之組合而言，測定至少一種標記物超過臨限值之概率。

為了論證尿液樣品及腫瘤樣品中分析之標記物組合之值，亦對使用圖1系列2中所述之TCC患者及非惡性對照之尿液樣品所獲得之qPCR數據進行正態分佈之分析。測定取自TCC患者qPCR數據之值在非惡性樣品分佈中應超過限定臨限值(例如大於50%、70%、75%、80%、90%、95%或99%)之概率。

用於檢測尿液中膀胱癌標記物之方法

在若干實施例中，可對尿液樣品理想地進行BTM之檢定。一般而言，用於檢定該等流體中寡核苷酸、蛋白質及肽之方法在此項技術中係已知的。然而，出於說明之目的，BTM之尿液含量可使用夾層型酶聯結免疫吸收檢分析(ELISA)來定量。對於血漿或血清檢定，將5μL適當稀釋樣品之等分試樣或連續稀釋之標準BTM及75μL過氧化物酶共軛之抗人類BTM抗體添加至微量滴定盤之孔中。在30℃下30分鐘培養期之後，以於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之0.05%吐溫(Tween)20洗滌孔以移除未結合之抗體。隨後在30℃下以含H₂O₂之鄰苯二胺培養BTM及抗BTM抗體之結合複合物歷時15分鐘。藉由添加1M H₂SO₄中止反應，且以微量滴定盤閱讀器量測492nm時之吸光率。應瞭解抗BTM抗體可為單株抗體或多株抗血清。

因為許多蛋白質係(1)藉由細胞分泌、(2)自細胞膜裂解、(3)在細胞死亡時自細胞丟失或(4)包含於脫落細胞中，所以應瞭解亦可於尿液中檢測BTM。另外，膀胱癌之診斷可藉由量測樣品中BTM之表現或樣品中BTM之積累來判定。先前技術之診斷方法包括膀胱鏡檢查、細胞學及在該等程序中所提取之細胞檢查。該等方法係依賴尿液中或尿導上皮之刷樣品中或其它情況下膀胱壁之活組織檢查樣本中腫瘤細胞之識別。該等方法受到若干類型之錯誤的影響，包括樣品錯誤、觀察者之間的識別錯誤及類似錯誤。

定量即時PCR

即時或定量PCR(qPCR)係用於PCR模板複本數之絕對或相對定量。使用引子表現V 2.0^TM(Applied Biosystems)設計Taqman^TM探針及引子組。可能時，所有潛在剪接變體係包括於所得擴增子中，擴增子優選係給與藉由源於MWG-Biotech之微陣列寡核苷酸所覆蓋之區段。引子及探針序列係顯示於圖2中。或者，若目標基因由遮蓋所要擴增子之Assay-on-Demand^TM表現檢定(Applied Biosystems)表示，則使用該等目標基團。在室內設計之檢定中，使用SYBR綠標記協定及自參照RNA製備之cDNA滴定引子濃度。在標準循環條件下於ABI Prism^TM 7000序列檢測系統上進行擴增。當在解離曲線中觀察到單一擴增產物時，則經625倍濃度範圍使用最佳引子濃度及5'FAM-3'TAMRA磷酸鹽Taqman^TM探針(Proligo)在250nM之最終濃度下產生標準曲線。給出超過0.98之回歸係數之標準曲線的檢定係用於隨後檢定中。

可在兩個96孔板上執行檢定，各RNA樣品代表單一cDNA。各板含有參照cDNA標準曲線，二份超過625倍濃度範圍。分析係由計算？CT(目標基因CT-意謂參照cDNA CT)組成。？CT與陰性log2倍性變化直接成比例。隨後計算相對於中值非惡性log2倍性變化之log2倍性變化(log2倍性變化-中值正常log2倍性變化)。可隨後將倍性變化集群成頻率級且繪製成圖表或描繪於盒鬚圖中。

對惡性膀胱癌的血清及尿液標記物之選擇

推定的血清標記物可選自基於(i)編碼蛋白質自細胞分泌或自膜之裂解的可能性；分泌之可能性係基於TargetP^TM之分析(Emanuelsson等人；J.Mol.Biol.300,1005-1006(2000))及(ii)其求和秩計分之陣列數據。然而，腫瘤樣品中過度表現程度之變化不僅反映腫瘤異質性而且亦反映具有"正常"組織(包括平滑肌、結締組織、黏膜下層細胞(參見美國專利6,335,170)、基質細胞及非惡性上皮細胞)之腫瘤樣品污染程度之變化。在許多情況下，"正常"污染以約25%之中值在5至70%之範圍內變化。

因此，吾人能夠藉由分析未受正常膀胱細胞高度污染之尿液樣品中的BTM來減少該等"假陽性"結果。此外，藉由使用qPCR方法，與使用先前技術中之微陣列方法相比，吾人已能更準確測定尿液樣品中mRNA之含量。因此，吾人已能避免受其它膀胱細胞類型大量污染且因而避免臨床樣品之微陣列分析技術中一更棘手之問題。

藉由量測尿液中標記物之積累且不依靠腫瘤中之表現速率，吾人意外地發現許多適用於檢測膀胱癌及測定其階段及/或其類型之BTM。此外，因為可引起患者由於可能之膀胱癌看醫師之一主要徵兆為尿液中出現血，所以吾人已判定血液中不高度表現之BTM在診斷中可具有很大價值。該等標記物包括IGFBP5、MGP、SEMA3F及 HOXA13(參見圖9)。

量測積累提供超過定義"過度表現"之優點。如上文所述，增加之積累可反映真實過度表現或分子生物學意義上增加之表現速率(意即每細胞每單位時間異核RNA(hnRNA)分子、mRNA分子或蛋白質增加之數目)。然而，積累亦可意謂於諸如尿液中之給定體積中標記物增加之量，即使表現速率不增加。例如，即使腫瘤細胞產生正常量之標記物，在樣品中觀察到該等細胞數目之增加可指示癌症之存在。此外，積累可反映樣品中游離或可溶性RNA。在一些狀況下，產生標記物之腫瘤細胞可死亡且細胞內容物釋放至周圍組織中。若細胞內容物可進入尿液，則游離標記物RNA可在尿液中檢測到。該等現象可尤其適用於診斷通常難以實現選擇性及特異性之淺表性膀胱癌。量測尿液中標記物之積累可為淺表性膀胱癌之一主要徵兆。因此，使用本發明之方法及設備可使檢測早期膀胱癌成為可能。

吾人亦指出在量測積累中，可需要小心校正樣品體積之變化。例如在尿液中，每單位體積標記物之量可視受驗者腎臟功能而定。因此，在尿液產生減少之病症中，可濃縮尿液中之細胞(包括腫瘤細胞)，因而產生積累之人工地更高量測(每單位體積)。可藉由獨立量測尿液產出量(例如每單位時間尿液輸出量)、尿液清除率(例如量測肌酸酐或BUN)來減少該等人工因素。相反，在尿液輸出量增加(諸如多尿)之病況下，可稀釋含有標記物之細胞且產生積累之人工地低量測。然而，吾人可控制利尿劑之使用、水攝取及可產生與真實積累無關之標記物積累之變化或樣品中標記物質量之變化的其它因素。在該等情況下，吾人可校正尿液產出量之速率的標記物之量。

因此，與先前技術方法相比，藉由量測尿液中BTM，吾人已能減少假陽性結果之發生率，表明該等方法優於先前技術方法。

除了膜之分泌物或裂解物標準未應用之外，尿液標記物係選自上文所述之陣列數據。因此，未預測適用於血清標記物之細胞內及膜結合之標記物係包括於內作為尿液標記物。

實例

本文所述之實例係出於說明本發明之實施例之目的且不意欲限制本發明之範疇。分析之其它實施例、方法及類型係在一般分子診斷技術者之範疇內且無需本文詳細描述。認為基於本文教示之本技術範疇內之其它實施例為本發明之一部分。

實例1：淺表性及侵入性惡性膀胱標記物之識別

自侵入性及淺表性膀胱癌之基因表現型的微陣列數據分級聚類顯示大量顯著差異。結果，分別以下列分析處理來該等癌症類型。然而，高比例基因在兩種癌症類型中均過度表現。圖3描述了一顯示侵入性惡性膀胱癌標記物之微陣列研究結果的表。199種侵入性標記物中之31種符合血清標記物之以上所列標準(圖中以"S"表示)。圖4描述了一顯示淺表性惡性膀胱癌之微陣列研究結果的表。170種淺表性標記物中之34種符合血清標記物之以上標準。圖3及4包括基因之HUGO符號("符號")、MWG Biotech寡核苷酸號、NCBI mRNA參照序列號、蛋白質參照序列號、腫瘤與非惡性基因表現之間的平均倍性變化、個體腫瘤樣品表現與非惡性樣品中值表現之間的最大倍性變化、初始未調整之學生t-測試之結果、2-樣品Wilcoxon測試之結果及求和秩計分。

侵入性膀胱癌標記物分析中199個基因之平均倍性變化(腫瘤：非惡性組織)在1.3至5.3範圍內變化且最大倍性變化在2.1至60.9範圍內變化。對於淺表性膀胱癌分析，170種標記物之平均過度表現在1.1至3.0範圍內變化且最大過度表現在1.9至144範圍變化。對於所示之各標記物，發現其作為癌症標記物之特異性的統計意義極高。學生t-測試值(具有少數例外)均低於10^-3，表明使用該等標記物之診斷與膀胱癌極其高度相關。應注意藉由微陣列研究產生之倍性變化趨於低估使用諸如qPCR觀察之更精確技術的實際表現變化。然而，由於別處所述之原因，微陣列分析可受到一或多種嚴重人工因素的影響。因此，吾人開發出基於qPCR之方法用於更準確地檢測膀胱癌之存在及階段。

實例2：qPCR分析

使用qPCR獲得圖3&4中所示之基因之子集的更敏感及準確定量之基因表現。分析來自高達30個侵入性膀胱腫瘤、25個淺表性膀胱腫瘤及18個正常膀胱上皮樣品之訊號RNA的由微陣列分析所識別之18個基因(圖3&4)，結果顯示於圖5中。顯示侵入型及淺表型膀胱癌的標記物SPAG5、TOP2a、CDC2、ENG、NRP1、EGFL6、SEM2、CHGA、UBE2C、HOXA13、MDK、THY1、BIRC5及SMC4L1之數據。與正常膀胱上皮相比，標記物SEMA3F、IGFBP5及NOV僅在淺表型中過度表現，且MGP僅在侵入型中過度表現；該等標記物在未過度表現之腫瘤樣品中維持與正常膀胱上皮類似之表現。圖5包括基因名稱、基因別名、基因符號、腫瘤(T)與非惡性(N)組織之間的中值倍性變化、個體腫瘤樣品與中值非惡性組織表現之間的最大倍性變化及具有大於非惡性樣品中表現水平第95個百分點之表現水平的腫瘤樣品之百分數。

圖5中標記物(除了CHGA)之中值倍性變化(腫瘤組織與中值非惡性組織表現相比)對於侵入性膀胱腫瘤在2至128倍之範圍內變化且對於淺表性膀胱腫瘤在2至39倍之範圍內變化。最大倍性變化對於侵入性腫瘤在24至2526之範圍內變化且對於淺表性腫瘤在6倍至619倍之範圍內變化。CHGA之表現類型係值得注意的，因為其在一部分腫瘤中具有極高的表現率(圖6s-6t)，但在剩餘中未檢測到表現。在15/25淺表性腫瘤、15/29侵入性腫瘤及9/10正常樣品中未檢測到表現。作為與正常比較之比率，正常樣品中的低表現排除了腫瘤中過度表現水平的準確定量，但此時可量測到BTM mRNA之積累且定量且用作診斷膀胱癌之基礎。對於侵入性腫瘤而言，基因SPAG5、TOP2A及CDC2之表現水平在腫瘤中=90%狀況下大於'正常'範圍95個百分點。除了BIRC5之外，在侵入性腫瘤中所檢查的圖5之剩餘基因在>45%樣品中具有大於正常95個百分點之表現。在淺表性腫瘤中，基因SPAG5、TOP2A、CDC2、ENG及NRP1之表現水平在腫瘤中=80%狀況下大於非惡性範圍95個百分點。除了CHGA、UBE2C及BIRC5之外，在淺表性腫瘤中檢查的圖5為之剩餘基因在>40%樣品中具有大於正常95個百分點之表現。

圖6a-6af描述了比較一系列18個基因(縱軸)中各基因之表現及在表現該基因(水平軸)、兩種正常組織(明棒)及淺表性或侵入性腫瘤組織(黑棒)之log2倍性變化觀察的頻率之直方圖。吾人驚人地發現對於該等18個基因中之各基因，正常及腫瘤組織之間頻率分佈無顯著分別。例如，圖6c描述了侵入性腫瘤中TOP2a表現之結果。僅觀察到兩種腫瘤樣品在正常範圍內具有表現水平。

使用qPCR在自等體積尿液提取之總RNA上測定患者及對照(圖1：樣品系列1)尿液中18種BTM-SPAG5、TOP2A、CDC2、ENG、IGFBP5、NOV、NRP1、SEMA3F、EGFL6、MGP、SEM2、CHGA、UBE2C、HOXA13、MDK、THY1、BIRC5及SMC4L1之積累。與對照尿液樣品相比，患者尿液中17種BTM顯示更高積累，EGFL6為例外(圖7)。17種BTM之中值倍性差異在2倍至265倍之範圍內變化。單一患者樣品與對照中的中值水平之最大差異在26倍至>10,000倍之範圍內變化。

圖8顯示如盒鬚圖所述之13種BTM之BTM轉錄物積累之差異且標準化至對照樣品中之中值表現。圖8顯示MDK、SEMA3F及TOP2A在癌症患者及對照尿液中無重疊。此外，IGFBP5、HOXA13、MGP、NRP1、SMC4L1、SPAG4及UBE2C之轉錄物的高水平積累幾乎總與膀胱癌相關。對於圖8中所述之剩餘的BTM，BIRC5、NOV及CDC2，其在患有膀胱癌之患者尿液中之表現與正常對照樣品相比增加至少約3倍。

引起測試膀胱癌存在之主要臨床症狀為血尿(意即尿液中存在肉眼可見或微觀水平之血液)。血液通常在視覺上或藉由使用尿液"量油計(dipstick)"化學檢測血色素來檢測。分別為僅約15%及4%病例之肉眼可見及微觀血尿與膀胱癌相關。因此，為使膀胱癌測試具有高特異性，全血中標記物表現之水平低或在一些狀況下不可檢測係很重要的。因此，為了增強具有高特異性之標記物之識別，圖8中13種標記物中的12種之表現係使用qPCR在血液RNA中測定。QPCR在使用圖2中所述之引子及探針自血液及膀胱腫瘤組織提取之5ug總RNA上進行。圖9顯示各標記物高於背景之週期數。對於標記物MGP、IGFBP5、SEMA3F及HoxA13，轉錄物不可在血液中檢測，但標記物SMC4L1及UBE2c尤其在血液中表現。吾人注意到顯示PCR週期數之數據為固有log2圖，藉以週期數增加1係指示兩倍之訊號。因此，在評估腫瘤組織及血液中存在的標記物之間的差異中，二個(2)週期之差異表示表現之4倍差異。類似地，5個週期(例如TOP2A)之差異表示2⁵或32倍表現之差異。諸如TOP2A及MDK之其它標記物由於血液表現及膀胱腫瘤表現之間大量差異，具有可檢測之血液表現，但保留合理之標記物。

為了檢查全血及膀胱腫瘤中標記物表現之間的差異另外且為了改進膀胱癌尿液標記物之選擇性，使用額外20個患者、13個正常對照及26個非惡性對照(圖1：樣品系列2)之尿液RNA選擇9種標記物供進一步分析。非惡性對照包括具有藉由細胞學在其尿液中所檢測之隱血或白血細胞的20個樣品。所有9種標記物顯示對照與癌症患者樣品之間的差異，分別與健康樣品及非惡性樣品對照，癌症患者樣品中過度表示之中值log2在5.4至10.4之範圍內變化及在4.0至10.1之範圍內變化(圖10)。說明該等數據之盒鬚圖係顯示於圖11中。

如血液qPCR數據所預測，與健康對照相比，標記物UBE2C及SMC4L1顯示非惡性對照尿液中積累之標記增加。與健康對照尿液樣品相比，非惡性樣品之尿液樣品中NRP1亦顯著升高且顯示癌症患者樣品及非惡性患者樣品之間相當之重疊，TOP2A及MDK亦顯示增加，但由於其在TCC細胞中極高地表現，其維持非惡性患者尿液樣品及癌症患者樣品中RNA積累之間很大的差異。相反，與健康對照樣品相比，HOXA13、IGFBP5、SEMA3F及MGP在非惡性尿液樣品中僅顯示少量增加。

總之，6種標記物(SEMA3F、HOXA13、MDK、IGFBP5、MGP及TOP2A)顯示在癌症患者樣品及非惡性對照之間最小的重疊。剩餘3種標記物(NRP1、UBE2C、SMC4L1)顯示在具有癌症患者樣品之非惡性對照子集及重疊中顯著提高。與健康對照相比，RNA標記物在非惡性對照尿液中增加之積累與該等標記物在存在於患有非惡性基板之患者尿液中之造血或內皮起源之細胞之表現一致。因此，與不考慮血液中標記物表現之先前技術方法相比，個體標記物使用尿液樣品診斷膀胱癌論證增加之敏感性及特異性。此結果完全在基於先前技術者的意料之外。

數據說明驚人之發現：僅使用基因表現數據之微陣列分析不能準確預測可顯示高敏感性及特異性之使用尿液標記物檢測膀胱癌之效用。需要考慮推定之標記物在造血及/或內皮起源之細胞中之表現。該可藉由(i)血液RNA之qPCR分析、(ii)表現數據庫分析(例如，血液及血管/內皮細胞RNA之EST庫)及/或(iii)由未分餾尿液提取之RNA之qPCR分析來達成。

敏感性及特異性

基於本文分析及揭示的兩個系列樣品，檢測膀胱癌之敏感性超過95%。包括患有非惡性疾病之患者樣品之系列2中之特異性亦超過95%。

實例3：多種標記物在檢測膀胱癌中的使用

圖12a-12b描述了與正常樣品相比個體腫瘤樣品中展現顯著增加表現("過度表現")之基因數目的直方圖。直方圖係基於自圖5中所示之第一個12種標記物獲得之qPCR數據。PCR分析中30個侵入性腫瘤中，27(90%)個過度表現至少4個大於95個百分點之基因(圖12a)。分析中25個淺表性腫瘤中，23(92%)個過度表現至少4個大於95個百分點之基因(圖12b)。該等發現表明在相對於正常組織多個基因過度表現之情況下，癌症檢測之可靠性極高，使癌症之診斷更確定。然而，在一些狀況下，單一標記物基因表現之提高足夠導致癌症之診斷。

使用標記物組合成功區分腫瘤與非腫瘤樣品之可靠性係進一步藉由圖13中所述之統計分析來說明。此分析比較腫瘤與非惡性樣品之qPCR基因表現數據之正態分佈。qPCR數據係概述於圖5中。分析顯示用於區分腫瘤與非惡性樣品之間的標記物數目之增加對測試敏感性之作用(以95%之固定特異性)。雖然單獨用於此分析時18種標記物中幾乎沒有具有大於90、95或99%之敏感性，但兩種或三種標記物之組合能夠以兩種或三種標記物之大量組合達到高敏感性(圖14a及14b)。

圖14a及14b顯示特定標記物及標記物組合對檢測侵入性及淺表性移行細胞癌(TCC)之敏感性，此時特異性固定在95%下。僅顯示具有>90%敏感性之組合。對於圖14a中所示之15種標記物，可以約95%對TOP2A、SPAG5及CDC2之敏感性單獨檢測侵入性膀胱癌。所示之其它標記物當單獨使用時具有較低之敏感性。

然而，兩種上文標記物之組合極度改良侵入性膀胱癌檢測之敏感性(圖13a及圖14a)。使用105種之兩種標記物組合中之13種可發現大於95%之敏感性。事實上，使用兩種標記物導致在105種標記物組合之42種中90%之最小敏感性。

對於淺表性膀胱癌(圖13b及圖14b)，未發現單獨任何標記物具有大於90%之敏感性，然而，136種兩種標記物組合中之11種達到此臨限值。22種三種標記物組合達到>95%之敏感性。

使用標記物組合亦可極大改良使用尿液樣品檢測膀胱癌之敏感性。圖15及16顯示使用尿液qPCR數據的個體標記物及標記物組合之檢測敏感性。

如圖16所示，雖然僅IGFBP5單獨具有>95%之敏感性，但是8種兩種標記物組合及37種三種標記物組合達到該臨限值。

實例4：患有淺表性及侵入性膀胱癌之患者中差異轉錄物積累

自圖5可看出包括SEMA3F、HOXA13、TOP2A及SPAG5之若干BTM顯示侵入性膀胱癌與淺表性膀胱癌之間的差異表現。為了擴大此觀察，比較患有侵入性與淺表性膀胱癌之患者尿液中該等轉錄物之積累。

自源於圖1中所述之患者等體積尿液提取RNA且BTM之積累係藉由qPCR測定。特定BTM組合之積累隨後以比率來表達。BTM組合係由一種與表淺性膀胱癌相比具有更高過度表現之BTM及一種與侵入性腫瘤相比具有更高過度表現之BTM組成。

圖17顯示20個表淺性及14個侵入性TCC患者之尿液樣品分析之三種標記物組合。所示之三種組合為(i)TOP2A及HOXA13、(ii)TOP2A及IGFBP5，及(iii)TOP2A及SEMA3F。可看出三種組合可區分患有淺表性與侵入性TCC之患者尿液樣品。圖5中顯示淺表型與侵入型TCC之間的表現差異之其它標記物亦能基於尿液樣品分析來測定TCC之類型。

此外，圖18顯示使用包括TOP2A之兩種標記物組合可用於辨別侵入性膀胱癌為1-2階段及3階段之腫瘤。

該等觀察顯示尿液中若干BTM轉錄物積累之測定能夠區分侵入性及淺表性膀胱癌。此外，藉由膀胱癌患者尿液樣品qPCR測定之BTM比率比對腫瘤RNA進行之相同分析更能區分侵入型與淺表型。此係藉由圖19來說明，其顯示使用約23個淺表性及28個侵入性膀胱腫瘤RNA製備物之qPCR數據(i)TOP2A及HOXA13、(ii)TOP2A及IGFBP5及(iii)TOP2A及SEMA3F之盒鬚圖；雖然該等BTM之比率仍允許區分淺表型與侵入型膀胱癌，但淺表性與侵入性比率之間存在更大重疊。此發現可反映具有與惡性細胞不相同BTM比率之細胞類型(諸如肌肉及纖維原細胞)的腫瘤RNA製備物之污染。或者，其可反映脫落於尿液中之惡性細胞中BTM的表現比保留於腫瘤體內之彼等細胞更強之差異。不管觀察者之原因，吾人認為檢測尿液中BTM之積累比習知微陣列分析具有顯著優點。

實例5：膀胱腫瘤標記物之抗體

在額外態樣中，本發明包括製造抗BTM之抗體。使用本文所述之方法，使用微陣列及/或qPCR方法可識別新穎BTM。一旦識別推定之標記物，則其可以足夠的量來產生以適於引發免疫學反應。在一些狀況下，可使用全長BTM，且在其它狀況下，一BTM之肽片段可足夠作為免疫原。免疫原可注入適當宿主(例如小鼠、兔子等)中且若需要可注入諸如Freund氏完全佐劑、Freund氏不完全佐劑之佐劑以增強免疫反應。應瞭解製造抗體在免疫學技術中係常規的且無需本文進一步描述。結果吾人可製造使用本文所述之方法識別之抗BTM或UBTM之抗體。

在其它實施例中，可製造抗本文所識別之腫瘤標記物之蛋白質或蛋白質核或抗與BTM一致之寡核苷酸序列之抗體。雖然某些蛋白質可糖基化，但糖基化類型之變體在某些情況下可導致缺乏糖基化類型之BTM形式的錯誤檢測。因此，在本發明之某些態樣中，BTM免疫原可包括去糖基化BTM或去糖基化BTM片段。去糖基化作用可使用此項技術中已知之一或多種糖苷酶來進行。或者，BTM cDNA可表現於諸如原核細胞株之糖基化缺失細胞株中，包括大腸桿菌及其類似物。

可製造其中具有BTM編碼之寡核苷酸之載體。許多該等病毒可基於此項技術中已知之標準載體。載體可用於轉染多種細胞株以製造產生BTM之細胞株，該等細胞株可用於製造特異性抗體發育所要數量之BTM或BTM檢測或BTM或UBTM標準化進展分析之其它試劑。

實例6：套組

基於本發明之發現，可預想及製造若干類型之測試套組。首先，可製造具有預載檢測分子(或"俘獲試劑")之檢測設備的套組。在檢測BTM mRNA之實施例中，該等設備可包含一基板(例如玻璃、矽膠、石英、金屬等)，其上結合了作為與待檢測之mRNA雜交之俘獲試劑的寡核苷酸。在一些實施例中，mRNA之直接檢測可藉由將mRNA(以cy3、cy5標記，放射性標記或其它標記)與基板上之寡核苷酸雜交來進行。在其它實施例中，mRNA之檢測可藉由首先使互補DNA(cDNA)至所要mRNA來進行。隨後，經標記之cDNA可與基板上之寡核苷酸雜交且檢測。

不管所用之檢測方法，需要比較測試BTM之表現與標準量測之表現。例如，RNA表現可標準化至總細胞DNA以表現組成性表現之RNA(例如核糖體RNA)或其它相對恆定之標記物。在量測諸如尿液之體液中BTM的實施例中，標準可為如本文所示自無惡性疾病之受者獲得之等體積尿液。

抗體亦可作為俘獲試劑用於套組中。在一些實施例中，基板(例如多孔板)可具有附著於其中之特定BTM或UBTM俘獲試劑。在一些實施例中，套組可具有包括其中的阻斷試劑。阻斷試劑可用於減少非特異性結合。例如，可使用不含BTM寡核苷酸之任何便利來源之過量DNA(諸如鮭魚精子DNA)來減少非特異性寡核苷酸結合。可使用過量阻斷蛋白諸如血清白蛋白來減少非特異性抗體結合。應瞭解檢測寡核苷酸及蛋白質之眾多方法在此項技術中係已知的，且可使用可特異性檢測與分子相關之BTM的任何策略且認為其係在本發明之範疇內。

在依靠抗體檢測之實施例中，BTM蛋白質或肽可基於每細胞或基於總細胞、組織或流體蛋白質、流體體積、組織質量(重量)來表現。或者，血清中BTM可基於相對高的豐富血清蛋白質諸如白蛋白來表現。

除了基板之外，測試套組可包含俘獲試劑(諸如探針)、洗滌溶液(例如SSC、其它鹽、緩衝液、清潔劑及其類似物)及檢測部分(例如cy3、cy5、放射性標記物及其類似物)。套組亦可包括使用及套件說明書。

實例7：用於檢測膀胱癌I之BTM組合

在一系列實施例中，測試BTM之HOXA13、MGP、SEMA3F及TOP2A(單獨或組合)之試劑可併入用於測試未分餾尿液或尿液細胞沉澱物之套組中以檢測膀胱癌。癌症患者及對照中該等BTM積累之範圍係顯示於圖20中。自需要監測疾病進度或治療反應之確診為膀胱癌的患者、具有泌尿症狀(包括肉眼可見及微觀之血尿)之個體或無症狀之個體收集尿液樣品。對於以量測未分餾之尿液中BTM之套組測試之患者或個體，可取用約2ml之尿液供測試。對於尿液小球之測試，可收集>20ml之尿液。

一適當套組包括：(i)使用及結果解釋說明書、(ii)用於來自未分餾尿液或尿液小球RNA之穩定化及純化的試劑、(iii)用於合成cDNA包括dNTP及反轉錄酶之試劑及(iv)用於BTM cDNA定量之試劑。在一形式中，該等試劑將用於定量PCR且應包括特定外顯子跨距之寡核苷酸引子、以用於檢測之探針標記之第三寡核苷酸、Taq聚合酶及PCR所需之其它緩衝液、鹽及dNTP。該套組亦可使用檢測轉錄物之其它方法，諸如BTM RNA與標記之探針直接雜交或分枝DNA技術；(v)檢測轉錄物之寡核苷酸及探針來自諸如β-肌動蛋白之高度轉錄之基因以用作品質對照量測；及(vi)BTM目標序列之定量樣品用作內標及健康及非惡性對照中BTM轉錄物積累之上限之參照。上限可定義為對照範圍之第95或第99個百分點，雖然可應用其它限制。尤其對於診斷淺表性膀胱癌，便利之臨限值係高於約50%，在其它狀況下高於約60%、70%或80%。

因此，使用本發明之方法，吾人可以較之先前技術之方法增加的敏感性及特異性來檢測膀胱癌及階段及類型。

在一些實施例中，腎臟功能可使用習知方法(例如，肌酸酐量測法)來測定。在該等實施例中的一些中，標記物之積累可藉由量測腎臟功能(例如尿液樣品中尿液體積、細胞體積、細胞數或總細胞蛋白質)來校正。

對於包括qPCR之測試，若測試樣品中BTM之積累大於上限1個PCR週期，則超過預定上限之測試樣品應標記為陽性。對於其它檢測方法，比正常上限(例如第90、第95或第97.5個百分點)高於2倍之結果應標記為陽性。

實例8：用於檢測膀胱癌II之BTM組合

在另一系列實施例中，在任一或兩種標記物組合TOP2A/SEMA3F及TOP2A/HOXA13尿液中之積累可用以提供存在於患者中之膀胱癌組織學類型的強預測，該患者係使用任何類型之尿液或血液測試進行膀胱癌之診斷。因此，可不需要膀胱鏡檢查及組織學檢查來診斷膀胱癌之類型。

用於測試該等比率之套組含有實例7中所述之(i)至(iv)組份。根據標準qPCR操作定量BTM之積累之後計算TOP2A/SEMA3F及TOP2A/HOXA13之比率。患有淺表性及侵入性膀胱癌之患者尿液中該等比率之範圍係顯示於圖21中。使用qPCR測試，TOP2A與SEMA3F之間小於5個週期之差異與為最豐富轉錄物之SEMA3F可預測侵入性膀胱癌，且大於5個週期可預測淺表性膀胱癌。對於TOP2A及HOXA13，小於8個週期之差異與為最豐富轉錄物之HOXA13可預測侵入性膀胱癌且大於8個週期可預測淺表性膀胱癌。

實例9：使用BTM評估膀胱癌之進度

為了評估膀胱腫瘤之進度，藉由膀胱壁之活組織檢查獲得組織之樣品或隨時間自患有膀胱癌之患者收集尿液之樣品。對在不同時間所取樣品進行BTM、UBTM或其組合積累之評估。BTM或UBTM之個體或組合增加之積累指示膀胱癌之進度。

實例10：使用BTM評估膀胱癌之治療

為了評估膀胱腫瘤之治療功效，自治療前所獲得之組織及/或尿液之樣品開始。測定一或多種BTM或UBTM之基線水平，作為各種BTM及UBTM互相之比率。開始處理且可包括此項技術中已知之任何治療，包括適於疾病類型及階段之外科、放射性治療或化學療法。在治療過程中，收集組織及/或尿液之樣品且分析BTM及/或UBTM之存在及量。測定各種BTM及UBTM之比率且將結果與(1)治療前患者之基線水平或(2)未患有膀胱癌之個體群體獲得之正常值比較。

以引用方式合併

本申請案中引用之所有公開案及專利係以引用方式全部併入本文中。

工業適用性

用於檢測BTM及UBTM家族成員之方法包括使用微陣列及/或即時PCR方法檢測核酸、蛋白質及肽。本發明之組合物及方法適用於診斷疾病、評估治療功效及用於製造試劑及測試適於量測BTM家族成員或UBTM家族成員表現之套組。

<110> Pacific Edge Biotechnology Ltd.

<120> 用於膀胱癌檢測的尿液標記物

<130> PEBL-01012WO0

<140> 094125037

<140> 2005-07-22

<150> NZ534289

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<150> US 60/692619

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<150> NZ539.219

<151> 2005-04-4

<160> 39

<170> PatentIn versi0n 3.3

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<212> DNA

<213> 人類

<400> 39

Claims

一種用於檢測個體之膀胱癌之活體外方法，其包含：檢測尿液中之尿膀胱腫瘤標記物(UBTM)核苷酸之積累，該個體之UBTM積累較一群未罹患惡性膀胱癌之正常個體尿液中之UBTM積累之約1.2倍為高，其特徵在於該UBTM為Midkine(軸突生長促進因子2)(MDK)。
如請求項1之方法，其中該UBTM不存在於血液中。
如請求項1或2之方法，其包含檢測至少一個額外之UBTM之積累，其中該UBTM係選自由下列所組成之群：GGH、SPP1、NRN1、SPARC、ADAMTS10、CNTN1、TLL2、PDIR、FBN1、KIAA0100基因產物、CALR、ITGBL1、ELA3B、SMOC2、HEXA、IGFBP7、MFAP2、CILP、OLFM1、LUM、SEM2、PRSS11、SULF1、SERPINH1、MGP、TIMP1、EGFL6、SPAG11、IGFBP5、SEMA3F、CDC2、TOP2A、UBE2C、STMN1、TUBA4、HIST1H1B、HMGB2、CCNA2、CDCA1、假定蛋白質MGC5576、DEK、MLF1IP、CDCA8、假定蛋白質FLJ20647、TYMS、SMC4L1、LYN、HMGB3、PTGIR、DONSON、HMMR、CLDN6、HIST1H1D、C10orf3、KNTC1、CKS1B、RRM2、HIST1H2BH、STK6、MPHOSPH1、CCNB2、GPR32、ENG、MFHAS1、HIST1H1C、AVPR2、CENPF、HOXA13、h4組蛋白家族成員g、MGC27121基因、NP、ASPM、假定蛋白質FLJ11871、LBH、NUDT1、HELLS、ASB9、MCM5、IMP-2、DKFZP566M1046、TUBA2、GAS2L3、假定蛋白質FLJ12442、MCM6、DOK3、WDR18、CKAP2、KIF20A、推定fap蛋白質、C6orf32、NEK2、CRY1、TGM2、DLG7、EIF2C2、DEPDC1、HIST2H4、MCM7、MTAP、KNTC2、HSPC150、SMC6L1、HIST1H2BC、ASF1B、ARH、LMNB1、假定蛋白質FLJ10719、假定蛋白質FLJ 10706、MAD2L1、SLC22A2、假定蛋白質MGC34923、SPAG5、ACVRL1、DSCR1、PRSS15、S100A9、MCM4、ST7L、PLEKHA4、EPHB1、CALD1、SMC1L1、Thy-1共轉錄、RAMP、FKBP11、C20orf129、HIST1H4H、CDKN3、MCAM、SNCAIP、NIPSNAP1、AP1M1、ANLN、C6orf69、TORC3、MAZ、TXNRD1、假定蛋白質xp 096695、C22orf4、VSNL1、與羧肽酶N 83 kDa鍊類似、KIAA1598、假定蛋白質FLJ13501、DKFZP4340047、假定蛋白質FLJ38716、與假定蛋白質(L1H3區)類似、假定蛋白質KIAA1875、PRIM1、假定蛋白質BC001096、MCM2、GJA3、C11orf30、與假定蛋白質FLJ30672類似、THY1、LRP3、LASS2、C18orf8、ZNF81、NARF、MTHFD2、D6T、SIAT7D、MMPL1、KLK11、KPNA2、FGFR1OP2、VIM、FLJ44108蛋白質、PAPOLG、FHOD1、RASL12、HMGN2、PITPNM2、DER1、EPHA4、VSIG1、RGS5、KIAA163蛋白質、SH2B、PGLYRP4、CDC45L、MLSTD1、假定蛋白質MGC11266、TNFRSF13B、NET1、LHFPL5、MX2、SPHK1、ABCG4、SERPINB2、GALNT10、LEPR、MXD4、FAPP2、NUP210、CSK、NRP1、MGAT1、KIAA0100基因產物、LCN7、BMP7、ADAMTS10、PM5、NOMO3、CPA6、NPPC、假定蛋白質FLJ23221、ERP70、GALNT14、ITIH3、PAPPA2、LOXL1、TNFRSF6B、SPARC、MSMB、CLDN6、PTMA、AVPR2、與鈉及氯依賴性肌胺酸轉運蛋白類似、TMEM19、假定蛋白質xp 047287、假定蛋白質FLJ11871、PROSC、MGC27121基因、NQO1、CKAP4、假定蛋白質BC001096、PDPK1、有絲分裂紡錘體組裝1調節物、MIRAB13、PORCN、SIX6、GJB2、FLJ35784蛋白質、SLC37A3、SPRY4、LHX3、C7orf27、SLC39A1、ZNF307、MIF、BST2、PSTPIP1、SOX4、NCOA5、假定蛋白質FLJ31438、ODD、SLC23A2、SHFM1、SRPK2、RAMP2、BPGM、RGS5、CXADR、MEIS2、TENS1、SNAI2、CHST2、HCA127、Thy-1共轉錄(LOC94105)、LRFN3、假定蛋白質FLJ22390、TRIB2、KRTHA3B、KIF21A、ANKRD17、RAG1、NUBP2、假定蛋白質FLJ20489、CASK、HIP1、PRKCDBP、TIE、C5orf15、CGI-72.ENTPD8、SH3BGRL3、NADH：輔酶氧化還原酶MLRQ次單元同系物、VG5Q、BG1、BCL2L11、ARK5、TLE3^-、ITIH5、RGS11、TM7SF3、SCRN3、PLXNA1、GJA4、假定蛋白質DKFZp434G1415、WSB2.CDA、GART、ZMPSTE24、TMEM33、GPI、假定蛋白質FLJ11000、CAMK1D、PTPN21及TNS。
如請求項1或2之方法，其中該檢測步驟係藉由檢測UBTM mRNA之積累進行。
如請求項1或2之方法，其中該檢測係使用微陣列進行。
如請求項1或2之方法，其中該檢測係使用定量聚合酶鏈式反應或雜交方法進行。
如請求項1或2之方法，其中該方法包括檢測該樣品中兩種或兩種以上UBTM家族成員之積累。
如請求項1或2之方法，其包含檢測自由TOP2a-MDK-IGFBP5及CDC2-MDK-IGFBP5組成之群的一或多個組合。
一種用於檢測膀胱癌之活體外方法，其包含：檢測來自疑似患有膀胱癌之患者尿液樣品中兩種或兩種以上選自由下列所組成之群之BTM家族成員之組合的核苷酸積累：TOP2a-HOXA13-MDK、SPAG5-HOXA13-MDK、CDC2-HOXA13-MDK、HOXA13-TOP2a-MDK及HOXA13-CDC2-MDK，該標記物之每一者之積累較一群未罹患惡性膀胱癌之正常個體之該標記物之每一者之積累之約1.2倍為高。
一種用於檢測個體之膀胱癌存在之活體外方法，其包含：判定尿液樣品中對MDK特異之核苷酸及一或多種選自由BIRC2、HOXA13、MGP、NOV、NRP1、SEMA3F、SPAG5及TOP2A組成之群的第一標記物之含量，且其中該第一標記物不存在於該個體之血液中。
一種用於區分惡性膀胱疾病與非惡性膀胱疾病之活體外方法，其包含：測定對MDK特異之核苷酸及一或多種選自由HOXA13、IGFBP5、MGP、NRP1、SEMA3F、SMC4L1、TOP2A及UBE2C組成之群的標記物在該患者尿液中之積累；及測定該樣品中MDK表現量與該一或多種標記物之比率，該比率與膀胱癌之存在相關。