RU2756255C1 - Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи - Google Patents
Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи Download PDFInfo
- Publication number
- RU2756255C1 RU2756255C1 RU2020136647A RU2020136647A RU2756255C1 RU 2756255 C1 RU2756255 C1 RU 2756255C1 RU 2020136647 A RU2020136647 A RU 2020136647A RU 2020136647 A RU2020136647 A RU 2020136647A RU 2756255 C1 RU2756255 C1 RU 2756255C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- minutes
- bladder
- sediment
- bladder cancer
- added
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, урологии, и может быть использовано для раннего выявления (проведения скрининга) рака мочевого пузыря, и касается способа раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи. Способ включает: забор первой утренней порции мочи обследуемого, центрифугирование ее при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов; слив супернатанта, добавление к осадку 2 мл PBS, ресуспендирование пипетированием на протяжении 1-2 мин и повторное центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 мин; процедуру отмывки проводят дважды; слив супернатанта, к осадку добавление 0,5 мл PBS, ресуспендирование пипетированием на протяжении 1-2 мин. Далее к полученной клеточной взвеси добавляют моноклональные антитела к CD45, меченные PerCP-Cyanine5.5 в объеме 20 мкл, перемешивают на персональном вортексе в течение 20 сек, добавляют моноклональные антитела к CD326, меченные аллофикоцианином в объеме 20 мкл, перемешивают на персональном вортексе в течение 20 сек и помещают в темное место; инкубацию клеточной взвеси проводят при комнатной температуре на протяжении 15 минут; после инкубации проводят измерение флуоресценции на проточном цитофлоурометре BD FACSCanto II, полученные данные анализируют в программном обеспечении FACSDiva по светорассеянию, количеству CD45+ событий и количеству CD326+ событий; при количестве CD45-CD326+ клеток, меньшем либо равном 2,65%, злокачественное новообразование мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений не предполагают; при количестве CD45-CD326+ клеток выше 2,65% предполагают наличие у обследуемого субъекта злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений. Изобретение является эффективным, точным, простым в выполнении, неинвазивным обнаружением бессимптомных злокачественных новообразований мочевого пузыря на основании цитометрического анализа осадка мочи с использованием моноклональных антител CD45 и CD326. Предлагаемый способ с высокой диагностической точностью (98,1%) позволяет выявить наличие рака мочевого пузыря без клинических проявлений на ранних стадиях. 2 пр., 1 табл., 4 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, урологии, и может быть использовано для раннего выявления (проведения скрининга) рака мочевого пузыря.
В связи с объективными трудностями в выявлении начальных этапов опухолевого процесса в мочевом пузыре (отсутствие клинических проявлений заболевания, отсутствие визуально идентифицируемых опухолевых очагов), существующие способы ранней диагностики рака мочевого пузыря относятся к направлению лабораторной диагностики.
Известны способы микроскопической и цитологической диагностики рака мочевого пузыря (Руководство по цитологической диагностике опухолей человека / под ред. А.С. Петрова. - М.: Медицина, 1976. - 304 с.) и способы, их оптимизирующие (Патент РФ №2547567 от 26.02.2014 и пр.). (Суть способов заключается в исследовании цитологического мазка на содержание морфологически атипичных клеток после различных процедур, например, биопсии.) Несмотря на достаточно высокую эффективность таких способов при выявлении злокачественных новообразований мочевого пузыря, их осуществление сопровождается трудностями, связанными со сложностью получения материала для исследования, инвазивностью указанных методов и значительным объемом трудозатрат. Кроме этого, непосредственное осуществление инвазивных процедур способно вызвать проявление некоторых клинических симптомов (например, микрогематурию), не связанных с онкологическим заболеванием.
Известны способы определения в биологических жидкостях (моче, крови, плазме, сыворотке) концентраций различных биомаркеров, ассоциированных с раком мочевого пузыря (Патент US 9892229 от 01.04.20; Патент РФ №2718284 от 01.04.20 и пр.). Данные методы используют различные технологии иммунохимических методов исследования и их чувствительность и специфичность зависят от типа используемого для проведения исследования оборудования. Применимость данной группы методов ранней диагностики заболевания существенно ограничивается фактом того, что до настоящего времени не выявлено ни одного органоспецифического биохимического маркера для рака мочевого пузыря. Кроме того, использование комплекса маркеров существенно повышает стоимость процедуры анализа.
Известны способы исследования молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с раком мочевого пузыря. Так, в способе диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря (Патент РФ №2456607 от 20.07.2012 и пр.) используется FISH-анализ с применением коммерческого ДНК-зонда «UroVysion» (ABBOTT), что делает этот способ доступным для широкого использования. Особенности метода позволяют получать достоверные результаты на меньшем количестве клеточного материала (по сравнению с цитологическими исследованиями) на более ранних стадиях рака мочевого пузыря. Известны способы анализа полиморфизма различных генов или их продуктов методами генетического анализа (Патент РФ №2393772 от 23.03.2009, Патент РФ №2469323 от 28.01.2011 и пр.). Такие способы диагностики позволяют оценить различные этапы канцерогенеза. Однако особенности методов требуют наличия специфических расходных материалов, значимая часть которых отсутствует в коммерческом доступе и должна быть синтезирована в лаборатории. Это накладывает довольно серьезное ограничение, связанное с межсерийной сопоставимостью данных, что отражается на точности проводимых оценок. Кроме того, все связанные с генетической диагностикой способы, сопровождаются высокими финансовыми затратами и должны выполняться специалистами с узкой специализацией.
Известен способ диагностики рака мочевого пузыря на основании клеточного цикла осадка мочи методом проточной цитофлуорометрии (Разрешение на применение новой медицинской технологии серия АА №0001899 ФС №2009/114 от 27 мая 2009 г.). Данный способ позволяет оценить плоидность и соотношение клеток в различных фазах клеточного цикла. Однако, в связи с тем, что клеточный цикл не является опухолеассоциированным явлением и на результат могут оказать влияние различные факторы физиологической (менструальный цикл, половое поведение и пр.), патологической (наличие сопутствующей инфекционной или воспалительной патологии) или терапевтической (проведение лечебных процедур) природы. Таким образом, высокая эффективность такого способа может быть достигнута только при предварительном отборе пациентов в группу с высоким риском развития рака мочевого пузыря.
Задача предлагаемого способа состоит в эффективном обнаружении бессимптомных злокачественных новообразований мочевого пузыря на основании цитометрического анализа осадка мочи с использованием моноклональных антител CD45 и CD326.
Поставленную задачу решали следующим образом. Первую утреннюю порцию мочи обследуемого субъекта центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин. К полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные PerCP-Cyanine5.5 (РегСР-Су5-5 - при возбуждении лазером 488 нм дает максимум флуоресценции на 695 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на вортексе (устройстве для перемешивания жидкостей за счет встряхивания емкости) в течение 20 сек. Добавляли моноклональные антитела к CD326, меченные аллофикоцианином (АРС - при возбуждении лазером 633 нм дает максимум флуоресценции на 650 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACSCanto II (BectonDickinson, США).
Для получения результата проводили анализ не менее 1000 событий. После окончания анализа осуществляли работу с полученными скатерограммами в программном обеспечении FACSDiva (BectonDickinson, США).
Первым шагом является гейтирование (установление порогового значения какого-либо параметра на основе контуров вероятности для выбора подмножества собранных событий для дальнейшего анализа) всех событий на скатерограмме (диаграмма, состоящая из образующих «облако» точек, где каждая точка соответствует конкретным сочетаниям параметров), прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния (фиг. 1). Это проводится для исключения из дальнейшего анализа крупных конгломератов клеток и коньюгатов красителей.
Следующим шагом является гейтирование CD45+ событий (фиг. 2). Клетки, экспрессирующие на своей мембране рецептор CD45 являются по своей природе лейкоцитами и исключаются из дальнейшего анализа.
Заключительным этапом является гейтирование CD326+ событий (фиг. 3). Анализ проводится только для популяции клеток, не экспрессирующих CD45 (то есть СБ45-негативных). Обосновано это фактом того, что экспрессия CD326 на поверхности клеток лейкоцитарного ряда не наблюдается. CD326 (рецептор ЕрСАМ) экспрессируется только на поверхности эпителиоцитов, которые являются ключевой популяцией клеток для оценки роста эпителиальных опухолей.
Этапы проведения исследования указаны на Фиг. 4.
При оценке количества CD45-CD326+ клеток у различных обследуемых субъектов были обнаружены различия, используемые для решения поставленной задачи (Табл. 1).
Способ осуществляют следующим образом:
Для оценки наличия злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений у обследуемых субъектов забирается первая утренняя порция мочи. По вышеописанной методике проводится измерение содержания в осадке мочи CD45-CD326+ клеток. Если количество CD45-CD326+ клеток меньше либо равно 2,65%, то злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений у такого обследуемого не предполагается. Если количество CD45-CD326+ клеток превышает 2,65%, то предполагается наличие у обследуемого субъекта злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений. В зависимости от совокупности клинических признаком врач рекомендует усиленное наблюдение за таким пациентом или дополнительное обследование иными методами инструментальной и/или лабораторной диагностики.
Чувствительность предлагаемого метода прогноза развития рецидива рака мочевого пузыря составляет 74,3%, специфичность - 92,1%, диагностическая точность - 98,1%.
Пример №1
Пациент А., 50 лет
При проведении периодического профосмотра выявлена микрогематурия. При определении уровня экспрессии CD326 выявлено количество CD45-CD326+ клеток в клеточном осадке мочи - 0,62%. Согласно предлагаемому способу наличие рака мочевого пузыря на ранних стадиях не предполагается. При дополнительном инструментальном обследовании выявлено заболевание мочевого пузыря воспалительной природы (цистит), проведены мероприятия по терапевтическому лечению воспаления.
До настоящего момента (в течение 30 месяцев) пациент находится под наблюдением специалистов, признаков рака мочевого пузыря не наблюдается.
Пример №2
Пациент Б., 66 лет
При проведении периодического профосмотра взята порция мочи. При определении уровня экспрессии CD326 выявлено количество CD45-CD326+ клеток в клеточном осадке мочи - 22,1%. Согласно предлагаемому способу у пациента предполагается наличие рака мочевого пузыря на ранних стадиях. В связи с тем, что клинических и лабораторных признаков заболевания не наблюдалось, пациенту рекомендовалось наблюдение у специалиста каждые 3 месяца. На 3 визит (через 9 месяцев) появились клинические признаки заболевания (микрогематурия). Пациенту проведена цистоскопия, показавшая наличие атипичных клеток. УЗИ органов малого таза показало мышечно-неинвазивную опухоль задней стенки мочевого пузыря. Пациенту проведена трансуретральная резекция.
Нами разработан метод скрининга бессимптомных злокачественных новообразований мочевого пузыря на основании цитометрического анализа осадка мочи с использованием моноклональных антител CD45 и CD326. Его достоинствами являются: отсутствие инвазивности для пациента, простота получения материала для исследования, низкий объем трудозатрат, высокая диагностическая точность. Выявление наличия рака мочевого пузыря без клинических проявлений на ранних стадиях снижает смертность больных и улучшает качество и продолжительность их жизни. Метод доступен для широкого применения в амбулаторно-поликлиническом звене здравоохранения. Для использования предлагаемого метода необходимо лишь наличие проточного цитофлуориметра и расходных материалов к нему (моноклональные антитела CD45 и CD326, промывочные растворы). Простота исследования не требует наличия узкой специализации исследователя, оно может быть выполнено средним медицинским персоналом (с верификацией результатов врачом).
Claims (1)
- Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи, включающий забор первой утренней порции мочи обследуемого, центрифугирование ее при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов; затем сливают супернатант, к осадку добавляют 2 мл PBS, осадок ресуспендируют пипетированием на протяжении 1-2 мин и повторно центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин; процедуру отмывки проводят дважды; затем супернатант сливают, к осадку добавляют 0,5 мл PBS, ресуспендируют пипетированием на протяжении 1-2 мин; отличающийся тем, что к полученной клеточной взвеси добавляют моноклональные антитела к CD45, меченные PerCP-Cyanine5.5 в объеме 20 мкл, перемешивают на вортексе в течение 20 сек, добавляют моноклональные антитела к CD326, меченные аллофикоцианином в объеме 20 мкл, перемешивают на вортексе в течение 20 сек и помещают в темное место; инкубацию клеточной взвеси проводят при комнатной температуре на протяжении 15 минут; после инкубации проводят измерение флуоресценции на проточном цитофлоурометре BD FACSCanto II, полученные данные анализируют в программном обеспечении FACSDiva по светорассеянию, количеству CD45+ событий и количеству CD326+ событий; при количестве CD45-CD326+ клеток, меньшем либо равном 2,65%, злокачественное новообразование мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений не предполагают; при количестве CD45-CD326+ клеток выше 2,65% предполагают наличие у обследуемого субъекта злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020136647A RU2756255C1 (ru) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020136647A RU2756255C1 (ru) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2756255C1 true RU2756255C1 (ru) | 2021-09-28 |
Family
ID=77999966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020136647A RU2756255C1 (ru) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2756255C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2547567C1 (ru) * | 2014-02-26 | 2015-04-10 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Онкологический диспансер N 3" | Способ цитологической диагностики рака мочевого пузыря |
| TW201734454A (zh) * | 2004-07-23 | 2017-10-01 | 太平洋愛吉生技股份有限公司 | 檢測膀胱癌之尿液標記物 |
| RU2670655C2 (ru) * | 2017-02-20 | 2018-10-24 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения Российской Федерации" | Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения |
| CN109880909A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-06-14 | 宁夏医科大学总医院 | 用于膀胱癌诊断的尿液微小rna靶基因数据库比值模型建立方法 |
-
2020
- 2020-11-06 RU RU2020136647A patent/RU2756255C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201734454A (zh) * | 2004-07-23 | 2017-10-01 | 太平洋愛吉生技股份有限公司 | 檢測膀胱癌之尿液標記物 |
| RU2547567C1 (ru) * | 2014-02-26 | 2015-04-10 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения "Онкологический диспансер N 3" | Способ цитологической диагностики рака мочевого пузыря |
| RU2670655C2 (ru) * | 2017-02-20 | 2018-10-24 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения Российской Федерации" | Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения |
| CN109880909A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-06-14 | 宁夏医科大学总医院 | 用于膀胱癌诊断的尿液微小rna靶基因数据库比值模型建立方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| FRANCESCO SORIA et al. Molecular markers in bladder cancer. World Journal of Urology (2019) 37: 31-40. * |
| STEP H. et al. // Fluorescence Diagnosis of Bladder Tumur by Use of 5-ALA - Fundamentals and Results / Baumgartner et al. // - 1998. - p. 39- 41. * |
| ПОНУКАЛИН А. Н. и др. Онкомаркеры в диагностике стадии инвазии рака мочевого пузыря. Медицинский вестник Башкортостана, Том 8, N 2, 2013, с. 213-218. * |
| ПОНУКАЛИН А. Н. и др. Онкомаркеры в диагностике стадии инвазии рака мочевого пузыря. Медицинский вестник Башкортостана, Том 8, N 2, 2013, с. 213-218. FRANCESCO SORIA et al. Molecular markers in bladder cancer. World Journal of Urology (2019) 37: 31-40. STEP H. et al. // Fluorescence Diagnosis of Bladder Tumur by Use of 5-ALA - Fundamentals and Results / Baumgartner et al. // - 1998. - p. 39- 41. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10613089B2 (en) | Method of using non-rare cells to detect rare cells | |
| US20230085158A1 (en) | Method of using non-rare cells to detect rare cells | |
| EP1861509B1 (en) | A method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells | |
| Borel et al. | Significance of low levels of thyroglobulin in fine needle aspirates from cervical lymph nodes of patients with a history of differentiated thyroid cancer | |
| KR20150008842A (ko) | 순환 종양 세포를 확인하기 위한 장치, 시스템 및 방법 | |
| Campi et al. | Novel liquid biomarkers and innovative imaging for kidney cancer diagnosis: what can be implemented in our practice today? A systematic review of the literature | |
| US11988658B2 (en) | Methods of assessing cellular breast samples and compositions for use in practicing the same | |
| Kipp et al. | Comparison of fluorescence in situ hybridization, p57 immunostaining, flow cytometry, and digital image analysis for diagnosing molar and nonmolar products of conception | |
| Guzmán-Calderón et al. | Intracystic glucose levels appear useful for diagnosis of pancreatic cystic lesions: a systematic review and meta-analysis | |
| JP2010243406A (ja) | Ａｆｐおよびｐｉｖｋａ−ｉｉの測定値を特徴値とした識別関数を利用する、肝臓癌および慢性肝疾患の病態進行度の検出方法 | |
| AU2012204796A1 (en) | Diagnostic method | |
| RU2756255C1 (ru) | Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи | |
| US20230131016A1 (en) | Methods for disease assessment using drain fluid | |
| Partyka et al. | Comparison of surgical and endoscopic sample collection for pancreatic cyst fluid biomarker identification | |
| JP2012022002A (ja) | 循環腫瘍細胞を用いる転移性乳癌患者の療法中の各追跡期間ポイントでの無増悪および全生存を予測する方法 | |
| CN114994327A (zh) | 一种生物标志物gsdme的应用 | |
| US11448650B2 (en) | Methods for diagnosing high-risk cancer using polysialic acid and one or more tissue-specific biomarkers | |
| CA3188184A1 (en) | Biomarker combinations for determining aggressive prostate cancer | |
| RU2670655C2 (ru) | Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения | |
| US20170067912A1 (en) | Compositions and methods for diagnosing barrett's esophagus stages | |
| WO2013099865A1 (ja) | Ａｃｆ検出方法 | |
| Sharma et al. | Circulating Tumor Cells in Oral Cancer | |
| Guo et al. | High neutrophil/lymphocyte ratio and low lymphocyte percentage are independent risk factors for new-onset CKD | |
| US20230176061A1 (en) | Methods for diagnosing high-risk cancer using polysialic acid and one or more tissue-specific biomarkers | |
| RU2823255C1 (ru) | Способ прогнозирования рецидива рака щитовидной железы после радикального хирургического вмешательства |