RU2670655C2 - Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения - Google Patents

Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения Download PDF

Info

Publication number
RU2670655C2
RU2670655C2 RU2017105638A RU2017105638A RU2670655C2 RU 2670655 C2 RU2670655 C2 RU 2670655C2 RU 2017105638 A RU2017105638 A RU 2017105638A RU 2017105638 A RU2017105638 A RU 2017105638A RU 2670655 C2 RU2670655 C2 RU 2670655C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
risk
added
cells
bladder cancer
recurrence
Prior art date
Application number
RU2017105638A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2017105638A3 (ru
RU2017105638A (ru
Inventor
Эдуард Васильевич Семенов
Евгений Владимирович Слепов
Руслан Александрович Зуков
Original Assignee
Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения Российской Федерации"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения Российской Федерации" filed Critical Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства Здравоохранения Российской Федерации"
Priority to RU2017105638A priority Critical patent/RU2670655C2/ru
Publication of RU2017105638A3 publication Critical patent/RU2017105638A3/ru
Publication of RU2017105638A publication Critical patent/RU2017105638A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2670655C2 publication Critical patent/RU2670655C2/ru

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения. Для этого производят забор первой утренней порции мочи пациента с раком мочевого пузыря T1N0M0, TaN0M0 или TisN0M0. Порцию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS. Затем проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Указанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS. Затем полученную клеточную взвесь ресуспендировали на протяжении 1-2 минут. К ней добавляли моноклональные антитела к CD 13, меченные фикоэритрином в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 секунд. Добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные флуоресцеин изотиоционатом в объеме 20 мкл. Снова перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубировали клеточную взвесь при комнатной температуре на протяжении 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре. При наличии в осадке мочи количества CD13+ клеток меньше или равного 3% и количества CD45+ клеток меньше или равного 4% считают риск развития рецидива низким. При наличии в осадке мочи количества CD13+ клеток больше 4% и количества CD45+ клеток больше 6% считают риск развития рецидива высоким. Изобретение позволяет оценить риски развития рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения. 2 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно: к онкологии, урологии и может быть использовано для определения риска развития рецидива поверхностного рака мочевого пузыря.
Известен способ цитологической диагностики рака мочевого пузыря (Патент РФ №2547567, G01 №33/48, Бюл. №10, 10.04.2015). В предлагаемом способе, включающем фиброцистоскопию, получение промывных вод мочевого пузыря спиртовым смывом, путем его катетеризации, после чего спиртовой смыв помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при скорости 1500 об/мин в течение 10 минут, после этого надосадочную жидкость сливают, к полученному осадку добавляют 4 мл питательной среды 199 для получения клеточной суспензии, которую затем помещают в фильтр-концентратор, центрифугируют, при этом происходит удаление фоновых элементов и разделение на фракции клеточных элементов для получения монослойного препарата, который после этого сушат на воздухе при комнатной температуре и используют для цитологического и/или иммуноцитохимического исследования. Оптимальный объем клеточной суспензии составляет от 100 до 400 мкл. Способ позволяет получить монослойные tospin-препараты с равномерным, тонкослойным (монослойным) распределением клеточного материала на небольшом участке предметного стекла. Изобретение обеспечивает повышение диагностических возможностей цитологической диагностики рака мочевого пузыря й его рецидивов.
У данного способа есть недостаток, связанный со сложностями получения материала для проведения исследования (инвазивность и трудоемкость методики).
Известен способ диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря (Патент РФ №2456607, G01N 33/50, Бюл. №20, 20.07.2012). Для этого образец утренней мочи от второго мочеиспускания последовательно обрабатывают полиэтиленгликолем, фосфатным буфером, фиксатором Карноя, центрифугируя после каждой обработки. Клеточную суспензию раскапывают в 10-мм лунки предметного стекла до получения 10-20 клеток в поле зрения. Затем препарат нагревают 2-4 ч. при 39°C, добавляют 200 мкл подогретого 0,005% раствора РНКазы, накрывают покровным стеклом, равным по размеру предметному, помещают покровным стеклом вниз во влажную камеру при температуре 37°C на 30 мин. После этого обрабатывают фосфатным буфером, 10% раствором пепсина, фосфатным буфером, 1% раствором формальдегида и обезвоживают спиртом. В целевую лунку наносят смесь из 0,5 мкл ДНК-зонда «UroVysion» и 1 мкл гибридизационного буфера, накрывают ее покровным стеклом диаметром 10 мм и нагревают 5 мин при 74°C и 18-24 ч. при 39°C. Затем препарат промывают в растворах детергента, в лунку добавляют DAPI и анализируют под флуоресцентным микроскопом. Оценивают не менее 25 морфологически аномальных клеток, и если как минимум в 4-х из них обнаружено больше 2-х перицентромерных сигналов не менее чем в двух хромосомах из трех: 3, 7 и 17-й и/или в 12-ти из 25 клеток отсутствует сигнал по локусу 9р21, диагностируют переходноклеточный РМП. Изобретение обеспечивает большую чувствительность способа при ранних стадиях по сравнению с более продвинутыми стадиями, доступен для широкого применения.
К недостаткам данного способа можно отнести высокие финансовые затраты на проведение исследования, потребность в дорогостоящем оборудовании, а также проведение работ высокоспециализированными специалистами.
Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики рака мочевого пузыря на основании клеточного цикла осадка мочи методом проточной цитофлуорометрии (Разрешение на применение новой медицинской технологии серия АА №0001899 ФС №2009/114 от 27 мая 2009 г.). Сущность способа заключается в том, что для исследования забирается утренняя порция мочи, образцы мочи центрифугируются, затем производится фиксация осадка мочи раствором 70% этанола. Выполняется окраска материала с помощью антител к цитокератину (моноклональные антитела к цитокератину IMMUNOTECH, Франция, No 2356) с целью дифференцировки эпителиальных клеток, входящих в состав осадка мочи от прочих. В качестве флуорохрома для метки ДНК эпителиальных клеток используется пропидия йодид (CALBIOCHEM, No 537059). Обработка материала производится с помощью программы ModFitLT 3.0. Данные, полученные в ходе исследования, представляются в виде точечного графика распределения фиксированных клеток в моче по интенсивности флуоресценции PI (пропидия йодида) (F1-2) и Cytoceratin (цитокератина) (F1-1), а также в виде гистограмм, на оси абсцисс которых откладываются каналы флуоресценции, а на оси ординат количество клеток, проходящих через эти каналы.
При обработке результатов проточной цитофлуорометрии анализируются следующие параметры: плоидность эпителиальных клеток, входящих в состав осадка мочи, величина индекса пролиферации (ИП = количество клеток в S-фазе в % + количество клеток в G2-фазе в %), количество гиперплоидных клеток. Диагностические критериями обнаружения рака мочевого пузыря, по данным проточной цитофлуорометрии, являются: обнаружение анеуплоидной линии клеток, величина ИП≥20%, количество гиперплоидных клеток>3%.
По результатам проведенного исследования показатели чувствительности и диагностической эффективности метода проточной цитофлуорометрии оказались выше, нежели цитологического исследования (71,25% и 51,3% (p<0,05); 75% и 67,2%, соответственно). При этом специфичность метода проточной цитофлуорометрии оказалась ниже цитологического исследования - (80,6% и 100% соответственно).
Описанный способ имеет недостаток, связанный с диагностикой рецидива поверхностных форм рака мочевого пузыря после проведенного комбинированного лечения, заключающийся в том, что он не позволяет оценить вероятность развития рецидива заболевания.
Задача предлагаемого способа заключается в определении риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после хирургического лечения с использованием метода проточной цитометрии и моноклональными антителами CD13 и CD 45.
Поставленную задачу решали следующим способом. Первую утреннюю порцию мочи пациента с поверхностной формой рака мочевого пузыря (T1N0M0, TaN0M0 или TisN0M0) центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжение 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжение 1-2 мин. К полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD13, меченные фикоэритрином (РЕ - максимум флуоресценции на 578 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек. Добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные флуоресцеин изотиоционатом (ФИТЦ - максимум флуоресценции на 518 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACSCanto II (BectonDickinson, США).
Согласно литературным данным, максимум экспрессии антигена CD13 локализуется на подслизистом слое мочевого пузыря, антиген CD45 является основным лейкоцитарным антигеном и маркирует клетки лимфоидной ткани. Уровни экспрессии антигенов CD13 и CD45 у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря представлены в таблице 1. У пациентов с развитием рецидива заболевания в клеточном осадке мочи количество клеток с экспрессией антигенов CD13 и CD45 отличается от таковых показателей пациентов, у которых развития рецидива диагностировано не было.
Figure 00000001
Таким образом, при определении у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря уровней экспрессии антигенов CD13 и CD45 можно прогнозировать развитие рецидива у них в дальнейшем в течение 12 месяцев.
Способ осуществляют следующим образом:
У пациентов с неинвазивным раком мочевого пузыря перед трансуретральной резекцией забирается первая утренняя порция мочи. По вышеописанной методике проводится измерение содержания в осадке мочи CD13+ и С045+клеток. Риск развития рецидива рассчитывается согласно таблице 2.
Figure 00000002
Чувствительность предлагаемого метода прогноза развития рецидива рака мочевого пузыря составляет 72,7%, специфичность - 77,0%, диагностическая точность - 97,6%.
Пример №1.
Больная А., 68 лет
При определении уровней экспрессии антигенов CD13 и CD45 получены следующие показатели: количество СD13+клеток - 1,50%; количество СD45+клеток - 3,90%. Прогноз согласно предлагаемому способу - вероятность рецидива низкая. До настоящего момента (в течение 14 месяцев) пациент находится под наблюдением специалистов, рецидива рака мочевого пузыря не наблюдается.
Рекомендовано: УЗИ органов малого таза каждые шесть месяцев, цистоскопическое исследование один раз в шесть месяцев.
Пример №2.
Больной Б., 45 лет
При определении уровней экспрессии антигенов CD13 и CD45 получены следующие показатели: количество СD13+клеток - 6,00%; количество СD45+клеток - 7,30%. Прогноз согласно предлагаемому способу - высокая вероятность рецидива заболевания. Рецидив заболевания был выявлен через 9 мес. после трансуретральной резекции.
Рекомендовано: цистоскопическое исследование каждые 3 месяца, УЗИ брюшной полости, забрюшинного пространства и малого таза каждые 3 месяца.
Предлагаемый способ позволяет прогнозировать развитие рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения с высокой диагностической точностью.

Claims (1)

  1. Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения, включающий забор утренней мочи и определение проточной цитофлоуриметрии, отличающийся тем что дополнительно первую утреннюю порцию мочи пациента с раком мочевого пузыря T1N0M0, TaN0M0 или TisN0M0 центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов; после этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин; описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды, далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 минут, к полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD 13, меченные фикоэритрином в объеме 20 мкл, перемешивали на персональном вортексе в течение 20 секунд, добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные флуоресцеин изотиоционатом в объеме 20 мкл, перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место; инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 минут, после инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре, и при наличии в осадке мочи количества CD13+ клеток меньше или равного 3% и количества CD45+ клеток меньше или равного 4% считают риск развития рецидива низким, а при наличии в осадке мочи количества CD13+ клеток больше 4% и количества CD45+ клеток больше 6% считают риск развития рецидива высоким.
RU2017105638A 2017-02-20 2017-02-20 Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения RU2670655C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017105638A RU2670655C2 (ru) 2017-02-20 2017-02-20 Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017105638A RU2670655C2 (ru) 2017-02-20 2017-02-20 Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2017105638A3 RU2017105638A3 (ru) 2018-08-20
RU2017105638A RU2017105638A (ru) 2018-08-20
RU2670655C2 true RU2670655C2 (ru) 2018-10-24

Family

ID=63177206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017105638A RU2670655C2 (ru) 2017-02-20 2017-02-20 Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2670655C2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2756255C1 (ru) * 2020-11-06 2021-09-28 Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства Здравоохранения Российской Федерации Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006012522A1 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Pacific Edge Biotechnology Ltd. Urine markers for detection of bladder cancer
RU2456607C1 (ru) * 2011-04-27 2012-07-20 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАДИОЛОГИИ И ХИРУРГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ФГУ "РНЦРХТ" Минздравсоцразвития России) Способ диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006012522A1 (en) * 2004-07-23 2006-02-02 Pacific Edge Biotechnology Ltd. Urine markers for detection of bladder cancer
RU2456607C1 (ru) * 2011-04-27 2012-07-20 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "РОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАДИОЛОГИИ И ХИРУРГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ФГУ "РНЦРХТ" Минздравсоцразвития России) Способ диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
POPOV A.M., et al., Minimal residual disease monitoring by flow cytometry in children with acute lymphoblastic leukemia,Klin Lab Diagn. 2010 Aug;(8):36-41-. *
БОЖЕНКО В.К. и др., Проточная цитометрия осадка мочи в диагностике рака мочевого пузыря, Вопросы онкологии, 2009, Том: 55, N 3, С. 278-284 - . *
БОЖЕНКО В.К. и др., Проточная цитометрия осадка мочи в диагностике рака мочевого пузыря, Вопросы онкологии, 2009, Том: 55, N 3, С. 278-284 - реферат. POPOV A.M., et al., Minimal residual disease monitoring by flow cytometry in children with acute lymphoblastic leukemia,Klin Lab Diagn. 2010 Aug;(8):36-41-реферат. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2756255C1 (ru) * 2020-11-06 2021-09-28 Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Красноярский Государственный Медицинский Университет Имени Профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства Здравоохранения Российской Федерации Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи

Also Published As

Publication number Publication date
RU2017105638A3 (ru) 2018-08-20
RU2017105638A (ru) 2018-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11988658B2 (en) Methods of assessing cellular breast samples and compositions for use in practicing the same
White et al. Flow cytometry: role in monitoring transitional cell carcinoma of bladder
Boldorini et al. Fluorescence in situ hybridisation in the cytological diagnosis of pancreatobiliary tumours
EP3214445B1 (en) Diagnostic method
RU2670655C2 (ru) Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения
Sapierzynski Practical aspects of immunocytochemistry in canine lymphomas
CN116699137A (zh) 一种评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法
Yuan et al. Predicting outcome for patients with node negative breast cancer: a comparative study of the value of flow cytometry and cell image analysis for determination of DNA ploidy
CN109975548B (zh) IgG4检测试剂在制备结直肠癌诊断剂方面的应用
Tsui et al. Comparisons of voided urine cytology, nuclear matrix protein‐22 and bladder tumor associated antigen tests for bladder cancer of geriatric male patients in Taiwan, China
Böhm et al. Urinary immunocytology—Promise or nonseller? A review with an opinion
Nordström et al. Laminin-5 γ 2 chain as an invasivity marker for uni-and multifocal lesions in the lower anogenital tract
CN111579785B (zh) 一种基于血浆外泌体蛋白的hpv感染致宫颈癌的早期诊断标志物及其应用
Bogush et al. Quantitative immunofluorescent estimation of estrogen receptor β expression in human solid tumors using flow cytometry
Liu et al. Evaluation of acridine orange florescence in exfoliative urinary cytology for diagnosing bladder carcinoma
CN112462065A (zh) 一种用于检测实体肿瘤的抗体组合物、试剂盒及检测方法
JP5574522B2 (ja) 癌マーカー及び癌細胞の検査方法
RU2756255C1 (ru) Способ раннего выявления рака мочевого пузыря с помощью цитофлоуриметрического анализа клеточного осадка мочи
KR101693190B1 (ko) 인유두종바이러스 검사와 mkrn1 발현 패턴에 따른 자궁경부암 예측 및 진단 방법
Bijelić et al. Neoadjuvant Chemotherapy Affects TFF3 Peptide Expression in Luminal B Subtype of Breast Cancer–A Pilot Study
RU2530557C1 (ru) Способ дифференциальной диагностики злокачественной и доброкачественной патологии молочной железы
CN114729055B (zh) 共表达CD45和EpCAM的细胞群的检测和分离方法及其用途
CN107475419A (zh) Kndc1基因及其表达产物在卵巢癌检测中的应用
CN117604110B (zh) 用于乳腺癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用
CN112698033A (zh) 一种血源性外泌体her2的检测方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20190221