CN111579785B - 一种基于血浆外泌体蛋白的hpv感染致宫颈癌的早期诊断标志物及其应用 - Google Patents

一种基于血浆外泌体蛋白的hpv感染致宫颈癌的早期诊断标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血浆外泌体蛋白Mortalin作为HPV阳性宫颈癌诊断标志物及其应用。通过蛋白质组学比较宫颈癌肿瘤组病人、癌前病变病人(CIN)及健康人血浆外泌体的差异蛋白，以及敲除HPV关键分子HPVE6/E7后的mortalin表达情况，发现外泌体mortalin能够作为宫颈癌的分子标志物，对血浆外泌体mortalin进行检测能够对宫颈癌进行初步筛查，能够提高宫颈癌的早期确诊概率。

Description

一种基于血浆外泌体蛋白的HPV感染致宫颈癌的早期诊断标 志物及其应用
技术领域
本发明涉及分子诊断标志物领域，具体涉及一种血浆外泌体作为HPV感染致宫颈癌的早期诊断标志物及其应用。
背景技术
宫颈癌是危害我国女性的第二大恶性肿瘤，其危险程度仅次于乳腺癌，发病率排在女性肿瘤的第四位，死亡率为第二位，是女性肿瘤相关疾病死亡的主要原因。宫颈癌严重降低了女性生活质量，并威胁着女性的生命健康。因此，对宫颈癌发病的早诊早治，并有效控制宫颈癌发病率、死亡率变成了当务之急。
HPV的感染是宫颈癌发生的主要原因之一，其相关率高达99.7％。HPV感染诱发宫颈癌的两个必要条件，一是高危型HPV(high risk HPV，hrHPV)感染，二是HPV持续性感染。HPV分为低中高危型，高危型HPV包含16、18、31、33、39、45、52亚型等，其中HPV16 和HPV18是最常见的高危型亚型，占宫颈癌发病原因的75％。
现如今宫颈癌的筛查手段分为TCT液基细胞检测以及HPV DNA检测。这两项检测可分别进行宫颈细胞不典型增生和癌变的检测以及判断是否感染HPV，但这两项检测都需要专门的妇科学检查来辅助确诊。通常情况下，在这两项检查结果表明高度怀疑宫颈癌后，再进行阴道镜和组织活检进行病理学诊断来确诊。
TCT检查是利用美国TBS评价系统进行诊断。生成TBS图文报告后，可以将宫颈鳞状上皮细胞异常分为5类：不能明确意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)、鳞状上皮细胞轻度不典型增生(LSIL)、鳞状上皮细胞重度不典型增生(HSIL)、可疑鳞癌细胞、癌细胞。但其缺陷在于，TCT检查需要借助妇科检查手段来进行，使用例如阴道窥器等工具提取病人的宫颈表面细胞样品。该过程往往会使病人产生不适感以及心理上的不良影响。
HPV DNA检测同样也需要使用妇科检查手段辅助取样，通常取宫颈脱落细胞或者宫颈粘液，利用聚合酶链式反应(PCR)进行HPV分型的检测。同样也会病人产生不适感以及心理上的不良影响。
而且HPV DNA检查和TCT检查要求检查者三天之内不能进行性生活，同时不适合进行阴道清洗后的检查者；当检查者月经时期不便于进行HPV和TCT检查；HPV DNA检查和TCT检查费用高，两项联合更是会对消费者造成经济负担；最主要的是，HPV DNA检查和 TCT检查只是初步筛查作用，没有预后判断作用。
因此，基于现有技术的缺陷，缺少一种能脱离传统取样方式，提高女性病患的心理接受程度，同时还兼具高效、准确、特应性强的HPV阳性宫颈癌诊断标志物及其相关应用，其将具有极大的经济与实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血浆外泌体蛋白作为HPV阳性宫颈癌诊断标志物及阐述其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种HPV感染致宫颈癌早期诊断标志物，其包括血浆外泌体Mortalin。
HPV感染能够通过招募转录因子CTCF上调宫颈上皮细胞Mortalin蛋白的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表达量与子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达通过Mortalin-p53-Gadd45A信号通路对癌旁组织以及宫颈上皮细胞组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮助子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。
进一步地，上述宫颈癌为高危型HPV持续感染引发的宫颈癌和/或子宫颈上皮内瘤变。
进一步地，上述血浆外泌体Mortalin在HPV感染的细胞中表达上调。
进一步地，上述诊断包括以下步骤：
检测受试者样品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，预测受试者是否患有宫颈癌。
其中，检测外泌体Mortalin方法包括Western blot、ELISA、qPCR或其组合。
其中，上述血浆外泌体Mortalin的提取方法包括试剂盒提取法、超高速离心法。
在一些实施例中，上述超高速离心法的步骤如下：
(1)用培养基以4:1体积比稀释胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，160000g离心16h，去除血清内外泌体；过滤，进行无菌处理；与培养基混合后，配置成10％FBS的无外泌体培养基；
(2)利用无外泌体培养基对宫颈癌细胞进行培养48-72h，收取细胞上清后以2000g离心去除细胞沉淀，收集上清；
(3)取步骤(2)所得上清，10000g离心去除直径大的细胞外囊泡，收集上清；
(4)取步骤(3)所得上清，120000g离心以沉淀外泌体，去掉上清后使用磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline，PBS)重悬沉淀外泌体；
(5)再次用120000g离心步骤(4)以洗涤沉淀外泌体，去除上清，即到外泌体。
其中，上述培养基为PRIM1640培养基。
在一些实施例中，上述试剂盒提取法的步骤如下：
(1)获取病人血液样本；
(2)用PBS润洗分离柱；
(3)将500ul外泌体样本(血液样本)上样至分离柱中；
(4)每次添加500ul PBS洗脱；
(5)按照500ul组份收集外泌体，一般于第7管外泌体含量最高，可收集第7-9管的液体，即得外泌体Mortalin。
本发明的第二个方面，提供：
定量检测上述的宫颈癌诊断标志物表达量的宫颈癌辅助诊断试剂；其中，上述宫颈癌诊断标志物为血浆外泌体Mortalin。
HPV感染能够上调宫颈细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表达量与CIN 及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达对癌旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮助子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。
其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。
进一步地，通过上述宫颈癌辅助诊断试剂检测受试者样品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，预测受试者是否患有宫颈癌。
进一步地，上述宫颈癌为HPV阳性宫颈癌。
更进一步地，上述宫颈癌还包括子宫颈上皮内瘤变(CIN)；
本发明的第三个方面，提供：
一种宫颈癌诊断试剂盒，其包括上述的宫颈癌辅助诊断试剂。
HPV感染能够上调宫颈上皮细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表达量与 CIN及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达对癌旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮助子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。
进一步地，通过上述宫颈癌辅助诊断试剂盒检测受试者样品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，预测受试者是否患有宫颈癌。
其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。
本发明的第四个方面，提供：
上述的宫颈癌诊断标志物、宫颈癌诊断试剂或宫颈癌诊断试剂盒在诊断或辅助诊断HPV 阳性宫颈癌中的应用；
其中，上述应用不包括疾病的诊断。
HPV感染能够上调宫颈细胞Mortalin的表达量，且血浆外泌体Mortalin的表达量与CIN 及宫颈癌的进程相关，成正向关系；宫颈癌组织中的外泌体Mortalin的高表达对癌旁组织以及上皮组织有恶性转化作用；可通过对血浆外泌体Mortalin的检测可以对帮助子宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的早期诊断，同时为宫颈癌的预后做初步判断。
其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。
本发明的第五个方面，提供：
定量检测外泌体Mortalin表达量的试剂在制备诊断或辅助诊断宫颈疾病试剂盒中的应用。
其中，上述宫颈疾病为HPV阳性宫颈癌；
上述宫颈疾病还包括子宫颈上皮内瘤变；
上述诊断或辅助诊断包括：通过上述检测外泌体Mortalin的试剂，检测受试者样品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，确定受试者是否患有宫颈癌；
其中，检测外泌体Mortalin方法包括Weatern blot、ELISA、qPCR或其组合。
上述应用不包括疾病的诊断。
本发明的第六个方面，提供：
上述的宫颈癌诊断标志物在制备药物中的应用，该药物用于抑制Mortalin表达和/或用于下列用途中的至少一种：
(1)抑制永生化宫颈上皮细胞H8的恶性转化；
(2)抑制宫颈癌肿瘤体积增大；
(3)抑制瘤旁组织转化。
本发明的有益效果是：
本发明中的血浆外泌体mortalin作为宫颈癌的分子标志物，通过对检查者血浆外泌体 Mortalin检测，能够对HPV阳性宫颈癌和CIN进行初步筛查，同时也可以作为其早期诊断依据。血液样本抽提便捷、快速、成本低，并且在检查者不方便做妇检或者有大量检查者筛查时，相比传统检测更容易操作，能够作为未来宫颈癌和CIN初步筛查的主要技术手段。
附图说明
图1为癌前病变组(子宫上皮内瘤变，CIN，A组)、癌症组(宫颈癌，B组)及健康对照组(C组)的Venn图；
图2为SiHa、C-33A及H8细胞的Mortalin、HPV E6、GAPDH的表达情况(2a)和SiHa、C-33A细胞上清外泌体(Exos)中Mortalin、CD63、CD9的表达情况(2b)；
图3为敲除HPV E6/E7(Ko E6/E7)后，SiHa细胞的Mortalin、HPV E6、HPV E7、GAPDH的表达情况(3a)和SiHa细胞上清外泌体(Exos)中Mortalin、CD63、CD9的表达情况(3b)；
图4为H8细胞与SiHa(4a)和Caski(4b)细胞不加入和加入外泌体抑制剂GW4869 共培养后的Mortalin、GAPDH的表达情况以及细胞迁移图(4c)；
图5为激光共聚焦显微镜下的外泌体(呈绿色(PKH67))、细胞膜(呈红色(Dil))，细胞核(呈蓝色(Hoechst33342))；
图6为与SiHa和Caski外泌体共培养后的H8细胞染色情况(a)和克隆效率(b)；
图7为注射SiHa和KdMorSiHa外泌体的肿瘤大小比较(a)和质量对比(b)；
图8为注射SiHa和KdMorSiHa外泌体的Mortalin、CD63、CD9、GAPDH的表达情况。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
病人体内的外泌体的获取
使用高速离心法获取病人体内的外泌体，具体步骤如下：
(1)获取病人的血液样本；
(2)血液样本通过3000rmp离心10min，去除血细胞获得血浆样本；
(3)取上清后，10000g高速离心30min，去除直径大的细胞外囊泡；
(4)取上清后，120000g超高速离心1.5h，沉淀外泌体，收集沉淀外泌体；
(5)对收集的外泌体再次离心，120000g离心1.5h，洗涤沉淀外泌体，即得外泌体Mortalin。取上清并溶解外泌体备用。
或使用试剂盒提取病人体内的外泌体，具体步骤如下：
(1)获取病人的血液样本；
(2)用PBS润洗分离柱；
(3)将500ul外泌体样本(宫颈粘液或血液样本)上样至分离柱中；
(4)每次添加500ul PBS洗脱；
(5)按照500ul组份收集外泌体，一般于第7管外泌体含量最高，可收集第7-9管的液体，即得外泌体Mortalin。
通过上述方法获得的病人体内的外泌体将用于以下验证试验中。
实施例1、血浆外泌体Mortalin表达量与宫颈癌分期程度相关性
蛋白质非标记定量技术(Lable-free)可通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需特定的定量标记试剂，通过分析质谱数据，比较样品间特定肽段的信号强度，从而达到对肽段对应的蛋白质进行相对定量的目的。
本发明利用Lable-free验证血浆外泌体Mortalin表达量与宫颈癌分期程度相关性。具体步骤如下：
(1)分别对癌前病变组(子宫上皮内瘤变，CIN，A组)、癌症组(宫颈癌，B组)及健康对照组(C组)各取10例病人血液样本，将这10例样本随机分成3个小组即每小组3-4例样本，将其血浆合并在一起后命名为A1、A2、A3小组作生物学重复，B、C组同理；
(2)每个小组利用本发明试剂盒提取外泌体；
(3)对每个小组外泌体进行BCA蛋白检测，并利用FASP酶解液和常规酶解实验buffer 对外泌体进行酶解处理；
(4)酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用QE-Plus质谱仪进行ESI质谱分析；
(5)ESI质谱搜库分析使用数据库为Uniprot(Homo sapiens)；
(6)计算A、B、C组所检测各个蛋白表达含量与组间表达量的差异，当P<0.05表明具有显著差异，据此绘制Venn图。
结果如表1和图1所示，在肿瘤组-癌前病变组(B-C组)间与肿瘤组-健康人组(B-C组) 间发现有5个蛋白为其共性差异蛋白，其中Mortalin(Uniprot ID:P38646)的P值低，表示组间差异的可能性大。数据显示，肿瘤组的血浆外泌体mortalin比癌前病变组以及健康人组均升高，其中，癌前病变组/肿瘤组的比值最低，说明Mortalin对鉴别二者均十分有效。这表明在正常组与癌前病变组、癌前病变组以及肿瘤组当中，血浆外泌体Mortalin 的表达量有显著差异能够区分三者，同时可以发现Mortalin的表达量随着疾病恶性程度上升而提高，成正向关系。
表1肿瘤组-癌前病变组(B-C组)间与肿瘤组-健康人组(B-C组)间的
共性差异蛋白表达量比较
Figure BDA0002473306320000071
实施例2、HPV感染与外泌体mortalin表达量上调的相关性
选取宫颈癌细胞株SiHa(HPV+)和C-33A(HPV-)以及永生化宫颈上皮细胞H8分别代表HPV阳性(HPV+)宫颈癌细胞、HPV阴性(HPV-)宫颈癌细胞和癌前病变细胞。Caski 也为HPV阳性细胞。比较HPV特征蛋白HPV E6/E7与细胞内及外泌体mortalin表达量的关联。
细胞内的外泌体的提取
具体方法如下：
(1)利用PRIM1640培养基以4:1体积比稀释胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，在超高速离心机中以160000g离心16h以去除血清内外泌体。将得到的稀释血清进行0.22μm过滤器过滤进行无菌处理。取50ml上述处理过的稀释血清，与50ml PRIM1640培养基混合后，配置成10％FBS的无外泌体培养基；
(2)利用无外泌体培养基对宫颈癌细胞进行培养48-72h，收取细胞上清后以2000g离心去除细胞沉淀，收集上清；
(3)取步骤(2)所得上清，10000g离心去除直径大的细胞外囊泡，收集上清；
(4)取步骤(3)所得上清，120000g离心以沉淀外泌体，去掉上清后使用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)重悬沉淀外泌体；
(5)再次用120000g离心步骤(4)以洗涤沉淀外泌体，去除上清后利用PBS溶解外泌体，保存于-80℃。
Western blot免疫印迹实验
SDS-PAGE胶的配制：12％的分离胶与5％的浓缩胶，浓缩胶和分离胶的配方如下所示：
Figure BDA0002473306320000072
Figure BDA0002473306320000081
上样与跑胶：根据合适的上样量制定上样体积，用1x电泳液加满内槽，外槽液体超过指示线。将样品加至每一个孔中，并在样品左右两侧泳道加Marker指示带以确认条带区域。浓缩胶使用恒压80V电泳30min，分离胶使用恒压120V 70-80min直至溴酚蓝快溢出。
转膜：配制好转膜工作液，并且准备好PVDF膜。在PVDF膜上放胶，在两侧再分别加上浸湿的滤纸与海绵，夹好后放入槽内浸泡在转膜工作液中。转膜装置放入4℃冰箱里防止胶体过热，用250mA恒流转80-90min。
封闭：用TBST溶液配制5％脱脂牛奶封闭液。取出PVDF膜经TBST溶液漂洗后，浸泡在封闭液中，在室温下用摇床轻摇封闭1-2h。
一抗孵育：将膜从封闭液中取出，用TBST溶液漂洗2次，3min/次。用抗体稀释液配制合适浓度的一抗(Mortalin 1:1000、GAPDH 1:3000、HPV E6 1:1000、HPV E7 1:1000、CD63 1:2000、CD9 1:1000)，将目的条带浸泡在对应抗体工作液中，4℃条件下摇晃过夜。
洗膜：回收一抗后，用TBST溶液洗涤条带3次，每次5min。
二抗孵育：用抗体稀释液稀释二抗(抗鼠/抗兔1：10000)室温下摇床孵育1-2h。
洗膜：弃去二抗，用TBST溶液洗条带5次，每次5min。
显影：弃去清洗液后，将条带浸泡在无菌水内。配制ECL工作液，按照1：1混合液体后，取液体均匀滴在条带表面，于成像机器中曝光显影。
结果：如图2所示，在细胞中(图2a)SiHa细胞的Mortalin表达量比C-33A及H8细胞的高，说明HPV+细胞mortalin含量比HPV-及永生化细胞更高。同时细胞上清外泌体(Exos)含量如图2b所示，同样表明HPV+细胞的外泌体mortalin含量相比于HPV-细胞更高。
CRISPR/Cas9转染实验
构建knockoutHPV-E6/E7-SiHa(KoHPV-E6/E7-SiHa)细胞株(稳转株)，具体步骤如下：
(1)设计E6/E7sgRNA序列，包装构建CRISPR/Cas9病毒；
(2)在24孔板铺完细胞后，根据病毒载量与MOI值确定病毒体积，转染gRNA病毒；
(3)转染9h后，更换培养基，48h后观察荧光情况，再利用嘌呤霉素(Puromycin)
进行筛选1周；
(4)筛选后扩增细胞，再次转染Cas9病毒；
(5)转染9h后，更换培养基，48h后开始用潮霉素(Hygromycin)进行筛选1周；
(6)对最终筛选出的细胞进行扩增，挑选细胞进行单克隆培养；
(7)对单克隆株进行Western blot以及qPCR的验证。
为了进一步研究HPV对mortalin的调控关系，我们对SiHa细胞敲除HPVE6/E7蛋白来构建knockoutHPV-E6/E7-SiHa(KoHPV-E6/E7-SiHa)稳转株，比较敲除HPV特征蛋白前后细胞及其外泌体的mortalin的表达量变化关系。
结果如图3所示，相比于SiHa细胞，敲除HPVE6/E7后细胞内及外泌体的mortalin含量均降低，提示HPV的存在能够促进mortalin的产生，HPV能上调mortalin的表达。同时，细胞内的mortalin含量也同外泌体内mortalin表达成正比。
实施例3外泌体Mortalin对永生化宫颈上皮的恶性转变作用的体外细胞实验
永生化宫颈上皮细胞H8作为HPV感染阳性细胞，是永生化细胞并未发生癌变，其癌变机制尚未阐明。本部分解释了宫颈癌源外泌体mortalin对H8细胞具有恶性转变功能，提示外泌体mortalin的作用可能为H8癌变的机制之一。
利用慢病毒Mortalin shRNA构建Knockdown Mortalin SiHa(KdMorSiHa/KdMS)以及 Knockdown Mortalin Caski(KdMorCaski/KdMC)细胞系，SiHa与Caski均为宫颈癌细胞株， H8细胞为永生化宫颈上皮细胞。两种细胞系在前期实验中均被证实构建成功，同时证实其细胞外泌体内Mortalin的表达量相对降低。
用实施例2细胞内的外泌体的方法提取细胞内的外泌体。
细胞共培养实验
GW4869是一类外泌体抑制剂，当需要确认产生作用的途径是否为外泌体时，可利用 GW4869对外泌体产生进行抑制以观察作用的变化。
①用6孔板0.4μm Transwell小室，在下室内铺H8细胞，上室铺SiHa或Caski细胞以及无外泌体完全培养基，放入小室进行共培养48h。
②在SiHa/Caski与H8共培实验中，将上层SiHa/Caski细胞进行预处理，即用含有工作浓度20μm的GW4869的培养基对SiHa细胞培养48h(S+GW/C+GW)再进行①的操作；
③除去下室培养基，用胰蛋白酶轻轻消化共培养后的H8细胞，再进行后续实验。
后续实验1：免疫印迹实验(Western blot，WB)
将Western blot实验分为SiHa处理组与Caski处理组，分别包含H8、SiHa/Caski、KdMS/KdMC、S+GW/C+GW处理小组，分别收集这与这几种细胞共培养过后的H8细胞，进行Western blot实验
对上述细胞共培实验中的③中各处理组细胞进行裂解并检测其蛋白浓度后，以20μg作为上样蛋白质量，确定样品体积进行上样；用分离胶分离蛋白后，进行转膜、封闭，孵育一抗过夜；收集一抗、洗膜后，孵育相应的二抗。洗膜后滴加ECL显影剂观察条带形成情况。
后续实验2：迁徙实验
将迁徙实验分为SiHa、KdMorSiHa、Caski和KdMorCaski组，收集这4种细胞共培后的 H8进行Transwell迁移实验。
①在24孔板8μm Transwell上室内铺处理过后的H8细胞和无血清基础培养基，下室加无外泌体完全培养基，上下小室的浓度差为迁移引诱剂，放入小室进行迁移实验；
②迁移12h后将培养基除去后，将小室放置在甲醇内固定20min；将多余的甲醇液体吸去，在室温下静置风干4h。再将小室膜浸没在0.1％的结晶紫溶液染色10min，PBS 内清洗3次，除去多余液体；
③将小室的膜裁下，正面朝上平铺在载玻片上，中性树胶固定后盖玻片封片，干燥后观察细胞迁移的情况。
结果如图4a、4b所示，当H8细胞与SiHa和Caski细胞共培养后，细胞内Mortalin表达量上升，而当用外泌体抑制剂GW4869后，Mortalin表达未上升，同时KdMortalin细胞共培养时也是这样的结果。如图4c所示，单位时间内SiHa组与Caski组作用下的H8细胞获得更强的迁徙能力，而当宫颈癌细胞敲除Mortalin后，H8迁徙能力下降。提示宫颈癌细胞可通过外泌体对H8细胞产生恶性作用，Mortalin为产生作用的关键分子。
外泌体共培养实验
在六孔板内每孔铺等量2×105的H8细胞。等细胞贴壁后，每孔加入40ug不同来源的外泌体进行共培养，在48h后停止共培。消化H8细胞并计数，所得细胞可进行后续的功能实验；或是每106细胞加细胞裂解液100ul，制作成蛋白样品等待后续分子检测。
后续实验1：摄取实验(功能实验)
具体步骤如下：
①铺适量H8细胞至共聚焦小皿中；将外泌体进行PKH67染色后，将悬液加至共聚焦小皿；
②共培养10h后，吸去培养基，用PBS清洗1遍后，用1ml甲醇固定H8细胞20min；
③PBS洗涤三次后，利用Dil染液进行细胞骨架染色10min；
④PBS洗涤3次后，Dapi染色5min；PBS洗涤3次，用封片剂进行封片；
⑤在激光共聚焦显微镜或者荧光显微镜下观察样品。
结果如图5所示，外泌体呈绿色(PKH67)，细胞膜呈红色(Dil)，细胞核呈蓝色(Hoechst33342)，结果显示H8能够摄取宫颈癌源外泌体。
后续实验2克隆形成实验
具体步骤如下：
①对与外泌体共培养后(外泌体共培养实验)的H8细胞进行消化，在镜下对细胞计数；取出500个细胞/孔，每个样品重复三孔，与培养基混合后均匀铺于6孔板内；
②用甲醇对细胞进行固定20min；PBS清洗3次；
③配制0.1％结晶紫溶液对细胞进行染色10min；再使用PBS进行清洗3次，直到无细胞区域无深染；
④对六孔板进行干燥处理，干燥后对样品进行拍照，并计算克隆形成的情况。
结果如下图6所示，与SiHa和Caski外泌体共培养后的H8细胞获得的增值能力明显高于敲除Mortalin组，提示宫颈癌细胞外泌体中的Mortalin能够促进H8增殖能力。
实施例4、血浆外泌体Mortalin的表达量与成瘤大小的关系以及对瘤旁组织的转化关系
本部分体内实验部分，证明了癌源外泌体mortalin对肿瘤的促进作用，以及瘤体大小与外周血外泌体mortalin含量的正相关联系。
动物实验
对消化细胞计数，用PBS溶解制成细胞悬液，裸鼠背部一侧消毒并注射5×105的100-150 μL的细胞悬液。成瘤后，每2天测量裸鼠的瘤体长短径。
肿瘤体积计算公式为：
Figure BDA0002473306320000111
当瘤体大小到达50mm2时，向瘤体注射不同的外泌体以观察外泌体对瘤体生长的影响。组1注射SiHa细胞外泌体(SiHa exos)；组2注射KdMortalin-SiHa细胞的外泌体(kdMorSiHa exos)；组3注射PBS。每次注射外泌体蛋白总量为20ug，以注射每3天/次，PBS作为肿瘤生长的空白对照组。
结果如图7a所示，注射SiHa外泌体的肿瘤明显大于其余两组，注射KdMorSiHa外泌体组的肿瘤明显比SiHa组的肿瘤质量更小(图7b)，说明SiHa外泌体Mortalin能够对肿瘤生长起促进作用。
后续实验：不同负荷小鼠血浆外泌体Mortalin的含量
具体步骤如下：
①分别对上述动物实验中的每组小鼠用心脏取血的方法抽取血液；
②3000rmp离心10min，去除血细胞，取上清；
③利用上述细胞外泌体的提取方法提取小鼠血浆外泌体；
④利用Western blot观察Mortalin表达情况。
结果如图8所示，注射SiHa外泌体(SiHa exos)小组中Mortalin表达量最高，敲除Mortalin 外泌体组则血浆外泌体Mortalin表达量相对降低。同时联系上述实验结果，可得宫颈癌外泌体Mortalin对肿瘤起促进作用；同时，血浆外泌体中Mortalin的表达量与肿瘤大小呈正向关系。
综上所述，通过蛋白质组学比较宫颈癌肿瘤组病人、癌前病变病人(CIN)及健康人血浆外泌体的差异蛋白，其中，外泌体mortalin在组间比较均有显著性差异，并且随着疾病严重而含量升高。同时，通过细胞实验发现了HPV感染的细胞mortalin表达，敲除HPV关键分子HPVE6/E7后，mortalin表达下降，并且外泌体mortalin含量变化情况与细胞内相同。说明HPV的感染能够上调细胞mortalin表达量，从而上调细胞外泌体mortalin表达量。此外，通过体外实验证明了HPV+宫颈癌细胞的外泌体mortalin对永生化宫颈上皮细胞H8的恶性转化作用。在体内实验中，含有mortalin的外泌体能够促进肿瘤生长，更重要的是，小鼠血浆外泌体mortalin的表达量与肿瘤大小成正比。其结果与体外实验结果相互印证。因此，说明了宫颈癌的血浆外泌体mortalin表达相比于CIN与健康人显著升高，升高的机制与HPV感染有关，HPV感染能够上调血浆外泌体mortalin的表达；同时HPV+宫颈癌细胞外泌体mortalin对永生化宫颈上皮细胞H8有恶性转化作用，而宫颈癌99％以上有HPV感染，因此外泌体mortalin能够作为宫颈癌的分子标志物，对血浆外泌体mortalin进行检测能够对宫颈癌进行初步筛查，能够提高宫颈癌的早诊概率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.定量检测血浆外泌体Mortalin表达量的试剂在制备诊断或辅助诊断宫颈疾病试剂盒中的应用；
其中，所述宫颈疾病为HPV感染的宫颈癌或子宫颈上皮内瘤变；
所述诊断或辅助诊断包括：通过所述定量检测外泌体Mortalin的试剂，检测受试者样品中Mortalin的表达水平；根据表达水平和对照的差异，预测受试者是否患有宫颈癌。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118109410B (zh) * 2024-04-26 2024-07-16 赛奥斯博生物科技(北京)有限公司 一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312549A (zh) * 2016-12-19 2019-10-08 莫尔豪斯医学院 用于通过抑制外泌体释放来治疗疾病的组合物和方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012031008A2 (en) * 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
WO2012170711A1 (en) * 2011-06-07 2012-12-13 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L Circulating biomarkers for cancer
EP4170031A1 (en) * 2012-10-23 2023-04-26 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
US20160083791A1 (en) * 2014-09-18 2016-03-24 Pathadvantage Associated System and method for detecting abnormalities in cervical cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312549A (zh) * 2016-12-19 2019-10-08 莫尔豪斯医学院 用于通过抑制外泌体释放来治疗疾病的组合物和方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of Exosomes in Plasma of Patients with Breast, Ovarian, Prostate, Hepatic, Gastric, Colon, and Pancreatic Cancers;Ming-Bo Huang et al;《J Cancer Ther》;20190531;第10卷(第5期);第3、5、8页 *
Exosomes in virus-associated cancer;Jin’en Wu et al;《CANCER LETTERS》;20181231;第438卷(第1期);第1-30页 *
Proteomics strategies to analyze HPV-transformed cells: relevance to cervical cancer;Fabio Di Domenico et al;《EXPERT REVIEWS》;20131231;第10卷(第5期);第461–472页 *

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