CN118109410B - 一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用，属于临床医学领域。本发明通过从外周血中分离单个核细胞，经培养、扩增，得到高纯度的自然杀伤细胞，利用超滤浓缩法分离提取自然杀伤细胞中的外泌体，得到自然杀伤细胞外泌体。经实验验证，该自然杀伤细胞外泌体和人乳头瘤病毒16型假病毒同时接种于HEK293细胞，可降低20%的HPV16PP感染效率；连续给药自然杀伤细胞外泌体7天，可杀死HEK293细胞中90%以上HPV病毒。本发明公开的自然杀伤细胞外泌体具有显著杀伤HPV病毒的作用。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学领域，特别是涉及一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用。
背景技术
自然杀伤细胞，又称NK细胞，属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，主要分布于外周血，淋巴结和骨髓中，是一类可直接杀伤病毒和肿瘤的免疫细胞。NK细胞的主要检测表型为CD3阴性、CD56和CD16阳性。
自然杀伤细胞外泌体（exosomes，Exos）也称细胞外囊泡（extracellularvesicles，EV）,是源于细胞内，通过胞吐的作用分泌到细胞外，作用于靶细胞的一类含有核酸、蛋白质和小分子细胞毒蛋白、microRNAs的小囊泡，其直径100~130nm，可以介导细胞间的信息交流。自然杀伤细胞的外泌体从细胞释放出来后通过胞吞或者胞膜融合的方式作用于受体细胞，转移各种DNA、RNA、蛋白质和脂质等生物活性分子，发挥信息传递和杀伤作用。目前没有相关来源于NK细胞的外泌体在杀伤人类乳头瘤病毒（HPV）的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该自然杀伤细胞外泌体通过连续给药，可杀死HEK293细胞中90%以上HPV病毒。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
分离获取外周血的单个核细胞，对所述单个核细胞进行扩增培养，得到高纯度的自然杀伤细胞；
利用超滤浓缩法提取所述自然杀伤细胞中的外泌体，经过滤除菌，得到自然杀伤细胞外泌体。
优选的是，所述扩增培养包括以下步骤：
用NK细胞激活培养基重悬所述单个核细胞，进行孵育培养；培养至第3天，补加NK细胞扩增培养基，之后每隔一天，补加一次所述NK细胞扩增培养基，培养至第14天，获取所述高纯度的自然杀伤细胞；
其中，所述NK细胞激活培养基为以无血清NK细胞培养基为基础，添加IL-2、IL-15、CD16抗体、CD137抗体、CD335抗体、沙培林和血浆；
所述NK细胞扩增培养基为以无血清NK细胞培养基为基础，添加IL-2、IL-15和血浆。
优选的是，所述NK细胞激活培养基为以无血清NK细胞培养基为基础，添加2000IU/mL IL-2、100ng/mL IL-15、100ng/mL CD16抗体、70ng/mL CD137抗体、50ng/mL CD335抗体、0.02KE/mL沙培林和5%血浆；
所述NK细胞扩增培养基为以无血清NK细胞培养基为基础，添加2000IU/mL IL-2、100ng/mL IL-15。
优选的是，所述超滤浓缩法提取自然杀伤细胞中的外泌体包括以下步骤：
经扩增培养得到的自然杀伤细胞液，离心后，取自然杀伤细胞的上清液；
将所述上清液利用膜孔径为0.65μm的中空纤维柱进行过滤，得到过滤液；
将所述过滤液采用分子截留量为500KD的中空纤维柱进行超滤浓缩，再用生理盐水进行置换，无菌过滤，得到自然杀伤细胞外泌体。
优选的是，所述上清液利用膜孔径为0.65μm的中空纤维柱进行过滤的条件为：流速2000mL/min，压力6-8Psi。
优选的是，所述过滤液采用分子截留量为500KD的中空纤维柱进行超滤浓缩的条件为：500mL/min，压力6-8Psi。
本发明还提供利用所述的制备方法制得的外泌体在如下任一项中的应用：
（1）在制备治疗人乳头瘤病毒感染的疾病的药物中的应用；
（2）在制备杀伤人乳头瘤病毒的药物中的应用。
本发明还提供一种治疗人乳头瘤病毒感染的疾病的药物，包括所述的制备方法制得的外泌体。
本发明还提供一种杀伤人乳头瘤病毒的药物，包括所述的制备方法制得的外泌体。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从自然杀伤细胞中分离提取得到NK细胞外泌体，通过实验发现，将NK细胞外泌体和人乳头瘤病毒16型假病毒（HPV16PP）同时接种于HEK293细胞，发现可降低20%的HPV16PP感染效率，证明NK细胞外泌体起到抗HPV病毒转染的作用；将HPV16PP接种于HEK293细胞后检测阳性率，而后连续7天将NK细胞外泌体接入细胞中，发现杀死HEK293细胞中90%以上HPV病毒，几乎检测不到感染病毒的阳性细胞，证明NK细胞外泌体起到杀伤HPV病毒的效果。本发明制备的NK细胞外泌体可以用于治疗HPV病毒感染的疾病药物的制备中，对治疗HPV提供了新的药物原料和治疗方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为NK细胞培养图；
图2为NK细胞鉴定图；
图3为自然杀伤细胞外泌体电镜图；
图4为自然杀伤细胞外泌体NTA图；
图5为检测NK细胞外泌体杀伤HPV病毒的效果图；A：10μL HPV16PP加入量的HEK293细胞荧光照片；B：10μL HPV16PP同时加入500μL NK细胞外泌体的HEK293细胞荧光照片；C：连续7天加入500μL外泌体后的HEK293细胞荧光照片。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明通过对自然杀伤细胞的分选、培养及鉴定，对自然杀伤细胞进行培养、扩增；通过超滤浓缩法提取外泌体，而后过滤除菌，得到外泌体，通过透射电镜及纳米颗粒跟踪分析技术NTA鉴定外泌体形状及粒径大小；将NK细胞外泌体和人乳头瘤病毒16型假病毒（HPV16PP）同时接种于HEK293细胞，通过检测HEK293细胞实验组和对照组的阳性率，观察分析NK细胞外泌体的抗病毒转染作用，发现实验组的阳性率较对照组低20%，证明NK细胞外泌体起到抗HPV病毒转染的作用；将人乳头瘤病毒16型假病毒（HPV16PP）接种于HEK293细胞后检测阳性率，而后连续7天将NK细胞外泌体接入细胞中，而后检测实验组和对照组的阳性率，发现实验组几乎检测不到感染病毒的阳性细胞，证明NK细胞外泌体起到杀伤HPV病毒的效果。下面以具体的实施例对上述的技术方案和技术效果进一步说明。
以下实施例所用的无血清NK细胞培养基来自LONZA公司的X-VIVO15，货号BEBP02-054Q。
实施例1
1、NK细胞的分选、培养与鉴定
（1）分离获取外周血的单个核细胞，用NK细胞激活培养基重悬单个核细胞，进行孵育培养；培养至第3天，补加NK细胞扩增培养基，之后每隔一天，补加一次所述NK细胞扩增培养基，培养至第14天，获取高纯度NK细胞（见图1）。
上述NK细胞激活培养基为：以无血清NK细胞培养基为基础，添加2000IU/mL IL-2、100ng/mL IL-15、100ng/mL CD16抗体、70ng/mL CD137抗体、50ng/mL CD335抗体、0.02KE/mL沙培林和5%血浆。
上述NK细胞扩增培养基为：以无血清NK细胞培养基为基础，添加2000IU/mL IL-2、100ng/mL IL-15。
（2）以细胞计数仪对NK细胞进行活率和数量检测，数量达到120亿，活率为93%，上清液体积达到4L。
以流式细胞检测仪检测NK细胞表型CD3-、CD56+、CD16+，纯度均达到99%以上，见图2。
2、NK细胞外泌体的提取与鉴定
对上述得到的高纯度NK细胞悬液，使用湘仪低速离心机按照500g/min、10min的条件进行离心；离心后的上清液转移至洁净的无菌容器中，得到NK细胞上清；然后以瑞普利金的全自动超滤浓缩系统和膜孔径为0.65μm的中空纤维柱配合使用，在2000mL/min的流速，0.6-0.8Psi压力的条件下，对NK细胞上清进行过滤，将上清中的细胞碎片和较大杂质去除，得到澄清的过滤液；再使用瑞普利金的全自动超滤浓缩系统和500KD的中空纤维柱对上一步得到的澄清的过滤液进行超滤浓缩，流速500mL/min，压力6-8Psi，缩小液体体积并除去大于500KD的杂质，最后浓缩至200mL后，以生理盐水进行置换，共计3遍，最终使NK外泌体完全处于生理盐水中。尔后以赛多利斯0.2μm无菌滤膜对上一步的浓缩液进行过滤除菌，获得纯度较高的无菌的NK细胞外泌体，收集至冻存管内-80℃保存备用。
取NK细胞外泌体进行电镜扫描和NTA检测，结果如图3和图4所示，确认外泌体形态无误，其浓度在2×1011Particles/mL，储存于-80℃冰箱。
3、检测HPV16PP对HEK293细胞的感染后的HEK293细胞阳性率
3.1 单次加入NK细胞外泌体检测杀伤HPV病毒的效果
将本公司的HEK293细胞复苏、传代培养，而后按100万/孔将HEK293细胞接种于6孔板中，分对照组3组，分别加入10μL、3μL、1μL人乳头瘤病毒16型假病毒（HPV16PP），实验组3组，各组分别加入10μL、3μL、1μL HPV16PP和500μL上述分离的NK细胞外泌体，培养72小时后以荧光显微镜观察，计算其感染HEK293的阳性率，结果见表1。10μL HPV16PP加入量的HEK293细胞荧光照片见图5中A，加入10μL HPV16PP同时加入500μL NK细胞外泌体的HEK293细胞荧光照片见图5中B，相比未加入Nk细胞外泌体的HEK293细胞明显减少。
表1 NK细胞外泌体抗HPV16PP感染HEK293的实验结果
3.2检测连续加入NK细胞外泌体杀伤HPV病毒的效果
将本公司的HEK293细胞复苏、传代培养，而后按100万/孔将HEK293细胞接种于6孔板中，分为4组，分别加入10μL的HPV16PP，培养72小时后以荧光显微镜观察，计算其感染HEK293的阳性率，结果见表2。
表2 HPV16PP感染HEK293的实验结果
而后对上述表2中的第1、2组每天分别加入500μL的NK细胞外泌体，第3、4组分别加入500μL生理盐水，连续处理7天后，培养72小时后以荧光显微镜观察，计算其感染HEK293的阳性率，结果见表3。10μL HPV16PP病毒加入量的HEK293细胞荧光照片见图5中A，连续7天加入500μL NK细胞外泌体后的HEK293细胞荧光照片见图5中C，结果显示几乎没有荧光线，说明连续加入NK细胞外泌体可以显著杀伤HPV病毒。
表3 NK细胞外泌体杀伤HPV16PP实验结果
上述结果表明：在同时将NK细胞外泌体和人乳头瘤病毒16型假病毒（HPV16PP）加入HEK293细胞中时，HPV16PP病毒的感染效率小幅度下降，证明单次加入NK细胞外泌体具有抗病毒感染效果。
将10μL的人乳头瘤病毒16型假病毒（HPV16PP）加入HEK293细胞中72小时后，细胞阳性率达到90%左右，而后连续7天加入500μL NK细胞外泌体，细胞阳性率几乎降为零，证明连续加入NK细胞外泌体具有极好的杀伤HPV病毒的效果。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种提高杀伤HPV病毒效果的自然杀伤细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分离获取外周血的单个核细胞，对所述单个核细胞进行扩增培养，得到高纯度的自然杀伤细胞；
利用超滤浓缩法提取所述自然杀伤细胞中的外泌体，经过滤除菌，得到自然杀伤细胞外泌体；
所述扩增培养包括以下步骤：
用NK细胞激活培养基重悬所述单个核细胞，进行孵育培养；培养至第3天，补加NK细胞扩增培养基，之后每隔一天，补加一次所述NK细胞扩增培养基，培养至第14天，获取所述高纯度的自然杀伤细胞；
其中，所述NK细胞激活培养基为以无血清NK细胞培养基为基础，添加2000IU/mL IL-2、100ng/mL IL-15、100ng/mL CD16抗体、70ng/mL CD137抗体、50ng/mL CD335抗体、0.02KE/mL沙培林和5%血浆；
所述NK细胞扩增培养基为以无血清NK细胞培养基为基础，添加2000IU/mL IL-2、100ng/mL IL-15；
所述超滤浓缩法提取自然杀伤细胞中的外泌体包括以下步骤：
经扩增培养得到的自然杀伤细胞液，离心后，取自然杀伤细胞的上清液；
将所述上清液利用膜孔径为0.65μm的中空纤维柱进行过滤，得到过滤液；
将所述过滤液采用分子截留量为500KD的中空纤维柱进行超滤浓缩，再用生理盐水进行置换，无菌过滤，得到自然杀伤细胞外泌体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述上清液利用膜孔径为0.65μm的中空纤维柱进行过滤的条件为：流速2000mL/min，压力6-8Psi。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述过滤液采用分子截留量为500KD的中空纤维柱进行超滤浓缩的条件为：流速500mL/min，压力6-8Psi。
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