ES2611772T3 - Uso de un dispositivo de filtración de flujo tangencial y métodos para el enriquecimiento de leucocitos - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo de filtración de flujo tangencial para preparar una población de células enriquecida en leucocitos, eliminando de forma selectiva componentes sanguíneos como el plasma, las plaquetas y eritrocitos, que se compone de: una unidad colectora (1) que dispone de una cámara de flujo cruzado cilíndrica (3) y una cámara de filtrado (4) separada por un filtro circular (5) dispuesto entre ellas, donde el filtro (5) comunica el fluido con la cámara de flujo cruzado (3) y la cámara de filtrado (4); el diámetro del filtro es sustancialmente igual al diámetro de la cámara de flujo cruzado; la cámara de flujo cruzado cilíndrica (3) tiene una entrada (6) y una salida (7), donde la entrada (6) se encuentra adyacente a la superficie de retenido del filtro para introducir una muestra de componentes sanguíneos que contiene leucocitos en la cámara de flujo cruzado (3) y en paralelo a la superficie de retenido del filtro (5); y la salida (7) se encuentra adyacente al centro del filtro (5) y perpendicular a la superficie de retenido del filtro (5); una bomba (14) para bombear el fluido hasta la cámara de flujo cruzado (3) a través de la entrada (6) y configurada para introducir el fluido en la cámara de flujo cruzado cilíndrica a una velocidad entrada de entre 5 y 100 veces la velocidad de filtración; donde esta disposición hace que el flujo de fluido entre en espiral hacia el centro del filtro generando un remolino en el fluido y el filtro (5), que tiene un tamaño de poro medio de entre 3 y 8 micrones, de forma que el flujo de la muestra que pasa a través del filtro (5) enriquece la muestra de componentes sanguíneos en leucocitos.
Description
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DESCRIPCION
Uso de un dispositivo de filtracion de flujo tangencial y metodos para el enriquecimiento de leucocitos Antecedentes de la invencion
A menudo las poblaciones de celulas sangumeas enriquecidas en leucocitos resultan recomendables para su uso en la investigacion o terapia. Entre las fuentes tipicas de leucocitos se incluyen la sangre periferica completa, el producto de la leucoferesis o aferesis, u otras fuentes menos comunes, tales como la sangre del cordon umbilical. El enriquecimiento de leucocitos se puede realizar de varias maneras. Entre los metodos tfpicos se incluyen los gradientes de densidad (por ejemplo, FICOLL-HYPAQUE®, sflice coloidal y similares), elutriacion, centrifugacion, lisis de eritrocitos mediante choque hipotonico y diversas combinaciones de estos metodos. Cada uno de estos metodos ofrece desventajas, siendo una de ellas la necesidad de unos laboriosos pasos de lavado tras la etapa de enriquecimiento.
Tras el enriquecimiento, las celulas se lavan tfpicamente mediante un proceso repetitivo. Por lo general, los pasos implican la colocacion de la suspension de celulas enriquecidas en un tubo centnfugo y provocar un proceso de granulacion de las celulas en el fondo del tubo utilizando una centrifugadora. El tubo se retira de la centrifugadora y el sobrenadante se decanta separandolo de los granulos de celulas. Se anade un lfquido de lavado al tubo y los granulos de celulas son resuspendidos. Tfpicamente estos pasos se repiten entre 2 y 4 veces.
Una desventaja de este proceso de lavado es que la resuspension secuencial y la centrifugacion pueden mermar la viabilidad de las celulas y potenciar su lisis. Otra desventaja del lavado mediante centrifugacion es la oportunidad de que las bacterias u otros agentes infecciosos contaminen las celulas. Aun cuando todos los materiales se mantengan en condiciones esteriles, la apertura repetida de los tubos centnfugos y la exposicion al aire de las pipetas y las botellas de la solucion de lavado puede provocar contaminacion. El riesgo de contaminacion es lo suficientemente importante como para que algunos organismos reguladores medicos exijan que solamente se utilicen sistemas "cerrados" para la manipulacion de las celulas.
Tambien se han utilizado metodos de filtracion para retirar los leucocitos de la sangre, conservando al mismo tiempo otros componentes sangumeos para su posterior uso. Por lo general, estos metodos atrapan los leucocitos sobre un filtro de forma no recuperable, al tiempo que se permite que otros componentes pasen a traves del filtro, recogiendose en un recipiente. Por ejemplo, existen filtros para retirar los leucocitos de la sangre, a fin de minimizar la incidencia de las reacciones aloinmunes tras una transfusion de sangre. Tfpicamente esto se consigue utilizando filtros fabricados en malla de fibra de plastico mateado. Por lo general, la malla mantiene una disposicion apropiada para atrapar los leucocitos en una matriz reticulada con una profundidad suficiente para que las celulas queden atrapadas por toda la profundidad del filtro, evitando de este modo que el filtro se obstruya, tal y como ocurrina si los leucocitos fuesen atrapados sobre una superficie plana.
WO98/13131 divulga un metodo para separar los eritrocitos de los leucocitos en sangre completa, utilizando un metodo y un aparato que emplea un filtro con un tamano de poro preciso, donde el aparato incluye un metodo para evitar la contaminacion u obstruccion de la superficie del material de filtrado. Uno de los metodos para evitar la contaminacion u obstruccion de la superficie de la membrana incluye hacer pasar una suspension de celulas (por ejemplo, en paralelo) por la superficie de la membrana del filtro u oscilar la membrana y la suspension entre sf.
El documento WO98/13131 divulga un metodo para separar los eritrocitos en sangre completa de los leucocitos, utilizando un dispositivo TFF.
Ademas de atrapar ffsicamente las celulas, los materiales y la gran superficie del filtro permiten que los leucocitos se adhieran de forma irreversible a la superficie. Muchas de estas celulas adherentes son precisamente las que se buscan para algunos procedimientos medicos. La combinacion resultante de atrapamiento y adherencia al filtro crea un metodo altamente eficaz para retirar los leucocitos a desechar antes de la terapia de infusion de sangre. Sin embargo, cuando los leucocitos son las celulas buscadas, este metodo de filtracion no resulta ventajoso.
Un metodo que ha resultado util para el fraccionamiento de diversas partmulas es la filtracion de flujo tangencial (TFF) o filtracion de "flujo cruzado". La TFF se basa en el movimiento de un fluido paralelo a la superficie de un filtro de membrana porosa. Los poros de la membrana permiten el paso del fluido y de las partmulas que se encuentran en el fluido y que son mas pequenas que los poros. Por otra parte, el flujo cruzado (o flujo "tangencial") de fluido paralelo al filtro evita la acumulacion de partmulas mayores que los poros sobre la superficie del filtro.
La TFF se ha utilizado para la separacion en bruto de diversos materiales. El uso de la filtracion de flujo tangencial en el campo farmaceutico ha sido revisado por Genovesi (J. Parenter. Aci. Technol., 37:81, 1983), incluyendo la filtracion de agua esteril para la inyeccion, clarificacion de un sistema de solvente y filtracion de enzimas de caldos y cultivos bacterianos. Marinaccio et al. (WO 85/03011) documenta un proceso para su uso en la extraccion de la sangre de componentes sangumeos particulados para la plasmaferesis, y Robinson et al. (Patente estadounidense 5.423.738 ) describe el uso de la TFF para
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extraer el plasma de la sangre, permitiendo la reinfusion de celulas sangumeas y plaquetas en los pacientes.
En otro uso, se ha documentado la TFF para la filtracion de cerveza (EP 0 208 450), concretamente para extraer partmulas como las celulas de levadura y otros solidos suspendidos. Kothe et al. (Patente estadounidense 4.644.056) divulga el uso de la TFF en la purificacion de inmunoglobulinas de la leche o el calostro, y Castino (Patente USA 4.420.398) describe su uso en la separacion de sustancias antivirales, tales como interferones, de los caldos que contienen estas sustancias, asf como celulas y partmulas virales. De forma similar, la TFF se ha utilizado en la separacion de enzimas bacterianas de los restos de celulas. (Quirk et al., Enzyme Microb. Technol, 6:201,1984) Por otra parte, las unidades de filtracion de flujo tangencial se han empleado en la concentracion de celulas suspendidas en medios de cultivo (vease, por ejemplo, Radlett, J. Appl. Chem. Biotechnol., 22:495, 1972).
Recientemente, tambien se ha documentado el uso de la TFF para separar liposomas y partmulas de lfpidos en funcion de su tamano. (Lenk et al., Patente USA 5.948.441.) La TFF permite la formacion y el aislamiento de liposomas y partmulas de lfpidos con un rango de tamano definido de poblaciones heterogeneas de tales partmulas. (Vease Lenk et al., supra).
Sin embargo, a pesar de que la TFF se ha utilizado para el fraccionamiento en bruto de lfquidos biologicos y la separacion, por ejemplo, de liposomas, el uso de la TFF para la separacion de diferentes poblaciones de celulas vivas que presentan unas caractensticas definidas no se ha apreciado en la tecnica. En particular, no se han abordado los problemas unicos asociados con la separacion selectiva de poblaciones de leucocitos (tales como monocitos, celulas precursoras y celulas madre hematopoyeticas CD34+ o similares) de otras celulas sangumeas, manteniendo la esterilidad, la viabilidad de las celulas, el potencial hematopoyetico para diferenciarse y la actividad celular inmunoterapeutica. Por otra parte, los enfoques actuales no han resuelto la extraccion de otras poblaciones de celulas, como poblaciones con rangos de tamano que se solapan.
Por tanto, sigue existiendo una necesidad en la tecnica de dispositivos y metodos adicionales para el enriquecimiento selectivo de leucocitos respecto de otros componentes de la sangre, incluyendo plasma, eritrocitos y/o plaquetas, preservando al mismo tiempo la esterilidad, la viabilidad de las celulas, el potencial para diferenciarse y la actividad celular inmunoterapeutica. La presente invencion satisface estas y otras necesidades.
Breve resumen de la invencion
La presente invencion se refiere a la separacion de leucocitos de la sangre y preparados sangumeos conforme a las reivindicaciones. En particular, se prepara una poblacion de celulas enriquecida en leucocitos mediante el uso de un dispositivo de filtracion de flujo tangencial, conforme a las reivindicaciones. Se proporcionan como parte de la divulgacion metodos para el uso del dispositivo en la preparacion de poblaciones enriquecidas en leucocitos y poblaciones de celulas enriquecidas en monocitos, celulas precursoras y celulas madre CD34+ hematopoyeticas y similares. Las poblaciones de celulas enriquecidas en leucocitos y/o monocitos y similares obtenidas mediante el uso de los dispositivos y metodos de la presente divulgacion se pueden utilizar para preparar composiciones de celulas presentadoras de antfgenos, como celulas dendnticas presentadoras de antfgenos, para la administracion a un individuo con miras a inducir una respuesta inmune, preparar composiciones de celulas madre pluripotentes, tales como macrofagos f (f-M$), para la induccion de la formacion de celulas epiteliales, neuronales, endoteliales o hepatocitos, preparar composiciones que comprenden poblaciones enriquecidas de celulas precursoras o celulas madre hematopoyeticas y similares.
El dispositivo de filtracion de flujo tangencial de la presente invencion comprende una unidad colectora que posee una camara de flujo cruzado cilmdrica y una camara de filtrado separada por un filtro. El diametro del filtro es sustancialmente igual al diametro de la camara de flujo cruzado. El filtro comunica el fluido de un lado, la superficie de retenido, con la camara de flujo cruzado y del otro lado, la superficie de filtrado, con la camara de filtrado. La camara de flujo cruzado dispone de una entrada y una salida, y la entrada se encuentra adyacente a la superficie de filtrado del filtro para introducir una muestra de componentes sangumeos que contiene leucocitos en la camara de flujo cruzado en paralelo a la superficie de retenido del filtro. La salida se encuentra adyacente al centro del filtro y perpendicular a la superficie de retenido del filtro. El dispositivo comprende asimismo una bomba para bombear el fluido hacia la camara de flujo cruzado a traves de la entrada y esta configurado para introducir el fluido en la camara de flujo cruzado cilmdrica a un mdice de entrada de unas 5-100 veces el mdice de filtracion; y esta disposicion hace que el flujo de fluido se introduzca en espiral hacia el centro del filtro, generando un remolino en el fluido, y el filtro tiene un tamano de poro medio que oscila entre 3 y 8 micrones, de forma que el flujo de la muestra que pasa por el filtro enriquece la muestra de componentes de la sangre con leucocitos. En determinadas realizaciones, el filtro tiene un tamano medio del poro de entre unos 3 y 7 micrones, o entre unos 3 y 5,5 micrones.
El dispositivo para el uso reivindicado comprende un medio para obtener un mdice de entrada predeterminado de la muestra en la entrada de la camara de flujo cruzado, asf como un medio para controlar el mdice de filtracion del filtrado a traves del filtro y en la camara de filtrado. El medio de control del mdice de filtracion limita la filtracion hasta un nivel inferior al mdice de filtracion sin resistencia del filtro.
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La muestra que contiene componentes sangumeos puede ser proporcionada mediante un dispositivo de origen, como un dispositivo de leucoferesis o un recipiente que contiene una muestra recogida, por ejemplo, de un dispositivo de leucoferesis y similares.
El dispositivo de filtracion de flujo tangencial para el uso reivindicado tambien puede comprender una unidad de recuperacion. La unidad de recuperacion contiene una entrada y se puede interconectar una salida en forma de bucle con la camara de flujo cruzado de la unidad colectora. En esta realizacion del dispositivo, la entrada de la camara de flujo cruzado comunica el fluido con la salida de la unidad de recuperacion, y la salida de la camara de flujo cruzado comunica el fluido con la entrada de la unidad de recuperacion. La unidad de recuperacion puede comprender tambien una entrada de la muestra y una entrada de lavado. En determinadas realizaciones del dispositivo de filtracion de flujo tangencial, la entrada de la muestra y la entrada de lavado son una unica entrada compartida. Tfpicamente, la entrada de lavado comunica el fluido con una fuente de fluido de lavado o reemplazo. El fluido de lavado o reemplazo puede ser, por ejemplo, una solucion tampon isotonica o medios de cultivo de tejidos.
La entrada de la muestra de la unidad de recuperacion comunica el fluido con una fuente de componentes sangumeos. En una realizacion de la presente invencion la fuente de componentes sangumeos es un dispositivo de procesamiento celular. El dispositivo de procesamiento celular puede ser un dispositivo de leucoferesis o un dispositivo capaz de producir una poblacion de celulas parcialmente enriquecida en leucocitos. En un ejemplo, el dispositivo de procesamiento celular comprende un recipiente que dispone de un primer puerto y un segundo puerto, un substrato que se adhiere a los precursores de celulas dendnticas monocfticas que comunica el fluido con el primer puerto y el segundo puerto, un tamiz para retener el sustrato en el recipiente y con un tamano de poro suficiente como para permitir el paso de las celulas dendnticas y precursores de celulas dendnticas monocfticas. El dispositivo comprende tambien una lmea de drenaje que comunica el fluido con el primer o el segundo puerto y una lmea colectora que comunica el fluido con el primer o el segundo puerto y que tambien comunica el fluido con la entrada de la muestra de la unidad de recuperacion del dispositivo de filtracion de flujo tangencial.
El dispositivo de procesamiento celular puede comprender tambien una pluralidad de fuentes de fluido para proporcionar medios aglutinantes, solucion tampon de lavado y solucion tampon de elucion. El dispositivo puede comprender tambien una bomba para transferir los diversos fluidos dentro y fuera del dispositivo de procesamiento celular. Tambien se puede disponer un medio de control de la temperatura, como un dispositivo calentador o refrigerador. En una realizacion de la presente invencion que dispone de un sistema cerrado, se proporciona una muestra de sangre o una preparacion de un producto sangumeo al dispositivo de procesamiento celular que contiene un material granulado capaz de adherirse a los precursores de celulas dendnticas monocfticas. Se permite que la muestra de sangre entre en contacto con el material granulado durante un tiempo suficiente como para adherirse a los precursores de celulas dendnticas monocfticas y se retiran mediante lavado los demas componentes del dispositivo a traves de la lmea de drenaje. Se anade la solucion tampon de elucion al dispositivo de procesamiento celular y los precursores de celulas dendnticas monocfticas pasan en condiciones asepticas a traves de la lmea colectora hasta la entrada de la muestra de la unidad de recuperacion, para el posterior enriquecimiento en monocitos de la muestra de sangre.
En una realizacion de la presente divulgacion tambien proporciona metodos para separar los leucocitos de una muestra de componentes sangumeos que contiene leucocitos conforme a la reivindicacion 1. La muestra se puede someter a purificacion parcial o a enriquecimiento por leucoferesis, centrifugacion por densidad, lisis diferencial, filtracion o preparacion de una capa leucocitaria para su introduccion en la unidad colectora. Se induce un movimiento de remolino en la muestra dentro de la camara de flujo cruzado. Adicionalmente, la poblacion de celulas enriquecida en leucocitos se puede lavar con una solucion de lavado.
En los metodos de la presente divulgacion, los componentes sangumeos no leucocitarios retirados de la muestra incluyen plasma y plaquetas, eritrocitos y similares. Los leucocitos del producto de los metodos de la divulgacion pueden comprender una poblacion sustancialmente enriquecida en monocitos. La poblacion de celulas enriquecida puede contener aproximadamente al menos un 20% de leucocitos, aunque tipicamente comprende aproximadamente al menos un 60% de leucocitos o mas. En una realizacion del metodo de la presente divulgacion, los pasos 1), 2) y 3) se repiten al menos dos veces para formar una poblacion de celulas enriquecida en leucocitos conforme a la reivindicacion 4. La poblacion de celulas enriquecida en leucocitos se puede utilizar tambien para la preparacion de precursores de celulas dendnticas monocfticas. En una realizacion, la poblacion de celulas enriquecidas se produce a traves de un metodo que consiste en poner en contacto un sustrato que se adhiere a los precursores de celulas dendnticas monocfticas con la poblacion de celulas enriquecidas en leucocitos, permitiendo que los precursores de celulas dendnticas monocfticas de la poblacion de celulas se adhieran de forma reversible al sustrato para formar complejos compuestos por precursores de celulas dendnticas monocfticas y sustrato; separar los complejos de los leucocitos que no se adhieren para obtener complejos que comprenden precursores de celulas dendnticas monocfticas; y cultivar los precursores de celulas dendnticas monocfticas para que se diferencien en celulas dendnticas inmaduras o maduras. En una realizacion concreta, los precursores de celulas dendnticas monocfticas se eluyen del sustrato antes del cultivo. El sustrato al que se adhieren los precursores de celulas dendnticas monocfticas puede
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comprender vidrio, poliestireno, plastico o microgranulos de poliestireno recubiertos de vidrio.
En otra realizacion de la presente divulgacion, se proporciona un metodo para enriquecer una muestra de componentes sangumeos en leucocitos, conforme a la reivindicacion 4. El metodo puede proporcionar una poblacion de celulas enriquecida sustancialmente libre de componentes sangumeos no leucocitarios, incluyendo plasma, plaquetas y eritrocitos. La poblacion de celulas enriquecida producida a traves de este metodo puede comprender aproximadamente al menos un 20% de leucocitos y ftpicamente al menos un 60% de leucocitos o mas. El metodo puede consistir tambien en tomar sangre de un sujeto y preparar la muestra de la sangre mediante leucoferesis, centrifugacion por densidad, lisis diferencial, filtracion o preparacion de una capa leucocitaria.
Una vez que la poblacion de celulas ha sido enriquecida en leucocitos, el metodo puede consistir tambien en preparar un tipo de celula concreto que se pueda inducir a partir de los leucocitos, tales como precursores de celulas dendnticas, celulas madre hematopoyeticas CD34+, celulas madre pluripotentes, tales como macrofagos f, y similares. En una realizacion concreta, las celulas dendnticas se pueden preparar a partir de la poblacion de celulas enriquecida. En este metodo, las celulas dendnticas se preparan como sigue: poniendo en contacto un sustrato que se adhiere a los precursores de celulas dendnticas monocfticas con una poblacion de celulas enriquecida; permitiendo que los precursores de celulas dendnticas monocfticas de la poblacion de celulas enriquecida se adhieran de forma reversible al sustrato para formar complejos que comprenden precursores de celulas dendnticas monocfticas y sustrato; separando los complejos de los leucocitos que no se adhieren para obtener complejos que contienen precursores de celulas dendnticas monocfticas; y cultivando los precursores de celulas dendnticas monocfticas para que los precursores se diferencien en celulas dendnticas inmaduras o maduras. El sustrato puede contener vidrio, poliestireno, plastico o microgranulos de poliestireno recubiertos de vidrio. Por otra parte, los precursores de celulas dendnticas monocfticas se pueden cultivar con citoquinas que promuevan la diferenciacion de los monocitos en celulas dendnticas. En una realizacion concreta, las citoquinas son GM-CSF e IL-4. Por otra parte, las celulas dendnticas pueden evolucionar a celulas dendnticas maduras.
Una vez que se han aislado los precursores de las celulas dendnticas, estas se pueden cultivar con un anftgeno en condiciones conducentes al procesamiento del anftgeno para formar celulas dendnticas cargadas de anftgeno. A continuacion, las celulas dendnticas cargadas de anftgeno se pueden administrar a un individuo o bien cultivarse in vivo o ex vivo con celulas T, a fin de inducir la formacion de celulas T citotoxicas espedficas de antfgeno. Las celulas T citotoxicas se pueden administrar a un individuo que precise una respuesta inmune espedfica de anftgeno inducida, como en el tratamiento del cancer y de una infeccion bacteriana o viral.
Se puede producir una poblacion de celulas enriquecida en celulas madre hematopoyeticas. En una realizacion de la divulgacion, al individuo se le puede proporcionar un agente movilizador de las celulas madre, como, por ejemplo, G-CSF, GM-CSF, AMD3100 (u otros agentes que inhiben la funcion de CXCR- 4), con una dosis alta o baja de ciclofosfamida y similares. El agente movilizador de las celulas madre induce la proliferacion de celulas madre CD34+ liberadas en el torrente sangumeo periferico. Una muestra de leucoferesis del individuo se introduce en una unidad de filtracion de flujo tangencial (TFF), donde la unidad TFF comprende una camara de flujo cruzado, una camara de filtrado y un filtro que comunica la camara de flujo cruzado con la camara de filtrado, donde el filtro tiene un tamano de poro de aproximadamente entre 3 y 5,5 micrones; (2) se hace recircular la muestra a traves de la unidad TFF a un mdice de entrada predeterminado y a un mdice de filtracion predeterminado, siendo el mdice de entrada predeterminado al menos cinco veces mayor que el mdice de filtracion predeterminado; donde el mdice de filtracion predeterminado es inferior al mdice de filtracion sin resistencia del filtro; y (3) se afsla una poblacion de celulas enriquecida en leucocitos CD34+. El metodo puede proporcionar una poblacion de celulas enriquecida que esta sustancialmente libre de componentes sangumeos no leucocitarios, incluyendo plasma, plaquetas y eritrocitos. La poblacion de celulas enriquecida por este metodo puede aumentar el porcentaje de celulas CD34+ entre 2 y 5 veces, aproximadamente un 1% - 5% del material de la leucoferesis y un 10% - 40% de las celulas en una poblacion de celulas enriquecida.
Por otra parte, los monocitos aislados tal como se ha descrito anteriormente se pueden cultivar en un medio que contiene M-CSF en un recipiente de cultivo de celulas no adhesivo, como una bolsa de cultivo de Teflon. El cultivo de los monocitos en M-CSF permite producir un importante numero de celulas CD34+. Las poblaciones de celulas enriquecidas en leucocitos o monocitos anteriormente descritas tambien se pueden cultivar en presencia de varias otras citoquinas y leucoquinas conocidas en la tecnica para inducir la produccion de varios otros tipos de celulas progenitoras. Por ejemplo, la poblacion de celulas enriquecida en leucocitos y/o monocitos se puede cultivar en presencia de VEGF, bFGF, IGF-1, EGF y suero fetal en una superficie recubierta de fibronectina y desechando las celulas no adherentes de las celulas angiogenicas circulantes similares a las endoteliales obtenidas, o los f-M$ se pueden diferenciar en celulas epiteliales mediante cultivo en EGF, diferenciarse en celulas neuronales y endoteliales mediante incubacion en NGF o VEGF, respectivamente, o diferenciarse en hepatocitos mediante incubacion en presencia de HGF y similares.
Breve descripcion de los dibujos
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Las Figuras 1A a 1C ilustran realizaciones del dispositivo de filtracion de flujo tangencial para la separacion de leucocitos y tambien de monocitos de una muestra de productos sangumeos. La Figura 1A proporciona una realizacion del dispositivo para el enriquecimiento de leucocitos donde la camara de flujo cruzado se encuentra por encima de la camara de filtracion. La Figura 1B ilustra una vista frontal del dispositivo, donde la entrada de la muestra se encuentra por debajo del filtro y el filtrado pasa hacia arriba a traves del filtro para el enriquecimiento de monocitos. La Figura 1C es una vista superior del dispositivo ilustrado en la Figura 1B.
La Figura 2 ilustra un ejemplo de filtracion de flujo tangencial (TFF) realizada con muestras de productos de la leucoferesis en diversas condiciones. Las muestras de 10 ml de producto de la leucoferesis, diluidas en una proporcion de 1:5 en una solucion tampon de PBS + heparina + DNasa I se sometieron a TFF utilizando un filtro de 3 micrones con un mdice de filtracion de 15 ml/min. Se muestra el porcentaje de leucocitos (WBC) en el material retenido (denominado "retenido", barras rayadas) y en el material filtrado (denominado "filtrado", barras negras) tras la TFF. Los indices de recirculacion (entrada) para Max., 10, 9, 8, 7, y 6 correspondieron a 1680, 1380, 1080, 870, y 540 ml/min, respectivamente.
La Figura 3 ilustra los resultados de un estudio de TFF realizado con el producto de la leucoferesis en un dispositivo TFF utilizando un filtro de 3 micrones, con un mdice de recirculacion (entrada) de 1080 ml/min., a tres indices de filtracion diferentes (11, 15, y 19,6 ml/min). Se muestra el porcentaje de leucocitos (denominados "WBC") en el retenido (barras rayadas) y en el filtrado (denominado "filtrado", barras negras).
La Figura 4 ilustra resultados adicionales de la TFF realizada con muestras del producto de la leucoferesis para el estudio que se describe en la Figura 1. Las muestras de 10 ml del producto de la leucoferesis, diluidas a una proporcion de 1:5, se sometieron a TFF utilizando un filtro de 3 micrones, con un mdice de filtracion de 15 ml/min. Se muestra el porcentaje de eritrocitos (denominados "RBC) en el retenido (recuadros rayados) y el filtrado (recuadros negros) tras la TFF. Los indices de recirculacion (entrada) para Max., 10, 9, 8, 7, y 6 correspondieron a 1680, 1380, 1080, 870, y 540 ml/min, respectivamente.
La Figura 5 ilustra resultados adicionales de la TFF realizada con muestras del producto de la leucoferesis para el estudio descrito en la Figura 2. Las muestras de 10 ml del producto de la leucoferesis, diluidas a una proporcion de 1:5, se sometieron a TFF utilizando un filtro de 3 micrones, con un mdice de recirculacion (entrada) de 1080 ml/min, a tres indices de filtracion diferentes (11, 15, y 19,6 ml/min). Se muestra porcentaje de eritrocitos (denominados "RBC") del retenido (barras rayadas) y del filtrado (denominado "filtrado", barras negras).
La Figura 6 ilustra un ejemplo de los efectos del incremento de la concentracion de material de la leucoferesis en la muestra. Se sometieron a TFF 50 ml de material de la leucoferesis, diluidos a una proporcion de 1:5 en PBS + heparina + DNasa I, utilizando un dispositivo con un tamano de poro del filtro de 3 micrones. Se muestra el porcentaje de eritrocitos (denominados "RBC") y leucocitos (denominados "WBC") en el retenido ("denominado "retenido") como una funcion del mdice de filtracion.
La Figura 7 ilustra un ejemplo de la separacion del producto de la leucoferesis entre filtros de 3 micrones y 5 micrones tras incrementar el producto de la leucoferesis (120 ml en 1/2 de una unidad entera). El mdice de recirculacion (entrada) fue de 1680 ml/min y el mdice de filtracion fue de 15 ml/min. En el caso de la TFF realizada con un filtro de 5 micrones, aproximadamente el 80% de los eritrocitos (denominados "RBC, barras negras) se extrajo del retenido, mientras que se retuvo aproximadamente el 62% de los leucocitos introducidos (denominados "WBC", barras rayadas claras) o mas de aproximadamente el 70% de los monocitos introducidos. Por el contrario, utilizando el filtro de 3 micrones, se retuvo aproximadamente el 65% de los leucocitos en el retenido, pero solamente se extrajo el 3% de los eritrocitos.
La Figura 8 ilustra una comparacion de la separacion del producto de la leucoferesis a traves de filtros de aproximadamente 4,5 y 8 micrones, tras aumentar la cantidad del producto de la leucoferesis proporcionado como muestra. El mdice de recirculacion (entrada) fue de 1680 ml/min y el mdice de filtracion fue de 15 ml/min. En el caso de la TFF realizada utilizando un filtro de 4,5 micrones, se extrajo aproximadamente el 99% de los eritrocitos (denominados "RBC", barras negras) del retenido, mientras que se retuvo aproximadamente el 90% de los leucocitos introducidos (denominados "WBC", barras rayadas laras). Por el contrario, con el filtro de 8 micrones, se extrajo aproximadamente el 98% de los eritrocitos introducidos, pero solamente se retuvo el 4% de los leucocitos.
La Figura 9 ilustra un ejemplo de la separacion con filtros de 4,5 micrones, tras incrementar el producto de la leucoferesis procesado (250 ml o una unidad completa). El mdice de recirculacion (entrada) fue de 1680 ml/min y el mdice de filtracion fue de 15 m/min. En el caso de la TFF realizada con filtros de 4,5 micrones durante 90 minutos con tres productos de la leucoferesis distintos, entre el 80 y el 95% de los eritrocitos se extrajeron del retenido, mientras que se retuvo aproximadamente entre el 80 y el 100% de los monocitos introducidos. Tras la TFF de una muestra de leucoferesis, el retenido tambien se sometio a ensayo y se averiguo que solamente contema aproximadamente el 2% de las plaquetas introducidas y el 3% del plasma introducido (denominado Exp 7 en la Tabla 1).
Descripcion de las realizaciones especificas
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La presente invencion establece el uso de dispositivos para el procesamiento de una mezcla heterogenea de componentes de la sangre para obtener una poblacion de leucocitos enriquecida. En un aspecto de la invencion, se establece el uso de dispositivos para el enriquecimiento de leucocitos a traves de la eliminacion selectiva de componentes sangumeos no leucocitarios, tales como plasma, plaquetas y/o eritrocitos y similares. En otro aspecto, se establece el uso de dispositivos para el enriquecimiento de monocitos mediante la eliminacion selectiva de los componentes sangumeos no monodticos, incluyendo, por ejemplo, la eliminacion de linfocitos, eritrocitos, plaquetas y similares de la muestra.
Una poblacion de leucocitos enriquecida se prepara tfpicamente a partir de una muestra o una mezcla fluida que contiene componentes sangumeos. Para los fines del presente, por "componentes sangumeos" se entendera cualquier material tfpicamente presente en la sangre, incluyendo el material tfpicamente presente tanto en estado sano como de enfermedad. Entre los componentes sangumeos se incluyen leucocitos y se pueden incluir, por ejemplo, linfocitos, monocitos, eritrocitos, neutrofilos, eosinofilos, celulas asesinas naturales (NK) y/o plaquetas, protemas solubles o insolubles o complejos de protemas (por ejemplo, enzimas, inmunoglobulinas o complejos de inmunoglobulina-antigeno), otros componentes macromoleculares, tales como lfpidos, o cualquier otra parte de la sangre completa que se pueda separar ffsicamente, con independencia de su composicion celular o molecular precisa, incluyendo, por ejemplo, plasma o suero.
La muestra o la mezcla fluida se puede enriquecer parcialmente con leucocitos antes de aplicar los metodos de la presente invencion. El termino "leucocito" se utiliza de forma intercambiable con el termino "globulo blanco" ("WBC", por sus siglas en ingles). Estos terminos incluyen agranulocitos mononucleares, entre los que se incluyen, por ejemplo, monocitos, precursores de celulas dendnticas y linfocitos, asf como granulocitos polimorfonucleares con nucleo segmentado y granulos citoplasmicos, incluyendo neutrofilos, eosinofilos, basofilos y mastocitos. "Monocito" se refiere a un tipo de leucocitos procedentes de las celulas mieloides, por lo general de mayor tamano que los linfocitos, con un nucleo ovoide o en forma de rinon, que contiene tfpicamente granulos lisosomales y que expresa tfpicamente CD14.
En determinados aspectos de la presente invencion, los linfocitos son separados de los leucocitos. "Linfocitos" se refiere a las celulas procedentes de las celulas progenitoras linfoides e incluye linfocitos B, linfocitos T y celulas asesinas naturales (NK). El termino "linfocitos pequenos" se refiere a los linfocitos que tienen aproximadamente 7-8 micrones de diametro.
Para los fines del presente, el termino "poblacion de leucocitos" se refiere a cualquier grupo de celulas que incluye leucocitos. Una poblacion de leucocitos puede incluir una gran variedad de subtipos de leucocitos o subtipos particulares, como monocitos y/o celulas precursoras dendnticas monodticas. Los terminos "enriquecimiento", "enriquecer" y "enriquecido" significan que el procesamiento de una muestra de productos sangumeos, empleando los dispositivos de la presente invencion, obtiene una poblacion de celulas que tiene un mayor porcentaje de leucocitos viables, en relacion con otros componentes, que la mezcla inicial (es decir, antes del enriquecimiento). Para los fines del presente, el termino "viable" se refiere a un leucocito que es capaz de diferenciacion en condiciones de cultivo adecuadas.
Los dispositivos empleados conforme a la presente invencion utilizan la filtracion de flujo tangencial para enriquecer una poblacion de leucocitos. Los terminos "filtracion de flujo tangencial" y "filtracion cruzada" se utilizan de forma intercambiable y se refieren a la separacion de partfculas suspendidas (por ejemplo, celulas) de una mezcla fluida, incluyendo la separacion de partroulas de una caractenstica definida (por ejemplo, un rango de tamano deseado) de una mezcla heterogenea de partroulas de la mezcla fluida. Las partroulas se separan derivando o haciendo circular la mezcla fluida (por ejemplo, un fluido de muestra) por una camara de muestra sustancialmente paralela o tangencial a un filtro (por ejemplo, la superficie del filtro que mira hacia el fluido de muestra), rtpicamente bajo cierta presion positiva, donde la mezcla fluida comprende las partroulas concentradas, o leucocitos, que mantienen un flujo tangencial a la superficie de la membrana.
Por lo general, la determinacion de las partroulas que se eliminan en el "filtrado", es decir, la proporcion de fluido que pasa a traves del filtro, y las partroulas retenidas en el "retenido" dependera de diversos factores. Entre estos factores se incluyen, por ejemplo, el tamano del poro del filtro, el mdice de entrada, el mdice de filtracion, la concentracion de partroulas en la mezcla fluida, la temperatura y la viscosidad de la mezcla fluida. Para los fines del presente, "tamano del poro" se refiere al tamano medio de los poros del filtro. 'Indice de entrada" se refiere a la velocidad a la que una muestra (por ejemplo, una mezcla fluida) se introduce en la camara que contiene el filtro. Cuando la muestra recircula en multiples ocasiones a traves de un filtro (por ejemplo, en un dispositivo conforme a la presente invencion), el mdice de entrada tambien se denomina "mdice de recirculacion". "Flujo cruzado" se refiere al flujo sustancialmente paralelo (es decir, paralelo a la superficie del filtro en cualquier direccion) de la mezcla fluida que pasa a traves del filtro. "fndice de flujo cruzado" se refiere al mdice de flujo de la muestra, o de la mezcla fluida, sobre el filtro y sustancialmente paralelo a este. Por lo general, el mdice de flujo cruzado de la mezcla fluida depende de diversos parametros, incluyendo, por ejemplo, el mdice de entrada y el tamano y la forma de la camara que contiene el filtro. 'Indice de filtracion" se refiere al mdice de flujo de la mezcla fluida a traves del filtro. El mdice de filtracion para un dispositivo conforme a la presente invencion es rtpicamente inferior al mdice de filtracion sin resistencia (es decir, de tubo abierto). 'Indice de salida" se refiere al mdice de salida de la mezcla fluida de la camara de flujo cruzado, salvo por la mezcla fluida que pasa a traves del filtro (es
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decir, el filtrado). Por lo general, el mdice de salida es igual al mdice de entrada menos el mdice de filtrado.
Por los fines del presente, el termino "filtro" se refiere a cualquier artmulo fabricado en cualquier material o combinacion de materiales que dispone de una pluralidad de poros para permitir que uno o mas componentes (por ejemplo, componentes sangumeos) de una muestra o mezcla fluida sometida a flujo cruzado a traves del artmulo pase de un lado a otro del mismo, separando asf dichos componentes (por ejemplo, productos sangumeos no leucocitarios) de otros componentes (por ejemplo, leucocitos). La superficie de un filtro puede tener cualquier area adecuada, como, por ejemplo, entre aproximadamente 42 y 145 mm de diametro, aunque se pueden utilizar filtros con una superficie mayor y menor. En determinadas realizaciones, solamente se utiliza un filtro en un dispositivo TFF. En otras realizaciones, se pueden utilizar filtros adicionales en el dispositivo TFF.
El filtro tfpicamente empleado en el dispositivo TFF empleado en la presente invencion se puede seleccionar entre una amplia gama de filtros polimericos organicos. Entre estos filtros se incluyen, a tttulo meramente enunciativo, membranas microporosas de nylon, fluoruro de polivinilideno (PVDF), nitrato/acetato de celulosa, polisulfona, policarbonato, polietileno, poliester, polipropileno y poliamida. Tambien se pueden utilizar otros filtros, como filtros ceramicos y metalicos. Se pueden emplear tanto filtros hidrofilos como hidrofobos, cargados y no cargados. En terminadas aplicaciones pueden ser preferibles los filtros hidrofilos.
Un filtro de la presente invencion tfpicamente comprende un numero de poros distribuidos a traves de la superficie del filtro. En determinadas realizaciones, el filtro tiene un tamano de poro con una pequena variacion. Por ejemplo, la variabilidad del tamano del poro puede ser aproximadamente del +/-20% o encontrarse en un rango de aproximadamente +0 a 20%. En una realizacion tfpica, se emplean filtros "nucleopore" u obtenidos por el metodo de revelado de trazas nucleares ("track etched') (por ejemplo, membranas de filtro track-etched de policarbonato o polietileno Poxetics® (Osmonics, Minnetonka, MN)). Estos filtros disponen tipicamente de una superficie lisa con tamanos de poro estrictamente controlados en el material. Los filtros se preparan tfpicamente exponiendo una lamina plana de plastico no poroso a una fuente de partmulas radiactivas, que tienen una energfa suficiente para atravesar la lamina de plastico. A continuacion se aumenta el diametro de las "trazas" mediante exposicion a solventes qmmicos o agentes corrosivos. El tamano de los poros se puede controlar a traves de las condiciones del revelado de trazas nucleares.
La presente invencion se beneficia de las diferencias entre los diversos tipos de celulas sangumeas para enriquecer los leucocitos (por ejemplo, monocitos, precursores de celulas dendnticas y similares). Estas diferencias pueden incluir, por ejemplo, diferencias de tamano, de forma y/o su capacidad de deformacion. El tamano y la capacidad de deformacion de las celulas de la sangre humana tfpicamente vanan en los distintos tipos de celulas. Los eritrocitos (globulos rojos) tienen tfpicamente la forma de un disco biconcavo, son enucleados, miden unos 7 micrones de diametro en su parte central y son relativamente deformables. Los leucocitos polimorfonucleares son tfpicamente esferoidales, tambien miden unos 7 micrones, pero son menos deformables que los eritrocitos. De las celulas mononucleares, los linfocitos tiene tfpicamente entre 7 y 10 micrones, mientras que los monocitos se encuentran normalmente en un rango de 10 a 15 micrones.
En diversas realizaciones, el tamano del poro del filtro se selecciona para el enriquecimiento de leucocitos y/o para fraccionar los componentes sangumeos, consiguiendo asf el enriquecimiento de los leucocitos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se pueden separar mediante TFF los monocitos que tienen un diametro nominal de 10 a 1,5 micrones y los eritrocitos que tienen un diametro nominal de 7 micrones, utilizando un filtro con un tamano de poro de entre 5 y 5,5 micrones aproximadamente. En una realizacion concreta, se utilizo un filtro de 4,5 micrones para separar con exito los monocitos de los demas componentes celulares de una muestra obtenida de la leucoferesis.
El tamano de poro del filtro se puede encontrar en un rango de entre 3 y 8 micrones aproximadamente o entre 3 y 5 micrones aproximadamente. Un tamano de poro del filtro en un rango de unos 3 micrones puede retener mas leucocitos y retirar los eritrocitos de los leucocitos de forma menos eficaz. Por lo contrario, un tamano de poro del filtro en un rango de unos 8 micrones puede retirar los eritrocitos de forma mas eficaz, aunque incrementa la perdida de leucocitos en el filtrado. Se puede utilizar un tamano de poro del filtro de entre 3 y 5,5 micrones aproximadamente para el enriquecimiento de celulas madre hematopoyeticas CD34+.
El enriquecimiento de leucocitos respecto de otros componentes sangumeos tambien se puede ver afectado por el mdice de entrada, el mdice de filtracion y/o la concentracion de celulas en la muestra o mezcla fluida. Por ejemplo, los eritrocitos son mas deformables que los leucocitos y, por tanto, pueden pasar mas facilmente a traves de un tamano de poro del filtro menor que el diametro maximo de los eritrocitos (por ejemplo, inferior a 7 micrones). En un ejemplo, espedfico, los eritrocitos se pueden separar de los leucocitos utilizando filtros con un tamano de poro de unos 5 micrones. En otras realizaciones, el tamano de poro del filtro se reduce en unos 3 micrones y la concentracion de celulas se incrementa (supra) para separar de forma eficiente los eritrocitos de los leucocitos.
El enriquecimiento de los leucocitos respecto de otros componentes sangumeos se puede realizar
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tambien manteniendo un mdice de filtracion inferior al mdice de filtracion sin resistencia (es decir, de tubo abierto), bajo el mismo mdice de entrada o mdice de recirculacion. En otras realizaciones, la perdida de leucocitos del filtrado se puede reducir manteniendo un mdice de entrada o recirculacion superior al mdice de filtracion. En algunos ejemplos de realizaciones, el mdice de entrada o recirculacion puede ser al menos unas cinco veces, al menos unas 10 veces, al menos unas 20 veces, al menos unas 50 veces o al menos unas 100 veces el mdice de filtracion.
Se puede obtener una muestra, o una mezcla fluida, que comprende diversos componentes celulares para el fraccionamiento celular mediante TFF a partir de diversas fuentes y pueden incluir mezclas de productos sangumeos en cualquiera de las diversas fases de procesamiento. Por ejemplo, la sangre puede ser de origen humano o no humano. Por otra parte, las mezclas fluidas pueden ser, por ejemplo, sangre completa, diversas diluciones de sangre completa, o sangre completa o una dilucion de sangre que haya sido sometida a algun procesamiento, por ejemplo, eliminacion del plasma u otros componentes sangumeos. De este modo, la mezcla fluida puede incluir, por ejemplo, una poblacion de celulas sangumeas al menos parcialmente enriquecida en leucocitos.
Los componentes sangumeos o poblaciones de leucocitos se pueden preparar utilizando metodo conocidos por los expertos en la tecnica. Estos metodos incluyen tfpicamente la recogida de sangre heparinizada, aferesis o leucoferesis, preparacion de una capa leucocitaria, roseteo, centrifugacion, centrifugacion a gradientes de densidad (por ejemplo, FICOLL-HYPAQUE®), PERCOLL®, sacarosa y similares), lisis diferencial de celulas no leucocitarias, filtracion y similares. Tambien se puede preparar una poblacion de leucocitos recogiendo sangre de un sujeto, desfibrinando para eliminar las plaquetas y apartando la mayona de los globulos rojos. La poblacion de leucocitos se puede enriquecer opcionalmente en monocitos, por ejemplo, mediante centrifugacion a traves de un gradiente PERCOLL®.
Opcionalmente, la mezcla fluida que contiene los componentes sangumeos se puede diluir o concentrar, como convenga. Por ejemplo, en determinadas realizaciones los componentes de la sangre se diluyen en una proporcion de 1:2, 1:5, 1:10 o cualquier otra que resulte apropiada. Los componentes de la sangre se pueden diluir, por ejemplo, en soluciones tampon isotonicas (por ejemplo, PBS o solucion tampon HEPES), medios de cultivo de tejidos y similares. Tfpicamente, la muestra de los componentes sangumeos sometida a TFF presenta una concentracion de celulas de entre 106 y 108 por ml, aproximadamente
Se pueden obtener poblaciones de celulas sangumeas de diversos tipos de sujetos, en funcion del uso deseado de la poblacion enriquecida en leucocitos. El sujeto puede ser un sujeto sano. Alternativamente, las celulas sangumeas se pueden obtener de un sujeto que requiere inmunoestimulacion, tales como, por ejemplo, un paciente con cancer u otro paciente para el que la inmunoestimulacion pueda resultar beneficiosa. Del mismo modo, las celulas sangumeas se pueden obtener de un sujeto que requiere inmunosupresion, como, por ejemplo, un paciente con un trastorno autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoide, diabetes, lupus, esclerosis multiple y similares). Tambien se puede obtener una poblacion de celulas sangumeas de un individuo sano con HLA compatible para su administracion a un paciente con HLA compatible que lo necesite. Asimismo, se puede obtener una poblacion de celulas sangumeas de un individuo al que se le haya administrado un agente movilizador de celulas madre, como, por ejemplo GM- CSF, G-CSF, AMD3100 (u otro agente que inhiba la funcion de CXCR-4), o una dosis baja o alta de ciclofosfamida ( Deliliers et al., Leuk, Lymphoma 43:1957, 2002 ) y similares. El individuo puede ser un paciente al que se le administrara una poblacion enriquecida, un familiar o un individuo con HLA compatible.
En determinadas realizaciones, la poblacion enriquecida en leucocitos puede ser recogida en el retenido, mientras que los demas componentes sangumeos pasan al filtrado. Por ejemplo, para el enriquecimiento de una poblacion en leucocitos (por ejemplo, incluyendo monocitos y linfocitos), otros componentes sangumeos, como plasma, plaquetas y eritrocitos, se pueden encontrar entre los componentes retirados selectivamente en el filtrado. En otras realizaciones, los linfocitos o pequenos linfocitos se pueden extraer selectivamente y pasar al filtrado.
Los dispositivos empleados conforme a la presente invencion ilustrados en las Figuras 1A a 1C comprenden tipicamente una camara de flujo cruzado (3) y una camara de filtrado (4). Hay un filtro (5) posicionado entre ellas con una superficie que comunica el fluido con la camara de flujo cruzado (la superficie de retenido y la otra superficie que comunica el fluido con la camara de filtrado (la superficie de filtrado). La camara de flujo cruzado, la camara de filtrado y el filtro comprenden una unidad colectora (1). En una realizacion, la camara de flujo cruzado tfpicamente tiene una capacidad de unos 55 ml y la camara de filtrado una capacidad de unos 25 ml. Tfpicamente el diametro del filtro es sustancialmente el mismo que el diametro de la camara de flujo cruzado. En determinadas realizaciones empleadas para demostrar la utilidad de la presente invencion, el filtro tiene aproximadamente entre 140 y 143 mm de diametro.
La mezcla fluida entra en la camara de flujo cruzado (3) a traves de una entrada de fluido (6) que se encuentra tfpicamente situada adyacente a la superficie de retenido del filtro y de forma que la mezcla fluida (por ejemplo, una muestra) entra en la camara sustancialmente paralela a la superficie de retenido del filtro. Tfpicamente, el fluido se retira de la camara de flujo cruzado (3) a traves de una salida de fluido (7), que se encuentra habitualmente en una parte de la camara de flujo cruzado perpendicular a la
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superficie de retenido del filtro. En determinados ejemplos de realizaciones, el diametro de la entrada de la camara de flujo cruzado (6) tiene aproximadamente entre 7 mm y 8 mm, y el diametro de la salida de la camara de flujo cruzado (7) tiene aproximadamente entre 8 mm y 10 mm. El filtrado se retira a traves de una salida (8) de la camara de filtrado (4).
Tfpicamente, la mezcla fluida se introduce en la camara de flujo cruzado a un mdice de entrada suficiente, de forma que el flujo cruzado de la mezcla fluida a traves de la superficie del filtro (superficie de retenido) alcanza una velocidad lo suficientemente alta como para alterar suavemente y mezclar el fluido y las celulas en la superficie de contacto del filtro, es decir, la capa limftrofe. Para los fines del presente, por "capa limftrofe" se entiende la capa de fluido adyacente a la superficie de retenido del filtro que deja tipicamente el fluido que pasa a traves del filtro. Esta alteracion de la capa limftrofe facilita la filtracion eficaz evitando que el material de la superficie de contacto del filtro se una al filtro o se estanque, lo que podna impedir una filtracion eficaz. El mdice de entrada de la mezcla fluida habitualmente no es suficiente, sin embargo, para causar la lisis de un numero sustancial de leucocitos.
En determinadas realizaciones, los componentes sangumeos se pasan a traves de la superficie de retenido del filtro, bombeando la mezcla fluida hacia la camara de flujo cruzado (3). La bomba empleada para impulsar el flujo cruzado de fluido a traves del filtro se denomina "bomba de flujo cruzado" o "bomba de recirculacion" (14). La bomba de flujo cruzado puede incluir cualquier dispositivo de bombeo que comunica el fluido con la camara de flujo cruzado (3) suficiente para introducir el flujo de fluido en la camara y a traves del filtro al mdice de entrada especificado, sin causar un dano sustancial a las celulas (por ejemplo, la lisis celular). Una bomba de flujo cruzado adecuada para su uso en la presente invencion puede incluir, por ejemplo, una bomba peristaltica, una bomba de piston, una bomba de diafragma o una bomba de rodillo. Se puede utilizar una bomba peristaltica, por ejemplo, cuando se desea mantener el dispositivo TFF como parte de un sistema "cerrado".
La mezcla fluida se bombea tfpicamente hacia la camara de flujo cruzado (3) a un mdice de entrada superior al mdice de filtracion. En un ejemplo de realizacion, el mdice de entrada es aproximadamente de 1680 ml/minuto y el mdice de filtracion es de unos 15 ml/minuto. En otros ejemplos de realizaciones, el mdice de entrada es aproximadamente de entre 1600 y 1800 ml/minuto, mientras que el mdice de filtracion es de entre unos 10 y 20 ml/minuto. El material no leucocitario (por ejemplo, eritrocitos, complejos inmunitarios, protemas y similares) pasa a traves del filtro (5) hacia una camara de filtrado (4).
Como se ha debatido anteriormente, el mdice de filtracion es tfpicamente inferior al mdice de filtracion sin resistencia (es decir, de tubo abierto). El mdice de filtracion se puede controlar, por ejemplo, reduciendo o limitando el tamano de la salida de la camara de filtrado, mediante el uso de un segundo medio de bombeo (por ejemplo, una "bomba de filtracion") para limitar el flujo, o similares.
La introduccion de una mezcla fluida en el dispositivo genera un movimiento en remolino dentro del fluido. Esto se consigue introduciendo la mezcla fluida, por ejemplo sustancialmente paralela a un filtro circular de una camara de flujo cruzado cilmdrica, a un mdice de entrada entre 5 o 10 y hasta 100 veces superior al mdice de filtracion. El flujo se elimina a traves de una salida (7) que se encuentra en la camara cilmdrica, perpendicular al filtro y tfpicamente adyacente al centro de la superficie del filtro. Esta disposicion provoca un flujo en espiral interior hacia el centro del filtro. Tfpicamente el flujo no es turbulento ni presenta una velocidad tan elevada como para provocar una lisis sustancial de los leucocitos. Como se ha debatido anteriormente, el flujo tambien puede "frotar" la superficie del filtro, para evitar la adherencia o el estancamiento en la capa limftrofe. Al calibrar el mdice de entrada de forma que sea elevado (por ejemplo, al menos unas cinco veces superior) con respecto al mdice de filtracion, la poblacion enriquecida en leucocitos resultante puede presentar al menos aproximadamente un 20% o al menos aproximadamente un 40% o mas de leucocitos.
En otro ejemplo de realizacion, se recircula el retenido para incrementar la eficacia de la separacion. Por ejemplo, una mezcla fluida que comprende componentes sangumeos se puede introducir en la camara de flujo cruzado y, a continuacion, se puede extraer el retenido a traves de la salida de fluido (7) de la camara de flujo cruzado a otra camara, como, por ejemplo, una camara desde la que el fluido se suministro inicialmente (una "unidad de recuperacion" (2)). La mezcla fluida de la unidad de recuperacion se puede reintroducir entonces en la unidad de flujo cruzado. Al conectar la unidad de recuperacion (2) y la unidad colectora (1) en "forma de bucle", se puede conseguir la recirculacion y filtracion continuas de la mezcla fluida. Alternativamente, el retenido se puede extraer a traves de la salida de fluido (7) de la camara de flujo cruzado (3) y reintroducirse directamente en la entrada de la camara de flujo cruzado (es decir, sin pasar por una unidad de recuperacion ni por otra camara). La mezcla fluida se puede pasar a traves de la unidad de flujo cruzado durante cualquier periodo adecuado de tiempo. En determinadas realizaciones, se puede recircular la mezcla fluida entre unos 5 y unos 60 minutos, o mas, a fin de conseguir el enriquecimiento o la pureza de celulas leucocitarias deseada.
En otra realizacion mas, se puede ajustar el volumen de la mezcla fluida anadiendo una solucion tampon, una solucion de lavado u otra solucion (denominadas colectivamente "ftquido de reemplazo"). La solucion de lavado se puede combinar, por ejemplo, con una mezcla fluida en una unidad de recuperacion (por ejemplo, a traves de una entrada de la solucion (13)), en una unidad colectora, en una bomba (14), en un tubo que sale de la unidad colectora o que se dirige a la misma, o en cualquier otro lugar conveniente. Por
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tanto, las celulas del retenido se pueden enriquecer y lavar en la misma operacion. ^picamente, la solucion de lavado es isotonica con las celulas. Las soluciones tampon y de lavado adecuadas pueden incluir diversas soluciones tampon (por ejemplo, solucion tampon de fosfatos (PBS) o solucion tampon HEPES), medios para el cultivo de tejidos y similares.
En determinadas realizaciones, las poblaciones de celulas son enriquecidas en una poblacion de leucocitos en un sistema cerrado y aseptico. Para los fines del presente, los terminos "sistema cerrado y aseptico" o "sistema cerrado" se refieren a un sistema en el que se minimiza la exposicion a condiciones no esteriles, ambiente, con circulacion de aire u otras condiciones no esteriles. Por lo general, los sistemas cerrados para el enriquecimiento de poblaciones de celulas excluyen la centrifugacion en tubos abiertos por la parte superior, la transferencia de celulas al aire libre, el cultivo de celulas en placas de cultivo de tejidos o matraces no hermeticos y similares. El conjunto del sistema de filtracion, incluyendo, por ejemplo, cualesquiera contenedores de celulas, incubadoras, recipientes para el cultivo de tejidos u otros aparatos para el procesamiento celular (infra) se puede mantener como un sistema "cerrado". En una realizacion tfpica, el sistema cerrado permite el enriquecimiento en leucocitos y, opcionalmente, la transferencia desde un recipiente colector inicial a un recipiente para el cultivo de tejidos hermetico, sin exposicion a una atmosfera no esteril. Tfpicamente, en un sistema cerrado se utiliza una bomba peristaltica (Figura 1A y 1C (15)).
En otro aspecto de la invencion, una mezcla heterogenea de componentes sangumeos es sustancialmente enriquecida en leucocitos mediante la eliminacion selectiva de la mezcla de los componentes sangumeos no leucocitarios, incluyendo, por ejemplo, plaquetas, eritrocitos y similares. Para los fines del presente, el termino "sustancialmente enriquecida" significa que la poblacion de celulas recuperada en el retenido, despues del numero de ciclos de recirculacion deseado, contiene al menos aproximadamente un 20% o al menos aproximadamente un 40% o al menos aproximadamente un 60% del tipo de celula deseado (por ejemplo, leucocitos). En otras realizaciones, una mezcla heterogenea de componentes sangumeos es enriquecida en leucocitos para formar una poblacion enriquecida en leucocitos sustancialmente libre de componentes sangumeos no leucocitarios. Para los fines del presente, el termino "sustancialmente libre" significa que la poblacion enriquecida en leucocitos comprende al menos un 50% de leucocitos.
En un ejemplo de realizacion de este aspecto de la presente divulgacion, el dispositivo TFF comprende una camara de flujo cruzado (3) con una capacidad de unos 55 ml y una camara de filtrado (4) con una capacidad de unos 25 ml. Ademas el dispositivo comprende lo siguiente: un tamano de poro del filtro de entre aproximadamente 1 y 10 micrones, o aproximadamente 2 y 8 micrones, o aproximadamente 3 y 5 micrones; un mdice de entrada de entre aproximadamente 1600 y 1800 ml/min; un mdice de filtracion de entre aproximadamente 12 y 17 ml/min, y un diametro del filtro de aproximadamente 142 mm. La mezcla fluida inicial tiene tfpicamente una concentracion de celulas de aproximadamente al menos 107 celulas por ml (por ejemplo, leucocitos y otras celulas).
En otro aspecto de la divulgacion, una mezcla heterogenea de componentes sangumeos es sustancialmente enriquecida en monocitos mediante la eliminacion selectiva de componentes sangumeos no monocfticos, incluyendo, por ejemplo, la eliminacion de linfocitos de la mezcla. Para los fines del presente, los terminos "eliminacion selectiva" o "eliminado de forma selectiva" y "eliminando de forma selectiva" se refieren a la eliminacion preferente de un tipo de celula y el enriquecimiento en otro tipo de celula. En un ejemplo de realizacion del presente aspecto, el dispositivo TFF comprende una camara de flujo cruzado (3) con una capacidad de aproximadamente 55 ml y una camara de filtrado (4) con una capacidad de aproximadamente 25 ml. Ademas, el dispositivo comprende lo siguiente: un tamano de poro del filtro de aproximadamente entre 3 y 8 micrones, o aproximadamente entre 3 y 5 micrones; un mdice de entrada de aproximadamente entre 1.600 y 1.800 ml/min, un mdice de filtracion de aproximadamente entre 12 y 17 ml/min, y un diametro del filtro de unos 142 mm. Tfpicamente, la mezcla fluida inicial tiene una concentracion de celulas de al menos unas 107 celulas por ml (por ejemplo, monocitos y otras celulas). En esta realizacion, el dispositivo se utilizo de manera invertida.
Cultivo, expansion y diferenciacion de poblaciones de celulas enriquecidas
Tras el enriquecimiento de una poblacion de celulas en leucocitos como se ha descrito supra, opcionalmente los leucocitos se pueden cultivar para que mantengan su viabilidad, incrementar el numero de celulas y/o diferenciar las celulas en otro tipo de celula. Entre los recipientes para el cultivo de tejidos adecuados se incluyen, por ejemplo, matraces para el cultivo de tejidos, bolsas, placas, biorreactores (incluyendo un fermentador) y similares.
En un ejemplo de realizacion, la poblacion enriquecida en leucocitos se puede cultivar en un sistema cerrado y aseptico, como un biorreactor, una bolsa para el cultivo de tejidos y similares. El sistema cerrado puede tener una entrada y/o salida para la introduccion o extraccion controlada y aseptica de fluidos (por ejemplo, medios para el cultivo de tejidos, soluciones tampon de lavado), gases, celulas y similares.
En otro ejemplo de realizacion, se puede transferir una poblacion enriquecida en leucocitos a un biorreactor. El biorreactor puede estar dotado de entradas y/o salidas apropiadas para la introduccion de celulas, gas esteril (por ejemplo, oxfgeno, dioxido de carbono y/o aire), medios para el cultivo de tejidos y
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similares. El biorreactor tambien puede disponer de medios para el control de la temperatura. ^picamente el biorreactor se utiliza a unos 37°C. Tambien puede incluir medios para agitar las celulas y/o el medio de cultivo en su interior. Los medios de agitacion pueden incluir, por ejemplo, una pala o filtro de rotacion (que tambien puede funcionar como salida para los medios).
En otro ejemplo de realizacion, se puede transferir una poblacion enriquecida en leucocitos a un sistema cerrado, como una bolsa para el cultivo de tejidos. Entre las bolsas para el cultivo de tejidos adecuadas se incluyen, por ejemplo, los contenedores de cultivo STERlCELL® (Nexell Therapeutics Inc.) o las bolsas de cultivo TEFLUN® (American Fluoroseal Corp.) El sistema cerrado puede tener cualquier tamano o capacidad adecuada, tal como apreciara un experto en la tecnica. Entre los volumenes adecuados se incluyen, por ejemplo, entre unos 0,01 litros y unos 5 litros, o entre unos 0,01 litros y unos 0,05 litros, aunque tambien resulta posible emplear capacidades mayores o inferiores sin desviarse del ambito de aplicacion de la presente invencion.
En determinadas realizaciones, de acuerdo con la presente invencion, opcionalmente las poblaciones de celulas enriquecidas en leucocitos (por ejemplo, incluyendo monocitos, precursores de celulas dendnticas monocticas, celulas madre hematopoyeticas CD34+ u otras celulas precursoras) se pueden cultivar y diferenciar mediante la adicion de un agente de induccion apropiado para obtener celulas de un determinado tipo concreto, incluyendo, por ejemplo, celulas dendnticas inmaduras o maduras, macrofagos f, celulas precursoras o celulas madre hematopoyeticas CD34+ u otras celulas precursoras. Entre los medios para el cultivo de tejidos adecuados se incluyen, por ejemplo, AIM-V, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15tm y similares. El medio para el cultivo de tejidos se puede complementar, si se desea, con aminoacidos, vitaminas, citoquinas, como el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrofagos (GM-CSF) y/o interleuquina 4 (IL-4), cationes divalentes y similares, con el objeto de promover la diferenciacion de las celulas en celulas dendnticas inmaduras, por ejemplo. Una combinacion de citoquinas tfpica es la formada por unas 500 unidades/ml de GM-CSF y de IL-4.
La poblacion enriquecida en leucocitos se puede cultivar durante cualquier periodo de tiempo adecuado. En determinadas realizaciones, los tiempos de cultivo adecuados para la diferenciacion de las celulas en celulas dendnticas inmaduras pueden ser de entre unos cuatro y siete dfas. La diferenciacion en celulas dendnticas inmaduras a partir de los precursores se puede controlar mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica, como, por ejemplo, por la presencia o ausencia de marcadores de superficie celulares (por ejemplo, CD14, CD11c+, CD83, HLA-DR+). Las celulas dendnticas inmaduras tambien se pueden cultivar en un medio para el cultivo de tejidos apropiado, a fin de expandir la poblacion de celulas y/o mantener las celulas dendnticas inmaduras en un estado para su posterior diferenciacion o absorcion de antigeno, procesamiento y presentacion. Por ejemplo, las celulas dendnticas inmaduras se pueden mantener en presencia de GM-CSF e IL-4.
En determinadas realizaciones, las celulas dendnticas inmaduras son preferibles para la presentacion de antigeno optima, debido a que conservan su capacidad para procesar un nuevo antigeno (vease, por ejemplo, Koch et al., J Immunol. 155: 93-100, 1995.) Por lo contrario, en el caso de las celulas dendnticas maduras (por ejemplo, CD14-, CD11c+, CD83+, CD86+, HLA-DR+), aquellas celulas que han estado expuestas a antigeno y lo han procesado y han estado expuestas a agentes de maduracion apropiados pierden tfpicamente su capacidad para procesar eficazmente nuevos antigenos.
Durante el cultivo, opcionalmente las celulas dendnticas inmaduras pueden ser expuestas a un antigeno predeterminado. Entre los antfgenos predeterminados adecuados se puede incluir cualquier antigeno para la presentacion a linfocitos T (por ejemplo, para la activacion, estimulacion de la proliferacion, induccion de anergia y similares). En una realizacion, las celulas dendnticas inmaduras se cultivan en presencia de un antigeno asociado a un tumor, como, por ejemplo, el antfgeno prostatico espedfico de membrana (PSMA) (por ejemplo, para la inmunoterapia para el cancer y/o la inhibicion del crecimiento del tumor). Otros antfgenos pueden incluir, por ejemplo, antfgenos bacterianos y virales, antfgenos espedficos o asociados a un tumor (por ejemplo, lisado de celulas tumorales, preparacion de la membrana de celulas tumorales, antfgenos aislados de tumores, protemas de fusion, liposomas y similares) y cualquier otro antfgeno. Tras el contacto con el antfgeno, las celulas se pueden cultivar durante cualquier periodo de tiempo apropiado, para permitir la absorcion y el procesamiento del antfgeno, para expandir la poblacion de celulas dendnticas espedficas de antfgeno y similares. Las celulas dendnticas inmaduras tambien se pueden madurar a celulas dendnticas maduras que presentan antfgeno, en el contexto de moleculas del MHC. Esta maduracion se puede realizar, por ejemplo, mediante cultivo en presencia de factores de maduracion, tales como citoquinas (por ejemplo, TNF-alfa), productos bacterianos (por ejemplo, BCG) y similares.
En otro aspecto mas de la invencion, una mezcla heterogenea de componentes sangumeos es sustancialmente enriquecida en celulas precursoras dendnticas monodticas. Tras el enriquecimiento de una poblacion de celulas en leucocitos o monocitos, tal como se ha descrito supra, los precursores de celulas dendnticas monodticas, como los de la sangre periferica, se pueden aislar de la poblacion enriquecida, mediante adherencia selectiva a un sustrato (por ejemplo, un sustrato de union a precursores de celulas dendnticas monodticas). Este sustrato se puede proporcionar, por ejemplo, en un matraz o placa de cultivo. Alternativamente, se puede utilizar un sustrato que presenta un elevado ratio de area de la superficie/volumen, como un sustrato particulado o fibroso, tal y como se divulga en WO 03/010292.
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Los precursores de celulas dendrfticas monocfticas pueden ser monocitos que se adhieren selectivamente al sustrato para formar complejos de precursores de celulas dendrfticas monocfticas y sustrato, mientras que otros leucocitos se mantienen sin unirse ("no adherentes"). Los leucocitos unidos son posteriormente separados de los leucocitos no unidos para formar una poblacion de celulas enriquecida en precursores de celulas dendrfticas monocfticas sobre el sustrato. Los precursores de celulas dendrfticas monocfticas se pueden cultivar y diferenciar sobre el sustrato o pueden ser eluidos del sustrato y posteriormente cultivados y diferenciados por separado, a fin de obtener celulas dendrfticas presentadoras de antigeno inmaduras y/o maduras. Segun este aspecto, opcionalmente los precursores de celulas dendrfticas monocfticas se pueden aislar y diferenciar en un sistema cerrado y aseptico.
Segun otro aspecto, se pueden emplear celulas dendrfticas expuestas a un antfgeno predeterminado para activar los linfocitos T in vitro o in vivo frente al antigeno. Opcionalmente, las celulas dendrfticas se pueden utilizar inmediatamente despues de la exposicion al antigeno para estimular los linfocitos T. Alternativamente, las celulas dendrfticas se pueden mantener en presencia de una combinacion de citoquinas (por ejemplo, GM-CSF e IL-4) antes de la exposicion a antigeno y linfocitos T. En una realizacion concreta, se utilizan celulas dendrfticas humanas para estimular los linfocitos T humanos in vitro o in vivo.
Los linfocitos T o un subconjunto de linfocitos T se pueden obtener a partir de diversos tejidos linfoides. Entre estos tejidos se incluyen, a tftulo meramente enunciativo, el bazo, los nodulos linfaticos y la sangre periferica. La purificacion de linfocitos T se puede conseguir , por ejemplo, mediante seleccion positiva o negativa, incluyendo, a tftulo meramente enunciativo, el uso de anticuerpos dirigidos a CD2, CD3, CD4, CD5, y/o CD8.
Los linfocitos T se pueden cultivar conjuntamente con celulas dendrfticas expuestas al antigeno predeterminado, como una poblacion de linfocitos T heterogenea o como un subconjunto de linfocitos T purificado. Por ejemplo, se pueden cultivar conjuntamente linfocitos T CD8+ con celulas dendrfticas expuestas a antigeno para obtener CTL espedfico de antfgeno. En determinadas realizaciones, la eliminacion temprana de linfocitos T CD4+ puede impedir el sobrecrecimiento de celulas CD4+ en un cultivo heterogeneo de linfocitos T CD8+ y CD4+. Alternativamente, se pueden cultivar conjuntamente poblaciones heterogeneas de linfocitos T CD4+ y CD8+ T con celulas dendrfticas para obtener una respuesta espedfica a un antfgeno que comprende tanto una respuesta citotoxica como inmune a TH.
Opcionalmente, estos linfocitos T estimulados se pueden volver a infundir en los sujetos. (Vease, por ejemplo, Riddle and Greenberg, J. Antimicrobial Chemotherapy 45:35-43, 2000; Correale et al., J. Neuroimmunology 107:130-39, 2000.) Por ejemplo, las celulas dendrfticas inmaduras se pueden poner en contacto con un antfgeno (por ejemplo, PSMA) y madurarse para formar celulas dendrfticas maduras. Los linfocitos T pueden ser aislados de un sujeto, ponerse en contacto con celulas dendrfticas maduras ex vivo para, a continuacion, administrarselas de nuevo al sujeto. Por ejemplo, se pueden administrar dosis de unos 1 x 107 a 5 x 109 linfocitos T CD8+ a un sujeto semanalmente, o cada dos semanas, durante un periodo de 1-4 meses, o mas. Alternativamente, las celulas dendrfticas maduras se pueden administrar directamente al sujeto. Tfpicamente, se utilizan aproximadamente 1 x 107 celulas dendrfticas por administracion y paciente.
Tfpicamente, un producto de la leucoferesis de un donante tratado con un agente movilizador de celulas madre comprende entre aproximadamente un 1 y un 5% de celulas, entre aproximadamente un 5 y un 20% de granulocitos, entre aproximadamente un 40 y un 60% de linfocitos, alrededor de aproximadamente un 10 y un 25% de monocitos con cantidades significativas de globulos rojos y plaquetas. El uso de un dispositivo TFF de la presente invencion con un filtro que tiene un tamano de poro de aproximadamente entre 3 y 5,5 micrones proporciona una poblacion enriquecida en leucocitos que comprende aproximadamente entre un 60 y un 70% de monocitos, casi ningun granulocito, aproximadamente un 14% de linfocitos y aproximadamente entre un 10 y un 40% de celulas CD34+. Esta poblacion enriquecida en leucocitos se puede utilizar como se expone mas adelante.
En otras realizaciones, los metodos de la presente divulgacion se utilizan para obtener un subconjunto de celulas distintas de monocitos o precursores de celulas dendrfticas monocfticas. Por ejemplo, se puede utilizar una poblacion enriquecida en leucocitos como fuente de celulas madre hematopoyeticaas, por ejemplo, trasplante alogenico o autologo. En determinadas realizaciones de la divulgacion, la poblacion enriquecida en leucocitos es posteriormente enriquecida en celulas madre, tras el procedimiento de separacion por flujo tangencial. Los metodos para el enriquecimiento en celulas madre hematopoyeticas a partir de una fuente de leucocitos de sangre periferica son conocidos en la tecnica y se pueden adaptar para su uso con una poblacion enriquecida en leucocitos aislados tal y como se describe en el presente. Por ejemplo, una poblacion enriquecida en leucocitos se puede enriquecer posteriormente en celulas CD34+, utilizando, por ejemplo, tecnicas de separacion inmunomagnetica (vease, por ejemplo, Rowley et al., Bone Marrow Transplant. 21:1253, 1998 ; Denning-Kendall et al., Br. J. Haematol 105:780, 1999 ). Por otra parte, para incrementar mas los rendimientos de celulas madre, una poblacion enriquecida en monocitos tras la TFF descrita en la presente divulgacion se puede cultivar en presencia de, por ejemplo, unos 50 ng/ml de M-CSF en un medio que contiene suero fetal para obtener celulas CD34+. El cultivo se debe realizar en un recipiente para el cultivo de celulas no adhesivo, como una bolsa de cultivo de TEFLON®. Por otra parte, los donantes de sangre periferica se pueden someter a un regimen de
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movilizacion de celulas madre, antes de la extraccion de la sangre periferica y de la separacion de los leucocitos mediante TFF. Son varios los agentes movilizadores conocidos en la tecnica para incrementar la eficacia del cultivo de celulas madre. Por ejemplo, los donantes se pueden tratar con GM-CSF, G-CSF, AMD3100 (u otro agente que inhiba la funcion de CXCR-4), y/o agentes quimioterapeuticos movilizadores, como, por ejemplo, una dosis alta o baja de ciclofosfamida (vease, por ejemplo, Deliliers et al., Leuk Lymphoma, 43:1957, 2002). El donante de sangre puede ser el paciente que va a recibir el trasplante, un familiar cercano, un individuo con HLA compatible o similares.
En otra realizacion, los metodos de la presente divulgacion tambien son utilizados para obtener un subconjunto de celulas diferentes de celulas madre, como, por ejemplo, una poblacion de celulas enriquecida en celulas progenitoras (por ejemplo, celulas progenitoras hematopoyeticas o endoteliales) o celulas que secretan un factor de interes (por ejemplo, factores de crecimiento angiogenicos o hematopoyeticos). Por ejemplo, las celulas progenitoras endoteliales circulantes (CEP) se pueden identificar como un subconjunto de las celulas CD34+ circulantes mediante, por ejemplo, expresion conjunta de VEGFR-2 y AC133 (asf como, por ejemplo, cadherina VE y selectina E). (Vease, por ejemplo, Peichev et al., Blood 95:952, 2000 .) Una poblacion enriquecida en leucocitos se puede enriquecer tambien en CEP, utilizando, por ejemplo, tecnicas de separacion inmunomagnetica con anticuerpos dirigidos a VEGFR-2 y AC133. Por otra parte, los CEP se pueden movilizar antes de la TFF mediante tratamiento con citoquinas, tales como VEGF (vease, por ejemplo, Gill et al., Cire Res., 88:167, 2001). Ademas, en otras realizaciones de la divulgacion se obtienen celulas angiogenicas circulantes (CAC) similares a las endoteliales (que secretan, por ejemplo, VEGF, HGF, G-CSF, y GM-CSF) cultivando una poblacion enriquecida en leucocitos con, por ejemplo, VEGF, bFGF, IGF-1, EGF, y FBS sobre una superficie recubierta con fibronectina y, a continuacion, descartando las celulas no adherentes (vease, por ejemplo, Rehman et al., Circulation 107:1164, 2003).
Por otra parte, la poblacion enriquecida en leucocitos se puede cultivar para inducir la expansion de celulas madre o progenitores pluripotentes. Por ejemplo, las celulas madre CD34+ se pueden expandir mediante cultivo con factores de crecimiento hematopoyeticos, tales como, por ejemplo, una combinacion de IL-1, IL-3, IL-6, factor de celulas madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos/monocitos (GM-CSF) y G-CSF (vease, por ejemplo, Sun et al., Haematologica 88:561, 2003 ). Alternativamente, por ejemplo, se puede tratar una poblacion enriquecida en monocitos con, por ejemplo, M-CSF, LIF y/o IL-6, con el objeto de obtener "macrofagos f" pluripotentes (f-M$), que morfologicamente recuerdan a los fibroblastos y que, a diferencia de los macrofagos estandar, presentan elevados niveles de CD34 (vease Zhao et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100:2426, 2003.) Los progenitores o celulas madre se pueden tratar posteriormente con diversas citoquinas y factores de crecimiento, a fin de inducir la diferenciacion en imeas hematopoyeticas o no hematopoyeticas.
En otras realizaciones de la divulgacion, se puede cultivar una poblacion enriquecida en leucocitos en determinadas condiciones adecuadas para inducir la diferenciacion (por ejemplo, diferenciacion de celulas progenitoras o transdiferenciacion de tipos de celulas mas diferenciados, como, por ejemplo, monocitos o celulas dendnticas obtenidas de monocitos). (Para los fines del presente, por "transdiferenciacion" se entiende un proceso de modulacion fenotfpica de una celula diferenciada, por lo general sin necesidad de ninguna division celular, por la que la celula diferenciada se diferencia en un tipo de celula morfologica y/o funcionalmente diferente.) Por ejemplo, ademas de la diferenciacion en celulas dendnticas, los monocitos se pueden transformar en otros tipos de celulas hematopoyeticas o no hematopoyeticas, incluyendo, por ejemplo, macrofagos, osteoclastos y celulas similares a las endoteliales, dependiendo de las condiciones de cultivo (vease, por ejemplo, Becker et al., J Immunol. 139:3703, 1987 ; Nicholson et al, Clin Sci. 99:133, 2000 ; Havemann et al., en Novel Angiogenic Mechanisms: Role of Circulating Progenitor Endothelial Cells 47-57 (Nicanor I. Moldovan eds., 2003 )). En una realizacion, una poblacion enriquecida en monocitos o celulas dendnticas obtenidas de monocitos es transdiferenciada en celulas similares a las endoteliales, mediante cultivo con, por ejemplo, VEGF, bFGF, IGF-1, hidrocortisona y FCS sobre una superficie recubierta de fibronectina. (Vease Havemann et al., supra.) Ademas, una poblacion enriquecida en leucocitos se puede cultivar en condiciones que inducen la diferenciacion de subconjuntos de celulas relativamente no diferenciadas (por ejemplo, celulas madre y progenitores pluripotentes) en lmeas de celulas hematopoyeticas o no hematopoyeticas, utilizando diversas citoquinas o factores de crecimiento. Por ejemplo, se puede inducir la diferenciacion de celulas madre pluripotentes obtenidas de monocitos (f- M$) en macrofagos estandar, linfocitos T, celulas epiteliales, celulas neuronales, celulas endoteliales o hepatocitos, mediante tratamiento con LPS, IL-2, EGF, NGF, VEGF, o HGF, respectivamente. (Vease Zhao et al., supra.) Esta diferenciacion se puede inducir antes o despues de la expansion celular, por ejemplo, la anteriormente descrita
Los siguientes ejemplos se ofrecen unicamente a tftulo ilustrativo de diversos aspectos de la invencion y no se debera considerar que limitan su alcance en modo alguno. Cualquier ejemplo no perteneciente al ambito de aplicacion de las reivindicaciones se ofrece exclusivamente con fines comparativos.
Ejemplo 1: Dispositivo TFF con unidad colectora y unidad de recuperacion en configuracion de bucle
Este ejemplo comprende una configuracion que dispone de una unidad colectora (1) y una unidad de recuperacion (2) en una configuracion de bucle del dispositvo de filtracion de flujo tangencial. (Figura 1A)
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La unidad colectora inclma una cubierta con dos camaras (una camara de flujo cruzado (3) y una camara de filtrado (4)), separadas por un filtro microporoso (5) (142 mm de diametro) con un tamano de poro de aproximadamente entre 1 y 10 micrones. La camara de flujo cruzado inclma una entrada de fluido (6) y una salida de fluido (7). La camara de filtrado inclma una salida de filtrado (8). La unidad de recuperacion inclma una cubierta (9) que inclma una entrada de retorno (10), una salida de retorno (11), una entrada de muestra (12) y una entrada de la solucion (13). En determinadas realizaciones, la entrada de la muestra y la entrada de la solucion son la misma, aunque pueden estar separadas. La muestra (por ejemplo, sangre, preparados de sangre o una poblacion preparada de leucocitos) se introdujo en la unidad de recuperacion por la entrada de la muestra (12) y se extrajo a traves de la salida de retorno (11) a la unidad colectora mediante la actuacion de una bomba de recirculacion (14). La muestra se introdujo en la unidad colectora a traves de la entrada del fluido (6) y fluyo a traves de la membrana microporosa (5), de forma que el movimiento del fluido se dirigfa tangencialmente a la direccion de filtracion. Por lo general, la entrada del fluido (6) estaba posicionada perpendicularmente al radio del filtro. Los indices relativos de entrada, filtracion y salida indujeron un movimiento en remolino, cuyo centro extrajo los componentes de la preparacion de la sangre que no atravesaron el filtro hacia la salida del fluido (7) y de vuelta a la unidad de recuperacion (2). El flujo de fluido entre la unidad de recuperacion y la unidad colectora se controlo mediante la bomba de recirculacion (14). La extraccion del filtrado de la unidad colectora se controlo mediante una bomba de filtrado (15).
Ejemplo 2: Retencion de leucocitos tras la TFF: Efectos del mdice de recirculacion y del mdice de filtracion sobre la eficacia de la retencion
En este ejemplo, se demostro el enriquecimiento en leucocitos utilizando un dispositivo TFF como el descrito en el Ejemplo 1, que contema membranas de poliester de 142 mm. Una muestra del producto de la leucoferesis se sometio a TFF en un dispositivo en diversas condiciones y se evaluo la retencion selectiva de leucocitos. En un conjunto de estudios, la TFF se realizo con 10 ml de producto de la leucoferesis utilizando un filtro de 3 micrones, con un mdice de filtracion de 15 ml/min (durante 17 min) y a diversos indices de recirculacion (entrada) (por ejemplo, 1.680, 1.380, 1.080, 870, y 540 ml/min). Por lo general, la mayona de los leucocitos se retuvieron en el retenido (es decir, menos de aproximadamente el 10% de los leucocitos en el filtrado), a menos que el mdice de recirculacion fuese inferior a 1080 ml/min (Figura 2; nota: los indices de recirculacion reales correspondientes designados Max, 10, 9, 8, 7, y 6 fueron 1680, 1380, 1080, 870, and 540 ml/min, respectivamente).
En otra serie de estudios, la TFF se realizo con 10 ml de producto de la leucoferesis en el dispositivo TFF del Ejemplo 1, utilizando un filtro de 3 micrones, con un mdice de recirculacion (entrada) de 1080 ml/min a tres indices de filtracion diferentes (11, 15, y 19,6 ml/min) Se recogieron unos 250 ml de filtrado por estudio. Ni el mdice de filtracion de 19,6 ml/min ni el de 11 ml/min fueron sustancialmente mas beneficiosos que el mdice de filtracion de 15 ml/min para la retencion de leucocitos (Figura 3).
Ejemplo 3: Eliminacion selectiva de eritrocitos del producto de la leucoferesis
En este ejemplo, se demostro la eliminacion selectiva de eritrocitos y los efectos del mdice de recirculacion, el mdice de filtracion y la concentracion de la muestra sobre la eficacia de la separacion utilizando el dispositivo TFF del Ejemplo 1. Las muestras del producto de la leucoferesis se sometieron a TFF en las condiciones establecidas en el Ejemplo 2 y se evaluo la eliminacion selectiva de eritrocitos. Al igual que en el Ejemplo 2, la TFF se realizo con 10 ml de producto de la leucoferesis, utilizando un filtro de 3 micrones, con un mdice de filtracion de 15 ml/min (durante 17 minutos) y a diversos indices de recirculacion (entrada) (por ejemplo, 1680, 1380, 1080, 870, y 540 ml/min). Se determino que, por lo general, la reduccion del mdice de recirculacion favoreda el paso de un mayor numero de eritrocitos al filtrado (Figura 4, nota: los indices de recirculacion reales correspondientes para Max, 10, 9,8, 7, y 6 fueron 1680, 1380, 1080, 870, y 540 ml/min, respectivamente). Se puede apreciar que, a pesar de que al descender el mdice de recirculacion aumento la eliminacion de eritrocitos del retenido, a un mdice de recirculacion inferior a 1.080 ml/min se redujo el rendimiento de leucocitos en el retenido (Figura 4).
Al igual que en el Ejemplo 2, la TFF se realizo con 10 ml de producto de la leucoferesis en el mismo dispositivo TFF, utilizando un filtro de 3 micrones, con un mdice de recirculacion (entrada) de 1080 ml/min a tres indices de filtracion diferentes (11, 15 y 19,6 ml/min). Se recogieron unos 250 ml de filtrado por estudio. Ni el mdice de filtracion de 19,6 ml/min ni el de 11 ml/min fueron sustancialmente mas beneficiosos que el mdice de filtracion de 15 ml/min para la eliminacion selectiva de eritrocitos (Figura 5). El mdice de filtracion de 19,6 ml/min redujo los eritrocitos en el retenido en mayor medida que el de 15 ml/min, aunque, tal como se puede apreciar en el Ejemplo 2, el mdice de filtracion de 15 ml/min proporciono un mayor rendimiento de leucocitos en el retenido (Figura 3).
Con respecto a la Figura 6, tambien se estudio el efecto de incrementar la concentracion de material de la leucoferesis en la muestra. Cincuenta mililitros (50 ml) de material de la leucoferesis, diluidos en una proporcion de 1:5 de PBS + heparina + DNasa I, se sometieron a TFF utilizando un dispositivo con un filtro que tema una tamano de poro de 3 micrones. El porcentaje de eritrocitos (designado "RBC) en el retenido fue mas o menos el mismo, aproximadamente el 100% de la entrada, cuando el mdice de filtracion era de unos 15 ml/min o 19,6 ml/min. Sin embargo, cuando los 50 ml de producto de la leucoferesis se diluyeron en una proporcion de 1:2 de la misma solucion tampon, solamente se retuvo el 40% de los eritrocitos
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introducidos en el retenido, lo que demuestra que la carga de mayores concentraciones en la muestra tambien puede promover la separacion de eritrocitos de los leucocitos (designados "WBC").
Ejemplo 4: Eliminacion selectiva de eritrocitos del producto de la leucoferesis: Efecto del tamano del poro sobre la eliminacion de eritrocitos
Para confirmar que la realizacion del dispositivo TFF presentada en el Ejemplo 1 obtendna unos resultados similares a niveles superiores, se comparo la TFF de 120 ml de producto de la leucoferesis (1/2 de una unidad entera) en dispositivos que conteman filtros con un tamano de poro de 3 micrones y 4,5 micrones. El mdice de recirculacion (entrada) fue de 1680 ml/min y el mdice de filtracion fue de 15 ml/min. Con respecto a la Figura 7, en la TFF realizada utilizando un filtro de 4,5 micrones se elimino aproximadamente el 80% de los eritrocitos (denominados "RBC", barras negras) del retenido, mientras que se retuvo aproximadamente el 62% de los leucocitos introducidos (designados "WBC", barras rayadas claras), o mas de aproximadamente el 70% de los monocitos introducidos. Por el contrario, utilizando el filtro de 2 micrones, se retuvo en el retenido aproximadamente el 65% de los leucocitos introducidos, pero solamente se elimino el 3% de los eritrocitos.
Con respecto a la Figura 8, la TFF de 45 ml de producto de la leucoferesis se comparo en dispositivos que teman filtros con un tamano de poro de 4,5 micrones frente a los de 8 micrones. El mdice de recirculacion (entrada) fue de 1680 ml/min, el mdice de filtracion fue de 15 ml/min y el tiempo fue de 60 minutos. En el caso de la TFF realizada utilizando un filtro de 4,5 micrones, aproximadamente el 99% de los eritrocitos (designados "RBC", barras negras) se elimino del retenido, mientras que se retuvo aproximadamente el 90% de los leucocitos introducidos (designados "WBC", barras rayadas claras). En el caso del filtro de 8 micrones, se elimino aproximadamente el 98% de los eritrocitos introducidos, pero solamente se retuvo el 4% de los leucocitos, lo que demuestra que el uso de un filtro de 4,5 micrones promovio una eliminacion de eritrocitos equivalente a la del filtro con un tamano de poro de 8 micrones, aunque se produjo una mayor retencion de leucocitos (designados "WBC").
Ejemplo 5: Enriquecimiento selectivo de leucocitos con eliminacion de plaquetas y plasma
En este ejemplo, se sometieron a TFF las muestras del producto de la leucoferesis en el dispositivo que se describe en el Ejemplo 1 a diversas condiciones y se evaluo la eliminacion selectiva de plaquetas y plasma. Con respecto a la Tabla 1, experimentos 1 a 6, se sometieron 45 ml de producto de la leucoferesis a TFF con un tamano de poro del filtro de 4,5 micrones o de 8 micrones, siendo el mdice de recirculacion (mdice de entrada) de 1690 o 1880 ml/min y el mdice de filtracion de 15 ml/min. La filtracion se realizo durante 60 o 90 minutos, segun lo indicado. Tras la TFF, el retenido se sometio a ensayo para determinar la presencia de leucocitos, plaquetas y plasma. En todos los experimentos, entre aproximadamente el 2 y el 100% de las plaquetas introducidas y entre aproximadamente el 97 y el 99% del plasma introducido se eliminaron del retenido, con independencia del tamano de poro (4,5 micrones u 8 micrones), del mdice de recirculacion (entrada) (1690 o 1880 ml/min), y del tiempo (60 min o 90 min) En el caso del experimento 7, se sometio un producto completo de la leucoferesis (250 ml) a TFF utilizando un tamano de poro de 4,5 micrones, un mdice de recirculacion (entrada) de 1690 ml/min y un mdice de filtracion de 15 ml/min, durante 90 minutos. Tras la TFF se sometio a ensayo el retenido y se concluyo que contema aproximadamente el 84% de los leucocitos introducidos, pero solamente el 2% de las plaquetas introducidas y el 3% del plasma introducido.
Tabla 1: Efecto del tamano de los poros del filtro sobre la retencion de PBMC
- Entrada de leucoferesis Poro Tamano indice de recirculacion Tiempo % Entrada de WBC en retenido % Entrada de plaquetas en retenido % Entrada de plasma en retenido
- Exp 1
- 45 ml 4,5 pm 1690ml/min 60 mm 88 2,0 2,0
- Exp 2
- 45 ml 4,5 pm 1690 ml/min 60 min 67 8,0 20
- Exp 3
- 45ml 4,5 pm 1690 ml/min 60 min 79 3,0 1,0
- Exp 4
- 45 ml 4,5 pm 1888ml/min 60 min 92 0,0 1,0
- 45 ml 8 pm 1888 ml/min 60 min 4 0,0 1,0
- Exp 5
- 45 ml 4,5 pm 1690 ml/min 60 min 130 3,0 3,0
- 45 ml 4,5 pm 1880 ml/min 60min 47 3,0 2,0
- Exp 6
- 45 ml 4,5 pm 1690 ml/min 60 min 80 1,0 2,0
- 45 ml 4,5 pm 1690 ml/min 90 min 72 0,2 2,0
- Exp 7
- 250 ml 4,5 pm 1690 ml/min 90 min 84 2,0 30
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Estos experimentos demuestran que la TFF elimina la mayor parte de las plaquetas y el plasma con multiples tamanos de poro (4,5 micrones u 8 micrones), mdices de recirculacion (entrada) (1690 o 1880 ml/min), volumenes de la muestra de leucoferesis (45 ml a 250 ml) y tiempos (60 min a 90 min).
Ejemplo 6: Enriquecimiento selectivo en leucocitos de productos de la leucoferesis enteros
Para confirmar que esta realizacion del dispositivo TFF obtendna unos resultados reproducibles utilizando unos volumenes de muestra mayores, se utilizo un dispositivo TFF designado dispositivo 5X con 250 ml de producto de la leucoferesis (una unidad entera), utilizando un filtro con un tamano de poro de 4,5 micrones, un mdice de recirculacion de 1680 ml/min y un mdice de filtracion de 15 ml/min y se comparo con el volumen inferior introducido. Con respecto a la Figura 9, la TFF se realizo durante 90 minutos con tres productos de la leucoferesis distintos y en dfas diferentes. Entre el 80 y el 95% de los eritrocitos se elimino del retenido y se retuvo entre aproximadamente el 80 y el 100% de los monocitos introducidos. Tras la TFF de Exp 1 en la Figura 9, el retenido tambien se sometio a ensayo y se concluyo que contema aproximadamente tan solo el 2% de las plaquetas introducidas y el 3% del plasma introducido (designado Exp 7 en la Tabla 1). Estos datos demostraron que la TFF puede enriquecer en leucocitos de forma reproducible y preferiblemente eliminar los eritrocitos, las plaquetas y el plasma del retenido.
Ejemplo 7: Dispositivo TFF para enriquecer selectivamente en monocitos una preparacion de sangre
Ademas del enriquecimiento en leucocitos, se testo el enriquecimiento selectivo en monocitos de preparaciones de sangre utilizando un aparato de TFF. Esta realizacion concreta del dispositivo comprendfa una configuracion invertida ("tipo IV") disenada para modificar la dinamica del flujo, alterando la direccion de la fuerza gravitacional a traves de la membrana (Figura 1C). Se sometieron 235 ml de producto de la leucoferesis a TFF durante 90 minutos, utilizando un filtro con un tamano de poro de 4,5 micrones, un mdice de recirculacion (entrada) de 1.680 ml/min y un mdice de filtracion de 15 ml/min. Tras 60 minutos de TFF, con el objeto de incrementar el filtrado efectivo, el volumen no valido se redujo a unos 120 ml. La muestra introducida, el retenido y el filtrado se sometieron a ensayo para determinar el contenido celular. Mientras que la muestra introducida contema un 32% de monocitos y un 65% de linfocitos, se averiguo que el retenido contema aproximadamente un 71% de monocitos frente a un 22% de linfocitos. El filtrado contema un 15% de monocitos frente a un 83% de linfocitos. (Vease la Tabla 2)
Tabla 2: Enriquecimiento de monocitos utilizando la configuracion de TFF de tipo IV (invertida)
- Entrada Retenido Filtrado
- N° monocitos.(x 109)
- 2,85 1,37 0,861
- N° linfocitos (x 109)
- 5,67 0,428 4,86
- N° granulocitos (x 109)
- 0,133 0,0571 0,0797
- N° RBC (x109)
- 64,6 1,37 78,9
- N° WBC (x109)
- 8,78 1,93 5,86
- % Monocitos
- 32,46 71,1 14,7
- % Linfocitos
- 64,54 22,17 82,88
- % Granulocitos
- 0,0151 2,96 1,36
- No lisados (x 109)
- 73,4 3,30 84,8
Ejemplo 8: Generacion de celulas dendnticas a partir de celulas aisladas mediante TFF.
En este ejemplo, la poblacion de celulas que se aislo y purifico mediante TFF se cultivo en condiciones estandar para la maduracion de celulas dendnticas a partir de precursores de celulas dendnticas monocfticas. La poblacion de celulas aisladas mediante TFF contema aproximadamente un 58,6% de monocitos, un 22% de linfocitos y un 12,5% de granulocitos. Esta mezcla de celulas se introdujo en una bolsa para el cultivo de tejidos en medios X-Vivo15 y 500 U de IL-4 y de GM-CSF. Despues de cinco dfas, se recogio aproximadamente el 50% de las celulas, se tino para detectar los marcadores DC y se analizo mediante citometna de flujo. El otro 50% aproximadamente de las celulas se expuso a agentes de maduracion, BCG (2,8 x 105 pfu/ml) e IFNy (1000 U/ml). Despues de 24 h tambien se recogieron y analizaron esas celulas de la misma manera. La Tabla 3 muestra los resultados de estos analisis. Los valores proporcionados representan el porcentaje de celulas positivas entre las celulas dendnticas, es decir tras la captura de las celulas grandes.
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Tabla 3. Deteccion de marcadores de superficie celular sobre celulas dendnticas inmaduras y maduras.
- Marcador
- Dendnticas inmaduras (% positivo) Dendnticas maduras (% positivo)
- CD14
- 10 2
- CD11c
- 99 96
- CD1a
- 70 69
- CD80
- 75 74
- CD83
- 7 34
- CD86
- 90 89
- CD541
- 100 98
- MHC II1
- 56 72
Estos marcadores demuestran un incremento significativo de la intensidad de fluorescencia media (MFI) entre las celulas positivas despues de la maduracion.
Basandose en los parametros de la dispersion frontal y la dispersion lateral del analisis de la citometna de flujo, se determino que la poblacion de celulas dendnticas inmaduras contema aproximadamente el 71% de DC vivas, el 21% de los linfocitos y el 7% de otras celulas (fundamentalmente celulas muertas de origen desconocido). La poblacion de celulas dendnticas maduras contema un 61% de DC vivas, un 21% de linfocitos y un 15% de otras celulas. Estos resultados demostraron que los monocitos purificados directamente del material de la leucoferesis mediante TFF se pueden convertir eficazmente en DC utilizando condiciones de cultivo estandar para la maduracion de las celulas dendnticas.
Ejemplo 8: Aislamiento de monocitos sobre granulos de vidrio
Una poblacion enriquecida en leucocitos es aislada mediante TFF conforme a cualquiera de los ejemplos anteriores. Durante la TFF, la solucion tampon es sustituida por medios AIM-V (Gibco-Life Science) que contienen un 1% de plasma autologo inactivado por calor (medios de union). Los granulos de vidrio (20 gramos) se preparan mediante un doble lavado en medios de union y posteriormente se colocan en una jeringa de 60 ml dotada de un material sinterizado para retener los granulos a fin de que formen un lecho de columna. (Alternativamente, se pueden utilizar granulos microportadores Plastic Plus (granulos de copolfmero de estireno tratado de SoloHill Engineering, Inc.) o granulos microportadores HilleX (granulos de copolfmero de estireno de SoloHill Engineering, Inc.). A continuacion, se retiran los medios de union del lecho de columna por flujo por gravedad. La poblacion enriquecida en leucocitos de la TFF se aplica a la columna y se recoge cualquier flujo resultante. Se anaden medios de union para proporcionar una pequena capa de lfquido por encima del lecho de columna. La columna con las celulas se incuba a 37°C durante 30 minutos.
Tras la incubacion, se abre el puerto de la columna y se recoge el flujo resultante. A continuacion, se lava el lecho de columna en seis ocasiones con medios de union (35 ml/lavado) administrados y retirados varias veces a traves del puerto de la columna, para permitir una suave resuspension de los granulos. Estos lavados van seguidos de dos lavados con solucion tampon de fosfato ("PBS"). Se obtuvieron los recuentos de celulas para todos los lavados y el flujo original, y se analizaron utilizando los parametros de dispersion frontal y dispersion lateral de la citometna de flujo (FACS) para determinar el porcentaje de monocitos presente. Tras completar los lavados, los monocitos unidos se eluyeron de los granulos utilizando PBS/0,4 % EDTA (en peso), seguido de un lavado mas con PBS. Las celulas que se obtienen en estas fracciones son analizadas de la misma manera que en los lavados. Las fracciones ricas en monocitos se agrupan.
Ejemplo 9: Diferenciacion de celulas dendnticas a partir de monocitos eluidos de granulos de vidrio
Los monocitos se lavan en dos ocasiones con 30 ml de PBS y se resuspenden en medios de cultivo (X- VIVO 15 (Biowhittaker Corp.) con 500 U de GM-CSF/ml y 500 U de interleuquina 4/ml). Una parte (2/3) de la suspension de celulas es transferida posteriormente a un biorreactor giratorio (Synthecon) y se cultiva durante 6 dfas a 37°C en un entorno humidificado conteniendo un 5% de CO2. Tras el cultivo, la poblacion de celulas comprende aproximadamente un 70% de celulas dendnticas inmaduras, en base al tamano de las celulas, su granularidad y los marcadores de la superficie celular.
Ejemplo 10: Activacion de celulas dendnticas inmaduras con antfgeno prostatico espedfico
Los monocitos son aislados de un paciente con cancer de prostata, tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Los monocitos se cultivan en bolsas para el cultivo de tejidos en medios de cultivo
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para tejidos X-VIVO 15 complementados con GM-CSF e interleuquina 4 (500 U/ml de cada) durante seis d^as a 37°C. A continuacion, las celulas dendnticas inmaduras resultantes se exponen a antigeno prostatico espedfico (PSMA) (aislado tal y como se describe en la Patente estadounidense n° 5.788.963) anadido a los medios de cultivo. Despues las celulas dendnticas inmaduras se diferencian para formar celulas dendnticas maduras utilizando un agente de maduracion. Las celulas dendnticas maduras (activadas) se anaden a un ensayo de proliferacion de linfocitos T. Los cultivos de linfocitos T son incubados en una incubadora humidificada a 37°C complementada con un 5% de CO2 durante cinco dfas, antes de anadir 1 |jCi 3H-timidina/por pocillo de una placa de microtitulacion. Tras una incubacion durante 24 horas, las celulas se recogen en una cosechadora de celulas semiautomatica (Skatron, Stevina, Va.) y se determina la radiactividad de las celulas cosechadas. Se evalua la proliferacion de linfocitos T mediante la medicion de la incorporacion media de 3H-TdR.
Ejemplo 11: Capacidad de las celulas dendnticas maduras cultivadas para presentar antfgeno
Para evaluar la capacidad de las celulas dendnticas maduras cultivadas para presentar antigeno y estimular linfocitos T autologos del mismo paciente, se realizaron ensayos de proliferacion de linfocitos T, tal y como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 10). En estos experimentos se selecciono el toxoide tetanico como antigeno representativo, con el fin de determinar si los linfocitos T de memoria de los pacientes se pueden activar in vitro. Los linfocitos T autologos cultivados con las celulas dendnticas del paciente y el toxoide tetanico proliferaran a niveles significativamente mayores que los niveles de partida (en ausencia de celulas dendnticas) y a unos niveles significativamente mayores que los linfocitos T cultivados con celulas dendnticas maduras (activadas) sin toxoide tetanico (es decir, mostrando una reaccion leucocitaria mixta autologa). Por tanto, la presentacion de toxoide tetanico por las celulas dendnticas resulta util para la proliferacion de linfocitos T.
Ejemplo 12: Estimulacion de linfocitos T autologos
Las celulas dendnticas maduras (activadas) espedficas para el cancer de prostata se utilizaron para estimular los linfocitos T autologos de un paciente con cancer de prostata. Se utilizo un lisado celular crudo de celulas LNCaP, una lmea de celulas de cancer de prostata metastasico, como antfgeno del cancer de prostata representativo en un ensayo de proliferacion de linfocitos T, descrito en terminos generales en la Patente USA n° 5.788.963. Se observo un incremento significativo en la incorporacion de 3HTdR cuando se incluyeron tanto celulas dendnticas maduras activadas como lisados de LNCaP en los cultivos de linfocitos T.
Ejemplo 13: Administracion de linfocitos T autologos estimulados a un sujeto
Los linfocitos T se prepararon mediante leucoferesis de un sujeto. Los linfocitos T se pusieron en contacto con celulas dendnticas maduras activadas. Las celulas dendnticas maduraron despues de entrar en contacto con un lisado celular crudo de celulas LNCaP, una lmea de celulas de cancer de prostata metastasico. Tras el contacto, los linfocitos T y las celulas dendnticas se cultivaron y expandieron. Los linfocitos T activados y expandidos se administraron al sujeto a una dosis aproximada de entre 107 y 5 x 109 celulas por dosis.
Ejemplo 14: Conversion de monocitos en celulas madre CD34+
El porcentaje de celulas CD34+ en la sangre periferica es extremadamente bajo, oscilando aproximadamente entre un 0,01% y un 0,1%. Las celulas CD34+ fueron reconocidas como el tipo de celulas necesario para el trasplante de la funcion hematopoyetica. Los monocitos se pueden aislar de la sangre periferica, utilizando el dispositivo y los metodos anteriormente descritos, produciendo entre 1 y 2 X 109 monocitos. A continuacion, estas celulas se pueden cultivar en 50 ng/ml de M-CSF en un medio conteniendo suero fetal bovino para obtener celulas CD34+. Los cultivos se deben realizar en un entorno no adhesivo, como las bolsas de cultivo de TEFLON®. Los cultivos en matraces para el cultivo de tejidos estandar fabricados en poliestireno no evolucionan a celulas CD34+. El analisis de las celulas grandes del cultivo revelo que las celulas CD34+ se encontraban en el rango de tamano mas grande.
Tabla 4. Expresion de CD34 sobre monocitos tras cultivo en M-CSF
- Porcentaje de celulas CD34+
- Cultivo en bolsa de cultivo
- 21
- Captura de celulas grandes
- 58
- Cultivo en matraz
- 6
- Captura de celulas grandes
- 11
Las celulas CD34+ preparadas con este metodo se pueden utilizar en trasplantes para reconstituir la medula osea del receptor o se pueden cultivar posteriormente en presencia de otras citoquinas con el fin de generar celulas endoteliales para su uso en el tratamiento, por ejemplo, del infarto de miocardio y
similares.
Los ejemplos proporcionados en el presente se ofrecen con miras a ilustrar, sin caracter limitador, el ambito de aplicacion de la invencion reivindicada. Otras variantes de la invencion resultaran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica y estan incluidas en las reivindicaciones adjuntas.
Claims (58)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un dispositivo de filtracion de flujo tangencial para preparar una poblacion de celulas enriquecida en leucocitos, eliminando de forma selectiva componentes sangumeos como el plasma, las plaquetas y eritrocitos, que se compone de:una unidad colectora (1) que dispone de una camara de flujo cruzado cilmdrica (3) y una camara de filtrado (4) separada por un filtro circular (5) dispuesto entre ellas, donde el filtro (5) comunica el fluido con la camara de flujo cruzado (3) y la camara de filtrado (4);el diametro del filtro es sustancialmente igual al diametro de la camara de flujo cruzado;la camara de flujo cruzado cilmdrica (3) tiene una entrada (6) y una salida (7), donde la entrada (6) se encuentra adyacente a la superficie de retenido del filtro para introducir una muestra de componentes sangumeos que contiene leucocitos en la camara de flujo cruzado (3) y en paralelo a la superficie de retenido del filtro (5); y la salida (7) se encuentra adyacente al centro del filtro (5) y perpendicular a la superficie de retenido del filtro (5);una bomba (14) para bombear el fluido hasta la camara de flujo cruzado (3) a traves de la entrada (6) y configurada para introducir el fluido en la camara de flujo cruzado cilmdrica a una velocidad entrada de entre 5 y 100 veces la velocidad de filtracion;donde esta disposicion hace que el flujo de fluido entre en espiral hacia el centro del filtro generando un remolino en el fluido y el filtro (5), que tiene un tamano de poro medio de entre 3 y 8 micrones, de forma que el flujo de la muestra que pasa a traves del filtro (5) enriquece la muestra de componentes sangumeos en leucocitos.
- 2. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 1 que comprende tambien:una unidad de recuperacion (2) que comprende una entrada (10) y una salida (11), la camara de flujo cruzado (3) y la unidad de recuperacion (2) se encuentran interconectadas en forma de bucle, donde la entrada (6) de la camara de flujo cruzado comunica el fluido con la salida (11) de la unidad de recuperacion, y la salida (7) de la camara de flujo cruzado comunica el fluido con la entrada (10) de la unidad de recuperacion.
- 3. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 2, donde la unidad de recuperacion comprende asimismo una entrada de la muestra (12) y una entrada de lavado (13).
- 4. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 3 que comprende asimismo una fuente de fluido de sustitucion que comunica el fluido con la entrada de lavado (13).
- 5. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 4, donde el fluido de reemplazo es una solucion tampon isotonico o medios de cultivo de tejidos.
- 6. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende tambien un dispositivo de procesamiento celular que comunica el fluido con la unidad colectora.
- 7. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 6, donde el dispositivo de procesamiento celular contiene granulos.
- 8. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 6 o 7, donde el dispositivo de procesamiento celular comprende un medio para el cultivo de una poblacion de celulas enriquecida en leucocitos.
- 9. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 8, donde el medio para el cultivo comprende: un recipiente que contiene un primer puerto y un segundo puerto;un substrato que se adhiere a los precursores de celulas dendnticas monocfticas, que comunica el fluido con el primer puerto y el segundo puerto;un tamiz para retener el sustrato en el recipiente y que tiene un tamano de poro suficiente para permitir el paso de los precursores de celulas dendnticas monocfticas y celulas dendnticas;una lmea de drenaje que comunica el fluido con el primer puerto y una lmea colectora que comunica el fluido con el primer puerto.
- 10. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 9 que comprende asimismo una pluralidad de fuentes de fluido que comunican el fluido con el primer puerto o el segundo puerto.
- 11. El dispositivo de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10 que comprende asimismo un recipiente de cultivo de tejidos cerrado y adaptado para recibir de asepticamente los precursores de las celulas dendnticas monocfticas.
- 12. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 11, donde el recipiente de cultivo de tejidos cerrado es una bolsa de cultivo, un matraz o un biorreactor.5101520253035404550
- 13. EI dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde las fuentes de fluido comprenden medios aglutinantes, solucion tampon de lavado y solucion tampon de elucion.
- 14. EI dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 que comprende asimismo una bomba que comunica el fluido con la pluralidad de fuentes de fluido y el primer puerto.
- 15. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende tambien un medio de control de temperatura para mantener el sustrato a una temperatura predeterminada.
- 16. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 15, donde el medio de control de temperatura es un calentador.
- 17. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el tamano de poro del filtro es de entre unos 3 y 7 micrones, o de entre unos 3 y unos 5,5 micrones.
- 18. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende tambien una fuente de componentes sangumeos que comunica el fluido con la entrada de la camara de flujo cruzado.
- 19. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 18, donde la fuente de componentes sangumeos es un dispositivo de leucoferesis.
- 20. Un dispositivo de flujo tangencial de conformidad con la reivindicacion 1 para enriquecer una muestra de componentes sangumeos con leucocitos, donde el dispositivo comprende un medio para reducir la velocidad de filtracion (15) a traves del filtro; ydonde el filtro (5) tiene un tamano de poro de entre 3 y 7 micrones.
- 21. El dispositivo de conformidad con la reivindicacion 20, que comprende tambien un medio para proporcionar una concentracion predeterminada de celulas sangumeas en la muestra, donde la concentracion predeterminada de celulas sangumeas es de 107 a 1010 celulas por miftmetro.
- 22. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde la camara de flujo cruzado se encuentra por encima del filtro y la camara de filtrado.
- 23. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde la camara de flujo cruzado se encuentra por debajo del filtro y la camara de filtrado.
- 24. Un metodo para separar leucocitos de una muestra de componentes sangumeos de un sujeto, donde la muestra contiene leucocitos, y el metodo consiste en lo siguiente:(i) introducir la muestra en una unidad colectora (1) del dispositivo como la mencionada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, a traves de una entrada (6) de la unidad colectora;(ii) someter la muestra a flujo cruzado de forma sustancialmente paralela a un filtro (5) que tiene un tamano de poro de entre unos 3 y 8 micrones;(iii) someter el fluido a filtracion a traves del filtro (5); y(iv) eliminar de forma selectiva los componentes sangumeos no leucocitarios de la muestra para formar una poblacion de celulas enriquecida en leucocitos.
- 25. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 24, que consiste tambien en lo siguiente:preparar la muestra del sujeto por leucoferesis, centrifugacion por densidad, lisis diferencial, filtracion o preparacion de una capa leucocitaria para su introduccion en la unidad colectora (1).
- 26. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 o 25, donde los componentes sangumeos no leucocitarios incluyen plasma, plaquetas y/o eritrocitos.
- 27. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, que consiste asimismo en repetir los pasos (i), (ii) y (iii) al menos dos veces para formar la poblacion de celulas enriquecida en leucocitos.
- 28. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde la poblacion de celulas enriquecida comprende al menos un 20% de leucocitos o al menos un 60% de leucocitos.
- 29. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, que consiste asimismo en lavar la poblacion de celulas enriquecida en leucocitos con una solucion de lavado.
- 30. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, que consiste asimismo en preparar precursores de celulas dendnticas monocfticas de la poblacion de celulas enriquecida en leucocitos.
- 31. El metodo de conformidad con la reivindicacion 30, donde el aislamiento de precursores de celulas dendnticas monocfticas consiste en lo siguiente:poner en contacto un sustrato que se adhiere a los precursores de celulas dendnticas monocfticas con la poblacion de celulas enriquecida en leucocitos;5101520253035404550permitir que los precursores de celulas dendrfticas monocfticas de la poblacion de celulas se adhieran de forma reversible al substrato para formar complejos que comprenden precursores de celulas dendrfticas monocfticas y sustrato;separar los complejos de los leucocitos no adherentes para obtener complejos que comprenden precursores de celulas dendrfticas monocfticas; ycultivar los precursores de celulas dendrfticas monocfticas para la diferenciacion de los precursores que forman celulas dendrfticas inmaduras o maduras.
- 32. El metodo de conformidad con la reivindicacion 31, donde los precursores de celulas dendrfticas monocfticas se eluyen del sustrato antes de proceder al cultivo o se cultivan sobre el sustrato.
- 33. El metodo de conformidad con la reivindicacion 32, donde el sustrato comprende vidrio, poliestireno, plastico o microgranulos de poliestireno recubiertos de vidrio.
- 34. Un metodo para enriquecer una muestra de componentes sangumeos en leucocitos, que consiste en:1) introducir la muestra en un dispositivo de filtracion de flujo tangencial (TFF), como el mencionado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21;2) hacer recircular la muestra a traves de la unidad TFF a una velocidad de entrada predeterminada y a una velocidad de filtracion predeterminada, siendo la velocidad de entrada predeterminada al menos cinco veces superior a la velocidad de filtracion predeterminada, y donde la velocidad de filtracion predeterminada es inferior a la velocidad de filtracion sin resistencia del filtro; y3) aislar una poblacion de celulas enriquecida en leucocitos.
- 35. El metodo de conformidad con la reivindicacion 34, donde la poblacion de celulas enriquecida se encuentra sustancialmente libre de componentes sangumeos no leucocitarios.
- 36. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 34, que consiste tambien en lo siguiente:extraer sangre de un sujeto y preparar la muestra de sangre mediante leucoferesis, centrifugacion por densidad, lisis diferencial, filtracion o preparacion de una capa leucocitaria.
- 37. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, donde los componentes sangumeos no leucocitarios incluyen plasma, plaquetas y/o eritrocitos.
- 38. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, donde la poblacion de celulas enriquecida comprende aproximadamente al menos un 20% de leucocitos o al menos un 60% de leucocitos.
- 39. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38, que consiste asimismo en lavar la poblacion de celulas enriquecida con una solucion de lavado.
- 40. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, que consiste asimismo en preparar celulas dendrfticas a partir de la poblacion de celulas enriquecida.
- 41. El metodo de conformidad con la reivindicacion 40, donde las celulas dendrfticas se preparan como sigue:poner en contacto un sustrato que se adhiere a los precursores de celulas dendrfticas monocfticas con la poblacion de celulas enriquecida;permitir que los precursores de celulas dendrfticas monocfticas de la poblacion de celulas enriquecida se adhieran de forma reversible al substrato para formar complejos que comprenden precursores de celulas dendrfticas monocfticas y sustrato;separar los complejos de los leucocitos no adherentes para obtener complejos que comprenden precursores de celulas dendrfticas monocfticas; ycultivar los precursores de celulas dendrfticas monocfticas para la diferenciacion de los precursores en celulas dendrfticas inmaduras o maduras.
- 42. El metodo de conformidad con la reivindicacion 41, donde el sustrato comprende vidrio, poliestireno, plastico o microgranulos de poliestireno recubiertos de vidrio.
- 43. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 41 o 42, que consiste tambien en aislar las celulas dendrfticas inmaduras o maduras.
- 44. El metodo de conformidad con la reivindicacion 37, donde los monocitos se cultivan con citoquinas que promueven la diferenciacion de monocitos en celulas dendrfticas.
- 45. El metodo de conformidad con la reivindicacion 44, donde las citoquinas son GM-CSF, GM-C-SF e IL- 4.
- 46. El metodo de conformidad con las reivindicaciones 44 o 45, donde las celulas dendrfticas maduran51015202530para ser celulas dendnticas maduras.
- 47. EI metodo de conformidad con la reivindicacion 45, donde las celulas dendnticas se cultivan con un antigeno en condiciones conducentes al procesamiento del antigeno para formar celulas dendnticas cargadas de antigeno.
- 48. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 47, donde el filtro tiene un tamano de poro de aproximadamente entre 3 y 5,5 micrones.
- 49. El metodo de conformidad con la reivindicacion 48, donde los leucocitos comprenden celulas CD34+.
- 50. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 o 49, donde la muestra de componentes sangumeos procede de un donante que ha sido tratado con al menos un agente movilizador de celulas madre.
- 51. El metodo de conformidad con la reivindicacion 50, donde el agente movilizador de celulas madre es G-CSF o ciclofosfamida.
- 52. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 51, que consiste asimismo en el enriquecimiento de los leucocitos en celulas CD34+.
- 53. El metodo de conformidad con la reivindicacion 52, donde el enriquecimiento de leucocitos en celulas CD34+ comprende el uso de un anticuerpo anti-CD34 conjugado con granulos magneticos.
- 54. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 53, que consiste tambien en la expansion de las celulas CD34+ ex vivo.
- 55. El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 a 51, que consiste asimismo en la preparacion de celulas madre pluripotentes obtenidas de monocitos a partir de la poblacion de celulas enriquecida en leucocitos.
- 56. El metodo de conformidad con la reivindicacion 55, que consiste asimismo en inducir la diferenciacion de un progenitor o celula madre.
- 57. El metodo de conformidad con la reivindicacion 48, que consiste asimismo en inducir la transdiferenciacion de una celula diferenciada.
- 58. El uso de un dispositivo de filtracion de flujo tangencial de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para preparar una poblacion de celulas enriquecida en leucocitos mediante la eliminacion selectiva de componentes sangumeos como plasma, plaquetas y eritrocitos.
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