KR20050024342A - 백혈구 농축을 위한 접선방향 유동 여과 장치 및 방법 - Google Patents

백혈구 농축을 위한 접선방향 유동 여과 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백혈구가 아닌 혈액 성분들을 제거하여 백혈구들을 위한 혈액 성분들의 혼성 혼합물을 농축하는 접선방향 유동 여과 장치 및 방법을 제공한다. 일 특정 실시예에서, 상기 장치는 단핵구가 풍부한 조성을 제공한다. 일 실시예에서는 여과물 챔버(4)로부터 미세기공 필터(5)에 의해 분리된 교차류 챔버(3)를 갖는 제거기 유닛(1)을 포함하고, 상기 제거기 유닛(1)은 접선방향 유동 입구(6), 백혈구가 풍부한 유체를 위한 유체 출구(7) 및 여과물 출구(8)를 또한 갖는다.

Description

백혈구 농축을 위한 접선방향 유동 여과 장치 및 방법{Tangential flow filtration devices and methods for leukocyte enrichment}
본 출원은 2002년 6월 19일 출원된 미국 임시 특허출원 제 60/390,730호의 우선권을 주장하며, 이는 본원에 참고문헌으로서 포함된다.
백혈구가 풍부한 혈액 세포군은 종종 연구 또는 치료에 사용하기 위해 요구된다. 전형적인 백혈구 출처는 말초 전혈(whole peripheral blood), 림프구 채집술(leukopheresis) 또는 성분 채집술(apheresis)의 결과물, 탯줄(umbilical cord) 혈액과 같은 덜 일반적인 출처가 포함된다. 백혈구의 농축은 몇가지 방식으로 이루어질 수 있다. 전형적인 방법에는 밀도 층 그레디언트(density step gradient; 예를 들어, 피콜-하이패크(FICOLL-HYPAQUE??), 콜로이드성 실리카 등), 수비(elutriation), 원심분리, 저장 쇼크(hypotonic shock)에 의한 적혈구의 용해, 및 이들 방법들의 다양한 조합이 포함된다. 이들 방법 각각에는 단점들이 있으며, 그중 하나가 농축 단계가 수행된 후에 수고스럽게 세정 단계들이 필요하다는 점이다.
농축(enrichment) 후에, 세포들은 전형적으로 반복적인 처리에 의해 세정된다. 이 단계들은 일반적으로 원심분리기 튜브로 농축된 세포 현탁액을 배치하고 원심분리기를 사용하여 튜브 바닥으로 세포들을 침전시키는 것을 포함한다. 튜브는 원심분리기로부터 제거되고, 상청액(supernatant)은 침전된 세포들로부터 기울여 따라진다. 세정액이 튜브에 첨가되고, 세포 덩어리(cell pellet)가 재부유(re-suspension)된다. 이들 단계들은 전형적으로 2 내지 4회 반복된다.
이러한 세정 처리의 한가지 단점은 순차적인 재부유 및 원심분리가 세포의 생활력(viability)을 감소시키고 세포의 용해를 증가시킬 수 있다는 점이다. 원심분리에 의한 세정의 다른 단점은 박테리아 또는 다른 감염원들이 세포를 오염시킬 가능성이다. 모든 재료가 살균된 상태를 유지한다해도, 원심분리기 튜브들을 반복하여 개봉하고, 피펫(pipette)과 세정액의 병을 공기에 노출하면 오염될 수 있다. 이 오염의 위험은 몇몇 의료 조정국(regulatory agencies)들에게는 충분히 중요하여 세포 취급에 대해 "밀폐된" 시스템만을 사용할 것을 요구한다.
여과 방법들은 차후의 용도를 위해 다른 혈액 성분을 유지하면서 혈액으로부터 백혈구를 제거하는데 사용되어왔다. 이러한 방법들은 일반적으로 회복불가능한 형태로 필터로 백혈구를 걸러 내면서, 다른 혈액 성분들은 필터를 지나 채집 용기로 가게 한다. 예를 들어, 필터들은 수혈(blood transfusion) 후에 동종면역(alloimmune) 반응의 발생이 최소화되도록 혈액으로부터 백혈구를 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 제거는 전형적으로, 매트 플라스틱 섬유 메쉬(matted plastic fiber mesh)로 만들어진 필터들을 사용하여 이루어진다. 메쉬는 일반적으로 충분한 깊이를 갖는 그물 매트릭스(reticulated matrix)로 백혈구를 걸러내어 세포들이 필터의 깊이방향에 걸쳐 걸려, 만약 백혈구들이 편평한 표면 상에 걸러질 경우 일어날 수 있는 막힘이 필터에 일어나지 않도록 배치된다.
세포들을 물리적으로 걸러내는 것에 부가하여, 필터의 재료 및 넓은 표면적은 백혈구들이 표면에 비가역적으로 고착될 수 있게 한다. 그 결과, 필터에 고착되고 걸러진 조합물은 수혈 치료 전에 백혈구들을 폐기하기 위해 높은 효율로 제거하는 수단을 만들어낸다. 그러나, 요구되는 세포들이 백혈구들일 때, 이러한 여과 방법은 유용하지 않다.
접선방향 유동 여과(TFF) 또는 "교차류(cross-flow)" 여과는 다양한 입자들의 분류에 유용하였던 방법이다. TFF는 다공성 막 필터의 표면에 평행한 유체의 운동에 의존한다. 막의 기공(pore)들은 기공들보다 작은 유체 내의 입자들 및 유체가 통과할 수 있게 한다. 부가하여, 필터에 평행한 유체의 교차류(또는 "접선방향 흐름")는 필터 표면 상의 기공들보다 큰 입자들이 축적되는 것을 방지한다.
TFF는 다양한 재료들의 대량 분리(gross separation)에 사용되어 왔다. 약학 분야에서 접선방향 유동 여과를 사용하는 것이 주사용 살균수의 여과, 용매 시스템의 명료화(clarification), 액체배치(broth) 및 박테리아 배양물로부터 효소들을 여과하는 것을 포함하여, 제노베지(Genovesi)(J. Parenter. Aci. Technol., 37:81, 1983)에 의해 검토되었다. 마리나치오(Marinaccio) 등(WO 85/03011호)은 혈장분리반출술(plasmapheresis)을 위해 혈액으로부터 미립자 혈액 성분을 제거하는데 사용하기 위한 공정을 보고하였고, 로빈슨 등(미국 특허 제 5,423,738호)은 혈액에서 혈장을 제거하기 위해 TFF를 사용하여 혈구와 혈소판을 환자에게 재수혈할 수 있게 하는 것을 설명한다.
다른 용도에서, TFF는 이스트 세포(yeast cell)와 다른 부유 고형물과 같은 미립자를 특히 제거하기 위한 맥주 여과(EP 0 208 450)에 대해 보고되어 있다. 코스(Kothe) 등(미국 특허 제 4,644,056호)은 우유 또는 초유(colostrum)로부터 면역글로블린(immunoglobulin)을 정제하는데 TFF를 사용하는 것을 공개하고, 카스티노(미국 특허 제 4,420,398호)는 바이러스 입자들, 세포들 및 항바이러스 물질을 담고 있는 액체배지로부터 인터페론과 같은 항바이러스 물질들을 분리하는데 사용하는 것을 공개한다. 유사하게, TFF는 세포 잔해로부터 박테리아 효소들을 분리하는데 사용되었다.(쿼크 등의, 효소 미생물 기술, 6:201, 1984.) 부가하여, 접선방향 유동 여과 유닛들은 배양 매체 내에 부유하는 세포들의 집중에 사용되었다.(예를 들어 래드릿(Radlett)의, J.Appl. Chem. Biotechnol., 22:495, 1972.)
TFF는 사이즈에 따라 리포좀(liposome)과 지질(lipid) 입자들을 분리하는 것으로 최근에 보고되어 있다.(렝크(Lenk) 등의 미국 특허 제 5,948,441호) TFF는 이러한 입자들의 혼성 군들로부터 정의된 사이즈 범위를 갖는 리포좀 및 지질 입자들을 형성 및 격리할 수 있다. (렝크의 상기 문헌 참조).
그러나, TFF는 생물학적 액체들의 대량 분류 및 예를 들어 리포좀의 분리에 사용되어 왔지만, 정의된 특성들을 갖는 상이한 살아있는 세포 군들의 분리에 TFF를 사용하는 것은 당업계에 인식되어 있지 않다. 특히, 무균상태(sterility), 세포 생활력, 조혈 분화 가능성, 면역요법적 세포 활성도를 유지하면서, 다른 혈구들로부터 (예를 들어, 단핵구(monocyte), CD34+ 조혈 줄기(hematopoietic stem) 및 전구체(precursor) 세포, 전구체 가지 세포(dendritic precursor cell) 등과 같은) 백혈구 군들을 선택적으로 분리하는 것에 관련한 독특한 문제들은 아직 처리되어 있지 않다. 부가하여, 예를 들어 중첩되는 사이즈 범위를 갖는 군들과 같은 다른 세포 군들을 제거하는 것은 현재의 접근방법에 의해서는 해결되지 않는다.
그러므로, 무균상태, 세포 생활력, 분화 가능성, 및 면역요법적 세포 활성도를 보존하면서, 혈장, 적혈구, 및/또는 혈소판을 포함하는 다른 혈액 성분들로부터 백혈구를 선택적으로 농축하기 위한 부가적인 장치 및 방법들이 당업계에 여전히 필요하다. 본 발명은 이러한 요구 및 다른 요구들을 만족한다.
도 1a 내지 도 1c는 혈액 제재 샘플로부터의 백혈구와 단핵구의 분리를 위한 접선방향 유동 여과 장치의 실시예들의 예시도. 도 1a는 백혈구의 농축을 위한 장치의 일 실시예를 제공하며 교차류 챔버는 여과액 챔버 위에 있다. 도 1b는 장치의 전면도를 예시하며 샘플의 입력은 필터 아래에서 이루어지고 여과액은 단핵구의 농축을 위해 필터를 상방향으로 지나간다. 도 1c는 도 1b에 예시된 장치의 상면도이다.
도 2는 다양한 조건 하에서 림프구 채집 제재의 샘플에 수행되는 접선방향 유동 여과(TFF)의 일 예의 예시도. PBS + 헤파린 + DNase I의 완충제로 1:5로 희석된 10 ml의 림프구 채집 제재의 샘플이 15ml/min의 여과율로 3미크론 필터를 사용하여 TFF를 거쳤다. TFF 후의 농축액("농축액"으로 표기함; 해칭된 바(bar))과 여과액("여과액"으로 표기함; 흑색 바)에서의 백혈구 백분율(WBC)이 도시되어 있다. 최대, 10, 9, 8, 7, 및 6의 재순환(입력)율은 각각 1680, 1380, 1080, 870, 및 540 ml/min에 상응한다.
도 3은 3가지 상이한 여과율(11, 15, 및 19.6 ml/min)에서 1080ml/min의 재순환(입력)율로, 3미크론 필터를 사용하여 TFF 장치에서 림프구 채집 제재에 수행된 TFF의 연구 결과를 예시한다. 농축액(해칭된 바) 또는 여과액("여과액"으로 표기함; 흑색 바)에서의 백혈구 백분율("WBC"로 표기함)이 도시되어 있다.
도 4는 도 1에 설명된 연구를 위해 림프구 채집 제재의 샘플들에 수행된 TFF의 부가적인 결과들의 예시도. 1:5로 희석된 10 ml의 림프구 채집 제재의 샘플이 15ml/min의 여과율로 3미크론 필터를 사용하여 TFF를 거쳤다. TFF 후의 농축액(해칭된 박스)과 여과액(흑색 박스)에서의 적혈구 백분율("RBC"로 표기함)이 도시되어 있다. 최대, 10, 9, 8, 7, 및 6의 재순환(입력)율은 각각 1680, 1380, 1080, 870, 및 540 ml/min에 상응한다.
도 5는 도 2에 설명한 연구를 위해 림프구 채집 제재의 샘플들에 수행된 TFF의 부가적인 결과들의 예시도. 1:5로 희석된 10 ml의 림프구 채집 제재의 샘플이 3가지 상이한 여과율(11, 15, 및 19.6 ml/min)에서 1080ml/min의 재순환(입력)율로, 3미크론 필터를 사용하여 TFF를 거쳤다. TFF 후의 농축액(해칭된 박스)과 여과액("여과액"으로 표기함; 흑색 박스)에서의 적혈구 백분율("RBC"로 표기함)이 도시되어 있다.
도 6은 샘플의 림프구 채집 재료의 농도를 증가시키는 효과들의 일 예의 예시도. PBS + 헤파린 + DNase I에서 1:5로 희석된 50 ml의 림프구 채집 재료가 3미크론의 기공 사이즈의 필터를 갖는 장치를 사용하여 TFF를 거쳤다. 농축액("농축액"으로 표기함) 내의 백혈구("WBC"로 표기함)와 적혈구("RBC"로 표기함)의 백분율이 여과율의 함수로서 도시되어 있다.
도 7은 림프구 채집 제재의 일정 비율 증가(scale-up; 12 ml 또는 전체 유닛의 1/2)시 3미크론 필터와 5미크론 필터 간의에 림프구 채집 제재의 분리의 일 예의 예시도. 재순환(입력)율은 1680ml/min이었고, 여과율은 15ml/min이었다. 5미크론 필터를 사용하여 수행된 TFF에 대해, 약 80%의 적혈구("RBC"로 표기함: 흑색 바)가 농축액으로부터 제거되었고, 약 62%의 입력 백혈구("WBC"로 표기함; 밝게 해칭된 바), 또는 약 70% 이상의 입력 단핵구가 유지되었다. 대조적으로, 5미크론 필터를 사용하여, 약 65%의 입력 백혈구가 농축액에 유지되었고, 약 3%의 적혈구만이 제거되었다.
도 8은 샘플로서 제공된 림프구 채집 제재의 량의 일정 비율 증가시 약 4.5미크론과 8미크론 필터를 통한 림프구 채집 제재의 분리의 비교 예시도. 재순환(입력)율은 1680ml/min이고, 여과율은 15ml/min이었다. 4.5미크론 필터를 사용하여 수행된 TFF에 대해, 약 99%의 적혈구("RBC"로 표기함: 흑색 바)가 농축액으로부터 제거되었고, 약 90%의 입력 백혈구("WBC"로 표기함; 밝게 해칭된 바)가 유지되었다. 대조적으로, 8미크론 필터를 사용하여, 약 98%의 입력 적혈구가 제거되었지만, 4%의 백혈구만이 유지되었다.
도 9는 처리된 림프구 채집 제재의 일정 비율 증가시 4.5미크론 필터에서의 분리의 일 예의 예시도. 재순환(입력)율은 1680ml/min이고, 여과율은 15ml/min이었다. 3가지 상이한 림프구 채집 제재에 90분 동안 4.5미크론 필터를 사용하여 수행된 TFF에 대해, 적혈구의 80 내지 95%가 농축액으로부터 제거되는 반면, 약 80 내지 100%의 입력 단핵구가 유지되었다. 하나의 림프구 채집 샘플의 TFF 후에, 농축액이 또한 시험되었고 약 2%만의 입력 혈소판과 3%의 입력 혈장(표 1의 Exp 7에 표기됨)을 갖는 것으로 밝혀짐.
본 발명은 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 것 및 혈액 제제(blood preparation)에 대한 것이다. 특히, 접선방향 유동 여과를 사용하여 백혈구가 풍부한 세포군을 만든다. 농축된 백혈구 군들과 단핵구, CD34+ 조혈 줄기가 풍부한 세포군들을 조제하기 위한 장치를 사용하는 방법은 전구체 세포 등을 제공한다. 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 얻어지는 백혈구 및/또는 단혈구 등이 풍부한 세포군들은 면역 반응의 유도를 위해 개인에게 투여하기 위해 항원 전달 세포(antigen presenting cell), 예를 들어 항원 전달 가지 세포의 조성을 조제하고, 상피(epithelial), 신경세포(neuronal), 내피(endothelial), 또는 간(hepatocyte) 세포를 형성하는 유도를 위해 다능성(pluripotent) 가지(stem) 세포, 예를 들어 f-대식세포(f-MΦ)의 조성을 조제하고, 개수가 증가된 조혈 가지 또는 전구체 세포 등을 포함하는 조성을 조제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 접선방향 유동 여과 장치는, 교차류 챔버, 여과액 챔버 및 그 사이에 배치되는 필터를 갖는 제거기(remover) 유닛을 포함한다. 필터는 일 측면에서 교차류 챔버의 농축액 표면과, 그리고 다른 측면에서 여과액 챔버의 여과액 표면과 유체가 통한다. 교차류 챔버는 필터의 농축액 표면에 평행하고 교차류 챔버로 백혈구를 포함하는 혈액 성분들의 샘플을 도입하는 구조의 입구(inlet)를 갖는다. 교차류 챔버에는 필터의 농축액 표면 반대쪽의 챔버의 일부분의 중앙에 배치된 출구가 또한 제공된다. 접선방향 유동 여과 장치에 사용하기에 적절한 필터는 전형적으로 약 1 내지 약 10 미크론 범위의 평균 기공 사이즈를 갖는다. 특정한 실시예에서, 필터는 약 3 내지 약 7 미크론 또는 약 3 내지 약 5.5 미크론의 평균 기공 사이즈를 갖는다.
또한, 장치는 교차류 챔버의 입구에 예정된 입력율의 샘플을 제공하는 수단과, 필터를 지나 여과물 챔버로의 여과물의 여과율을 제어하는 수단을 포함할 수 있다. 여과율 제어 수단은 필터에 무해한 여과율 이하로 여과율을 제어한다. 혈액 구성성분들을 포함하는 샘플은 림프구 채집 장치와 같은 소스(source) 장치 또는 예를 들어 림프구 채집 장치 등으로부터 채집된 샘플을 담는 컨테이너에 의해 제공될 수 있다.
접선방향 유동 여과 장치는 회복(recovery) 유닛을 추가로 포함할 수 있다. 입구 및 출구를 포함하는 회복 유닛은 회복 유닛의 교차류 챔버와 루프(loop) 형태로 상호연결될 수 있다. 이 실시예의 장치에서, 교차류 챔버 입구는 회복 유닛 출구와 유체가 서로 통하고, 교차류 챔버 출구는 회복 유닛 입구와 유체가 서로 통한다. 회복 유닛은 샘플 입구와 세정액(wash) 입구를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 실시예들의 접선방향 유동 여과 장치에서 샘플 입구 및 세정액 입구는 단일의 공유되는 입구이다. 전형적으로, 세정액 입구는 치환액(replacement) 또는 세척액의 출처와 유체가 서로 통한다. 치환액 또는 세정액은 예를 들어 등장성 완충제(isotonic buffer) 또는 조직 배양 매체일 수 있다.
회복 유닛의 샘플 입구는 혈액 성분의 출처와 유체가 서로 통한다. 본 발명의 일 실시예에서, 혈액 성분의 출처는 세포-가공(cell-processing) 장치이다. 세포-가공 장치는 백혈구 채집 장치, 또는 백혈구가 부분적으로 농축된 세포군을 만들 수 있는 장치일 수 있다. 일 예에서, 세포 처리 장치는 제 1 및 제 2 포트(port)를 갖는 용기(vessel), 제 1 및 제 2 포트와 유체가 서로 통하는 단핵구 가지 세포 전구체(monocyte dendritic cell precursor) 고착용 기판, 단핵구 가지 세포 전구체 및 가지 세포가 통과하게 하기에 충분한 기공 사이즈를 갖고 용기 내에 기판을 유지시키는 스크린(screen)을 포함한다. 장치는 제 1 또는 제 2 포트와 유체가 서로 통하는 배수 라인(drain line)과, 접선방향 유동 여과 장치의 회복 유닛의 샘플 입구와 역시 유체가 서로 통하며 제 1 및/또는 제 2 포트와 유체가 서로 통하는 채집(collection) 라인을 추가로 포함한다.
세포 처리 장치는 결합 매체, 세정 완충제(washing buffer) 및 세척 완충제(elution buffer)를 제공하기 위한 다수의 유체원을 또한 포함할 수 있다. 장치는 다양한 유체들을 셀 가공 장치 내외로 전달하기 위해 펌프를 추가로 포함할 수 있다. 가열기 또는 냉각 장치와 같은 온도 제어 수단이 제공될 수도 있다. 밀폐계를 제공하는 본 발명의 일 실시예에서, 단핵구 가지 세포 전구체를 고착할 수 있는 비드(bead) 재료를 포함하는 세포 처리 장치로, 혈액 샘플 또는 혈액 제제(blood product preparation)가 제공된다. 혈액 샘플은 단핵구 가지 세포 전구체를 고착시키기에 충분한 시간동안 비드 재료와 접촉이 허용되고, 장치는 배수 라인을 통해 다른 세포 성분들로 세척된다. 세척 완충제는 세포 처리 장치에 첨가되고, 단핵구 가지 세포 전구체는 단핵구의 혈액 샘플을 추가로 농축하기 위해 무균 상태에서 채집 라인을 지나 회복 유닛의 샘플 입구로 보내진다.
본 발명의 일 실시예에서, 필터에 의해 분리된 여과액 챔버와 교차류 챔버를 포함하는 제거기 유닛과, 교차류 챔버 입구를 지나는 샘플의 예정된 입력율을 제공하는 수단과, 필터를 지나는 여과율을 감소시키는 수단을 포함하는, 백혈구의 혈액 성분들의 샘플을 농축하기 위한 접선방향 유동 여과 장치가 제공되며, 교차류 챔버는 입구와 출구를 갖고, 출구는 챔버의 상부 부분의 중앙에 배치되고, 입구는 필터 위에 배치되어 필터에 실질적으로 평행하게 교차류 챔버로 유체를 도입하고; 필터는 약 3 내지 약 7 미크론의 기공 사이즈를 갖고; 이에 의해 샘플은 교차류 챔버의 농축액 내의 백혈구에 대해 농축된다. 또한, 다른 특정한 실시예에서, 필터는 약 3 내지 약 5.5 미크론의 기공 사이즈를 가져 CD34+ 백혈구의 세포군을 농축한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 필터에 의해 분리되고 여과액 챔버 아래의 교차류 챔버를 포함하는 제거기 유닛과, 교차류 챔버 입구를 지나는 샘플의 예정된 입력율을 제공하는 수단과, 필터를 지나는 여과율을 유지하는 수단을 포함하는, 단핵구에 대한 혈액 성분의 샘플을 농축하기 위한 접선방향 유동 여과 장치가 제공되며, 교차류 챔버는 입구와 출구를 갖고, 출구는 챔버의 하부 부분의 중앙에 배치되고, 입구는 필터 아래에 배치되어 필터에 실질적으로 평행하게 교차류 챔버로 유체를 도입하고; 필터는 약 3 내지 약 7 미크론의 기공 사이즈를 갖고; 이에 의해 샘플은 교차류 챔버의 농축액 내의 백혈구에 대해 농축된다. 또한, 다른 특정한 실시예에서, 필터는 약 3 내지 약 5.5 미크론의 기공 사이즈를 가져 CD34+ 백혈구의 세포군을 농축한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 필터(5)에 의해 분리된 여과액 챔버(4)와 교차류 챔버(3)를 갖는 제거기 유닛(1)을 포함하는, 혈액 성분들 포함하는 샘플을 농축하기 위한 접선방향 유동 여과 장치가 제공되며, 교차류 챔버는 입구와 출구를 갖고, 출구는 입구 위에 배치되며 챔버의 상부 부분의 중앙에 배치되고, 필터는 교차류 챔버 이구에 실질적으로 평행하고 아래쪽에 배치된다. 장치는 교차류 챔버 입구를 지나는 샘플의 예정된 입력율을 제공하는 수단과; 필터를 지나는 유체의 예정된 여과율을 제공하는 수단과; 샘플 내의 혈구들의 예정된 농도를 제공하는 수단을 추가로 포함하고, 예정된 여과율은 예정된 입력율의 약 1/5 내지 약 1/100이고, 혈구들의 예정된 농도는 전형적으로 밀리 리터(ml)당 약 107 내지 109 세포이다. 전형적으로 필터는 약 3 미크론 내지 약 7 미크론의 기공 사이즈를 갖는다. 또한, 다른 특정한 실시예에서, 필터는 약 3 내지 약 5.5 미크론의 기공 사이즈를 가져 CD34+ 백혈구의 세포군을 농축한다.
본 발명은 백혈구를 포함하는 혈액 성분들의 샘플로부터 백혈구를 분리하는 방법을 또한 제공한다. 상기 방법에서, (1) 제거기 유닛의 입구를 통해 제거기 유닛으로 샘플을 도입하고; (2) 샘플이 약 1 내지 약 10 미크론의 기공 사이즈를 갖는 필터에 실질적으로 평행한 교차류가 되게 하고; (3) 유체가 필터를 지나 여과되게 하고; (4) 샘플로부터 백혈구가 아닌 혈액 성분들을 선택적으로 제거하여 백혈구가 풍부한 세포군을 형성하는 것을 포함하는 단계들이 제공된다. 샘플은 제거기 유닛에 도입하기 위해 림프구 채집술 또는 밀도 원심분리, 분별 용해(differential lysis), 여과, 또는 백혈구 연층(buffy coat)의 제제(preparation)에 의해 부분적 정제 또는 농축될 수 있다. 일 실시예에서, 교차류 챔버 내의 와류 운동으로 유동하도록 샘플이 도입된다. 부가적으로 백혈구가 풍부한 세포군은 세정액에 의해 세정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 샘플로부터 제거되는 백혈구가 아닌 혈액 성분들에는 혈장, 혈소판, 적혈구 등이 포함된다. 본 발명의 방법에 의한 결과물인 백혈구는 상당히 풍부한 단핵구 군을 포함할 수 있다. 농축된 세포군은 적어도 약 20%의 백혈구를 포함할 수 있지만, 전형적으로 적어도 약 60% 이상의 백혈구를 포함한다. 본 발명의 방법의 일 실시예에서, 단계 (1), (2), 및 (3)은 백혈구가 풍부한 세포군을 형성하기 위해 적어도 2번 반복된다. 백혈구가 풍부한 세포군은 추가로 단핵구 가지 세포 전구체의 제제에도 사용될 수 있다. 일 실시예에서 농축된 세포군은, 백혈구가 풍부한 세포군과 단핵구 가지 세포 전구체 고착 기질(substrate)을 접촉시키고; 단핵구 가지 세포 전구체와 기질을 포함하는 복합물들을 형성하기 위해 세포군의 단핵구 가지 세포 전구체가 기질에 가역적으로 고착하게 하고; 고착하지 않은 백혈구로부터 복합물을 분리하여 단핵구 가지 세포 전구체를 포함하는 복합물을 얻고; 단핵구 가지 세포 전구체를 배양하여 전구체들을 분류하여 미숙한 또는 성숙한 가지 세포들을 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 만들어진다. 일 실시예에서, 단핵구 가지 세포 전구체는 배양 전에 기질로부터 세척된다. 단핵구 가지 세포 전구체를 고착하기 위한 기질에는 글래스(glass), 폴리스티렌, 플라스틱, 또는 글래스가 코팅된 폴리스티렌 마이크로비드가 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, (1) 접선방향 유동 여과(TFF) 유닛으로 샘플을 도입하고, 상기 TFF 유닛은 교차류 챔버, 여과액 챔버와, 교차류 챔버 및 여과액 챔버와 유체가 서로 통하는 필터를 포함하고, 필터는 약 1 내지 약 10 미크론의 기공 사이즈를 갖고; (2) 예정된 입력율 및 예정된 여과율로 샘플이 TFF 유닛을 재순환하게 하고, 예정된 입력율은 예정된 여과율의 적어도 5배이고, 예정된 여과율은 필터를 방해하지 않는 여과율보다 작고; (3) 백혈구가 풍부한 세포군을 격리하는 것을 포함하는 백혈구에 대해 혈액 성분들의 샘플을 농축하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 혈장, 혈소판 및 적혈구를 포함하는 백혈구가 아닌 혈액 성분들이 실질적으로 없는 풍부한 세포군을 얻을 수 있다. 상기 방법에 의해 얻어진 풍부한 세포군은 적어도 약 20%의 백혈구, 전형적으로 적어도 약 60%이상의 백혈구를 포함할 수 있다. 상기 방법은 환자(subject)로부터 혈액을 채집하고, 림프구 채집술 또는 밀도 원심분리, 분별 용해, 여과에 의해 혈액으로부터 샘플을 제제하는 것, 또는 백혈구 연층의 제제를 추가로 포함할 수 있다.
일단, 세포군이 백혈구에 대해 농축되면, 방법은 예를 들어, 가지 세포 전구체, CD34+ 조혈 가지 세포, 또는 f-대식세포와 같은 다능성 줄기 세포 등과 같은 백혈구로부터 유도될 수 있는 특수한 세포 타입을 제제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일 특정 실시예에서, 가지 세포들은 농축된 세포군으로부터 제제될 수 있다. 이러한 방법에서, 가지 세포들은, 농축된 세포군과 단핵구 가지 세포 전구체 고착 기질을 접착시키고; 단핵구 가지 세포 전구체와 기질을 포함하는 복합물들을 형성하기 위해 농축된 세포군의 단핵구 가지 세포 전구체가 기질에 가역적으로 고착하게 하고; 고착하지 않은 백혈구로부터 복합물을 분리하여 단핵구 가지 세포 전구체를 포함하는 복합물을 얻고; 단핵구 가지 세포 전구체를 배양하여 전구체들을 분류하여 미숙한 또는 성숙한 가지 세포들을 형성하는 것을 포함하는 방법에 의해 제제된다. 기질에는 글래스, 폴리스티렌, 플라스틱, 또는 글래스가 코팅된 폴리스티렌 마이크로비드가 포함될 수 있다. 부가적으로, 단핵구 가지 세포 전구체는 단핵구의 가지 세포로의 분화를 촉진하는 시토카인(cytokine)과 함께 배양될 수 있다. 특정 실시예에서, 시토카인은 GM-CSF와 IL-4이다. 또한, 가지 세포들은 가지 세포들을 성장시키도록 숙성될 수 있다.
일단, 가지 세포 전구체들이 격리되었으면, 가지 세포는 항원이 채워진(antigen loaded) 가지 세포를 형성하도록 항원을 처리하는 것을 돕는 조건 하에서 항원과 함께 배양될 수 있다. 그 다음에, 항원이 채워진 가지 세포가 개인에게 투여되거나, 또는 항원이 채워진 가지 세포가 생체 내외에서 T 세포와 함께 배양되어 항원에 대해 특정적인 세포독성(cytotoxic) T 세포를 형성하게 할 수 있다. 세포독성 T 세포는 암과 박테리아 또는 바이러스 감염의 치료에서와 같이 도입된 항원에 특정적인 면역 반응이 필요할 때 개인에게 투여될 수 있다.
조혈 가지 세포가 풍부한 세포군이 만들어질 수 있다. 일 실시예에서, 개인은 예를 들어 G-CSF, GM-CSF, AMD3100(또는 CXCR-4 기능을 억제하는 다른 시약), 또는 다량 또는 소량의 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 등과 같은 가지 세포 집결제(mobilizing agent)를 공급받을 수 있다. 가지 세포 집결제는 말초 혈류로 방출되는 CD34+ 가지 세포의 증식을 유도한다. (1) 개인으로부터의 림프구 채집 샘플은 접선방향 유동 여과(TFF) 유닛으로 도입되고, TFF 유닛은 교차류 챔버, 여과액 챔버와, 교차류 챔버 및 여과액 챔버와 유체가 서로 통하는 필터를 포함하고, 필터는 약 3 내지 약 5.5 미크론의 기공 사이즈를 갖고; (2) 예정된 입력율 및 예정된 여과율로 샘플이 TFF 유닛을 재순환하게 하고, 예정된 입력율은 예정된 여과율의 적어도 5배이고, 예정된 여과율은 필터를 방해하지 않는 여과율보다 작고; (3) CD34+ 백혈구가 풍부한 세포군을 격리한다. 상기 방법은 혈장, 혈소판 및 적혈구를 포함하는 백혈구가 아닌 혈액 성분들이 실질적으로 없는 풍부한 세포군을 얻을 수 있다. 상기 방법에 의해 얻어진 풍부한 세포군은 1 내지 약 5%의 백혈구 채집 재료로부터 풍부한 세포군에서 약 10% 내지 약 40%의 세포로 2 내지 5배(fold)로 CD34+ 세포 백분율을 증가시킬 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이 격리된 단핵구는 비-고착성 세포 배양 컨테이너, 예를 들어, 테플론 배양 백 내의 M-CSF를 함유한 매체 내에서 배양될 수 있다. M-CSF 내에서의 단핵구를 배양하면 많은 수의 CD34+ 세포가 얻어진다. 상술한 바와 같이 백혈구 또는 단핵구가 풍부한 세포군은 다수의 다른 선구체(progenitor) 세포 타입의 생산을 유도하기 위해 당업계에 공지된 다수의 시토카인과 류코카인(leukokine)의 존재 하에서 배양될 수도 있다. 예를 들어, 백혈구 및/또는 단핵구가 풍부한 세포군은 섬유결합소(fibronectin)가 코팅된 표면 상에 VEGF, bFGF, IGF-1, EGF 및 태아 혈청(fetal serum)의 존재 하에 배양되고 비-고착 세포들을 얻어진 내피와 같은 순환하는 혈관생성 세포에 폐기하거나, 또는 f-MΦ가 EGF에서 배양하여 상피 세포로 분화되고, NGF 또는 VEGF에서 각각 배양하여 신경세포와 내피 세포로 분화되거나 또는 HGF의 존재 하에서 배양하여 간세포(hepatocyte)로 분화될 수 있다.
본 발명은 농축된 백혈구 군을 제공하기 위해 혈액 성분의 이종 혼합물을 처리하는 장치 및 방법을 제공한다. 본 발명의 일 특징에서, 비-백혈구 혈액 성분, 예를 들어 혈장, 혈소판 및/또는 적혈구 등을 선택적으로 제거하여 백혈구를 농축하는 장치 및 방법이 제공된다. 다른 특징에서, 혼합물로부터 예를 들어 림프구(lymphocyte), 적혈구, 혈소판 등을 포함하는 비-단핵구 혈액 성분의 선택적 제거에 의해 단핵구를 농축하는 장치 및 방법이 제공된다.
농축된 백혈구 군은 전형적으로 혈액 성분들을 포함하는 샘플 또는 유체 혼합물로부터 제제된다. 본원에서 사용되는 용어 "혈액 성분"은 병에 걸리거나 걸리지 않은 상태에서 전형적으로 존재하는 이러한 재료를 포함하는, 혈액에 전형적으로 존재하는 임의의 재료를 의미한다. 혈액 성분은 백혈구를 포함하고 예를 들어, 림프구, 단핵구, 적혈구, 호중구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 자연세포독성(NK; natural-killer) 세포, 및/또는 혈소판, 용해성 또는 비용해성 단백질 또는 단백질 복합체(예를 들어, 효소, 면역글로블린, 또는 면역글로블린-항원 복합체), 예를 들어 지질과 같은 다른 고분자 성분을 포함하거나, 또는 예를 들어, 혈장 또는 혈청을 포함하는, 그 정확한 분자 또는 세포 구성에 무관하게, 물리적으로 분리될 수 있다.
샘플 또는 유체 혼합물은 본 발명의 방법을 실시하기 전에 백혈구가 부분적으로 농축될 수 있다. 용어 "백혈구(leukocyte)"는 용어 "백혈구(white blood cell)"("WBC")와 상호변환가능하게 사용된다. 이들 용어는 예를 들어 단핵구, 가지 세포 전구체, 및 림프구를 포함하는 단핵 무과립세포(mononuclear agranulocyte), 및 호중구, 호산구, 호염기구(basophils), 및 비만 세포(mast cell)를 포함하는, 분절된 핵과 세포질(cytoplasmic) 입자를 갖는 다형핵(polymorphonuclear) 과립백혈구(granulocyte)를 포함한다. "단핵구"는 전형적으로 CD14로 표현되고 전형적으로 리포좀 입자를 포함하는, 타원형 또는 신장(kidney) 형상의 핵을 갖는 일반적으로 림프구보다 큰 골수-유도(myeloid-derived) 백혈구 류를 의미한다.
본 발명의 특정한 특징들에서, 림프구들은 백혈구들로부터 분리된다. "림프구"는 림프 선구체 세포로부터 유도되며, B-림프구, T-림프구, 자연세포독성 세포를 포함하는 세포를 의미한다. 용어 "작은 림프구"는 약 7 내지 8 미크론 직경의 림프구를 의미한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "백혈구 군(population of leukocytes)"은 백혈구를 포함하는 임의의 그룹의 세포를 의미한다. 백혈구 군은 예를 들어 단핵구 및/또는 단핵구 전구체 가지 세포와 같은 넓은 범위의 백혈구 하위-타입 또는 특정한 하위-타입을 포함할 수 있다. 용어들 "농축(enrichment)", "농축하다", "농축된"은 본 발명의 장치 또는 하기의 방법을 사용하여 혈액 성분의 혼합물을 처리하여 초기의 혼합물(즉, 농축 전)보다 다른 성분에 관하여 생존한 백혈구의 백분율이 더 높은 세포군이 얻어짐을 의미한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "생균(viable)"은 적절한 배양 조건 하에서 분화(differentiation)될 수 있는 백혈구를 의미한다.
본 발명에 따른 장치는 백혈구 군을 농축하기 위해 접선방향 유동 여과를 사용한다. 용어 "접선방향 유동 여과"와 "교차류 여과"는 상호변환가능하게 사용되고, 유체 혼합물 내의 이종 입자 혼합물로부터 한정된 특성(예를 들어, 원하는 사이즈 범위)의 입자들의 분리를 포함하는, 유체 혼합물로부터 부유 입자들(예를 들어, 세포들)의 분리를 의미한다. 입자들은 전형적으로 일정한 정 압력하에서 필터(예를 들어, 샘플 유체와 마주하는 필터 표면)에 실질적으로 평행하거나 또는 접선방향인 샘플 챔버에서 유체 혼합물(예를 들어, 샘플 유체)을 지나가거나 또는 순환하여 분리되며, 집중된 입자들 또는 백혈구를 포함하는 유체 혼합물은 막 표면에 접선방향으로 계속 흐른다.
일반적으로 "여과액", 즉 필터를 지나는 유체의 부분에서 어떤 입자들이 제거될지 및 어떤 입자들이 "농축액"에 유지될지를 결정하는 것은 다양한 요인에 의존한다. 이러한 요인에는 예를 들어 필터 기공 사이즈, 입력율, 여과율, 유체 혼합물 내의 입자의 농도, 유체 혼합물의 온도, 점성이 포함된다. 본원에서 사용될 때, "기공 사이즈"는 필터 내의 기공들의 평균 사이즈를 의미한다. "입력율"은 필터를 수용하는 챔버로 샘플(예를 들어, 유체 혼합물)이 도입되는 속도를 의미한다. 샘플이 (예를 들어 본 발명에 따른 장치에서) 필터를 거쳐 여러번 재순환되는 경우, 입력율은 "재순환율"로도 언급된다. "교차류"는 필터에 걸친 유체 혼합물의 유동에 실질적으로 평행한 (즉, 임의의 방향에서 필터의 표면에 평행한) 것을 의미한다. "교차류 율"은 필터에 실질적으로 평행하고 그 위에서의 샘플 또는 유체 혼합물의 유속을 의미하고, 유체 혼합물의 교차류 율은 일반적으로 예를 들어 필터를 수용하는 챔버의 입력율, 사이즈 및 형상을 포함하는 다양한 변수에 의존한다. "여과율"은 필터를 지나는 유체 혼합물의 유속을 의미한다. 본 발명에 따른 장치 및 방법의 여과율은 방해받지 않는(unopposed; 즉 개방된 튜브) 여과율보다 작다. "출력율"은 필터를 통해 지나는 유체 혼합물(즉, 여과액) 이외의, 교차류 챔버로부터의 유체 혼합물을 제거하는 비율을 의미한다. 출력율은 일반적으로 입력율에서 여과율을 감산한 것과 동일하다.
본원에서 사용될 때, 용어 "필터"는 물체에 걸쳐 교차류를 거치는 샘플 또는 유체 혼합물의 하나 이상의 성분(예를 들어, 혈액 성분들)이 기공을 지나가게 하여 다른 성분들(예를 들어, 백혈구)로부터 그 성분들(예를 들어, 비-백혈구)을 분리하는 다수의 기공을 갖는 임의의 재료 또는 재료들의 조합으로 이루어지는 임의의 물체를 의미한다. 필터의 표면은 이보다 더 크거나 작은 면적의 필터도 사용될 수 있지만, 예를 들어, 직경 약 42 내지 약 145mm와 같은 임의의 적절한 면적을 가질 수 있다. 특정 실시예들에서, TFF 장치에 단 하나의 필터가 사용된다. 다른 실시예들에서는, TFF 장치에 부가적인 필터들이 사용될 수 있다.
본 발명의 TFF 장치에 전형적으로 사용되는 필터는 넓은 범위의 유기 중합체 필터로부터 선택될 수 있다. 이러한 필터에는 나일론, 불화비닐리덴 수지(PVDF; polyvinylidene fluoride), 아세트산/질산 셀룰로오스, 폴리설폰, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리아미드의 미세기공 막들이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 세라믹 필터와 금속 필터와 같은 다른 필터도 사용될 수 있다. 친수성(hydrophilic) 또는 공수성, 충전된 그리고 충전되지 않은 필터 모두가 사용될 수 있다. 특정한 응용예에서는, 친수성 필터가 바람직할 수 있다.
본 발명의 필터는 전형적으로 필터의 면적에 걸쳐 분산된 다수의 기공을 포함한다. 특정 실시예에서, 필터는 기공 사이즈에 있어서 작은 편차를 갖는 기공 사이즈를 갖는다. 예를 들어, 기공 사이즈의 변화는 약 ±20%이거나, 또는 약 +0 내지 약 20% 범위 내에 있을 수 있다. 전형적인 일 실시예에서, "뉴클포어(nuclepore)" 또는 "트랙 에칭된(track etched)" 필터가 사용된다(예를 들어, 포어틱스(Poretics??) 폴리에틸렌 또는 폴리카보네이트 트랙-에칭된 필터 막(미국 미네소타주, 미네통카 오스모닉스)). 이들 필터는 전형적으로 재료에서 기공 사이즈가 엄격히 제어된 매끈한 표면을 갖는다. 이러한 필터는 전형적으로 플라스틱 시트를 뚫기에 충분한 에너지를 갖는 방사성 입자원에 기공이 없는 플라스틱 편평한 시트를 노출시켜 만들어진다. 그 다음에 화학 용제 또는 에칭 시약에 노출시켜 "트랙"이 직경에서 넓어진다. 기공의 사이즈는 트랙 에칭 조건에 의해 제어될 수 있다.
본 발명은 백혈구를 농축하기 위해 혈액 내의 다양한 세포 타입(예를 들어, 단핵구, 가지 세포 전구체 등) 간의 차이를 이용한다. 이러한 차이에는 예를 들어 사이즈, 형상 및/또는 가변형성의 차이가 포함될 수 있다. 사람의 혈액 내의 세포의 사이즈 및 가변형성은 전형적으로 세포 타입에 의해 변한다. 적혈구는 전형적으로 양면이 오목한 원판 형상이고, 핵이 없고, 주 직경이 약 7미크론 크기이고 비교적 가변성이다. 다형핵 백혈구 세포는 전형적으로 구(spheroidal)형이고 역시 약 7미크론 크기이고 적혈구보다 가변형성이 적다. 단핵 세포 중에, 림프구는 전형적으로 7 내지 10 미크론이고, 단핵구는 일반적으로 10 내지 15 미크론의 범위이다.
다양한 실시예에서, 필터 기공 사이즈는 백혈구를 농축하거나 및/또는 혈액 성분들을 분류하여 백혈구를 농축하도록 선택된다. 예를 들어, 특정 실시예들에서, 공칭 직경 10 내지 15 미크론을 갖는 단핵구와, 공칭 직경 7미크론을 갖는 적혈구가 약 5 내지 약 5.5 미크론의 기공 사이즈를 갖는 필터를 사용하여 TFF에 의해 분리될 수 있다. 특정한 실시예에서, 4.5 미크론의 필터가 사용되어 림프구 채집 샘플의 다른 세포 성분들로부터 단핵구를 성공적으로 분리했다.
다른 실시예들에서, 필터 기공 사이즈는 약 1 내지 약 10 미크론 또는 약 3 내지 약 8 미크론, 또는 약 3 내지 약 5 미크론의 범위 내에 있을 수 있다. 약 3 미크론의 범위에서 필터 기공 사이즈는 대부분의 백혈구를 유지할 수 있고, 백혈구로부터 적혈구를 적은 효율로 제거하게 한다. 대조적으로, 약 8 미크론의 범위의 필터 기공 사이즈는 적혈구를 보다 높은 효율로 제거하지만 여과액에서의 백혈구의 손실을 증가시킨다. 약 3 내지 약 5.5 미크론의 필터 사이즈가 CD34+ 조혈 가지 세포를 농축하는데 사용될 수 있다.
다른 세포 혈액 성분으로부터 백혈구를 농축하는 것은 샘플 또는 유체 혼합물 내의 세포의 농도, 입력율, 및/또는 여과율에 의해서도 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 적혈구는 백혈구보다 변형되기 쉬우므로, 적혈구의 주직경보다 작은 필터 기공 사이즈(예를 들어, 약 7미크론 미만)를 보다 쉽게 지날 수 있다. 특정 예에서, 적혈구는 약 5미크론의 기공 사이즈를 갖는 필터를 사용하여 백혈구로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예에서, 필터 기공 사이즈는 약 3미크론으로 감소되고, (상기) 세포의 농도가 증가되어 백혈구로부터 적혈구를 효율적으로 분리한다.
다른 세포 혈액 성분으로부터 백혈구를 농축하는 것은 동일한 입력 또는 재순환율 하에서 방해받지 않는(즉, 개방된 튜브) 여과율보다 작은 여과율을 유지하여 이루어질 수 있다. 다른 실시예에서, 여과액에 대한 백혈구의 손실은 여과율보다 큰 입력 또는 재순환율을 유지하여 감소될 수 잇다. 예시된 실시예에서, 입력 또는 재순환율은 여과율의 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 50배 이상, 또는 약 100배 이상일 수 있다.
TFF에 의한 세포 분화를 위해 다양한 혈액 성분을 포함하는 샘플 또는 혼합물이 다양한 출처로부터 얻어질 수 있고, 다양한 처리 단계 중의 임의의 단계에서 혈액 제재의 유체 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 혈액 원은 인간이거나 또는 인간이 아닐 수 있다. 또한, 유체 혼합물은 예를 들어, 전혈, 전혈의 다양한 희석물, 또는 예를 들어, 혈장 또는 다른 혈액 성분을 제거하여 처리된 전혈 또는 희석된 혈액일 수 있다. 그러므로, 유체 혼합물은 예를 들어, 이미 백혈구에 대해 적어도 부분적으로 농축된 혈액 세포군을 포함할 수 있다.
혈액 성분 또는 백혈구 군이 당업계에 공지된 방법에 의해 준비될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 헤파린 첨가 혈액의 채집, 성분 채집 또는 림프구 채집, 백혈구 연층의 제제, 로제팅(rosetting), 원심분리, 밀도 층 그레디언트(예를 들어, 피콜-하이패크, 퍼콜(PERCOLL??), 설탕(sucrose) 등), 비-백혈구의 분별 용해, 여과 등을 포함한다. 백혈구 군은 환자로부터 혈액을 채집하고, 탈섬유하여 혈소판을 제거하고 대다수의 적혈구를 용해(lysing)하여 얻어질 수도 있다. 백혈구 군은 예를 들어 퍼콜 그레디언트를 통한 원심분리에 의해 단핵구에 대해 선택적으로 농축될 수 있다.
혈액 성분을 포함하는 유체 혼합물은 필요하면 선택적으로 희석되거나 또는 농축될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시예에서, 혈액 성분은 1:2, 1:5, 1:10 또는 다른 적절한 희석비로 희석된다. 혈액 성분은 예를 들어, 등장성 완충제(예를 들어, PBS 또는 HEPES-완충된 함염물) 또는 조직 배양 매체 등으로 희석된다. 전형적으로 TFF를 받는 혈액 성분의 샘플은 약 106 내지 약 108 세포/ml의 세포 농도를 갖는다.
혈액 세포군은 농축된 백혈구 군의 원하는 용도에 따라 다양한 타입의 환자로부터 얻어질 수 있다. 환자는 건강한 환자일 수 있다. 다르게는, 혈액 세포가 예를 들어, 암 환자 또는 면역 자극이 유익할 수 있는 다른 환자와 같이 면역 자극이 필요한 환자로부터 얻어질 수 있다. 유사하게, 혈액 세포는 예를 들어 자가 면역 장애(예를 들어, 류마티스 관절염, 당뇨병, 낭창, 다발경화증 등)를 겪는 환자와 같은 면역억제를 필요로 하는 환자로부터 얻어질 수 있다. 혈액 세포군은 면역자극을 필요로 하는 HLA-대응 환자로 투여하기 위해 HLA-대응하는 건강한 개인으로부터 얻어질 수도 있다. 혈액 세포군은 예를 들어, GM-CSF, G-CSF, AMD3100(또는 CXCR-4 기능을 억제하는 다른 시약), 또는 저량- 또는 다량의 시클로포스파미드(델리에 등의 백혈병 림프종 43:1957, 2002) 등과 같은 가지 세포 집결제가 투여된 개인으로부터 얻어질 수도 있다. 개인은 농축된 세포군을 받을 환자, 친척, 또는 HLA-대응 개인일 수 있다.
특정 실시예에서, 농축된 백혈구 군은 농축액에 채집될 수 있고, 다른 혈액 성분은 여과액으로 통과할 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 단핵구와 림프구를 포함하는) 백혈구 군의 농축을 위해, 혈장, 혈소판, 및/또는 적혈구와 같은 다른 혈액 성분이 성분들 중에서 선택적으로 여과액으로 제거될 수 있다. 부가적인 실시예에서, 림프구 또는 작은 림프구가 선택적으로 제거되고 여과액으로 보내질 수 있다.
도 1a 내지 도 1c에 도시된 본 발명에 따른 장치는 전형적으로 교차류 챔버(3)와 여과액 챔버(4)를 포함한다. 필터(5)는 교차류 챔버와 여과액 챔버 사이에 배치되고, 일 측면이 교차류 챔버(농축액 표면)와 유체가 통하고 다른 측면이 여과액 챔버(여과액 표면)와 유체가 통한다. 교차류 챔버, 여과액 챔버, 필터는 제거기 유닛(1)을 구성한다. 일 실시예에서, 교차류 챔버는 전형적으로 약 55ml의 체적을 갖고, 여과액 챔버는 약 25ml의 체적을 갖는다. 필터 직경은 전형적으로 교차류 챔버의 직경과 실질적으로 동일하다. 본 발명의 용도를 예시하는데 사용되는 특정한 실시예들에서, 필터는 직경이 약 140mm 내지 약 143mm이다.
유체 혼합물이 필터의 농축액 표면에 인접하게 전형적으로 배치된 유체 입구(6)를 통해 교차류 챔버(3)로 들어가, 유체 혼합물(예를 들어, 샘플)이 필터의 농축액 표면에 실질적으로 평행하게 챔버에 들어간다. 전형적으로, 유체는 유체 출구(7)를 통해 교차류 챔버(3)로부터 제거되고, 출구는 필터의 농축액 표면에 직각인 교차류 챔버의 일부분에 일반적으로 배치되어 있다. 특정한 실시예들에서, 교차류 챔버 입구(6)의 직경은 약 7 내지 8mm이고, 교차류 챔버 출구(7)의 직경은 약 8 내지 10mm이다. 여과액은 여과액 챔버(4)의 출구(8)를 통해 제거된다.
전형적으로, 유체 혼합물은 충분한 입력율로 교차류 챔버로 도입되어 필터 표면(농축액 표면)에 걸친 유체 혼합물의 교차류가 필터의 접촉면, 즉 경계층에서 유체와 세포를 부드럽게 교란하고 다시 혼합(back-mix)시키기에 충분한 속도이다. 본원에서 사용될 때, "경계층"은 전형적으로 필터를 지나가는 유체가 지나가는 필터의 농축액 측면 상에서 및 이 측면 부근의 유체층을 의미한다. 이러한 경계층의 교란은 필터 접촉면에서의 재료가 필터에 붙거나 정체되어 효율적인 여과를 방해하는 것을 막아 효율적인 여과를 돕는다. 그러나, 유체 혼합물의 입력율은 일반적으로 상당한 개수의 백혈구를 용해시키기에는 충분하지 않다.
특정 실시예들에서, 혈액 성분들은 유체 혼합물을 교차류 챔버(3)로 가압수송하여 필터의 농축액 표면에 걸쳐 지나가게 된다. 필터에 걸친 유체의 교차류를 구동하는데 사용되는 펌프는 "교차류 펌프" 또는 "재순환 펌프"(14)로서 불린다. 교차류 펌프는 세포에 큰 손상(예를 들어, 세포 용해)을 일으키지 않고 특정한 입력율에서 필터에 걸친 챔버로의 유체 유동을 도입하기에 충분한 교차류 챔버(3)와 유체가 통하는 임의의 가압수송 장치를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 교차류 펌프에는 예를 들어, 연동(peristaltic) 펌프, 피스톤 펌프, 다이어프램 펌프, 또는 롤러 펌프가 포함될 수 있다. 연동 펌프는 예를 들어 "밀폐" 시스템의 일부로서 TFF 장치를 유지하고자 하는 경우에 사용될 수 있다.
유체 혼합물은 전형적으로 여과율을 초과하는 입력율에서 교차류 챔버(3)로 가압수송된다. 일 실시예에서, 입력율은 약 1680ml/분이고, 여과율은 약 15ml/분이다. 다른 실시예들에서, 입력율은 약 1600 내지 약 1800 ml/분이고, 여과율은 약 10 내지 약 20ml/분이다. 비-백혈구 재료(예를 들어, 적혈구, 면역 복합체, 단백질 등)가 필터(5)를 지나 여과물 챔버(4)로 간다.
상술한 바와 같이, 여과율은 전형적으로 방해받지 않은(즉, 개방된 튜브) 속도보다 작다. 여과율은 예를 들어 유동을 제한하기 위해 제 2 펌프 수단(예를 들어, "여과 펌프") 등을 사용하여 여과액 챔버 출구의 사이즈를 감소시키거나 또는 제한하여 제어될 수 있다.
다른 실시예에서, 유체 혼합물을 장치로 도입하는 것이 유체 내에 와류 운동을 생성한다. 이는 예를 들어 여과율의 약 5 또는 10 내지 약 100 배의 입력율로 원통형 교차류 챔버 내의 원형 필터에 실질적으로 평행하게 혼합물을 도입하여 이루어질 수 있다. 전형적으로 필터 중심 부근 및 필터에 직각인 원통형 챔버에 배치된 출구(7)에 의해 관통류가 제거된다. 이렇게 배치하면 필터 중심을 향해 유동이 내측으로 나선을 그리게 한다. 유동은 전형적으로 백혈구가 상당히 용해될 정도로 난류가 아니거나 그리 높은 속도가 아니다. 상술한 바와 같이, 유동은 경계층에서의 정체 또는 결합을 방지하기 위해 필터 표면을 "문지를" 수 있다. 여과율보다 크게(예를 들어, 약 5배 이상으로) 입력율을 교정하여, 결과적으로 농축된 백혈구 군이 약 20%이상 또는 약 40% 이상의 백혈구일 수 있다.
다른 실시예에서, 농축액은 분리 효율을 증가시키기 위해 재순환된다. 예를 들어, 혈액 성분을 포함하는 유체 혼합물이 교차류 챔버로 도입된 다음, 농축액이 교차류 챔버의 유체 출구(7)를 통해 예를 들어, 유체가 초기에 공급된 챔버("회복 유닛"(2))와 같은 다른 챔버로 회수될 수 있다. 그 다음에, 회복 유닛의 유체 혼합물이 교차류 유닛으로 재도입된다. 회복 유닛(2)과 제거기 유닛(1)을 "루프 형태"로 연결하여, 유체 혼합물의 연속적인 재순환 및 여과가 이루어질 수 있다. 다르게는, 농축액이 교차류 챔버(3)의 유체 출구(7)를 통해 회수되고 교차류 챔버 입구로 직접 (즉, 회복 유닛 또는 다른 챔버를 지나지 않고) 재도입될 수 있다. 유체 혼합물은 임의의 적절한 시간동안 교차류 유닛을 지나갈 수 있다. 특정한 실시예들에서, 유체 혼합물은 약 5 내지 약 60분 동안 재순환되어 원하는 백혈구 세포 정제 또는 농축을 이룰 수 있다.
또 다른 실시예에서, 유체 혼합물의 체적이 완충제, 세정액 또는 다른 용액(총칭하여 "치환액"으로 부름)을 첨가하여 조정될 수 있다. 세정 용액은 예를 들어 회복 유닛(예를 들어, 용액 입구(13)를 통해), 제거기 유닛에서, 펌프(14)에서, 제거기 유닛으로부터 또는 유닛으로의 배관에서, 또는 임의의 다른 편리한 위치에서 유체 혼합물과 섞일 수 있다. 그러므로, 농축액의 세포가 동일 작업에서 농축되고 세정될 수 있다. 전형적으로 세정 용액은 세포와 등장성이다. 적절한 완충 및 세정 용액에는 다양한 완충제(예를 들어, 인산염완충식염수(PBS) 또는 HEPES-완충식염수), 조직 배양 매체 등이 포함될 수 있다.
특정 실시예들에서, 세포군은 밀폐된 무균 시스템 내에서 백혈구 군에 대해 농축된다. 본원에서 사용될 때, 용어 "밀폐된 무균 시스템" 또는 "밀폐 시스템"은 살균되지 않은, 대기의 또는 순환 공기 또는 다른 살균되지 않은 조건에의 노출이 최소화 또는 제거된 시스템을 의미한다. 세포군을 농축하기 위한 밀폐 시스템은 일반적으로 상부 개방된 튜브의 원심분리, 세포의 개방된 공기중 전달, 조직 배양 판 또는 밀봉되지 않은 플래스크에서의 세포 배양 등을 일반적으로 배제한다. 모든 세포 컨테이너, 인큐베이터, 조직 배양 용기 또는 다른 세포 처리 장치(후술함)를 포함하는 전체 여과 시스템은 "밀폐된" 시스템으로서 유지될 수 있다. 전형적인 일 실시예에서, 밀폐 시스템은 무균상태에서 백혈구를 농축할 수 있게 하고, 선택적으로는 살균되지 않은 공기 중에 노출됨없이 초기의 채집 용기로부터 밀봉가능한 조직 배양 용기로 전달될 수 있다. 전형적으로, 연동 펌프(15; 도 1a 및 도 1c) 수단이 밀폐 시스템에 사용된다.
본 발명의 다른 특징에서, 혈액 성분의 이종 혼합물이 예를 들어, 혈장, 혈소판, 적혈구 등을 포함하는 비-백혈구 혈액 성분의 혼합물로부터 선택적으로 제거하여 백혈구에 대해 상당히 농축된다. 본원에 사용될 때, 용어 "상당히 농축된"은 필요한 만큼의 회수의 재순환 후의 농축액에 회복된 세포군이 원하는 세포 타입(예를 들어, 백혈구)을 약 20%이상, 또는 약 40%이상, 또는 약 60%이상 포함함을 의미한다. 다른 실시예들에서, 혈액 성분의 이종 혼합물이 백혈구에 대해 농축되어 비-백혈구 혈액 성분이 실질적으로 없는 농축된 백혈구 군을 형성한다. 본원에 사용될 때, 용어 "실질적으로 없는"은 농축된 백혈구 군이 50%이상 백혈구를 포함함을 의미한다.
본 발명의 상기 특징의 일 실시예에서, TFF 장치는 약 55ml의 용적을 갖는 교차류 챔버(3)와 약 25ml의 용적을 갖는 여과액 챔버(4)를 포함한다. 또한, 장치는 약 1 내지 약 10미크론, 약 2 내지 약 8미크론, 약 3 내지 약 5미크론의 필터 기공 사이즈; 약 1600 내지 약 1800ml/분의 입력율; 약 12 내지 약 17ml/분의 여과율; 약 142mm의 필터 직경을 포함한다. 초기 유체 혼합물은 전형적으로 약 107 세포/ml 이상의 세포 농도(예를 들어, 백혈구와 다른 세포)를 갖는다.
본 발명의 다른 특징에서, 혈액 성분의 이종 혼합물이 예를 들어, 혼합물로부터 림프구를 제거하는 것을 포함하는 비-단핵구 혈액 성분을 선택적으로 제거하여 단핵구가 상당히 농축된다. 본원에서 사용될 때, 용어 "선택적 제거", "선택적으로 제거된" 및 "선택적으로 제거하는"은 다른 세포 타입에 대해 농축되고 한 가지 세포 타입을 제거하는 것을 의미한다. 이 양태의 실시예에서, TFF 장치는 약 55ml의 용적을 갖는 교차류 챔버(3)와 약 25ml의 용적을 갖는 여과액 챔버(4)를 포함한다. 또한, 장치는 약 1 내지 약 10미크론, 약 2 내지 약 8미크론, 약 3 내지 약 5미크론의 필터 기공 사이즈; 약 1600 내지 약 1800ml/분의 입력율; 약 12 내지 약 17ml/분의 여과율; 약 142mm의 필터 직경을 포함한다. 초기 유체 혼합물은 전형적으로 약 107 세포/ml 이상의 세포 농도(예를 들어, 단핵구와 다른 세포)를 갖는다. 이 실시예에서, 장치는 역전된 방식으로 작동되었다.
농축된 세포군의 배양, 증식 및 분화
상술한 바와 같은 백혈구 세포군의 농축 후에, 백혈구는 그 생활력을 유지하도록 선택적으로 배양되어, 세포 개수를 증가시키고 및/또는 세포를 다른 세포 타입과 분화한다. 적절한 조직 배양 용기에는 예를 들어, 조직 배양 플래스크, 백, 판, (발효기를 포함하는) 생물 반응기(bioreactor) 등이 포함된다.
일 실시예에서, 농축된 백혈구 군이 생물 반응기, 조직 배양 백 등과 같은 밀폐된 무균 상태 시스템 내에서 배양될 수 있다. 밀폐 시스템은 유체(예를 들어, 조직 배양 매체, 세정 완충제), 가스, 세포 등의 제어된 무균상태 도입 또는 제거를 위한 입구 및/또는 출구를 가질 수 있다.
다른 실시예에서, 농축된 백혈구 군이 생물 반응기로 전달될 수 있다. 생물 반응기는 세포, 무균 가스(예를 들어, 산소, 이산화 탄소, 및/또는 공기), 조직 배양 매체 등을 도입하기 위한 적절한 입구 및/또는 출구를 구비할 수 있다. 생물 반응기는 온도 제어 수단을 가질 수도 있다. 생물 반응기는 전형적으로 약 37℃에서 작동된다. 생물 반응기는 생물 반응기 내의 세포 및/또는 배양 매체를 교반하는 수단을 포함할 수도 있다. 교반 수단은 예를 들어, 주걱(paddle) 또는 스핀 필터(매체에 대한 출구로서 기능할수도 있음)를 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 농축된 백혈구 군이 조직 배양 백과 같은 밀폐 시스템에 전달될 수 있다. 적절한 조직 배양 백은 예를 들어, 스터리셀(STERICELL??) 배양 컨테이너(넥셀 세라퓨틱스 인크.) 또는 테플론(TEFLON??) 배양 백(어메리컨 플루오르실 코포레이션)을 포함할 수 있다. 밀폐 시스템은 당업자에게 이해되는 바와 같이, 임의의 적절한 사이즈 또는 체적을 가질 수 있다. 적절한 체적에는, 예를 들어 약 0.01 리터 내지 약 5 리터, 또는 약 0.01 리터 내지 약 0.05 리터가 포함되지만, 보다 크거나 작은 체적도 가능하며 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에 따른 다양한 실시예들에서, 농축된 백혈구 군(예를 들어, 단핵구, 단핵구 가지 세포 전구체, CD34+ 조혈 가지 세포, 또는 다른 전구체 세포)이 예를 들어, 미숙한 또는 성숙한 가지 세포 f-대식세포, CD34+ 조혈 가지 또는 전구체 세포 또는 다른 전구체 세포를 포함하는 특정한 세포 타입의 세포를 얻기 위해 적절한 유도제를 첨가하여 선택적으로 배양되고 분화될 수 있다. 적절한 조직 배양 매체에는 예를 들어, AIM-V, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15TM 등이 포함된다. 조직 배양 매체는 세포의 예를 들어, 미숙한 가지 세포로의 분화를 촉진하기 위해 과립백혈구(granulocyte)/대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 및/또는 인터루킨(interleukin) 4(IL-4), 이가 양이온(divalent cation) 등과 같은 아미노산, 비타민, 시토카인을 필요에 따라 보충할 수 있다. 전형적인 시토카인 조성은 GM-CSF와 IL-4 각각에 대해 약 500 유닛/ml이다.
농축된 백혈구 군은 임의의 적절한 때에 배양될 수 있다. 특정한 실시예들에서, 세포의 미숙한 가지 세포로의 분화를 위한 적절한 배양 시간은 약 4 내지 7일일 수 있다. 전구체로부터 미숙한 가지 세포의 분화는 세포 표면 마커(예를 들어, CD14-, CD11c+, CD83lo, HLA-DR+)의 존재 또는 부재에 의한 것과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 미숙한 가지 세포는 추가 분화 또는 항원 양수(uptake), 처리 및 제공을 위한 상태로 미숙한 가지 세포를 유지하거나 및/또는 세포군 증식을 위해 적절한 조직 배양 매체 내에서 배양될 수도 있다. 예를 들어, 미숙한 가지 세포는 GM-CSF와 IL-4의 존재 하에서 유지될 수 있다.
특정한 실시예들에서, 미숙한 가지 세포는 새로운 항원을 처리할 수 있는 능력을 유지하기 때문에 최적의 항원 제공에 대해 선호된다. (예를 들어, 코흐 등의 J. Immunol. 155:93-100, 1995. 참조). 대조적으로, 처리 항원에 대해 노출되었고 적절한 숙성제에 노출된 성숙한 가지 세포(예를 들어, CD14-, CD11c+, CD83+, CD86+, HLA-DR+)는 전형적으로, 새로운 항원을 효과적으로 처리하는 능력을 상실했다.
배양 중에, 미숙한 가지 세포는 예정된 항원에 선택적으로 노출될 수 있다. 적절한 예정된 항원은 (예를 들어, 활성화, 증식의 자극, 에너지 유도 등을 위해) T-세포에 제공하기 위한 임의의 항원을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 미숙한 가지 세포는 예를 들어, (예를 들어 암 면역치료 및/또는 종량 성장 억제를 위해) 전립선에 특정적인 막 항원(PSMA)과 같은, 종양과 관련한 항원의 존재하에서 배양된다. 다른 항원은 예를 들어, 박테리아 및 바이러스 항원, 종양에 특정적인 또는 종양과 관련한 항원(예를 들어, 종양 세포 용해질, 종양 세포 막 제제, 종양으로부터 격리된 항원, 융합 단백질, 리포좀 등), 및 임의의 다른 항원을 포함할 수 있다. 항원과 접촉한 후에, 세포들은 항원-특정적인 가지 세포군 등을 증식시키기 위해 항원 양수 및 처리가 가능하도록 임의의 적절한 시간 동안 배양될 수 있다. 미숙한 가지 세포는 MHC 분자의 관점에서 항원을 제공하는 성숙한 가지 세포로 숙성될 수도 있다. 이러한 숙성은 예를 들어 시토카인(예를 들어, TNF-α), 박테리아 생성물(예를 들어, BCG) 등과 같은 숙성 요인의 존재하에서 배양에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에서, 혈액 성분의 이종 혼합물이 단핵구 전구체 가지 세포에 대해 상당히 농축된다. 상술한 바와 같이 백혈구 또는 단핵구에 대한 세포군의 농축 후에, 말초 혈액으로부터와 같이 단핵구 가지 세포 전구체가 기질(예를 들어, 단핵구 가지 세포 전구체 결합 기질)에의 선택적인 고착을 통해 농축된 군으로부터 격리될 수 있다. 이러한 기질은 예를 들어, 조직 배양 원반 또는 플래스크에 의해 제공될 수 있다. 다르게는, (그 내용이 본원에 참고문헌으로서 포함되는 2002년 7월 25일 출원된 PCT/US02/23865호에 공개된 바와 같이) 미립자 또는 섬유질 기질과 같은, 높은 표면적 대 체적비를 갖는 기질이 사용될 수 있다. 단핵구 가지 세포 전구체는 단핵구 가지 세포 전구체와 기질의 복합체를 형성하기 위해 기질에 선택적으로 고착하지만 다른 백혈구는 결합되지 않은("고착되지 않은") 상태를 유지하는 단핵구일 수 있다. 그 다음에, 결합된 백혈구가 결합되지 않은 백혈구로부터 분리되어 기질 상에 단핵구 가지 세포 전구체가 풍부한 세포군을 형성한다. 단핵구 가지 세포 전구체는 기질 상에서 배양 및 분화되거나, 또는 기질로부터 세척된 다음에 개별적으로 배양 및 분화되어, 미성숙 및/또는 성숙한, 항원-제공 가지 세포를 얻을 수 있다. 이 특징에 따르면, 단핵구 가지 세포 전구체는 밀폐된 무균상태 시스템에서 선택적으로 격리 및 분화될 수 있다.
다른 특징에 따르면, 예정된 항원에 노출된 가지 세포는 항원에 대해 생체 내외에서 T 세포를 활성화하는데 사용될 수 있다. 가지 세포는 T 세포를 자극하기 위해 항원에 노출된 직후에 선택적으로 사용될 수 있다. 다르게는, 가지 세포는 항원과 T 세포에 노출되기 전에 시토카인(예를 들어, GM-CSF와 IL-4)의 조합물의 존재 하에서 유지될 수 있다. 특정한 일 실시예에서, 인간의 가지 세포가 생체 내외에서 인간의 T 세포를 자극하는데 사용된다.
T 세포 또는 T 세포의 부분집합(subset)이 다양한 림프 조직으로부터 얻어질 수 있다. 이러한 조직은 비장, 림프 절, 말초 혈액을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. T 세포 정제는 예를 들어, CD2, CD3, CD4, CD5, 및/또는 CD8에 대한 항체를 사용하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적극적 또는 소극적인 선택에 의해 이루어질 수 있다.
T 세포는 혼합된 T 세포군 또는 정제된 T 세포 부분집합으로서 예정된 항원에 노출된 가지 세포와 함께 배양될 수 있다. 예를 들어, 정제된 CD8+ T 세포는 항원에 특정적인 CTL을 알아내기 위해 항원에 노출된 가지 세포와 함께 배양될 수 있다. 특정한 실시예들에서, CD4+ T 세포를 일찍 제거하면 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두의 혼합된 배약체 내의 CD4+ 세포의 과다 성장을 방지할 수 있다. 다르게는, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합군이 세포독성 및 TH 면역반응 모두를 포함하는 항원에 특정적인 반응을 알아내기 위해 가지 세포와 함께 배양될 수 있다.
이러한 자극된 T 세포는 선택적으로 환자들에 재 주입될 수 있다. (예를 들어, 리들과 그린버그의 J. 항균 화학요법 45:35-43, 2000; 코릴 등의 J. 신경면역학 107:130-39, 2000 참고; 이들의 내용은 참고문헌으로서 본원에 포함됨). 예를 들어, 미숙한 가지 세포가 항원(예를 들어, PSMA)과 접촉하고 숙성되어 성숙한 가지 세포를 형성할 수 있다. T 세포는 환자로부터 격리되고 생체 외에서 성숙한 가지 세포와 접촉한 다음에 환자에 재-투여될 수 있다. 예를 들어, 약 1 x 107 내지 5 x 109의 CD8+ T 세포의 투여량이 1 내지 4달 이상의 기간동안 매주, 또는 격주마다 환자에게 투여될 수 있다. 다르게는, 성숙한 가지 세포는 환자에게 직접 투여될 수 있다. 전형적으로 약 1 x 107의 가지 세포가 환자에게의 1회 투여량으로 사용된다.
전형적으로, 가지 세포 집중제와 함께 처리된 제공자(donor)로부터의 림프구 채집 결과물은 상당한 양의 적혈구와 혈소판과 함께 약 10 내지 약 25% 단핵구 주변에 약 1 내지 5% 세포, 약 5 내지 약 20%의 과립백혈구, 약 40 내지 약 60%의 림프구를 포함한다. 약 3 내지 약 5.5 미크론의 기공 사이즈를 갖는 필터를 갖는 본 발명의 TFF 장치를 사용하면 약 60 내지 70%의 단핵구와, 거의 과립백혈구가 없고, 약 10% 림프구와 약 10 내지 약 40%의 CD34+ 세포를 포함하는 농축된 백혈구 군이 얻어진다. 이러한 농축된 백혈구 군은 하기에 제시된 바와 같이 사용될 수 있다.
다른 실시예들에서, 본 발명의 방법은 단핵구 또는 단핵구 가지 세포 전구체 이외의 세포 부분집합을 얻는데 사용된다. 예를 들어, 농축된 백혈구 군은 유전적으로 다른 사람에게의 또는 자가 변환이식을 위한 조혈 가지 세포원으로서 사용될 수 있다. 특정한 실시예들에서, 농축된 백혈구 군은 접선방향 유동 분리 절차 후에 가지 세포에 대해 추가로 농축될 수 있다. 말초 혈액 백혈구원으로부터의 조혈 가지 세포의 농축 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 설명된 바와 같이 격리된 농축된 백혈구 군과 함께 사용하기 위해 적용될 수 있다. 예를 들어, 농축된 백혈구 군은 예를 들어, 면역자석 분리 기술(예를 들어, 로울리 등의 골수 이식 21:1253, 1998; 데닝-켄달 등의 Br. J. 혈액학 105:780, 1999 참조)을 사용하여 추가로 농축될 수 있다. 부가적으로, 가지 세포 수율을 더 증가시키기 위해, 본 발명에 설명된 TFF 이후에 단핵구가 농축된 세포군이 예를 들어, CD34+ 세포를 유도하기 위해 탯줄 혈청을 담고 있는 매체 내의 약 50 ng/ml M-CSF의 존재하에서 배양될 수 있다. 배양은 테플론 배양 백과 같은 비-고착성 세포 배양 컨테이너 내에서 실시되어야 한다. 또한, 말초 혈액 제공자는 말초 혈액의 채집 및 TFF에 의한 백혈구의 분리 전에 가지 세포 집중 요양법(mobilizing regimen)을 받을 수 있다. 가지 세포 수확 효율을 증가시키기 위한 다양한 집중제가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 제공자는 GM-CSF, G-CSF, AMD3100 (또는 다른 CXCR-4 기능을 억제하는 시약) 및/또는 예를 들어, 다량 또는 소량의 시클로포파미드와 같은 집중 화학치료제로 치료받을 수 있다(예를 들어, 델리에 등의 백혈병 림프종, 43:1957, 2002 참조). 혈액 제공자는 이식을 받는 환자, 가까운 친척, HLA-대응 개인 등일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 관심있는 인자(예를 들어, 조혈 또는 혈관생성 성장 인자)를 분비하는 세포, 또는 선구체 세포가 풍부한 세포군(예를 들어, 조혈 또는 내피 선구체 세포)과 같은 가지 세포이 아닌 하부집합을 얻는데에도 사용된다. 예를 들어, 순환하는 내피 선구체 세포(CEPs)는 예를 들어 VEGFR-2와 AC133의 공동-발현(및 예를 들어, VE-카드헤린(cadherin)과 E-실렉틴(selectin))에 의해 순환하는 CD34+ 세포의 하부집합으로서 인식될 수 있다. 농축된 백혈구 군은 예를 들어, VEGFR-2와 AC133에 대한 항체와 함께 면역 자기 분리 기술을 사용하여 CEPs에 대해 추가로 농축될 수 있다. 또한, CEPs는 예를 들어, VEGF와 같은 시토카인에 의한 치료에 의해 TFF 전에 집중될 수 있다(예를 들어, 질 등의 Circ Res., 88;167, 2001 참조). 또한, 또 다른 실시예에서, 내피와 같은 순환하는 혈관생성 세포(CACs)(예를 들어, VEGF, HGF, G-CSF, 및 GM-CSF를 분비함)가 예를 들어, 섬유결합소가 코팅된 표면 상의 VEGF, bFGF, IGF-1, EGF, 및 FBS로 농축된 백혈구 군을 배양한 다음에 비-고착 세포를 폐기하여 얻어진다(예를 들어, 레만 등의 순환 107:1164, 2003 참조).
또한, 농축된 백혈구 군이 배양되어 다능성 선구체 또는 가지 세포의 증식을 유도할 수 있다. 예를 들어, CD34+ 가지 세포가 예를 들어, IL-1, IL-3, IL-6, 가지 세포 인자(SCF), 과립백혈구-단핵구 집락-자극 인자(GM-CSF) 및 G-CSF의 조합과 같은 조혈 성장 인자와 함께 배양하여 증식될 수 있다(예를 들어, 선 등의 혈액학 88:561, 2003 참조). 다르게는, 예를 들어, 농축된 단핵구 군이 예를 들어, M-CSF, LIF, 및/또는 IL-6와 함께 처리되어 다능성 "f-대식세포"(f-MΦ)를 얻을 수 있고, 이는 형태학적으로 표준의 대식세포와는 다르게 섬유모세포를 닮았고, 상승된 레벨의 CD34를 나타낸다(자오 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2426, 2003 참조). 선구체 또는 가지 세포는 이후에 임의의 다양한 시토카인과 성장 인자들로 처리되어 조혈 또는 비-조혈 혈통으로의 분호를 유도할 수 있다.
다른 실시예들에서, 농축된 백혈구 군이 분화(예를 들어, 선구체 세포의 분화, 또는 단핵구 또는 단핵구에서 유도된 가지 세포와 같은 보다 분화된 세포 타입의 전환분화)를 유도하기 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. (본원에서 사용될 때, "전환분화"는 일반적으로 세포를 분할할 필요없이 분화된 세포의 표현형 조절 과정을 의미하며 이에 의해 분화된 세포는 형태학적으로 및/또는 기능적으로 상이한 세포 타입으로 분화된다.) 예를 들어, 가지 세포로의 분화에 부가하여, 단핵구가 배양 조건에 따라 예를 들어, 대식세포, 파골세포, 및 내피세포와 같은 세포를 포함하는 다른 조혈 또는 비-조혈 세포 타입으로 변형될 수 있다(예를 들어, 베커 등의 J. 면역학 139:3703, 1987; 니콜슨 등의 임상 과학 99:133, 2000; 하베만 등의 신규한 혈관형성 메커니즘: 순환 선구체 내피 세포의 역할 47-57(Nicanor I. Moldovan eds., 2003) 참조). 일 실시예에서, 농축된 단핵구 또는 단핵구에서 유도된 가지 세포군이 예를 들어, 섬유결합소가 코팅된 표면 상의 VEGF, bFGF, IGF-1, 히드로코티손(hydrocortisone), 및 FBS와 함께 배양하여 내피세포와 같은 세포로 전환분화된다(상기 하베만 등의 문헌 참조). 또한, 농축된 백혈구 군은 임의의 다양한 시토카인 또는 성장 인자를 사용하여 비교적 분화되지 않은 세포 하부집합의 조혈 또는 비-조혈 혈통으로의 분화를 유도하는 조건하에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 단핵구에서 유도된 다능성 가지 세포(f-MΦ)는 예를 들어, LPS, IL-2, EGF, NGF, VEGF, 또는 HGF 각각으로 치료하여 표준의 대식세포, T 임파구, 외피 세포, 신경세포, 내피 세포, 또는 간세포로 분화하도록 유도될 수 있다(상기 자오의 문헌 참조). 이러한 분화는 예를 들어, 상술한 것과 같은 세포 증식 전후에 유도될 수 있다.
하기의 예들은 단지 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위해 제공되었고 절대로 본 발명을 제한하는 것으로 해석되면 안된다.
예 1: 루프 구성으로 제거기 유닛과 회복 유닛을 갖는 TFF 장치
본 발명의 일 실시예는 접선방향 유동 여과 장치의 루프 구성에서 제거기 유닛(1)과 회복 유닛(2)을 갖는 구성을 포함한다(도 1a). 회복 유닛은 약 1 미크론 내지 10 미크론의 기공 사이즈를 갖는 미세기공 필터(5; 직경 142mm)에 의해 분리된, 두 개의 챔버(교차류 챔버(3)와 여과액 챔버(4))를 갖는 하우징을 포함한다. 교차류 챔버는 유체 입구(6)와 유체 출구(7)를 포함한다. 여과액 챔버는 여과액 출구(8)를 포함한다. 회복 유닛은 복귀 입구(10), 복귀 출구(11), 샘플 입구(12), 용액 입구(13)를 포함하는 하우징(9)을 포함한다. 특정 실시예에서, 샘플 입구와 용액 입구는 동일하지만 분리될 수 있다. 샘플(예를 들어, 혈액, 혈액 제제, 또는 제제된 백혈구 군)이 샘플 입구(12)에 의해 회복 유닛으로 도입되었고, 재순환 펌프(14)의 작용에 의해 복귀 출구(11)를 통해 제거기 유닛으로 회수되었다. 샘플은 유체 입구(6)를 통해 제거기 유닛으로 도입되었고 미세기공 막(5)에 걸쳐 유동하여, 유체의 운동이 여과 방향에 접선방향으로 향해졌다. 유체 입구(6)는 필터의 반경에 일반적으로 직각으로 배치되었다. 상대적인 입구율, 여과율, 출구율은 와류를 유도하고, 그 중심은 필터를 지나지 않은 혈액 제제의 성분을 유체 출구(7)로 끌어들이고 다시 회복 유닛(2)에 가게 한다. 회복 유닛과 제거기 유닛 간의 유체 유동은 재순환 펌프(14)에 의해 제어된다. 제거기 유닛으로부터의 여과액의 제거는 여과액 펌프(15)에 의해 제어되었다.
예 2: TFF 후의 백혈구의 보존-농축 효율에서의 여과율과 재순환율의 영향
이 예에서, 직경 142mm의 폴리에스테르 막을 수용한 예 1에서 설명한 바와 같은 TFF 장치를 사용하는 백혈구의 농축이 예시되었다. 림프구 채집 제재의 샘플은 다양한 조건하에서 장치의 TFF를 거쳐갔고, 백혈구의 선택적인 유지가 평가되었다. 일 조건의 연구에서, TFF는 15ml/분(17분동안)의 여과율과 다양한 재순환(입력)율(예를 들어, 1680, 1380, 1080, 870, 및 540 ml/분)에서, 3미크론 필터를 사용하여 10ml의 림프구 채집 제재에 대해 수행되었다. 대부분의 백혈구는 일반적으로 재순환율이 1080 ml/분보다 낮지 않으면 (즉, 여과액 내의 백혈구의 약 10% 미만) 농축액에 유지되었다(도 2; 최대, 10, 9, 8, 7, 및 6으로 표시된 실제 재순환율은 각각 1680, 1380, 1080, 870 및 540ml/분에 상당하였다).
다른 조건의 연구들에서, TFF는 3가지 상이한 여과율(11, 15, 및 19.6 ml/분)에서 1080 ml/분의 재순환(입력)율로, 3미크론 필터를 사용하여 예 1의 TFF 장치에서 10ml의 림프구 채집 제재에 대해 수행되었다. 19.6 ml/분과 11ml/분 여과율 모두 백혈구의 유지에 대해 15ml/분의 여과율보다 실질적으로 더 유익하지 않았다(도 3).
예 3: 림프구 채집 제재로부터의 적혈구의 선택적 제거
이 예에서, 적혈구의 선택적인 제거와 예 1의 TFF 장치를 사용하여 분리 효율에 대한 재순환율, 여과율, 샘플 농도의 영향이 예시되었다. 림프구 채집 제재의 샘플은 도 2에 설정된 것과 같은 조건 하에서 TFF를 거쳤고, 적혈구의 선택적인 제거가 평가되었다. 예 2에서와 같이, TFF는 15ml/분(17분동안)의 여과율과 다양한 재순환(입력)율(예를 들어, 1680, 1380, 1080, 870, 및 540 ml/분)에서, 3미크론 필터를 사용하여 10ml의 림프구 채집 제재에 대해 수행되었다. 일반적으로, 재순환율을 감소시키면 더 많은 적혈구가 필터를 지나가게 함이 밝혀졌다(도 4; 최대, 10, 9, 8, 7, 및 6으로 표시된 실제 재순환율은 각각 1680, 1380, 1080, 870 및 540ml/분에 상당함). 재순환율을 감소시키면 농축액으로부터의 적혈구가 제거되지만, 1080ml/분보다 낮은 재순환율에서는 농축액 내의 백혈구의 수율이 감소되었음을 볼 수 있다(도 4).
예 2에서와 같이, TFF는 3가지 상이한 여과율(11, 15, 및 19.6 ml/분)에서 1080 ml/분의 재순환(입력)율로, 3미크론 필터를 사용하여 동일한 TFF 장치에서 10ml의 림프구 채집 제재에 대해 수행되었다. 약 250ml의 여과액이 조건당 채집되었다. 19.6 ml/분과 11ml/분 여과율 모두 적혈구의 선택적 제거에 대해 15ml/분의 여과율보다 실질적으로 더 유익하지 않았다(도 5). 19.6 ml/분의 여과율은 농축액에서의 적혈구가 감소되었지만, 예 2에서 볼 수 있는 바와 같이 15ml/분의 여과율이 농축액 내의 백혈구 수율이 더 높았다(도 3).
도 6을 참조하면, 샘플 내의 림프구 채집 재료의 농도 증가 영향이 또한 연구되었다. PBS + 헤파린 + DNase I에서 1:5로 희석된 50 ml의 림프구 채집 재료가 3미크론의 기공 사이즈를 갖는 필터를 갖는 장치를 사용하여 TFF를 받았다. 여과율이 약 15ml/분 또는 19.6ml/분이면 농축액 내의 적혈구의 백분율("RBC"로 표시)은 거의 동일하게 입력의 약 100%였다. 그러나, 50 ml의 림프구 채집 제재가 동일한 완충제에서 1:2로 희석되면, 입력 적혈구의 40%만이 농축액에 유지되어 샘플 농도를 높이면 백혈구로부터의 적혈구의 분리를 촉진할 수 있음을 도시한다("WBC"로 표시).
예 4: 림프구 채집 제재로부터의 적혈구의 선택적 제거 - 적혈구의 제거시 기공 사이즈의 영향
예 1에 제시된 TFF 장치의 실시예가 일정 비율 증가(scale-up)시에 유사하게 수행됨을 확인하기 위해, 120ml의 림프구 채집 제재(전체 유닛의 1/2)의 TFF가 3미크론 대 4.5미크론의 기공 사이즈를 갖는 필터들을 갖는 장치들에서 비교되었다. 재순환(입력)율은 1680ml/분이었고, 여과율은 15ml/분이었다. 도 7을 참조하면, 4.5미크론 필터를 사용하여 수행된 TFF에 대해, 약 80%의 적혈구("RBC"로 표시; 흑색 바)가 농축액으로부터 제거되고 약 62%의 입력 백혈구("WBC"로 표시; 밝게 해칭된 바), 약 70%이상의 입력 단핵구가 유지되었다. 대조적으로, 3미크론 필터를 사용하면, 약 65%의 입력 백혈구가 농축액에 유지되었지만 적혈구의 3%만이 제거되었다.
도 8을 참조하면, 45ml의 림프구 채집 제재의 TFF가 4.5미크론 대 8미크론의 기공 사이즈를 갖는 필터들을 갖는 장치들에서 비교되었다. 재순환(입력)율은 1680ml/분이었고, 여과율은 15ml/분이었고, 시간은 60분이었다. 4.5미크론 필터를 사용하여 수행된 TFF에 대해, 약 99%의 적혈구("RBC"로 표시; 흑색 바)가 농축액으로부터 제거되고 약 90%의 입력 백혈구("WBC"로 표시; 밝게 해칭된 바)가 유지되었다. 8미크론 필터를 사용하면, 약 98%의 입력 적혈구가 제거되지만 백혈구의 4%만이 유지되어, 4.5미크론 필터를 사용하는 것이 보다 큰 8미크론 기공 사이즈의 필터에 대해 동일한 적혈구 제거를 촉진하였지만, 백혈구의 유지율("WBC"로 표시)은 보다 높게 얻어졌다.
예 5: 혈소판과 혈장 제거 및 백혈구의 선택적 농축
이 예에서, 림프구 채집 제재의 샘플들이 다양한 조건 하에서 예 1에 설명된 장치에서 TFF를 받았고, 혈소판과 혈장의 선택적인 제거가 평가되었다. 표 1을 참조하면, 실험 1 내지 6에서, 45ml의 림프구 채집 제재가 4.5미크론 또는 8미크론 기공 사이즈 중의 어느 하나를 갖는 필터로 TFF를 받고, 재순환율(입력율)은 1690 또는 1880 ml/분 중의 어느 하나였고, 여과율은 15ml/분이었다. 여과는 표기된 바와 같이 60 또는 90분 중 어느 하나에 대해 실시되었다. TFF 후에, 농축액은 백혈구, 혈소판, 혈장에 대해 분석되었다. 모든 실험에서, 입력 혈소판의 92 내지 약 100%, 입력 혈장의 약 97 내지 약 99%가 기공 사이즈(4.5미크론 또는 8미크론), 재순환(입력)율(1690 또는 1880ml/분), 시간(60분 또는 90분)에 무관하게 농축액으로부터 제거되었다. 실험 7에 대해, 모든 림프구 채집 제재(250ml)가 90분의 지속시간에 대해 15ml/분 여과율, 1690ml/분 재순환(입력)율, 4.5미크론 기공 사이즈를 사용하여 TFF를 받았다. TFF 후에, 농축액이 분석되었고, 입력 백혈구의 약 84%를 갖지만 약 2%만의 입력 혈소판과 3%의 입력 혈장을 가짐이 밝혀졌다.
PBMC의 농축액에서 필터 기공 사이즈의 영향
림프구 채집물 입력 기공 사이즈 재순환율 시간 농축액에서의 %입력WBC 농축액에서의 %입력 혈소판 농축액에서의 %입력 혈장
Exp 1 45ml 4.5㎛ 1690ml/min 60min 88 2.0 2.0
Exp 2 45ml 4.5㎛ 1690ml/min 60min 67 8.0 2.0
Exp 3 45ml 4.5㎛ 1690ml/min 60min 79 3.0 1.0
Exp 4 45ml 4.5㎛ 1888ml/min 60min 92 0.0 1.0
45ml 8㎛ 1888ml/min 60min 4 0.0 1.0
Exp 5 45ml 4.5㎛ 1690ml/min 60min 130 3.0 3.0
45ml 4.5㎛ 1880ml/min 60min 47 3.0 2.0
Exp 6 45ml 4.5㎛ 1690ml/min 60min 80 1.0 2.0
45ml 4.5㎛ 1690ml/min 60min 72 0.2 2.0
Exp 7 250ml 4.5㎛ 1690ml/min 90min 84 2.0 3.0
이들 실험은 TFF가 여러 기공 사이즈(4.5미크론 또는 8미크론), 재순환(입력)율(1690 또는 1880ml/분), 림프구 채집 샘플의 체적(45ml 내지 250ml), 및 시간(60분 내지 90분)에 대해 대부분의 혈소판과 혈장을 제거함을 보인다.
예 6: 전체 림프구 채집 제재로부터의 백혈구의 선택적 농축
이 실시예의 TFF 장치가 보다 큰 샘플 사이즈로 증가될 때 재현가능하게 수행됨을 확인하기 위해, 5X 장치로 표기된 TFF 장치가 4.5미크론 기공 사이즈 필터, 1680ml/분의 재순환율, 15ml/분의 여과율을 사용하여 250ml의 림프구 채집 제재(전체 유닛)와 함께 사용되었고, 보다 낮은 입력 체적과 비교되었다. 도 9를 참조하면, TFF는 90분동안 3가지 상이한 백혈구 제재에 대해 상이한 일수 동안 수행되었다. 적혈구의 80 내지 95%가 농축액으로부터 제거되었지만, 약 80 내지 약 100%의 입력 단핵구가 유지되었다. 도 9에서 실험 1에 대한 TFF 후에, 농축액이 분석되었고 약 2%의 입력 혈소판과 3%의 입력 혈장만을 가짐이 밝혀졌다(표 1의 실험 7로 표시). 이들 데이터는 TFF가 백혈구에 대해 재현가능하게 농축할 수 있고 바람직하게는 농축액으로부터 적혈구, 혈소판, 혈장을 제거함을 보인다.
예 7: 단핵구용 혈액 제제를 선택적으로 농축하기 위한 TFF 장치
백혈구의 농축에 부가하여, 혈액 제재로부터의 단핵구의 선택적인 농축이 TFF 장치를 사용하여 시험되었다. 이러한 특정한 실시예의 장치는 막에 걸친 중력의 방향을 바꿔 유동 역학을 바꾸도록 설계된 역전된("타입 IV") 구조를 포함한다(도 1c). 235ml의 림프구 채집물 제재가 4.5미크론 기공 사이즈 필터, 1680ml/분의 재순환율, 15ml/분의 여과율을 사용하여 90분동안 TFF를 받았다. 60분의 TFF 후에, 유효 여과액을 증가시키기 위해, 빈 체적이 약 120ml 로 감소되었다. 입력, 농축액, 및 여과액은 각각 세포 함량에 대해 분석되었다. 입력은 32%의 단핵구와 65%의 림프구였던 반면에, 농축액은 22%의 림프구에 비해 약 71%의 단핵구를 가짐이 밝혀졌다. 여과액은 83%의 림프구에 비해 1.5%의 단핵구를 포함한다.(표 2 참조).
타입 IV(역전된) TFF 구성을 사용한 단핵구의 농축
입력 농축물 여과물
단핵구 개수(x 109) 2.85 1.37 0.861
림프구 개수(x 109) 5.67 0.428 4.86
과립백혈구개수(x109) 0.133 0.0571 0.0797
RBC 개수(x 109) 64.6 1.37 78.9
WBC 개수(x 109) 8.78 1.93 5.86
%단핵구 32.46 71.1 14.7
%림프구 64.54 22.17 82.88
%과립백혈구 0.0151 2.96 1.36
용해되지 않음(x 109) 73.4 3.30 84.8
예 8: TFF 에 의해 격리된 세포로부터 가지 세포들의 생성
이 예에서, TFF에 의해 격리되고 정제된 세포군이 단핵구 전구체 가지 세포로부터 가지 세포를 숙성시키기 위해 표준 조건하에서 배양되었다. TFF에 의해 격리된 세포군은 약 58.6% 단구체, 22% 림프구, 12.5% 과립 백혈구를 포함하였다. 이러한 세포 혼합물은 IL-4와 GM-CSF 각각에 대해 500U이고 X-Vivo 15 매체내에서 조직 배양 백으로 도입되었다. 5일 후에, 약 50%이 세포가 수확되었고 DC 마커(marker)로 얼룩졌고 유동세포측정(flowcytometric)에 의해 분석되었다. 세포의 다른 약 50%는 숙성제, BCG(2.8 x 105 pfu/ml) 및 IFNυ(1000 U/ml)에 노출되었다. 24시간 후에, 이들 세포도 수확되고 동일한 방식으로 분석되었다. 표 3은 이들 분석 결과를 도시한다. 제시된 값들은 가지 세포들 중의 즉 많은 세포를 동기화(gating)한 후의 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
미숙한 및 성숙한 가지 세포의 세포 표면 마커의 검출
마커 미숙한 DC(%양성) 성숙한 DC(%양성)
CD14 10 2
CD11c 99 96
CD1a 70 69
CD80 75 74
CD83 7 34
CD86 90 89
CD541 100 98
MHC II1 56 72
이들 마커는 숙성 후 양성 세포 중의 평균 발광 강도(MFT)의 큰 증가를 보인다.
유동세포측정 분석의 전방 광 산란 및 측방 산란 변수들에 근거하여, 미숙한 가지 세포군은 약 71%의 살아있는 DC, 21%의 림프구와 7%의 다른 세포(대부분 알 수 없는 종의 죽은 세포)를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 성숙한 가지 세포군은 약 61%의 살아있는 DC, 21%의 림프구와 15%의 다른 세포를 포함하였다. 이들 결과는 TFF에 의해 림프구 채집 제재로부터 직접 정제된 단핵구가 가지 세포를 숙성시키는 표준 배양 조건을 사용하여 효율적으로 변환될 수 있음을 나타낸다.
예 8: 글래스 비드 상의 단핵구의 격리
농축된 백혈구 군이 이전의 예들 중의 임의의 하나에 따른 TFF에 의해 격리된다. TFF 중에, 완충제가 1%열-비활성화된 자가 혈장(결합 매체)을 포함하는 AIM-V 매체(깁코-라이프 사이언스)로 대체되었다. 글래스 비드(20g)가 결합 매체에서 2번 세척하여 준비되고 이후에 컬럼 층(column bed)을 형성하기 위해 비드를 보유하도록 프릿(frit)을 구비한 60 ml 주사기 내에 배치된다.(다르게는, (솔로힐 엔지니어링 인크로부터의 스티렌 공중합체 비드로 처리된) 플라스틱 플러스(Plastic Plus) 마이크로캐리어 비드, 또는 (솔로힐 엔지니어링 인크로부터의 스티렌 공중합체 비드로 처리된)힐엑스(HilleX) 마이크로캐리어 비드가 사용될 수 있다.) 그 다음에, 결합 매체가 컬럼 층으로부터 중력에 의해 유동하여 배수된다. TFF로부터 농축된 백혈구 군이 컬럼에 가해지고, 임의의 관통유동이 채집되었다. 결합 매체가 첨가되어 컬럼 층 상의 작은 액체층을 제공한다. 세포를 갖는 컬럼은 30분동안 37℃에서 배양되었다.
배양 후에, 컬럼의 포트가 개방되고, 관통 유동이 채집되었다. 그 다음에 컬럼 층이 결합 매체(세척당 35ml)컬럼 포트를 통해 여러번 투여 및 제거되어 6번 세척되어 비드들이 부드럽게 재부유하게 한다. 이러한 세척 후에는 인산염완충식염수("PBS")로 2번 세척된다. 세포 개수가 원래의 관통유동과 모든 세정액에 대해 얻어지고, 이들은 전방 및 측방 산란 FACS 분석에 의해 분석되어 존재하는 단핵구의 백분율을 판정한다. 세척완료 후에, 결합된 단핵구가 PBS/0, 3% EDTA(w/v)를 사용하여 비드로부터 세척된 이후에 한번 더 PBS로 세척된다. 이러한 비율로 얻어지는 세포들은 세정액과 같은 방식으로 분석된다. 단핵구가 많은 비율이 저장(pool)된다.
예 9: 글래스 비드로부터 추출된 단핵구로부터의 가지 세포의 분화
단핵구는 30ml의 PBS로 2번 세척되고 배양 매체(500U의 GM-CSF/ml와 500U의 인터류킨 4/ml과 함께 X-VIVO 15(바이오휘테이커 코퍼레이션)) 내에 재부유된다. 그 다음에, 세포 부유물의 일부(2/3)가 회전식 생물 반응기(신세컨)로 전달되고 5% CO2를 포함하는 습한 환경 내에서 37℃로 6일 동안 배양되었다. 배양 후에, 세포군은 세포 사이즈, 입자성 및 세포 표면 마커에 근거하여 약 70%의 미성숙 가지 세포를 포함한다.
예 10: 전립선(prostate)에 특정적인 항원을 갖는 미성숙 가지 세포의 활성화
단핵구는 이전의 예들에서 설명한 바와 같이 전립선 암 환자로부터 격리된다. 단핵구는 37℃로 6일 동안 GM-CSF와 인터류킨 4(각각 500U/ml)를 보충한 X-VIVO 15 조직 배양 매체 내에서 조직 배양 백 내에서 배양된다. 그 다음에, 결과적인 미성숙 가지 세포가 배양 매체에 첨가된, 전립선에 특정적인 항원(MSMA)(미국 특허 제 5,788,963호에 설명된 바와 같이 격리됨)에 노출된다. 그 다음에, 미성숙 가지 세포가 분화되어 숙성제를 사용하여 성숙한 가지 세포를 형성한다. 성숙한(활성화된) 가지 세포는 T 세포 증식 분석을 위해 첨가된다. T 세포 배양물은 마이크로티터(microtiter) 판의 1 μCi3H-티미딘/웰을 첨가하기 전에 5일동안 5%의 CO2가 보충된 습한 37℃의 인큐베이터 내에서 배양된다. 24시간 배양 후에, 세포는 반자동 세포 수확기(버지니아주, 스테비나, 스카트론)로 수확되고, 채집된 새포의 방사성이 판정된다. T 셀 증식은 평균 3H-TdR 합일화(incorporation)의 측정에 의해 분석되었다.
예 11: 현재의 항원에 대한 배양된 숙성된 가지 세포의 능력
배양된 숙성된 가지 세포의 현재의 항원에 대한 능력을 평가하고 동일한 환자로부터의 자가 T 세포를 자극하기 위해, T 세포 증식 분석이 상술한 바와 같이 수행되었다(예 10). 환자의 메모리 T 세포가 생체 밖에서 활성화될 수 있는지 판정하기 위해 이들 실험에서 대표적인 항원으로서 파상풍 변성독소가 선택되었다. 환자의 가지 세포와 함께 배양된 자가 T 세포와 파상풍 변성독소는 (가지 세포 부재시) 백그라운드 레벨보다 상당히 높은 레벨로 증식하고, 파상풍 변성독소이 없는 성숙한 (활성화된) 가지 세포와 함께 배양된 T 세포보다 상당히 높은 레벨로 증식한다(즉, 자가 혼합된 림프구 반응을 보임). 그러므로, 가지 세포에 의한 파상풍 변성독소의 제공은 T 세포 증식에 유용하다.
예 12: 자가 T 세포의 자극
전립선 암에 대해 특정적인 숙성된(활성화된) 가지 세포가 전립선 암 환자의 자가 T 세포를 자극하는데 사용된다. LNCaP 세포의 천연 세포 용해질, 전이 전립선 암 세포 라인이 (본원에 참고문헌으로서 그 내용이 포함되는) 미국 특허 제 5,788,963호에 공개된 바와 같이 일반적으로 T 세포 증식에서 대표적인 전립선 암 항원으로서 사용된다. 성숙한 활성화된 가지 세포와 LNCaP 용해질이 모두 T 세포 배양물에 포함될 때 3H-TdR 합일화의 상당한 증가가 관측되었다.
예 13: 자극된 자가 T 세포의 환자에게의 투여
T 세포는 환자로부터의 림프구 채집에 의해 준비된다. T 세포는 성숙한 활성화된 가지 세포와 접촉된다. 가지 세포는 LNCaP 세포의 천연 세포 용해질, 전이 전립선 암 세포 라인과 접촉한 후에 숙성된다. 접촉 후에, T 세포와 가지 세포가 배양 및 증식된다. 증식된, 활성화된 T 세포는 1회 투여량당 약 107 내지 약 5 x 109 세포의 투여량으로 환자에게 투여되었다.
예 14: 단핵구의 CD 34 + 가지 세포로의 변환
말초 혈액에서의 CD34+ 세포의 백분율이 약 0.01% 내지 약 0.1% 범위로 매우 낮다. CD34+ 세포는 조혈 기능의 성공적인 이식에 필요한 세포 타입으로 인식되어 있다. 단핵구는 상술한 장치 및 방법을 사용하여 말초 혈액으로부터 격리되어 1 내지 2 x 109 단핵구를 산출할 수 있다. 그 다음에, 이들 세포는 CD34+ 세포를 유도하기 위해 소의 태아 혈청을 함유하는 매체 내에 50 ng/ml M-CSF 내에서 배양될 수 있다. 배양은 테플론 배양 백과 같은 비-고착성 환경에서 수행되어야 한다. 표준 폴리스티렌 조직 배양 플래스크에서의 배양은 CD34+ 세포로 발육되지 않는다. 배양시 큰 세포를 분석한 결과 CD34+ 세포가 보다 큰 사이즈 범위로 나타났다.
M-CSF 내의 배양 후의 단핵구 상의 CD34의 발현
CD34+ 세포의 백분율
배양 백 내의 배양물 21
큰 세포의 동기화 58
플래스크 내의 배양물 6
큰 세포의 동기화 11
이 방법에 의해 제제된 CD34+ 세포는 수혜자의 골수를 재구성하도록 이식에 사용되거나, 또는 예를 들어, 심근 경색증 등의 치료시에 사용하기 위한 내피 세포를 생성하기 위해 다른 시네카인의 존재 하에 추가로 배양될 수 있다.
본원에 제공된 예들은 예시를 위한 것으로 본 발명의 청구범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 다른 변형은 당업자에게 쉽게 이해될 것이고 첨부된 청구범위에 의해 포함된다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 다른 참고문헌들은 본원에 참고문헌으로서 포함된다.

Claims (69)

  1. 백혈구가 농축된 세포군(cell population)을 만드는 접선방향 유동 여과 장치에 있어서,
    교차류 챔버(cross-flow chamber), 여과액 챔버와 그 사이에 배치되며, 교차류 챔버 및 여과액 챔버와 유체가 서로 통하는 필터를 갖는 제거기 유닛(remover unit)을 포함하고;
    상기 교차류 챔버는 입구 및 출구를 갖고, 입구는 백혈구를 포함하는 혈액 성분들의 샘플을 필터의 표면에 평행하게 교차류 챔버로 도입하도록 배치되고; 출구는 필터 표면 반대쪽의 교차류 챔버의 일부분의 중앙에 배치되고;
    상기 필터는 약 1 내지 약 10 미크론 범위의 평균 기공 사이즈를 가짐으로써; 필터에 걸친 샘플 유동이 백혈구에 대한 혈액 성분들의 샘플을 농축하는, 백혈구가 농축된 세포군을 만드는 접선방향 유동 여과 장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 교차류 챔버의 입구에 예정된 입력율의 샘플을 제공하는 수단과;
    상기 필터를 지나 여과액 챔버로의 여과액의 여과율을 제어하는 수단을 추가로 포함하고;
    상기 여과율 제어 수단은 필터에 대해 방해받지 않는 여과율보다 작은 여과율로 제한하는 접선방향 유동 여과 장치.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 필터 기공 사이즈는 약 3 미크론 내지 약 7 미크론인 접선방향 유동 여과 장치.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 필터 기공 사이즈는 약 3 미크론 내지 약 5.5 미크론인 접선방향 유동 여과 장치.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 교차류 챔버 입구와 유체가 서로 통하는 혈액 성분원(source of blood constituents)을 추가로 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 혈액 성분원은 림프구 채집 장치인 접선방향 유동 여과 장치.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    입구 및 출구를 포함하는 회복 유닛을 추가로 포함하고, 교차류 챔버와 회복 유닛은 루프 형태로 상호 연결되고, 교차류 챔버 입구가 회복 유닛 출구와 유체가 서로 통하고, 교차류 챔버 출구가 회복 유닛 입구와 유체가 서로 통하는 접선방향 유동 여과 장치.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 회복 유닛은 샘플 입구 및 세정액 입구를 추가로 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  9. 제 8 항에 있어서,
    세정액 입구와 유체가 서로 통하는 치환액(replacement liquid) 원을 추가로 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 치환액은 등장성 완충제(isotonic buffer) 또는 조직 배양 매체인 접선방향 유동 여과 장치.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 교차류 챔버는 원통형이고, 출구는 필터의 중심 반대쪽 및 필터의 표면에 직각으로 배치되는 접선방향 유동 여과 장치.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 제거기 유닛과 유체가 서로 통하는 세포 처리 장치를 추가로 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  13. 제 12 항에 있어서,
    세포 처리 장치는 비드(bead)를 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  14. 제 12 항에 있어서,
    세포 처리 장치는 백혈구가 농축된 세포군을 배향하는 수단을 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 배양 수단은 제 1 포트 및 제 2 포트를 갖는 용기와;
    제 1 포트 및 제 2 포트와 유체가 서로 통하는 단핵구 가지 세포 전구체 고착 기질과;
    용기 내에 기질을 유지하며, 단핵구 가지 세포 전구체와 가지 세포가 통과하기에 충분한 기공 사이즈를 갖는 스크린과;
    제 1 포트와 유체가 서로 통하는 배수 라인과;
    제 1 포트와 유체가 서로 통하는 채집 라인을 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  16. 제 15 항에 있어서,
    제 1 포트 또는 제 2 포트와 유체가 서로 통하는 다수의 유체원을 추가로 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  17. 제 15 항에 있어서,
    단핵구 가지 세포 전구체를 무균상태로 수용하는 구성의 밀봉가능한 조직 배양 용기를 추가로 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  18. 제 15 항에 있어서,
    상기 밀봉가능한 조직 배양 용기는 조직 배양 백, 플래스크(flask) 또는 생물 반응기(bioreactor)인 접선방향 유동 여과 장치.
  19. 제 15 항에 있어서,
    상기 유체원은 결합 매체, 세정 완충제와 세척 완충제를 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  20. 제 15 항에 있어서,
    다수의 유체원 및 제 1 포트와 유체가 서로 통하는 펌프를 추가로 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  21. 제 15 항에 있어서,
    예정된 온도에서 기질을 유지하기 위한 온도 제어 수단을 추가로 포함하는 접선방향 유동 여과 장치.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 온도 제어 수단은 가열기인 접선방향 유동 여과 장치.
  23. 백혈구에 대해 혈액 성분의 샘플을 농축하는 접선방향 유동 장치에 있어서,
    필터(5)에 의해 분리된 교차류 챔버(3), 여과액 챔버(4)를 포함하는 제거기 유닛과;
    상기 교차류 챔버의 입구를 통과하는 예정된 입력율(14)의 샘플을 제공하는 수단과;
    상기 필터를 지나는 여과율(15)을 감소시키는 수단을 포함하고;
    상기 교차류 챔버(3)는 입구(6)와 출구(7)를 갖고, 출구는 챔버의 상부 부분 중앙에 배치되고, 입구는 필터 위에 배치되며 필터에 실질적으로 평행하게 교차류 챔버로 유체를 도입하고, 필터는 약 3미크론 내지 약 7미크론의 기공 사이즈를 갖고; 이에 의해 샘플이 교차류 챔버 내의 농축액의 백혈구에 대해 농축되는, 백혈구에 대해 혈액 성분의 샘플을 농축하는 접선방향 유동 장치.
  24. 백혈구에 대해 혈액 성분의 샘플을 농축하는 접선방향 유동 장치에 있어서,
    필터(5)에 의해 분리된 교차류 챔버(3), 여과액 챔버(4)를 포함하는 제거기 유닛과;
    상기 교차류 챔버의 입구를 통과하는 예정된 입력율(14)의 샘플을 제공하는 수단과;
    필터를 지나는 예정된 여과율(15)을 유체를 제공하는 수단과;
    샘플 내의 혈액 세포의 예정된 농도를 제공하는 수단을 포함하고;
    교차류 챔버(3)는 입구(6)와 출구(7)를 갖고, 출구는 입구 위에 그리고 챔버의 상부 부분의 중앙에 배치되고, 필터는 교차류 챔버 입구에 실질적으로 평행하게 및 그 아래에 배치되고, 예정된 여과율은 예정된 입력율의 약 1/5내지 약 1/100이고, 혈액 세포의 예정된 농도는 약 107 내지 약 1010 세포/mm이고, 필터는 약 3미크론 내지 약 7미크론의 기공 사이즈를 갖고;
    이에 의해 샘플이 교차류 챔버 내의 농축액의 백혈구에 대해 농축되는, 백혈구에 대해 혈액 성분의 샘플을 농축하는 접선방향 유동 장치.
  25. 환자로부터의 백혈구를 포함하는 혈액 성분의 샘플로부터 백혈구를 분리하는 방법에 있어서,
    (1) 제거기 유닛의 입구를 통해 제거기 유닛으로 샘플을 도입하는 단계와;
    (2) 약 1 내지 약 10 미크론의 기공 사이즈를 갖는 필터에 실질적으로 평행하게 샘플이 교차-유동하게 하는 단계와;
    (3) 유체가 필터를 거쳐 여과되게 하는 단계 및;
    (4) 백혈구에 대해 농축된 세포군을 형성하기 위해 샘플로부터 비-백혈구 혈액 성분들을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하는, 환자로부터의 백혈구를 포함하는 혈액 성분의 샘플로부터 백혈구를 분리하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    제거기 유닛으로의 도입을 위해 백혈구 연층(buffy coat)의 제제(preparation) 또는 림프구 채집, 밀도 원심분리, 분별 용해, 여과에 의한 환자로부터의 샘플을 준비하는 단계를 추가로 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서,
    상기 비-백혈구 혈액 성분(non-leukocyte blood constituent)은 혈장과 혈소판을 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서,
    상기 비-백혈구 혈액 성분은 적혈구를 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  29. 제 25 항에 있어서,
    상기 백혈구는 단핵구를 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  30. 제 25 항에 있어서,
    백혈구가 농축된 세포군을 형성하기 위해서, 단계 (1), (2), 및 (3)을 2회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  31. 제 25 항에 있어서,
    상기 농축된 세포군은 적어도 약 20%의 백혈구를 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  32. 제 25 항에 있어서,
    상기 농축된 세포군은 적어도 약 60%의 백혈구를 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  33. 제 25 항에 있어서,
    상기 교차류 챔버 내의 샘플에 와류 운동을 유도하는 단계를 추가로 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  34. 제 25 항에 있어서,
    세정액으로 백혈구가 농축된 세포군을 세정하는 단계를 추가로 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  35. 제 25 항에 있어서,
    백혈구가 농축된 세포군으로부터 단핵구 가지 세포 전구체를 만드는 단계를 추가로 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    단핵구 가지 세포 전구체의 격리는,
    단핵구 가지 세포 전구체 고착용 기질과 백혈구가 농축된 세포군을 접촉시키는 단계와;
    세포군 내의 단핵구 가지 세포 전구체가 기질에 가역적으로 고착하게 하여 단핵구 가지 세포 전구체와 기질을 포함하는 복합체를 형성하는 단계와;
    단핵구 가지 세포 전구체를 포함하는 복합체를 얻기 위해 고착하지 않은 백혈구로부터 복합체를 분리하는 단계와;
    단핵구 가지 세포 전구체를 배양하여 전구체를 분화하여 미성숙 또는 성숙한 가지 세포를 형성하는 단계를 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 단핵구 가지 세포 전구체는 배양 전에 기질로부터 세척되는 백혈구를 분리하는 방법.
  38. 제 36 항에 있어서,
    상기 단핵구 가지 세포 전구체는 기질 상에서 배양되는 백혈구를 분리하는 방법.
  39. 제 36 항에 있어서,
    상기 기질은 글래스, 폴리스티렌, 플라스틱 또는 글래스가 코팅된 폴리스티렌 마이크로비드를 포함하는 백혈구를 분리하는 방법.
  40. 백혈구에 대해 혈액 성분들의 샘플을 농축하는 방법에 있어서,
    (1) 접선방향 유동 여과(TFF) 유닛으로 샘플을 도입하고, TFF 유닛은 교차류 챔버, 여과액 챔버, 교차류 챔버 및 여과액 챔버와 유체가 서로 통하는 필터를 포함하고, 필터는 약 1 내지 약 10 미크론의 기공 사이즈를 갖는 단계와;
    (2) 예정된 입력율 및 예정된 여과율에서 TFF 유닛을 통해 샘플을 재순환시키고, 예정된 입력율은 예정된 여과율의 5배 이상이고; 예정된 여과율은 필터에 대해 방해받지 않은 여과율보다 작은 단계 및;
    (3) 백혈구가 풍부한 세포군을 격리하는 단계를 포함하는, 백혈구에 대해 혈액 성분들의 샘플을 농축하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    농축된 세포군은 비-백혈구 혈액 성분이 실질적으로 없는 농축 방법.
  42. 제 40 항에 있어서,
    환자로부터 혈액을 채집하고, 백혈구 연층의 제제, 또는 림프구 채집, 밀도 원심분리, 분별 용해, 여과에 의한 샘플을 준비하는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  43. 제 40 항에 있어서,
    상기 비-백혈구 혈액 성분은 혈장과 혈소판을 포함하는 농축 방법.
  44. 제 41 항에 있어서,
    상기 비-백혈구 혈액 성분은 적혈구를 포함하는 농축 방법.
  45. 제 40 항에 있어서,
    상기 백혈구는 단핵구를 포함하는 농축 방법.
  46. 제 40 항에 있어서,
    농축된 세포군은 적어도 약 20%의 백혈구를 포함하는 농축 방법.
  47. 제 40 항에 있어서,
    농축된 세포군은 적어도 약 60%의 백혈구를 포함하는 농축 방법.
  48. 제 40 항에 있어서,
    상기 교차류 챔버 내의 샘플에 와류 운동을 유도하는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  49. 제 40 항에 있어서,
    세정액으로 백혈구가 농축된 세포군을 세정하는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  50. 제 40 항에 있어서,
    농축된 세포군으로부터 가지 세포를 만드는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  51. 제 50 항에 있어서,
    가지 세포는,
    단핵구 가지 세포 전구체 고착용 기질과 농축된 세포군을 접촉시키는 단계와;
    농축된 세포군 내의 단핵구 가지 세포 전구체가 기질에 가역적으로 고착하게 하여 단핵구 가지 세포 전구체와 기질을 포함하는 복합체를 형성하는 단계와;
    단핵구 가지 세포 전구체를 포함하는 복합체를 얻기 위해 고착하지 않은 백혈구로부터 복합체를 분리하는 단계와;
    단핵구 가지 세포 전구체를 배양하여 전구체를 분화하여 미성숙 또는 성숙한 가지 세포를 형성하여 만들어지는 단계를 포함하는 농축 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    상기 기질은 글래스, 폴리스티렌, 플라스틱 또는 글래스가 코팅된 폴리스티렌 마이크로비드를 포함하는 농축 방법.
  53. 제 51 항에 있어서,
    미성숙 또는 성숙한 가지 세포를 격리하는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  54. 제 45 항에 있어서,
    상기 단핵구는 단핵구의 가지 세포로의 분화를 촉진하기 위해 시토카인과 함께 배양되는 농축 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    시토카인은 GM-CSF와 IL-4인 농축 방법.
  56. 제 54 항에 있어서,
    가지 세포는 성숙한 가지 세포로 숙성되는 농축 방법.
  57. 제 54 항에 있어서,
    가지 세포는 항원이 채워진(antigen loaded) 가지 세포를 형성하도록 항원을 처리하는 것을 돕는 조건 하에서 항원과 함께 배양되는 농축 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    항원이 채워진 가지 세포를 개인에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  59. 제 57 항에 있어서,
    항원이 채워진 가지 세포는 성숙한 항원 전달 세포로 세포를 숙성시키기 위해 숙성제와 함께 배양되는 농축 방법.
  60. 제 40 항에 있어서,
    상기 필터는 약 3 내지 약 5.5 미크론의 기공 사이즈를 갖는 농축 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    백혈구는 CD34+ 세포를 포함하는 농축 방법.
  62. 제 61 항에 있어서,
    혈액 성분의 샘플은 하나 이상의 가지 세포 집결제로 치료받은 제공자(donor)로부터 얻어지는 농축 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    가지 세포 집결제는 G-CSF 또는 시클로포스파미드(cyclophosphamide)인 농축 방법.
  64. 제 61 항에 있어서,
    CD34+ 세포에 대해 백혈구를 농축하는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  65. 제 64 항에 있어서,
    CD34+ 세포에 대한 백혈구의 농축은 자석 비드와 접합된 안티-CD34 항체(antibody)를 사용하는 단계를 포함하는 농축 방법.
  66. 제 61 항에 있어서,
    체외에서 CD34+ 세포를 증식시키는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  67. 제 60 항에 있어서,
    백혈구에 대해 농축된 세포군으로부터 단핵구로부터 유도된 다능성 가지 세포를 만드는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  68. 제 60 항에 있어서,
    선구체 또는 가지 세포의 분화를 유도하는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
  69. 제 60 항에 있어서,
    분화된 세포의 전환분화(transdifferentiation)를 유도하는 단계를 추가로 포함하는 농축 방법.
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