CN117511869B - 一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，本发明具体公开了一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用，包括以下步骤：（1）将单个核细胞接种到生物反应器中，利用第一培养基在生物反应器中进行培养1天；（2）更换生物反应器中的培养基，利用第二培养基将步骤（1）的单个核细胞在生物反应器中继续培养13~15天，得到免疫细胞；本发明在培养过程中采用了第二培养基，制备得到了NK细胞占比高的免疫细胞，所述的第二培养基能有效的扩增免疫细胞，并能提高细胞活率。（2）本发明所述的制备方法，制备得到的NK细胞占比达到96%以上，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。
背景技术
免疫细胞治疗是将病人本身的免疫细胞在体外增殖和活化后， 再回输至体内的一种治疗方式。目前免疫细胞治疗已逐渐被应用于癌症治疗上， 成功的关键在于了解各类免疫细胞的特性和功能， 并根据癌症患者的状况及基因特性来选择最合适的免疫细胞类型，例如自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞等。
NK细胞(Naturalkillercell)是机体除T细胞之外的另一抗肿瘤利器,本身具有广谱的肿瘤杀伤能力。NK细胞数量减少或者功能受损与各种类型癌症的进展相关。在应用NK细胞作为过继性免疫治疗的细胞时，NK细胞的主要来源是外周血，但外周血单个核细胞中NK细胞的数量仅占10%~15%，因此NK细胞的体外扩增培养十分重要。
CN 106754704A公开了一种免疫细胞体外诱导扩增的方法。该方法包括：利用CD16抗体包被培养容器，以便得到包被后的培养容器；利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中进行免疫细胞激活培养基，以便得到激活的免疫细胞；利用免疫细胞扩增培养基将所述初步诱导扩增的免疫细胞进行第二诱导扩增培养，以便得到扩增的免疫细胞；以及利用免疫细胞规模化扩增培养基将所述分化的免疫细胞进行第三诱导扩增培养，以便获得规模化扩增的功能激活免疫细胞。利用该方法对单个核细胞进行诱导扩增培养得到大规模的免疫细胞，具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点，从而满足临床治疗大量免疫细胞的需要，其在培养过程中，在不同的培养阶段，采用了不同的培养基，方法复杂，不利于产业化生产。
鉴于此，提出本申请。
发明内容
本发明提供一种免疫细胞及其在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用，本发明所述的制备方法，制备得到的免疫细胞中NK细胞占比达到96%以上，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%，具有广泛的应用前景。
本发明解决其技术问题采用以下技术方案：
一种免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）将单个核细胞接种到生物反应器中，利用第一培养基在生物反应器中进行培养1天；
（2）更换生物反应器中的培养基，利用第二培养基将步骤（1）的单个核细胞在生物反应器中继续培养13~15天，得到免疫细胞；
所述第二培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、8~12%自体血浆、小球藻提取物0.8~2mg/mL、IFN-γ800~1200 IU/mL、白细胞介素-2 800~1200 IU/mL、二巯基乙醇0.02~0.08μL/mL、L-精氨酸100~300μg/mL、葡萄糖20~50μg/mL、亚硒酸钠20~100μg/mL。
本发明创造性的在培养过程中采用了上述特定的第二培养基，制备得到了NK细胞占比高的免疫细胞，所述的第二培养基能有效的扩增免疫细胞，并能提高细胞活率，且在培养过程中，只需使用第二培养基培养即可，无需使用其他的培养基搭配使用。
其中，本发明所述的制备方法，制备得到的免疫细胞中NK细胞占比达到96%以上，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%，具有广泛的应用前景。
本发明创造性的在第二培养基中加入小球藻提取物，所述的小球藻提取物能够有效的活化免疫细胞，刺激免疫细胞，使其产生较长的时间记忆，提高免疫细胞的兴奋度，可有效抑制细胞进入休眠，提高免疫细胞的活性，进而促进免疫细胞的扩增，含有所述的小球藻提取物的第二培养基能够调节培养过程中能够的渗透压，对细胞膜起保护作用，提高细胞的保水能力。
作为本发明的优选实施方案，所述培养在37℃、2~7％CO2、8~10％O2以及无菌条件下进行。
作为本发明的优选实施方案，所述第一培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、8~12%自体血浆、白细胞介素-2 800~1200 IU/mL、0.005~0.02KE/ml沙培林。
作为本发明的优选实施方案，所述单个核细胞来源于外周血。
作为本发明的优选实施方案，所述第二培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、10%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
作为本发明的优选实施方案，所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTMCTSTM无血清培养基或SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
作为本发明的优选实施方案，所述小球藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将小球藻粉、复合酶加入到水中，在45~55℃下酶解4~10h，得到酶解液；
（2）将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
（3）将截留液以0.5~2BV/h上大孔吸附树脂，洗脱速度为1~2BV/h，先用去离子水洗0.5~2 BV，再用体积浓度为50~80%乙醇溶液洗1~2 BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
本发明所述的小球藻提取物能够显著提高NK细胞的占比，并提高扩增倍数，且不同的制备方法制备得到的小球藻提取物对于效果的提高是不同的，采用本发明的方法相比于其他的方法能够更加显著的提高NK细胞的比例和扩增倍数。
作为本发明的优选实施方案，所述复合酶为纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的混合物；
所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：（0.4~0.8）：（0.2~0.6）。
作为本发明的优选实施方案，所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：（0.01~0.05）：（2~10）。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的免疫细胞在制备具有抗肿瘤作用的药物中的应用。
本发明的有益效果：（1）本发明在培养过程中采用了第二培养基，制备得到了NK细胞占比高的免疫细胞，所述的第二培养基能有效的扩增免疫细胞，并能提高细胞活率。（2）本发明所述的制备方法，制备得到的NK细胞占比达到96%以上，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%，具有广泛的应用前景。（3）本发明在第二培养基中加入小球藻提取物，所述的小球藻提取物能够有效的活化免疫细胞，刺激免疫细胞，使其产生较长的时间记忆，提高免疫细胞的兴奋度，可有效抑制细胞进入休眠，提高免疫细胞的活性，进而促进免疫细胞的扩增，含有所述的小球藻提取物的第二培养基能够调节培养过程中能够的渗透压，对细胞膜起保护作用，提高细胞的保水能力。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本发明中，具体的分散、搅拌处理方式没有特别限制。
本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）预处理，具体如下：
1.准备抗人CD16包被的ZellWerk生物反应器
1.1在生物反应器中加入经医用生理盐水溶解的2.5μg/mL抗人CD16单克隆抗体15mL，轻轻晃动培养瓶使抗体铺满培养面，4℃避光过夜。
1.2使用前回收抗体包被液，用15mL生理盐水洗涤生物反应器一次，再用15mL的T细胞扩增培养基(OpTmizerTMCTSTM T-cellexpansion SFM)洗涤一次。
2.采集外周血，分离外周血血浆和单个核细胞
2.1用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约200ml，预留1ml外周血做快检和血型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4℃保存运输，准确记录采集信息。快检筛选合格后将外周血送入GMP实验室，若快检不合格，血样废弃处理。
2.2在GMP实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中(≤40ml/管)，2500rpm离心15min。
2.3转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500rpm离心15min，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞。
2.4将血浆放到56℃水浴锅中水浴30-50min灭活补体，3500rpm离心15min去除补体，10ml每支分装到15ml无菌离心管中，-20℃冻存备用；并留取7.5ml血浆进行慢检：病毒五项、支原体、内毒素和微生物，其中病毒由第三方检测为准。
2.5将步骤2中的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降。
2.6待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，1800rpm离心5min，弃去上清，沉淀用10ml生理盐水重悬。
2.7取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液。室温2000rpm慢升慢降离心25min。
2.8轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次。
2.91ml生理盐水重悬细胞，取5μl细胞加入到245μl生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率。实验结束的带血污物均经过配比过得新洁尔灭浸泡过夜才能丢弃。
2.10预留4×106个细胞进行流式抗体标记检测NK细胞的比例。
（2）将2.10剩余的单个核细胞接种到生物反应器中，利用第一培养基（50mL）在生物反应器中进行培养1天；培养在37℃、5％CO2、9％O2以及无菌条件下进行；
所述第一培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、白细胞介素-2 1000 IU/mL、0.01KE/ml沙培林。
（3）更换生物反应器中的培养基，利用第二培养基将步骤（2）的单个核细胞在生物反应器中继续培养（培养在37℃、5％CO2、9％O2以及无菌条件下进行）14天（每天更换一次培养基），进行细胞回收，得到免疫细胞，留取10ml培养基上清进行Elisa分泌因子检测；
所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL；
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.6：0.4。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.04：5。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
（4）将免疫用200ml生理盐水重悬，并加入10ml人血清白蛋白，混匀；并从中取10ml细胞悬液待检，剩余的细胞注入回输袋中准备回输。从回输袋中抽取10ml细胞悬液进行检测：支原体、内毒素、微生物和病毒五项。
（5）流式细胞仪检测细胞中淋巴细胞谱系
取10ml免疫细胞，1800rpm离心回收细胞，进行流式抗体标记。设置同型对照、单标样品和染色管，每管样品细胞数约5× 105个，然后加入对应抗体染色。4℃，30min放置，用生理盐水洗涤，然后上机检测分析淋巴细胞群中的NK细胞比例。
（6）取10ml免疫细胞用台盼蓝染色检测细胞存活率；
（7）将剩余10ml细胞悬液上清，进行分装，用以检测病毒五项、内毒素、支原体、微生物。
实施例2
实施例2与实施例1不同之处在于，第二培养基的组成比例不同，其他都相同。
本实施例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、8%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ800IU/mL、白细胞介素-2 1200 IU/mL、二巯基乙醇0.02μL/mL、L-精氨酸300μg/mL、葡萄糖20μg/mL、亚硒酸钠100μg/mL。
实施例3
实施例3与实施例1不同之处在于，第二培养基的组成比例不同，其他都相同。
本实施例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、12%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ800~1200 IU/mL、白细胞介素-2 800IU/mL、二巯基乙醇0.08μL/mL、L-精氨酸100μg/mL、葡萄糖50μg/mL、亚硒酸钠20μg/mL。
实施例4
实施例4与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的用量不同，其他都相同。
本实施例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、小球藻提取物0.8mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
实施例5
实施例5与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的用量不同，其他都相同。
本实施例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、小球藻提取物2mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
实施例6
实施例6与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的制备参数不同，其他都相同。
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.8：0.2。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.03：6。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
实施例7
实施例7与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的制备参数不同，其他都相同。
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.5：0.5。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.05：10。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
实施例8
实施例8与实施例1不同之处在于，小球藻提取物的制备参数不同，其他都相同。
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.4：0.6。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.02：4。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
对比例1
对比例1与实施例1不同之处在于，对比例1的第二培养基不含有小球藻提取物，其他都相同。
本对比例所述第二培养基由以下组分组成：OpTmizerTMCTSTM无血清培养基、10%自体血浆、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
对比例2
对比例2与实施例1不同之处在于，对比例2的小球藻提取物的制备方法不同于实施例1，其他都相同。
本对比例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：0.6：0.4。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.04：5。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液，干燥，得到小球藻提取物。
对比例3
对比例3与实施例1不同之处在于，对比例3的小球藻提取物的制备方法不同于实施例1，其他都相同。
本实施例的小球藻提取物的制备方法如下：
S1、将小球藻粉、复合酶加入到水中，在50℃下酶解8h，得到酶解液；
所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶，所述纤维素酶、果胶酶的质量比为1：1。
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：0.04：5。
S2、将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
S3、将截留液以1BV/h上D101大孔吸附树脂，洗脱速度为1.5BV/h，先用去离子水洗1.5BV，再用体积浓度为70%乙醇溶液洗2BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物。
测试例
实施例和对比例的NK细胞比例、细胞活率、扩增倍数如表1所示。
表1
从表1中可看出，本发明所制备得到的免疫细胞NK细胞所占比例高，达到96%以上，且扩增倍数和活率均明显优于现有技术，采用本发明的方法，扩增倍数≥245，细胞活率≥96%。
对比实施例1~8可看出，实施例1为本发明的最佳实施方式，其NK细胞比例高，扩增倍数高，且细胞活率也高。
对比实施例1与对比例1~3可看出，本发明所述的小球藻提取物能够显著提高NK细胞的占比，并提高扩增倍数，且不同的制备方法制备得到的小球藻提取物对于效果的提高是不同的，采用本发明的方法相比于其他的方法能够更加显著的提高NK细胞的比例和扩增倍数。
经过详细的分析实施例1与对比例2可知，若小球藻提取物不经过大孔吸附树脂纯化处理，其含有的杂质成分过多，且小球藻提取物中能够提高NK细胞的比例和扩增倍数的成分含量相对不高，因此，在本发明中，必须使用经过大孔吸附树脂纯化的小球藻提取物。
对比实施例1与对比例3可知，若小球藻提取物的制备过程中，采用其他的酶替换本发明的复合酶，将导致效果显著下降。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (6)
1.一种免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将单个核细胞接种到生物反应器中，利用第一培养基在生物反应器中进行培养1天；
（2）更换生物反应器中的培养基，利用第二培养基将步骤（1）的单个核细胞在生物反应器中继续培养13~15天，得到免疫细胞；
所述第二培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、8~12%自体血浆、小球藻提取物0.8~2mg/mL、IFN-γ800~1200 IU/mL、白细胞介素-2 800~1200 IU/mL、二巯基乙醇0.02~0.08μL/mL、L-精氨酸100~300μg/mL、葡萄糖20~50μg/mL、亚硒酸钠20~100μg/mL；
所述小球藻提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将小球藻粉、复合酶加入到水中，在45~55℃下酶解4~10h，得到酶解液；
（2）将酶解液采用截留分子量10KD的超滤膜进行超滤，收集透过液，再采用截留分子量为3KD的超滤膜对透过液进行超滤，收集截留液；
（3）将截留液以0.5~2BV/h上大孔吸附树脂，洗脱速度为1~2BV/h，先用去离子水洗0.5~2 BV，再用体积浓度为50~80%乙醇溶液洗1~2 BV，收集乙醇溶液洗脱液，干燥，得到小球藻提取物；
所述复合酶为纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的混合物；所述纤维素酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶的质量比为1：（0.4~0.8）：（0.2~0.6）；
所述小球藻粉、复合酶、水的质量比为1：（0.01~0.05）：（2~10）。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述培养在37℃、2~7％CO2、8~10％O2以及无菌条件下进行。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第一培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、8~12%自体血浆、白细胞介素-2 800~1200 IU/mL、0.005~0.02KE/ml沙培林。
4.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述单个核细胞来源于外周血。
5.根据权利要求1所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第二培养基由以下组分组成：无血清淋巴细胞培养基、10%自体血浆、小球藻提取物1mg/mL、IFN-γ1000 IU/mL、白细胞介素-2 1000 IU/mL、二巯基乙醇0.05μL/mL、L-精氨酸250μg/mL、葡萄糖40μg/mL、亚硒酸钠50μg/mL。
6.根据权利要求1~5任一所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述无血清淋巴细胞培养基为OpTmizerTM CTSTM无血清培养基或SuperCultureTML500人淋巴细胞无血清培养基。
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