CN107090434A - 一种提高cik细胞培养效果的血液抗凝和保存方法 - Google Patents

一种提高cik细胞培养效果的血液抗凝和保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法，收集新鲜外周血后加入含有抗凝剂的采血容器中，封口后于4‑30℃保存，所述采血容器的容积不小于外周血和抗凝剂总体积的1.5倍；将外周血加入含有抗凝剂的采血容器后，用添加氩气的混合空气将采血容器中的剩余空气置换后再封口；混合空气中，空气与氩气的体积比为100:4‑8。本发明提供的血液抗凝和保存方法可以保证采血后24h内进行单个核细胞收集和CIK细胞培养不会造成CIK细胞增殖效率无明显降低，为医疗机构和医务工作者留有足够弹性时间。

Description

一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法
技术领域
本发明属于免疫治疗领域，涉及CIK细胞培养，具体涉及一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法。
背景技术
细胞过继免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要方法之一，在多种免疫活性因子的作用下，通过体外培养可以消除肿瘤患者体内的免疫抑制因素，有效活化和扩增免疫活性细胞，回输体内后可直接杀伤或诱导免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞。过继免疫治疗有很多优越性，其免疫细胞在体外处理，可绕过体内免疫障碍的种种机制，从而选择性地激发抗肿瘤免疫应答。另外，在体外培养条件下，对肿瘤抗原耐受的免疫细胞可被逆转。目前，基因工程可大量克隆不同细胞因子及抗原多肽，使体外活化扩展大量抗肿瘤免疫细胞更为方便，避免一些制剂体内大量应用带来的严重副反应。因此，过继免疫治疗成为近年来肿瘤免疫治疗中的热点，为晚期患者开辟了新的治疗途径。但作为一种新的治疗手段，治疗方案及标准尚待进一步规范和统一，应用时机及途径等问题尚需进一步探讨。
常用于细胞免疫治疗的细胞包括细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞等。其中，CIK细胞是一种经体外诱导培养形成的具有肿瘤细胞杀伤活性的NK样T细胞，其克服了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润细胞(TIL)等细胞增殖能力差、对肿瘤细胞毒性低的缺点，能满足临床治疗的要求。CIK细胞培养简单，将单个核细胞在体外培养，有序地添加IFN-γ、抗CD3单克隆抗体、IL-1α、IL-2进行诱导，2～3周以后即可收获大量具有强细胞毒性的效应细胞。此外，在培养过程中添加其他外源刺激因子，如IL-15、IL-21、CD137单抗、抗胸腺细胞球蛋白等，可以增强CIK细胞的扩增能力或对肿瘤的细胞毒性。
单个核细胞通常取自自体外周血。虽然研究表明，采血后24h内均可收集单个核细胞用于CIK细胞培养，但保存时间越长，增殖效率越差，超过8h，将会影响CIK细胞培养16d之后的增殖效率(王宇环等，细胞与分子免疫学杂志，2016年第3期)。
但是，临床上，由于人力和设备紧张，尤其在突发状况下，常常不能保证在采血后的8小时内完成单个核细胞的收集和培养，一定程度上降低了CIK细胞的培养效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法，以保证采血后24h内进行单个核细胞收集和CIK细胞培养不会造成CIK细胞增殖效率明显降低，为医疗机构和医务工作者留有足够的弹性时间。
实现本发明上述目的技术方案如下：
提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法，收集新鲜外周血加入含有抗凝剂的采血容器中，封口后于4-30℃保存，将外周血加入含有抗凝剂的采血容器后，用添加氩气的混合空气将采血容器中的剩余空气置换后再封口；混合空气中，空气与氩气的体积比为100:4-8。
优选地，保存期间，每1-3小时轻轻将采血容器往复颠倒1次，操作后采血容器的状态恢复至初始状态。
优选地，所述采血容器的容积不小于外周血和抗凝剂总体积的1.5倍。
优选地，采血容器的容积与外周血和抗凝剂总体积的最小倍数P取决于封口后保存时间t，二者满足如下公式：
p＝k×(t-8)+1.5
其中，系数k取值6.25×10-2；t的取值范围为8≤t≤24，单位为小时。
优选地，所述抗凝剂为肝素钠或枸橼酸钠。
优选地，所述采血容器为采血管或采血袋。
优选地，保存温度优选4℃。
氩气在血液保存以提高CIK细胞培养效果方面的应用。
本发明的突出优点：
本发明提供的血液抗凝和保存方法可以保证采血后24h内进行单个核细胞收集和CIK细胞培养不会造成CIK细胞增殖效率无明显降低，为医疗机构和医务工作者留有足够弹性时间。
附图说明
图1为各组CIK细胞培养16天相对于初始细胞数的增殖倍数；
图2为各组CIK细胞培养8天IFN-γ分泌总量比较。
具体实施方式
下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。未特别强调的操作均在常温常压下实施。
一、实验材料
提供外周血的健康志愿者经传染病检测及血常规和凝血功能检测正常。AIM-V型淋巴细胞无血清培养基，GIBCO；IL-2、IL-1α和IFN-γ，上海江莱生物科技有限公司；抗CD3mAb，上海研卉生物科技有限公司，人IFN-γELISA试剂盒，上海乔羽生物科技有限公司。
肝素钠采用中国医药集团上海试剂公司生产的干份肝素钠。取40mg用100ml去离子水溶解。取干净采血管(10mL)若干，每管加入肝素钠溶液1mL即可抗凝至少5ml血液。
添加氩气的混合空气制备：将空气与氩气按体积比100:6混合，备用。
二、实验方法
1、分组及血液样本采集
新鲜对照组(1个采血管)：0小时；
常规保存组(3个采血管)：8小时、16小时、24小时；
氩气保存组(3个采血管)：8小时、16小时、24小时。
常规无菌抽取新鲜外周血，取静脉血5mL加入含肝素钠的采血管内，新鲜对照组紧接着就开始分离单个核细胞进行培养，常规保存组和氩气保存组分别保存8小时、16小时、24小时(保存温度4℃)后取1个采血管中进行分离和培养。其中，氩气保存组采血结束后用制备好的添加氩气的混合空气将采血容器中的剩余空气置换后再封口。置换方法为：将制备好的混合气体以30-50mL/min的流速向采血管内吹30s，记住将气流管出口靠近血液液面。保存期间，每2小时轻轻将采血容器往复颠倒1次，操作后采血容器的状态恢复至初始状态。
2、CIK的分离和培养
外周血经Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心分离PBMC，接种于T25培养瓶内，并用AIM-V淋巴细胞无血清培养基调细胞密度为4×106/mL。第0天加入1000IU/mL IFN-γ，37℃、5％CO2孵箱中，饱和湿度条件下培养24h后，加入40ng/mL抗CD3mAb、2ng/mL IL-1α，以后每2-3d补充1200IU/mL IL-2的AIM-V无血清培养基，控制细胞数在(1.2-1.6)×106/mL。
3、CIK细胞增殖倍数测定
分别在培养的第0、4、8、12、16天，用细胞计数仪计数，计算细胞总量和增殖倍数。
4、CIK细胞分泌IFN-γ总量测定
在培养第8天，取细胞上清液0.5mL用ELISA试剂盒检测IFN-γ浓度，并计算总量。
5、统计分析
采用SPSS17.0统计软件分析，计算数据以均值±方差表示，组间比较采用多样本重复测量的方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
三、实验结果
1、形态学观察结果
常规保存组、氩气保存组观察结果与新鲜对照组基本一致，无明显差别。刚分离出来的CIK细胞呈单个分布，体积较小并呈圆形，立体感和折光性弱；培养24h后，细胞均匀分散，扩增不明显，集落小，表面光滑；3d后，集落增多，体积变大，细胞扩增明显；5d后，集落进一步增多变大，立体感变强，细胞增大且折光性变强；7d后，集落布满瓶底；10d后，细胞集落成圆饼形，中间厚，四周薄，立体感强；12d后，集落变大增多，形状不规则，单个细胞也明显增多，密集沉积底部，稍微摇动即均匀分布在悬液中。
2、各组CIK细胞体外增殖效率比较
图1和下表为各组CIK细胞不同培养时间后相对于初始细胞数的增殖倍数。
培养4天 培养8天 培养12天 培养16天
新鲜对照组 1.9 3.6 16.4 34.8
常规保存组-保存8小时 2.1 3.5 14.1 19.4
常规保存组-保存16小时 1.8 3.5 12.8 17.7
常规保存组-保存24小时 2.1 3.2 13.3 15.4
氩气保存组-保存8小时 1.6 3.4 17.5 35.3
氩气保存组-保存16小时 1.8 3.6 16.8 34.1
氩气保存组-保存24小时 1.8 3.4 17.1 34.3
从图1和上表可以看出，常规保存8、16和24小时后的外周血所培养出的CIK细胞增殖能力有明显降低(培养12天后尤其是16天降低显著，12天之前与新鲜对照组无显著差异)。使用本发明抗凝和保存方法保存8、16和24小时后的外周血所培养出的CIK细胞增殖能力未见明显降低，培养16天内的增殖倍数与新鲜对照组无显著差异。
该结果证明，本发明提供的抗凝和保存方法能够于24小时内有效维持外周血分离培养CIK细胞的效果，有效维持培养过程中CIK细胞的增殖能力。
3、各组CIK细胞IFN-γ分泌量比较
图2和下表为各组CIK细胞培养8天后，细胞上清液中IFN-γ总量(μg)的比较。
从图2和上表可以看出，氩气保存组在保存8、16、24小时内，IFN-γ总量与新鲜对照组无明显下降，差异不显著；常规保存组在保存8、16小时内，IFN-γ总量与新鲜对照组无明显下降，差异不显著，但是，保存24小时后，IFN-γ总量比新鲜对照组降低33.8％，下降显著。
已知常规保存组和氩气保存组保存8、16、24小时内不影响CIK细胞8天内的增殖效率，细胞总量无明显差异，如果IFN-γ总量下降明显，就证明CIK细胞分泌IFN-γ的能力下降。而本发明方法在保存8、16、24小时内，IFN-γ总量与新鲜对照组无明显下降，证明本发明提供的抗凝和保存方法能够于24小时内有效维持CIK细胞分泌IFN-γ的能力。
本发明采血容器的容积优选不小于外周血和抗凝剂总体积的1.5倍。采血容器的容积与外周血和抗凝剂总体积的最小倍数P取决于封口后保存时间t，可以按如下公式推算：
p＝k×(t-8)+1.5
其中，系数k取值6.25×10-2；t的取值范围为8≤t≤24，单位为小时。
本发明中，抗凝剂也可以使用枸橼酸钠；根据取血量，采血容器也可以使用采血袋。保存温度优选4℃，4-30℃范围内保存也可以；混合空气中，空气与氩气的体积比为100:4-8。
上述实验结果证明，本发明提供的抗凝和保存方法能够于24小时内有效维持外周血分离培养CIK细胞的效果，有效维持培养过程中CIK细胞的增殖能力和分泌IFN-γ的能力，为医疗机构和医务工作者留有足够弹性时间。
上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。

Claims (8)

1.一种提高CIK细胞培养效果的血液抗凝和保存方法，收集新鲜外周血加入含有抗凝剂的采血容器中，封口后于4-30℃保存，其特征在于：将外周血加入含有抗凝剂的采血容器后，用添加氩气的混合空气将采血容器中的剩余空气置换后再封口；混合空气中，空气与氩气的体积比为100:4-8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：保存期间，每1-3小时轻轻将采血容器往复颠倒1次，操作后采血容器的状态恢复至初始状态。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述采血容器的容积不小于外周血和抗凝剂总体积的1.5倍。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采血容器的容积与外周血和抗凝剂总体积的最小倍数P取决于封口后保存时间t，二者满足如下公式：
p＝k×(t-8)+1.5
其中，系数k取值6.25×10-2；t的取值范围为8≤t≤24，单位为小时。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述抗凝剂为肝素钠或枸橼酸钠。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述采血容器为采血管或采血袋。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：保存温度优选4℃。
8.氩气在血液保存以提高CIK细胞培养效果方面的应用。
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