CN115725493A - 一种力学性囊泡的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种力学性囊泡的制备方法。本发明提供了一种囊泡的制备方法，将机械压力施加至细胞诱导细胞死亡，从而获得产生所述的囊泡。使用本发明所述的方法诱导细胞死亡产生所述囊泡，产量稳定，效率高。且由于诱导过程无需额外添加诱导试剂，只需要进行加压(正压或负压)处理，无需担心试剂残留的问题，因而具有极好的可操作性和安全性，适合大规模生产，具有广阔的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种力学性囊泡的制备方法。
背景技术
细胞新生和死亡伴随着机体生命的整个过程，二者的平衡对于维持机体的稳态具有非常重要的意义，然而目前对于细胞死亡的认识仍在不断深入。细胞死亡及其功能失调是各种病理和生理过程的基础，包括细胞稳态，组织重塑和肿瘤发生。1972年，Kerr及其同事发现细胞死亡的一种典型形态变化，提出了“细胞凋亡”的概念：具有核变化包括核染色质浓缩和核碎裂，细胞收缩以及与相邻细胞的附着丧失等明显的形态特征。之后30年里陆续有十余种新型细胞死亡形式被发现命名，如细胞焦亡、细胞坏死、铁死亡、细胞自噬等，提示细胞死亡是多样性的，可能有许多细胞新型死亡形式亟需探索，这对于疾病治疗和对生命的认识都具有非常重要的意义。
细胞凋亡会产生大量凋亡外囊泡(Apototic extracellular vesicles,ApoEVs)，其中包含多种细胞成分，包括microRNA，mRNA，DNA，蛋白质和脂质。ApoEVs既可通过细胞因子等转移促进细胞间通讯发挥作用，又可作为小分子药物的载体发挥作用，具有可行的临床应用前景。
发明内容
一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡的制备方法，将机械压力施加至细胞诱导细胞死亡，从而获得产生所述的囊泡。
一些实施方案中，所述机械压力包括正压力或负压力。
一些实施方案中，所述负压力的大小为-0.1～-0.05Mpa；
一些实施方案中，所述负压力的大小为-0.1～-0.06Mpa；
一些实施方案中，所述负压力的大小为-0.1～-0.07Mpa。
一些实施方案中，所述正压力的大小为2～6g/cm2。
一些实施方案中，所述正压力的大小为2～5g/cm2。
一些实施方案中，所述正压力的大小为2～4g/cm2。
一些实施方案中，所述囊泡是细胞处于正常存活时将机械压力施加至细胞诱导细胞死亡而产生的囊泡。
一些实施方案中，所述细胞包括干细胞、体细胞或肿瘤细胞。
一些实施方案中，所述干细胞包括全能干细胞或多能干细胞。
一些实施方案中，所述干细胞包括间充质干细胞或诱导性多能干细胞。
一些实施方案中，所述间充质干细胞来源包括骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜或肌腱。
一些实施方案中，所述的体细胞包括Jurkat、PBMC或红细胞。
一些实施方案中，所述负压力通过负压培养箱达到。
一些实施方案中，所述正压力通过放置玻璃片于细胞上，然后将载有重物的容器置于玻璃片上培养细胞对细胞施加压力达到。
一些实施方案中，所述重物包括钢珠。
一些实施方案中，所述玻璃片包括石英玻璃片。
一些实施方案中，所述的诱导细胞死亡的时间为3-72小时。
一些实施方案中，所述诱导细胞死亡的时间为3-50小时。
一些实施方案中，所述诱导细胞死亡的时间为3-48小时。
一些实施方案中，所述诱导细胞死亡的时间为3-24小时。
一些实施方案中，所述机械压力为负压力时，所述诱导细胞死亡的时间为3-40小时。
一些实施方案中，所述机械压力为负压力时，所述诱导细胞死亡的时间为3-30小时。
一些实施方案中，所述机械压力为负压力时，所述诱导细胞死亡的时间为3-24小时。
一些实施方案中，诱导细胞产囊泡的温度为20℃-50℃。
一些实施方案中，诱导细胞产囊泡的温度为25℃-40℃。
一些实施方案中，诱导细胞产囊泡的温度为25℃-37℃。
一些实施方案中，本发明提供了所述的方法获得的囊泡。
一些实施方案中，使用本发明所述的方法诱导细胞死亡产生所述囊泡，产量稳定，效率高。且由于诱导过程无需额外添加诱导试剂，只需要进行加压(正压或负压)处理，无需担心试剂残留的问题，因而具有极好的可操作性和安全性，适合大规模生产，具有广阔的临床应用前景。
一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物包括intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3和caspase3中一种或多种。
一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物包括CD63、Annexin V、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3、caspase3的组合。
一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物包括CD63、Annexin V、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1的组合。
一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物包括CD63、Annexin V、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3的组合。
一些实施方案中，所述正压力诱导细胞产生的囊泡对CD63、intergrinα5、RhoA的表达低于STS诱导细胞产生的囊泡对CD63、intergrinα5、RhoA的表达。
一些实施方案中，所述正压力或负压力诱导细胞产生的囊泡对Annexin V、calnexin、piezo1的表达高于STS诱导细胞产生的囊泡对Annexin V、calnexin、piezo1的表达。
一些实施方案中，所述正压力或负压力诱导细胞产生的囊泡对cl-caspase3的表达低于STS诱导细胞产生的囊泡对cl-caspase3的表达。
一些实施方案中，分离囊泡的方法包括选用超速离心或差速离心的方法分离所述囊泡。
一些实施方案中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收集到的沉淀进行第四次离心，取沉淀。
一些实施方案中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟。一些实施方案中，所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟。一些实施方案中，所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟。一些实施方案中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟。一些实施方案中，所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟。一些实施方案中，所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟。一些实施方案中，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟。一些实施方案中，所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分钟。一些实施方案中，所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟。一些实施方案中，所述第四次离心为10000-30000g离心15-60分钟。一些实施方案中，所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟。一些实施方案中，所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟。
一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05-0.4μm。
一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05-0.38μm。
一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05～0.35μm。
一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05～0.32μm。
一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05～0.3μm。
一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05～0.25μm。
一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05～0.22μm。
一些实施方案中，所述囊泡直径为0.55～0.22μm。
一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，包括所述的囊泡以及药学上可接受的辅料。
一些实施方案中，所述药物组合物的制剂形式选自冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊、或贴剂。
一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡，所述囊泡具有的标志物包括intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3和caspase3中一种或多种。
一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物包括CD63、Annexin V、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3、caspase3的组合。
一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物包括CD63、Annexin V、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1的组合。
一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物包括CD63、Annexin V、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3的组合。
一些实施方案中，本发明提供了所述的囊泡在脂肪调节、或成骨分化方面的用途；或者在制备脂肪调节剂或成骨分化剂方面的用途。
一些实施方案中，所述的脂肪调节为抑制成脂。
一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，含有如上所述的囊泡。
一些实施方案中，所述组合物为分化培养基。
一些实施方案中，所述的组合物为成骨分化培养基。
附图说明
图1为细胞正压力加力装置。
图2为差速离心方法收集IEVs的流程图。
图3为UMSC正压力下力学性死亡形态动态变化图。
图4为UMSC正压力下产的IEVs细胞膜和细胞核染色结果图。
图5为UMSC正压力下产的IEVs负染透射电镜图。
图6为UMSC正压力下产的IEVs的数量、粒径、电位。
图7为UMSC正压力下产的IEVs的CD63阳性率。
图8为UMSC正压力下产的IEVs的Annexin V阳性率。
图9为UMSC正压力下产的IEVs的intergrinα5阳性率。
图10为UMSC正压力下产的IEVs的RhoA阳性率。
图11为UMSC在-0.08Mpa负压条件下培养24h后的形态。
图12为UMSC负压力下产的IEVs细胞膜和细胞核染色结果图。
图13为UMSC负压力下产的IEVs的负染透射电镜图。
图14为UMSC负压力下产的IEVs的数量、粒径、电位。
图15为Jurkat在-0.08Mpa负压条件下培养24h后的形态。
图16为PBMC在-0.08Mpa负压条件下培养24h后的形态。
图17为Jurkat/PBMC负压力产的IEVs的数量、粒径、电位。
图18为UMSC正/负压力产的IEVs的特异性marker的western blot结果。
图19为UMSC正/负压力产的IEVs的成骨、成脂功能验证结果。
图20为负压培养箱诱导UMSCs后光镜下观察UMSCs形态改变图。
图21为负压培养箱诱导UMSCs后超高分辨率显微镜观察UMSCs产囊泡过程的动态变化图。
图22为负压培养箱诱导UMSCs后电镜下观察细胞形态图。
图23为负压培养箱诱导UMSCs后生成的ApoV负染透射电镜图。
图24为通过Zeta View对UMSCs负压培养箱不同压力诱导后囊泡的数量、粒径、电位进行分析的结果。
图25为通过Zeta View对UMSCs负压培养箱不同温度诱导后囊泡的数量、粒径、电位进行分析的结果。
图26为Jurkat/PBMC负压培养箱诱导后光镜下观察Jurkat/PBMC形态改变图。
图27为通过Zeta View对Jurkat/PBMC在负压力下产的ApoV的数量、粒径、电位进行分析的结果。
图28为超高分辨率显微镜观察RBC经负压培养箱诱导后产囊泡过程的形态变化图。
图29为ZetaView对RBC在负压力下产的ApoV的数量、粒径、电位进行分析结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中的IEVs为诱导性囊泡的简称，可称为诱导性囊泡，也可称为诱导性细胞外囊泡(Induced extracellular vesicles,IEVs)，IEV同IEVs。诱导性细胞外囊泡是指的是一种在前体细胞(例如干细胞)正常存活时，被干预或诱导，使其死亡产生的一类亚细胞产物。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞，例如是非凋亡的细胞、非衰老的细胞、非老化而增殖停滞的细胞、非冻存后复苏的细胞、非发生恶变而异常增殖的细胞或非出现损伤的细胞等。在一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自细胞培养过程中，细胞接触融合80-100％的时候的细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自对数期细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自人或鼠组织来源的原代培养及其传代培养细胞。一些实施方式中，所述的正常存活时的细胞取自已确立的细胞系或细胞株。在一些实施方式中，所述的前体细胞取自早期的细胞。
本文中，IEVs为细胞外囊泡(即EV)的一种；本公开中，正压力、负压力诱导产生的囊泡，也属于一种IEVs，在本文中称为“力学诱导囊泡”。本文中，“apoV”同“EV”或“Apop-EV”也可以称为IEVs。
本发明中的STS为星形孢菌素。
“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
如本文所用，术语“高表达”等旨在包括将核酸或蛋白质的表达增加至高于目前已有囊泡(例如外泌体)所含有的水平。
本文实施例中，所使用的脐带间充质干细胞为P4-P8代的人脐带间充质干细胞；以下实施例1和实施例2具体使用的为P4细胞。
本文实施例中，各组实验中，如若未指明具体的温度的话，温度为37℃。
实施例1加正压力诱导脐带间充质干细胞死亡获得的IEVs
1、实验方法
(1)体外正压力诱导脐带间充质干细胞死亡
将脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs)接种于6孔板里，使用含有10％FBS、青霉素(100U ml-1)、链霉素(100μg ml-1)、2mM l-谷氨酰胺和10mM l-抗坏血酸磷酸盐的MEM-ALPHA培养基培养，待细胞长至90-95％时，更换为不含血清的MEM-ALPHA培养基培养(实验组)，和含有500nM STS、不含血清的MEM-ALPHA培养基(对照组)，然后实验组给细胞加力(如图1所示的装置)，放置30mm×1mm的石英玻璃片于细胞上，然后将载有4g/cm2钢珠的容器置于石英玻璃片上培养细胞，24/48/72h后取出压在细胞上的装置，然后收集含有死亡UMSCs的培养基于离心管中。
(2)差速离心法收集IEVs
将上述获得的含有死亡UMSCs的培养基进行差速离心(流程如图2所示)：800g离心10min弃去细胞沉淀，收集上清，2000g离心5min后弃去细胞碎片等沉淀，收集上清，16000g离心30min后收集沉淀即为IEVs，然后用1ml PBS重悬IEVs后16000g离心30min后收集沉淀，PBS重悬IEVs后4℃保存，用于后续鉴定分析。
(3)正压力诱导的UMSC来源的IEVs的鉴定分析
分离得到IEVs后，通过膜染料、核染料等对IEVs染色；负染囊泡后使用透射电镜观察形态；使用纳米颗粒跟踪分析仪ZetaView分析IEVs的数量、粒径、电位；使用流式细胞仪分析IEVs的标志物CD63及细胞凋亡标志物AnnexinV、intergrinα5、RhoA。
2、实验结果
(1)UMSC正压力下力学性死亡动态过程
通过细胞染料标记细胞膜、细胞核、线粒体，然后高内涵显微镜观察UMSC力学性死亡过程的动态变化。如图3所示，与STS诱导的细胞凋亡(染色质浓缩和核碎裂，细胞收缩以及与相邻细胞的附着丧失)相比，单个UMSC在正压力诱导死亡产生囊泡成串珠状，细胞核骤缩；相邻细胞附着未丧失，呈现聚集团块状死亡，并且收缩过程中伸出很多细长的丝状物质。
(2)UMSC正压力下产的IEVs的鉴定分析
如图4所示，通过cell masker细胞膜染料、hoechst细胞核染料等对IEVs染色，可见STS-IEVs和4g/cm2-IEVs为圆泡状物质。如图5所示，从IEVs负染透射电镜图可见STS-IEVs和4g/cm2-IEVs为囊泡状。图4和图5中的STS组为诱导时间为7小时产生的IEVs，4g/cm2组为正压力处理48小时获得的IEVs。
通过ZetaView对UMSC来源的IEVs的数量、粒径、电位进行分析。如图6所示，STS诱导获得的IEVs与正压力下诱导获得的IEVs的数量差异不明显，粒径稍大，电位差异不明显。
注：图6中，EVNb指的是相应囊泡的数量(以1010个为单位)，所用细胞量约为每组0.5X10^6个细胞。
如图7-10所示，通过流式细胞仪对正压力下诱导UMSC获得的IEVs的标志物进行分析。与STS诱导获得的IEVs相比，正压力下诱导获得的IEVs的标志物CD63阳性率低，细胞凋亡标志物AnnexinV阳性率差异不明显，intergrinα5、RhoA阳性率低。
实施例2加负压力诱导细胞获得IEVs
1、实验方法
(1)体外负压力诱导脐带间充质干细胞死亡
将脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs)接种于10cm培养皿里，待细胞长至90-95％时，更换为不含血清的MEM-ALPHA培养基培养(实验组)，和含有500nM STS、不含血清的MEM-ALPHA培养基(对照组)，然后实验组置于负压培养箱(37℃，-0.08Mpa)中，12/24h后取出细胞，然后收集含有死亡UMSC的培养基于离心管中。
(2)体外负压力诱导Jurkat细胞和单核细胞死亡
将悬浮细胞Jurkat细胞及人外周血来源的单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)接种于10cm培养皿里，待细胞长至90-95％时，更换为不含血清的1640培养基培养(实验组)，和含有500nM STS、不含血清的MEM-ALPHA培养基(对照组)，然后实验组置于负压培养箱中，12/24h后取出细胞，然后收集含有死亡细胞的培养基于离心管中。
(3)差速离心收集IEVs
方法同实施例1。
(4)负压力诱导的UMSC/Jurkat/PBMC来源的IEVs的鉴定分析
分离得到UMSC/Jurkat/PBMC来源的IEVs后，通过膜染料、核染料等对IEVs染色；负染囊泡后使用透射电镜观察形态；使用纳米颗粒跟踪分析仪ZetaView分析囊泡的数量、粒径、电位。使用western blot进行囊泡表面marker进行鉴定。
(5)正/负压力诱导的UMSC来源的IEVs的功能鉴定分析
分离得到UMSC来源的IEVs后，加入成骨/成脂培养基诱导的UMSC中(成骨诱导14天，成脂诱导4周)，然后通过茜素红和油红染色进行囊泡成骨成脂功能鉴定。使用westernblot进行成骨成脂标志蛋白进行鉴定。
2、实验结果
(1)UMSC负压力下力学性死亡形态
将UMSC置于-0.08Mpa的负压培养箱中培养24h后，光镜下观察UMSC形态改变。如图11所示，发现了细胞死亡形态，与STS诱导(诱导时间为7小时)的细胞晚期凋亡形态相比，负压诱导UMSC下发现的细胞死亡同样突起大泡，核浓缩碎裂。
(2)UMSC负压力下产的IEVs的鉴定分析
如图12所示，通过cell masker细胞膜染料、hoechst细胞核染料等对IEVs染色，可见STS-IEVs(诱导时间7小时)和-0.08Mpa-IEVs(诱导时间24小时)为圆泡状物质。如图13所示，囊泡负染透射电镜图可见STS-IEVs(诱导时间7小时)和4g/cm2-IEVs(诱导时间24小时)为囊泡状。
通过ZetaView对UMSC负压力下力学性死亡囊泡的数量、粒径、电位进行分析。如图14所示，与STS诱导(诱导时间7小时)获得的IEVs相比，负压力诱导(诱导时间24小时)获得的IEVs的数量较多，粒径差异不明显，负电位稍低。
(3)Jurkat/PBMC负压力下力学性死亡形态
将Jurkat/PBMC置于-0.08Mpa的负压培养箱中培养24h后，光镜下观察Jurkat/PBMC形态改变。如图15，图16所示，与STS诱导(诱导时间7小时)的细胞凋亡形态相比，负压诱导Juakat细胞死亡核碎裂更明显，负压诱导PBMC细胞死亡空泡状物质较多。
(4)Jurkat/PBMC负压力下产的IEVs的鉴定分析
通过ZetaView对Jurkat/PBMC在负压力下产的IEVs的数量、粒径、电位进行分析。如图17所示，与STS诱导(诱导时间7小时)获得的IEVs相比，负压力下诱导(诱导时间24小时)获得的IEVs的数量较多，粒径稍大，负电位较高。
(5)UMSC负压力下产的IEVs的表面marker鉴定分析
如图18所示，与STS诱导获得的IEVs相比，正/负压力下诱导获得的IEVs力学性死亡囊泡的蛋白表达不同。其中，与STS诱导产生的EV相比，正压和负压诱导的IEV的AnnexinV(凋亡囊泡marker)、calnexin(凋亡囊泡marker)、piezo1(机械力相关蛋白)表达较高，cl-caspase3(细胞凋亡关键蛋白)表达较低。
其中，STS组诱导时间7小时，正/负压力组的诱导时间均为24小时。
(6)UMSC负压力下产的IEVs的功能鉴定分析
如图19所示，与STS诱导(7小时)获得的IEVs相比，正/负压力下诱导(均为24小时)获得的IEVs促进UMSC成骨表达能力更明显，成骨标志蛋白ALP、RUNX2表达较低；与STS诱导获得的IEVs相比，正/负压力下诱导获得的IEVs抑制UMSC成脂能力更明显，成脂标志蛋白PPAR-Y表达较低。
实施例3体外负压力诱导脐带间充质干细胞产囊泡
1、实验方法
(1)将脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs)接种于10cm培养皿里，加入含10％FBS的MEM-ALPHA培养基，放置在常规的二氧化碳培养箱中培养。待细胞长至90-95％时，实验组更换为不含血清的MEM-ALPHA培养基培养，然后置于负压培养箱中；对照组更换为含有500nM星形孢菌素(Staurosporine，STS)、不含血清的MEM-ALPHA培养基，然后置于常规的二氧化碳培养箱中培养。
(2)负压诱导；
(3)囊泡收集：待细胞诱导培养后，收集UMSCs培养基于离心管中，将上述获得的含有囊泡的培养基进行差速离心(流程如图2所示)：800g离心10min弃去细胞沉淀，收集上清，2000g离心5min后弃去细胞碎片等沉淀，收集上清，16000g离心30min后收集沉淀即为凋亡囊泡(apoptotic vesicle,apoV)，然后用1ml PBS重悬ApoV后16000g离心30min后收集沉淀，PBS重悬apoV后4℃保存，用于后续鉴定分析；
2、实验结果
2.1 MSCs经负压培养箱诱导后细胞形态
将UMSCs置于-0.08Mpa的负压培养箱中37℃培养20h后，光镜下观察UMSCs形态改变(图20)；通过细胞染料标记细胞膜、细胞核，然后超高分辨率显微镜观察UMSCs产囊泡过程的动态变化(图21)。电镜下观察细胞形态(图22)。
2.2 UMSCs经负压培养箱诱导后生成的ApoV的鉴定分析
囊泡负染透射电镜图(图23)；通过ZetaView对UMSCs负压培养箱不同压力诱导后囊泡的数量、粒径、电位进行分析(图24)；通过ZetaView对UMSCs负压培养箱不同温度诱导后囊泡的数量、粒径、电位进行分析(图25)。
其中，图23为实验组的囊泡负染透射电镜图，所述的囊泡来源于经负压诱导后的UMSCs：负压诱导条件为0.08Mpa的负压培养箱中37℃培养20h后。
实施例4体外负压力诱导Jurkat细胞和单核细胞产囊泡
1、实验方法
(1)将悬浮细胞Jurkat细胞接种于10cm培养皿里，使用含10％FBS的1640培养基在常规的二氧化碳培养箱中培养，待细胞长至90-95％时，更换为不含血清的1640培养基培养(实验组)，和含有500nM STS、不含血清的1640培养基(对照组)；实验组置于负压培养箱中培养，对照组置于常规的二氧化碳培养箱中培养。
将分离得到的人外周血来源的单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)直接接种于10cm培养皿里，分别用不含血清的1640培养基培养(实验组)，和含有500nM STS、不含血清的1640培养基培养(对照组)；实验组置于负压培养箱中，对照组置于常规的二氧化碳培养箱中培养。
(2)负压诱导；
(3)囊泡收集：待细胞诱导培养后，收集细胞培养基于离心管中，将上述获得的含有囊泡的培养基进行差速离心(流程如图2所示)：800g离心10min弃去细胞沉淀，收集上清，2000g离心5min后弃去细胞碎片等沉淀，收集上清，16000g离心30min后收集沉淀即为凋亡囊泡(apoptotic vesicle,apoV)，然后用1ml PBS重悬ApoV后16000g离心30min后收集沉淀，PBS重悬apoV后4℃保存，用于后续鉴定分析；
2、实验结果
2.1 Jurkat/PBMC经负压培养箱诱导后的形态
光镜下观察Jurkat/PBMC形态改变(图26)。
2.2 Jurkat/PBMC负压培养箱诱导后生成的ApoV的鉴定分析
通过Zeta View对Jurkat/PBMC在负压力下产的ApoV的数量、粒径、电位进行分析(图27)。
实施例5外负压力诱导红细胞产囊泡
1、实验方法
(1)将人来源的红细胞(red blood cell,RBC)接种于10cm培养皿中，于不含血清的1640培养基中培养(实验组)，和在红细胞裂解液(中国CWBIO)中培养4h(对照组)；实验组置于负压培养箱中(图1)，对照组置于常规的二氧化碳培养箱中培养。
(2)负压诱导；
(3)囊泡收集：待细胞在诱导培养后，收集细胞培养基于离心管中，将上述获得的含有囊泡的培养基进行差速离心(流程如图2所示)：800g离心10min弃去细胞沉淀，收集上清，2000g离心5min后弃去细胞碎片等沉淀，收集上清，16000g离心30min后收集沉淀即为凋亡囊泡(apoptotic vesicle,apoV)，然后用1ml PBS重悬ApoV后16000g离心30min后收集沉淀，PBS重悬apoV后4℃保存，用于后续鉴定分析。
2、实验结果
2.1 RBC经负压培养箱诱导后的形态
将RBC置于-0.08Mpa的负压培养箱中37℃培养48h后，通过细胞染料标记细胞膜，然后超高分辨率显微镜观察RBC产囊泡过程的形态变化(图28)。
2.2 RBC负压培养箱诱导后生成的ApoV的鉴定分析
通过ZetaView对RBC在负压力下产的ApoV的数量、粒径、电位进行分析(图29)。
Claims (10)
1.一种囊泡的制备方法，其特征在于，将机械压力施加至细胞诱导细胞死亡，从而产生所述的囊泡。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述机械压力包括正压力或负压力；
优选地，所述负压力的大小为-0.1～-0.005Mpa；
优选地，所述负压力的大小为-0.1～-0.01Mpa；
优选地，所述负压力的大小为-0.1～-0.02Mpa；
优选地，所述负压力的大小为-0.1～-0.03Mpa；
优选地，所述负压力的大小为-0.1～-0.05Mpa；
优选地，所述负压力的大小为-0.1～-0.06Mpa；
优选地，所述负压力的大小为-0.1～-0.07Mpa；优选地，所述正压力的大小为2～6g/cm2；
优选地，所述正压力的大小为2～5g/cm2；
优选地，所述正压力的大小为2～4g/cm2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述囊泡是细胞处于正常存活时将机械压力施加至细胞诱导细胞死亡而产生的囊泡；
所述细胞包括干细胞、体细胞或肿瘤细胞；
优选地，所述干细胞包括全能干细胞或多能干细胞；
优选地，所述干细胞包括间充质干细胞或诱导性多能干细胞；
优选地，所述间充质干细胞来源包括骨髓、尿液、口腔、脂肪、胎盘、脐带、骨膜或肌腱；
优选地，所述的体细胞包括Jurkat、PBMC或红细胞。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述负压力通过负压培养箱达到；
优选地，所述正压力通过放置玻璃片于细胞上，然后将载有重物的容器置于玻璃片上培养细胞对细胞施加压力达到；
优选地，所述重物包括钢珠；
优选地，所述玻璃片包括石英玻璃片。
5.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述诱导细胞死亡的时间为3～72小时；
所述诱导细胞死亡的时间为3～50小时；
优选地，所述诱导细胞死亡的时间为3-48小时；
优选地，所述诱导细胞死亡的时间为3-24小时；
优选地，所述机械压力为负压力时，所述诱导细胞死亡的时间为3-40小时；
优选地，所述机械压力为负压力时，所述诱导细胞死亡的时间为3-30小时；
优选地，所述机械压力为负压力时，所述诱导细胞死亡的时间为3-24小时；
优选地，所述机械压力为负压力时，所述诱导细胞死亡的时间为5-24小时。
优选地，诱导细胞产囊泡的温度为20℃-50℃；
优选地，诱导细胞产囊泡的温度为25℃-40℃；
优选地，诱导细胞产囊泡的温度为25℃-37℃。
6.权利要求1-5任一所述的方法获得的囊泡；
优选地，所述囊泡具有的标志物包括intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3和caspase3中的一种或多种；
优选地，所述囊泡具有的标志物包括CD63、AnnexinV、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3、caspase3的组合；
优选地，所述囊泡具有的标志物包括CD63、AnnexinV、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1的组合；
优选地，所述囊泡具有的标志物包括CD63、AnnexinV、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3的组合；
优选地，所述正压力诱导细胞产生的囊泡对CD63、intergrinα5、RhoA的表达低于STS诱导细胞产生的囊泡对CD63、intergrinα5、RhoA的表达；
优选地，所述正压力或负压力诱导细胞产生的囊泡对AnnexinV、calnexin、piezo1的表达高于STS诱导细胞产生的囊泡对AnnexinV、calnexin、piezo1的表达；
优选地，所述正压力或负压力诱导细胞产生的囊泡对cl-caspase3的表达低于STS诱导细胞产生的囊泡对cl-caspase3的表达。
7.如权利要求6所述的囊泡，其特征在于，所述囊泡的直径为0.05-0.4μm；
优选地，所述囊泡的直径为0.05-0.38μm；
优选地，所述囊泡的直径为0.05～0.35μm；
优选地，所述囊泡的直径为0.05～0.32μm；
优选地，所述囊泡的直径为0.05～0.3μm；
优选地，所述囊泡的直径为0.05～0.25μm；
优选地，所述囊泡的直径为0.05～0.22μm；
优选地，所述囊泡直径为0.55～0.22μm。
8.一种囊泡，所述囊泡具有的标志物包括intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3和caspase3中的一种或多种；
优选地，所述囊泡具有的标志物包括CD63、AnnexinV、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3、caspase3的组合；
优选地，所述囊泡具有的标志物包括CD63、AnnexinV、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1的组合；
优选地，所述囊泡具有的标志物包括CD63、AnnexinV、intergrinα5、RhoA、calnexin、piezo1、cl-caspase3的组合。
9.如权利要求6-8任一所述的囊泡在脂肪调节、或成骨分化方面的用途；或者在制备脂肪调节剂或成骨分化剂方面的用途；
优选地，所述的脂肪调节为抑制成脂。
10.一种组合物，其特征在于，含有如权利要求6-8任一所述的囊泡；
优选地，所述组合物为分化培养基；
优选地，所述的组合物为成骨分化培养基。
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