CN117343902A - 一种高纯度nk细胞体外扩增培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法，属于细胞培养领域。该方法包括单个核细胞的分离、NK细胞的激活和NK细胞的扩增；所述NK激活阶段的培养基包括无血清培养基、沙培林、CD16抗体、CD137抗体、CD335（NKp46）抗体、IL‑2、IL‑15和人自体血浆；所述NK扩增阶段的培养基包括无血清培养基、IL‑2、IL‑15和人自体血浆。本发明通过对外周血来源的单个核细胞进行体外激活和扩增，可以得到大量高纯度、高杀伤活性、高细胞毒活性的CD56brightNK细胞，培养21天，NK细胞扩增倍数为800倍，CD3‑CD56+的比例大于98％，CD16+的比例大于95%，本发明能够满足临床对NK细胞的需求。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别是涉及一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法。
背景技术
癌症是现代社会中对人类威胁最大的疾病之一，对癌症的治疗一直是现代医学的关注点。肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。
NK细胞的肿瘤杀伤机制包括：
(1)FasL与Fas相作用，最终启动了靶细胞凋亡系统；
(2)穿孔素/颗粒酶作用，激发凋亡相关酶系统致细胞发生凋亡；
(3)NK细胞表面表达的CD16分子与肿瘤特异性IgG抗体发生结合，从而识别、杀伤与IgG抗体发生特异性结合的肿瘤细胞；
(4)TNF-α、IFN-γ等与靶细胞表面相应受体的结合，启动靶细胞的凋亡系统。
目前一般采用滋养细胞系方法(如使用K562细胞本身作为滋养细胞系)来扩增培养NK细胞，该方法得到NK细胞纯度较高，但由于K562本身就是肿瘤细胞，生产过程中存在安全隐患。
部分采用CD16抗体联合细胞因子来扩增培养NK细胞，需要提前用CD16抗体包被培养瓶，操作繁琐，且容易发生CD16抗体包被培养瓶失败而影响后续NK扩增培养，生产过程存在不稳定隐患。
因此，目前研发一种纯度高、扩增倍数高、细胞活率高且操作简单的NK细胞扩增方法，对于NK细胞大规模临床应用，以提高病人免疫力并杀伤肿瘤细胞是非常重要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法操作简单、成效快、成本低、安全性高，培养21天能使NK细胞体外扩增800倍，而且NK细胞纯度高，具有很高的临床价值。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法，包括以下步骤：
分离获取外周血的单个核细胞，用NK细胞激活培养基重悬所述单个核细胞，进行孵育培养；培养至第3天，补加NK细胞扩增培养基，之后每隔一天，补加一次所述NK细胞扩增培养基，培养至第21天，获取所述高纯度NK细胞；
所述NK细胞激活培养基为含有IL-2、IL-15、CD16抗体、CD137抗体、CD335抗体、沙培林和血浆的无血清NK细胞基础培养基；其中，血浆为自体血浆，即血浆和外周血的来源受体相同。
所述NK细胞扩增培养基为含有IL-2、IL-15和血浆的无血清NK细胞基础培养基。
优选的是，所述NK细胞激活培养基为以无血清NK细胞基础培养基为基础，添加终浓度为500-2000 IU/mL IL-2、20-100 ng/mL IL-15、20-100ng/mL CD16抗体、20-100ng/mLCD137抗体、20-100ng/mL CD335抗体、0.01-0.05KE/mL沙培林和5%-10%血浆。
优选的是，所述NK细胞激活培养基为以无血清NK细胞基础培养基为基础，添加终浓度为1000IU/mL IL-2、50ng/mL IL-15、50ng/mL CD16抗体、50ng/mL CD137抗体、50ng/mLCD335抗体、0.02KE/mL沙培林和10%血浆。
优选的是，所述NK细胞扩增培养基为以无血清NK细胞基础培养基为基础，添加终浓度为800-1500 IU/mL IL-2、20-100ng/mL IL-15和5%-10%血浆。
优选的是，所述NK细胞扩增培养基为以无血清NK细胞基础培养基为基础，添加终浓度为1000 IU/mL IL-2、50ng/mL IL-15和10%血浆。
优选的是，所述孵育培养的条件为：37℃，5% CO2。
优选的是，所述分离获取外周血的单个核细胞的方法包括以下步骤：将外周血与NK分选试剂按体积比25:1混合，避光孵育，经离心、清洗，获取所述外周血的单个核细胞。
优选的是，所述避光孵育的条件为：室温避光孵育30min。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明可有效避免动物血清中不确定成分或诱导的肿瘤细胞系对细胞培养造成不确定性，不仅提高NK细胞的纯度，而且对肿瘤杀伤效果显著；
(2)本发明NK细胞的激活培养过程中，无需提前用CD16抗体包被培养瓶，减少操作步骤，提高NK激活稳定性；
(3)本发明通过向无血清NK细胞基础培养基中加入IL-2、IL-15、CD16抗体、CD137抗体、CD335（NKp46）抗体、沙培林与自体血浆，提高细胞因子对NK的刺激，激活NK细胞，促使NK细胞增殖，而且高浓度IL-2可有效抑制T细胞的生长，使所得NK细胞的纯度更高，性能稳定；本发明的NK细胞培养基添加因子少，培养方法操作简便、高效，能够满足临床对NK细胞的需求；
(4)本发明方法操作简单、成效快、成本低、安全性高，培养21天能使NK细胞体外扩 增800倍，而且NK细胞纯度高，具有很高的临床价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的体外扩增高纯度NK细胞培养方法的流程示意图；
图2为21天内NK细胞扩增示意图；
图3为流式检测NK细胞的CD3-CD56+结果示意图；
图4为流式检测NK细胞的CD16+结果示意图；
图5为NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤实验的结果示意图；
图6为NK细胞对肿瘤细胞NCI H1650的杀伤实验的结果示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明提供了一种体外扩增高纯度NK细胞培养方法，具体通过向无血清NK细胞基础培养基中加入IL-2、IL-15、CD16抗体、CD137抗体、CD335（NKp46）抗体、沙培林与自体血浆，不断的优化培养基，获取了高效培养和高纯度的NK细胞，其流程示意图见图1。
以下实施例中涉及的培养基：
NK细胞激活培养基为以无血清NK细胞基础培养基为基础，添加终浓度为500-2000IU/mL IL-2、20-100 ng/mL IL-15、20-100ng/mL CD16抗体、20-100ng/mL CD137抗体、20-100ng/mL CD335抗体、0.01-0.05KE/mL沙培林和5%-10%血浆。
NK细胞扩增培养基为以无血清NK细胞基础培养基为基础，添加终浓度为800-1500IU/mL IL-2、20-100ng/mL IL-15和5%-10%血浆。
实施例1 一种体外扩增高纯度NK细胞培养方法，方法步骤包括：
S1：用NK分选试剂处理外周血：在淋巴分离液分离单个核细胞前，将外周血按体积比25:1加入NK分选试剂（StemCell：15065），即每1mL外周血加入40μL的NK分选试剂，室温条件下，避光孵育30min；
S2：淋巴分离液分离单个核细胞：将20mL外周血加入装有15mL人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋：LTS1077）的50mL离心管一，在460g，室温下离心30min，降速设为0；
S3：洗涤PBMC：用巴氏吸管将白膜层吸出，在离心管二中加入20-25mL的DPBS清洗，在380g条件下离心10min，弃上清；再次加入20-25mL的DPBS清洗，在300g条件下离心10min，弃上清；使用20-25mL的DPBS重悬、混匀、取样，采用台盼蓝染色计数，在300g条件下离心10min；
S4：配制细胞悬液：用无血清NK细胞基础培养基（iMediam For NK，GC）重悬细胞、混匀，将细胞密度调整为2×106/mL -2.5×106/mL；
S5：接种细胞：将上述细胞悬浮液接种NK细胞激活培养基进行培养，具体操作为：将上述细胞悬液接加入培养瓶，添加终浓度为20ng/mL的IL-15（同立海源：GMP-TL202-0100）、终浓度为500IU/mL的IL-2（双鹭药业：REC-Q5-0042）、终浓度为20ng/mL的CD16抗体（bioscienc: 16-3359-82）、终浓度为20ng/mL的CD137抗体（biolegend：309841）、终浓度为20ng/mL的CD335（NKp46）（bioscienc：16-3359-82）抗体、终浓度为0.01KE/mL的沙培林（山东鲁亚：国药准字S19980003）、终浓度为5%的自体血浆；将接种后的培养瓶置于二氧化碳培养箱培养；
S6：培养至第3、5、7、9、11、13、15和18天时补液操作：将细胞混匀、取样，采用台盼蓝染色计数，补加NK细胞扩增培养基，该NK细胞扩增培养基含有终浓度为20ng/ml的IL-15、终浓度为800IU/mL的IL-2、终浓度为5%的自体血浆，将细胞密度调整为7×105/mL -10×105/mL，期间检测，在扩增培养21天时细胞扩增600倍；
S7：采用流式检测手段，检测NK细胞表面markerCD3、CD56、CD16，结果显示细胞培养21天后的CD3-CD56+为98.3%，CD16+为94.3%。
实施例2 一种体外扩增高纯度NK细胞培养方法，方法步骤包括：
S1：用NK分选试剂处理外周血：在淋巴分离液分离单个核细胞前，将外周血按25:1加入NK分选试剂，即每1mL外周血加入40μL的NK分选试剂，室温条件下，避光孵育30min；
S2：淋巴分离液分离单个核细胞：将20mL外周血加入装有15mL淋巴分离液的50mL离心管一，在460g，室温下离心30min，降速设为0；
S3：洗涤PBMC：用巴氏吸管将白膜层吸出，在离心管二中加入20-25mL的DPBS清洗，在380g条件下离心10min，弃上清；再次加入20-25mL的DPBS清洗，在300g条件下离心10min，弃上清；使用20-25mL的DPBS重悬、混匀、取样，采用台盼蓝染色计数，在300g条件下离心10min；
S4：配制细胞悬液：用无血清NK细胞基础培养基重悬细胞、混匀，将细胞密度调整为2×106/mL -2.5×106/mL；
S5：接种细胞：将上述细胞悬浮液接种NK细胞激活培养基进行培养，具体操作为：将上述细胞悬液接加入培养瓶，添加终浓度为50ng/mL的IL-15、终浓度为1000IU/mL的IL-2、终浓度为50ng/mL的CD16抗体、终浓度为50ng/mL的CD137抗体、终浓度为50ng/mL的CD335抗体、终浓度为0.02KE/mL的沙培林、终浓度为10%的自体血浆；将接种后的培养瓶置于二氧化碳培养箱培养；
S6：培养至第3、5、7、9、11、13、15和18天时补液操作：将细胞混匀、取样，采用台盼蓝染色计数，补加NK细胞扩增培养基，含有终浓度为50ng/ml的IL-15、终浓度为1000IU/mL的IL-2、终浓度为10%的自体血浆的无血清NK细胞基础培养，将细胞密度调整为7×105/mL-10×105/ml，期间检测，并在第21日回收细胞；
S7：采用流式检测手段，检测NK细胞表面markerCD3、CD56、CD16。
结果如图2所示，在前9天内扩增不明显，从11天开始，随着扩增时间延长，扩增速度也加大，在扩增培养21天时细胞扩增800倍；
结果如图3-图4所示，结果显示细胞培养21天后的CD3-CD56+为99.52%，CD16+为96.9%。
实施例3 一种体外扩增高纯度NK细胞培养方法，方法步骤包括：
S1：用NK分选试剂处理外周血：在人外周血淋巴细胞分离液分离单个核细胞前，将外周血按25:1加入NK分选试剂，即每1mL外周血加入40μL的NK分选试剂，室温条件下，避光孵育30min；
S2：淋巴分离液分离单个核细胞：将20mL外周血加入装有15mL淋巴分离液的50mL离心管一，在460g，室温下离心30min，降速设为0；
S3洗涤PBMC：用巴氏吸管将白膜层吸出，在离心管二中加入20-25mL的DPBS清洗，在380g条件下离心10min，弃上清；再次加入20-25mL的DPBS清洗，在300g条件下离心10min，弃上清；使用20-25mL的DPBS重悬、混匀、取样，采用台盼蓝染色计数，在300g条件下离心10min；
S4：配制细胞悬液：用无血清NK细胞基础培养基重悬细胞、混匀，将细胞密度调整为2×106/mL -2.5×106/mL；
S5：接种细胞：将上述细胞悬浮液接种NK细胞激活培养基进行培养，具体操作为：将上述细胞悬液接加入培养瓶，添加终浓度为70ng/mL的IL-15、终浓度为800IU/mL的IL-2、终浓度为60ng/mL的CD16抗体、终浓度为80ng/mL的CD137抗体、终浓度为70ng/mL的CD335抗体、终浓度为0.03KE/mL的沙培林、终浓度为7%的自体血浆；将接种后的培养瓶置于二氧化碳培养箱培养；
S6：培养至第3、5、7、9、11、13、15和18天时补液操作：将细胞混匀、取样，采用台盼蓝染色计数，补加NK细胞扩增培养基，含有终浓度为70ng/mL的IL-15、终浓度为800IU/mL的IL-2、终浓度为7%的自体血浆的无血清NK细胞基础培养基，将细胞密度调整为7×105/mL -10×105/mL，期间检测，在扩增培养21天时细胞扩增700倍。
S7：采用流式检测手段，检测NK细胞表面markerCD3、CD56、CD16，结果显示细胞培养21天的CD3-CD56+ 为97.8%，CD16+为95.7%。
实施例4 一种体外扩增高纯度NK细胞培养方法，方法步骤包括：
S1：用NK分选试剂处理外周血：在人外周血淋巴细胞分离液分离单个核细胞前，将外周血按25:1加入NK分选试剂，即每1mL外周血加入40μL的NK分选试剂，室温条件下，避光孵育30min；
S2：淋巴分离液分离单个核细胞：将20mL外周血加入装有15mL淋巴分离液的50mL离心管一，在460g，室温下离心30min，降速设为0；
S3洗涤PBMC：用巴氏吸管将白膜层吸出，在离心管二中加入20-25mL的DPBS清洗，在380g条件下离心10min，弃上清；再次加入20-25mL的DPBS清洗，在300g条件下离心10min，弃上清；使用20-25mL的DPBS重悬、混匀、取样，采用台盼蓝染色计数，在300g条件下离心10min；
S4：配制细胞悬液：用无血清NK细胞基础培养基重悬细胞、混匀，将细胞密度调整为2×106/mL -2.5×106/mL；
S5：接种细胞：将上述细胞悬浮液接种NK细胞激活培养基进行培养，具体操作为：将上述细胞悬液接加入培养瓶，添加终浓度为100ng/mL的IL-15、终浓度为1500IU/mL的IL-2、终浓度为100ng/mL的CD16抗体、终浓度为100ng/mL的CD137抗体、终浓度为100ng/mL的CD335抗体、终浓度为0.02KE/mL的沙培林、终浓度为10%的自体血浆；将接种后的培养瓶置于二氧化碳培养箱培养；
S6：培养至第3、5、7、9、11、13、15和18天时补液操作：将细胞混匀、取样，采用台盼蓝染色计数，补加NK细胞扩增培养基，含有终浓度为100ng/ml的IL-15、终浓度为2000IU/mL的IL-2、终浓度为10%的自体血浆的无血清NK细胞基础培养基，将细胞密度调整为7×105/mL -10×105/mL，期间检测，在扩增培养21天时细胞扩增680倍；
S7：采用流式检测手段，检测NK细胞表面markerCD3、CD56、CD16，结果显示细胞培养21天的CD3-CD56+为98.76%，CD16+为96.3%。
应用例：NK对肿瘤细胞的杀伤实验，方法步骤包括：
S1：按照表1所示分组和接种细胞，各组3个重复。
表1
S2：分别将NCI H1650和K562肿瘤细胞按10000cells/100μL /孔接种至96孔板，置于5% CO2，37ºC常规培养24h。
S3：用10%FBS的1640完全培养基重选NK细胞，按效靶比例0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1接种NK细胞，每个实验组重复3个样本，置于5% CO2，37ºC孵育20h。
S4：按1:10的比例每孔加入10μL CCK-8，置于5% CO2，37ºC孵育4-6h。
S5：用酶标仪测定在450nm处吸光度。
S6：根据以下公式计算各组实验的细胞杀伤性：
效应细胞杀伤率=1－（实验组平均OD－效应细胞对照组平均OD）/（靶细胞对照组平均OD－空白组平均OD）
S7：结果如图5和图6所示，随着效靶比增大，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率也逐渐增高，其中，对K562肿瘤细胞的杀伤率可达100%，对NCI H1650肿瘤细胞的杀伤率也可达99.51%。
本发明接种在含有将外周血单个核细胞接种在含有IL-2、IL-15、CD16抗体、CD137抗体、CD335（NKp46）抗体、沙培林的NK细胞激活培养基中，通过D16抗体、CD137抗体及CD335（NKp46）抗体联合作用，进一步提高IL2、IL15对NK细胞的刺激与活化，获得扩增效率与纯度更高的NK细胞。上述技术不使用磁珠分选细胞，不使用滋养层细胞活化方法，也不需要提前用CD16抗体包被培养瓶，操作简单、成效快、成本低、安全性高。可实现体外高效扩增NK细胞，21天内细胞扩增800倍。本方法得到的NK细胞纯度更高、活性高、对肿瘤细胞的杀伤效果好，具有很高的临床价值。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
分离获取外周血的单个核细胞，用NK细胞激活培养基重悬所述单个核细胞，进行孵育培养；培养至第3天，补加NK细胞扩增培养基，之后每隔一天，补加一次所述NK细胞扩增培养基，培养至第21天，获取所述高纯度NK细胞；
所述NK细胞激活培养基为以无血清NK细胞基础培养基为基础，添加终浓度为1000IU/mL IL-2、50ng/mL IL-15、50ng/mL CD16抗体、50ng/mL CD137抗体、50ng/mL CD335抗体、0.02KE/mL沙培林和10%血浆；
所述NK细胞扩增培养基为以无血清NK细胞基础培养基为基础，添加终浓度为1000 IU/mL IL-2、50ng/mL IL-15和10%血浆。
2.如权利要求1所述的高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，所述孵育培养的条件为：37℃，5% CO2。
3.如权利要求1所述的高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，所述分离获取外周血的单个核细胞的方法包括以下步骤：将外周血与NK分选试剂按体积比25:1混合，避光孵育，经离心、清洗，获取所述外周血的单个核细胞。
4.如权利要求3所述的高纯度NK细胞体外扩增培养方法，其特征在于，所述避光孵育的条件为：室温避光孵育30min。
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