CN110511907A

CN110511907A - 一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性nk细胞的方法

Info

Publication number: CN110511907A
Application number: CN201910408509.2A
Authority: CN
Inventors: 邓蒙蒙; 程箫; 刘丹; 吴疆; 王保如
Original assignee: Anhui Ruida Health Industry Co Ltd
Current assignee: Anhui Ruida Health Industry Co Ltd
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2019-11-29

Abstract

本发明公开了一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，具体涉及自体或同种异体外周血单个核细胞在体外稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞的方法，步骤为：(1)分离单个核细胞；(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD3⁺T淋巴细胞；(3)加入NK细胞培养用无血清细胞培养基及细胞因子IL‑15、IL‑12、IL‑21、IL‑2和OK432，体外培养2‑5天后全换液；(4)NK细胞换液；(5)收获NK细胞。在体外培养条件下稳定扩增大量高纯度、高细胞活性的NK细胞，同时减少T细胞数量，且满足临床应用所需。

Description

一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法

技术领域：

本发明涉及到免疫细胞治疗领域，具体是一种自体或同种异体外周血单个核细胞在体外稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞的方法。

背景技术：

细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤。目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3^-CD56⁺，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56^highCD16^-细胞和具有细胞毒活性的CD56^dimCD16⁺细胞。 NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。最新的研究表明，阻断NK细胞表面的免疫检测点受体TIGIT，可以有效的阻止NK细胞的耗竭，促进NK细胞依赖的肿瘤免疫，抑制多种小鼠恶性肿瘤的生长。阻断PD-1/PD-L1信号通路可以激活 NK细胞和T细胞、逆转肿瘤免疫微环境，增强机体内源性抗肿瘤免疫效应。因此，NK 细胞在机体免疫系统抵抗肿瘤的反应中发挥必不可少的作用，机体NK细胞功能紊乱，是肿瘤发生、发展的可能原因之一。自体或者同种异体NK细胞已经用于治疗恶性淋巴瘤、难治性非霍奇金淋巴瘤、复发性/难治性急性白血病、急性髓性白血病、儿童复发/难治性神经母细胞瘤、晚期胃癌、结直肠癌、结直肠癌/胰腺癌肝转移以及多种复发性、转移性实体瘤。临床显示出良好的耐受性和一定的治疗效果。NK细胞的治疗效果和回输的NK细胞的纯度和数量呈正相关。

目前已经有一些可提供临床使用的NK细胞扩增技术，但是多采用饲养细胞(例如，表达IL-15和41BB配体的K562细胞、EBV转化的类淋巴母细胞细胞系、Wilm’s肿瘤细胞、射线辐照的PBMCs等)进行刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)或者纯化富集后的NK细胞获得大量功能完备的NK细胞。现有的NK细胞扩增方法要么NK细胞的扩增数量较低，难以满足临床应用需求；要么采用饲养细胞的培养方法，临床应用存在一定的风险，而且NK细胞扩增培养步骤繁琐，成本较高，NK细胞比例相对较低，有残留的T细胞和B细胞，具有引起GVHD的风险。目前一些专利文献报道的无饲养细胞的NK细胞扩增方法，多采用anti-CD3抗体和anti-CD16抗体包被细胞培养瓶刺激、活化NK细胞，细胞培养方法繁琐、不稳定、扩增的NK细胞纯度较低。

而且在现有的技术研究中，试验又发现，供者在提供NK细胞时，并不能达到完全的纯化目的，有一定量的T细胞跟着NK细胞一起输入到了受者的体内。而这些跟着NK 细胞一起输注的T细胞由于膜上的相关配体的影响，将对NK细胞的KIR的表达产生一定的干扰作用。针对以上情况，现有的处理方法是将这些准备输入到患者体内的NK细胞和混杂于其中的T细胞，提前进行照射、清除、净化等的处理，使得T细胞的数量减少到最低。以上方法虽然较好地处理了混杂于NK细胞中的T细胞，却并不是毫无问题的。因为，在进行照射等处理的同时，NK细胞必然也会遭受到各种理化因素的影响，继而会产生如下的后果：数量减少、活性降低、还有一些使NK细胞产生未知的、不利的变化。

针对上述所述问题，因此，急需开发一种稳定的、无血清、无饲养细胞的高纯度、高活性NK细胞扩增培养体系。

发明内容：

为解决现有技术存在的不足，解决现有NK细胞培养技术繁琐、NK细胞纯度低、杀伤功能弱、培养体系不稳定的缺点，本发明提供一种无血清、无饲养细胞的NK细胞体外扩增方法，可在体外培养条件下稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞，从而能够有效的提供满足临床应用所需的NK细胞。

为了达到上述目的，本发明设计了一种无血清、无饲养细胞的NK细胞体外扩增方法，扩增方法由以下步骤构成：

(1)分离单个核细胞；

(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD3⁺T淋巴细胞；

(3)加入NK细胞培养用无血清细胞培养基及终浓度为10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、500-2000U/ml IL-2和0.1-20μg/ml OK432接种在细胞培养瓶体外培养2-5天后全换液；

(4)NK细胞换液；

(5)收获NK细胞。

本发明所述单个核细胞是通过肝素抗凝无菌一次性采血管静脉穿刺采集外周血后，通过Ficoll密度梯度离心获得或者通过单采机采集的单个核细胞；或者来自于脐带血、骨髓和iPSCs诱导分化得到的单个核细胞。

所述免疫分选去除单个核细胞中的CD3⁺T淋巴细胞可采用免疫磁珠、膜泡免疫分选和流式细胞仪免疫分选等方法。

所述去除CD3⁺T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×10⁶cells/ml，优选为 1×10⁶cells/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-15的浓度优选为120-350ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-12的浓度优选为100-300ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-21的浓度优选为100-380ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-2的浓度优选为1000-1800U/ml。

所述细胞因子组合中所用OK432的浓度优选为0.5-5μg/ml。

所述NK细胞全换液天数优选为第4天，细胞浓度优选为1×10⁶cells/ml。

所述NK细胞换液为通过补加含NK细胞扩增所需细胞因子的NK细胞无血清培养调整NK细胞浓度至1×10⁶cells/ml。

所述NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果：

(1)与现有NK细胞扩增方法相比，所述NK细胞扩增方法无需血清、无需饲养细胞刺激、无需预先包被培养瓶，即可建立稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞，简单可行。

(2)OK432同IL-15、IL-12、IL-21、IL-2共同用于刺激NK细胞扩增培养，可以减少T细胞数量，并且增加NK细胞的纯度和增强NK细胞的活性，解决了现存的NK细胞回输治疗时一定量的T细胞跟着NK细胞一起输入到了受者的体内，从而产生的T细胞对NK细胞疗效的影响。且本培养方法不会降低NK细胞的活性和数量，解决了传统技术方法中的缺陷。

附图说明：

图1为实施例3扩增培养NK细胞生长曲线。

图2为实施例3扩增培养NK细胞在第14天和第21天的扩增倍数。

图3为实施例4扩增培养NK细胞生长曲线。

图4为实施例4扩增培养NK细胞在第14天和第21天的扩增倍数。

图5为实施例5扩增培养NK细胞生长曲线。

图6为实施例3扩增NK细胞在第21天时的表型。

图7为实施例4扩增NK细胞在第21天时的表型。

图8为实施例5扩增NK细胞在第21天时的表型。

图9为加入NK细胞4h时对NCI-H1975细胞的细胞毒活性。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 NK细胞体外扩增-单核细胞的分离

1.单核细胞的分离

1.1在生物安全柜正常工作状态下，50ml无菌离心管分别加入Ficoll-Paque Plus淋巴细胞分离液；

1.2将患者外周全血与DPBS按比例均匀稀释后缓慢注入于离心管中淋巴细胞分离液液面上层；

1.3 20℃，400×g，离心30分钟；

1.4使用无菌吸管吸取分离管中的血浆层，将血浆放入50ml无菌离心管中，56℃水浴 30分钟灭活，800g×离心10分钟，将上层血浆转移至新的50ml无菌离心管中；

1.5吸取分离所得的单个核细胞层(PBMCs)装于50ml无菌离心管中；

1.6加入DPBS，混匀，20℃，400×g，离心10分钟，洗涤1次；

1.7弃上清液，再用DPBS将1.6步所有细胞重悬至一个50ml无菌离心管中，混匀，取20 μl细胞悬液置于1.5ml EP管中计数。

实施例2 NK细胞体外扩增-CD3⁺T细胞去除

2.1根据步骤1.7的计数结果，取出5×10⁵细胞置于1.5ml EP管中，用于分选前表型检测，剩余细胞20℃，400×g，离心10分钟，再洗涤1次，弃上清液，用含0.5％人血白蛋白及1mM EDTA的DPBS(0.5％HSA，1mM EDTA，DPBS)将细胞浓度调整至1×10⁸ cells/ml，转移至5ml无菌流式管中，按150μl/ml样品加入Easysep^TM Human CD3Positive Selection KitII中的Human CD3Positive Selection Cocktail II，混匀，室温放置3min；

2.2将Easysep^TM Human CD3Positive Selection Kit II中的RapidSphereTM50100混匀，按 90μl/ml样品加至步骤2.1的流式管中，混匀，室温放置3min；

2.3用含0.5％HSA，1mM EDTA，DPBS将步骤2.2中5ml无菌流式管中的细胞悬液的体积补齐至2.5ml，轻轻混匀；

2.4将上述5ml无菌流式管置于磁铁中室温静置3min，拿起磁铁，将细胞倒于15ml无菌离心管中，取20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中计数。

实施例3 NK细胞体外扩增-NK细胞培养

3.1根据2.4步计数结果，取出5×10⁵细胞置于1.5ml EP管中，用于分选后表型检测，剩余细胞悬液用L500培养基将剩余细胞体积补至14ml，混匀，20℃，400×g，离心5min；

3.2弃上清，20℃，400×g，离心5min；

3.3吸弃上清，用含10％自体血清的SuperCulture^TML500(L500)培养基将细胞浓度调整至 1×10⁶cells/ml，加入IL-2使其终浓度为1500IU/ml，另加入细胞因子(IL-15、Il-12和IL-21 终浓度均为200ng/ml)和OK432(终浓度均为2ng/ml)，混匀。

3.4将细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO₂培养箱中培养。

3.5培养第4天，将细胞吹匀，取20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中，用于计数。剩余细胞转至50ml无菌离心管中，20℃，400×g，离心5min；

3.6弃上清，用新鲜配制的含10％自体血清的L500培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至 1×10⁶cells/ml，同时加入IL-2使其终浓度为1500U/ml和另加入细胞因子(IL-15、Il-12、 IL-21终浓度均为2μg/ml)，混匀。

3.7将上述细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO₂培养箱中继续培养。

3.8培养第5天-第21天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的L500培养基(如有足够血浆，可继续维持10％自体血浆含量)，维持细胞浓度1×10⁶cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养。

在培养第0、4、6、8、10、12、14、16、18和21天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图1所示，接种880万细胞，扩增21天，细胞总数可达约 78亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第14天和第21天，计算NK细胞扩增倍数，可见采用本发明方法可以获得大量的NK细胞，结果参见图2。

实施例4 NK细胞体外扩增-NK细胞培养

4.1根据2.4步计数结果，取出5×10⁵细胞置于1.5ml EP管中，用于分选后表型检测，剩余细胞悬液用L500培养基将剩余细胞体积补至14ml，混匀，20℃，400×g，离心5min；

4.2弃上清，20℃，400×g，离心5min；

4.3吸弃上清，用含10％自体血清的SuperCulture^TML500(L500)培养基将细胞浓度调整至 1×10⁶cells/ml，加入IL-2使其终浓度为1500IU/ml，另加入细胞因子(IL-15、Il-12和IL-21 终浓度均为200ng/ml)，混匀。

4.4将细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO₂培养箱中培养。

4.5培养第4天，将细胞吹匀，取20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中，用于计数。剩余细胞转至50ml无菌离心管中，20℃，400×g，离心5min；

4.6弃上清，用新鲜配制的含10％自体血清的L500培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至 1×10⁶cells/ml，同时加入IL-2使其终浓度为1500U/ml和另加入细胞因子(IL-15、Il-12、 IL-21终浓度均为2μg/ml)，混匀。

4.7将上述细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO₂培养箱中继续培养。

4.8培养第5天-第21天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的L500培养基(如有足够血浆，可继续维持10％自体血浆含量)，维持细胞浓度1×10⁶cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养。

在培养第0、4、6、8、10、12、14、16、18和21天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图3所示，接种880万细胞，扩增21天，细胞总数可达约 56亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第14天和第21天，计算NK细胞扩增倍数，可见采用本发明方法可以获得大量的NK细胞，结果参见图4。

实施例5 NK细胞体外扩增-NK细胞培养

5.1根据2.4步计数结果，取出5×10⁵细胞置于1.5ml EP管中，用于分选后表型检测，剩余细胞悬液用L500培养基将剩余细胞体积补至14ml，混匀，20℃，400×g，离心5min；

5.2弃上清，20℃，400×g，离心5min；

5.3吸弃上清，用含10％自体血清的SuperCulture^TML500(L500)培养基将细胞浓度调整至 1×10⁶cells/ml，加入IL-2使其终浓度为1500IU/ml，OK432终浓度均为2ng/ml，混匀。

5.4将细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO₂培养箱中培养。

5.5培养第4天，将细胞吹匀，取20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中，用于计数。剩余细胞转至50ml无菌离心管中，20℃，400×g，离心5min；

5.6弃上清，用新鲜配制的含10％自体血清的L500培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至 1×10⁶cells/ml，同时加入IL-2使其终浓度为1500U/ml和另加入细胞因子(IL-15、Il-12、 IL-21终浓度均为2μg/ml)，混匀。

5.7将上述细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO₂培养箱中继续培养。

5.8培养第5天-第21天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的L500培养基(如有足够血浆，可继续维持10％自体血浆含量)，维持细胞浓度1×10⁶cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养。

在培养第0、4、6、8、10、12、14、16、18和21天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图5所示，接种880万细胞，扩增21天，细胞总数可达约5 亿，不能满足临床应用需要。

实施例6 NK细胞表型检测

6.本发明扩增培养的NK细胞表型检测

6.1取实施例3、实施例4、实施例5培养第21天的细胞，放入1.5mL的EP管中，每管 1×10⁶个细胞，400×g离心5分钟，去上清；

6.2分别加入1mLDPBS洗一遍，400×g离心5分钟，去上清；

6.3加入100μL的DPBS，分别加入APC Mouse IgG1,κIsotype Ctrl，-PerCP MouseIgG1,κ Isotype Ctrl和-PerCPanti-human CD3，APC anti-human CD56荧光抗体，4℃放置30分钟。

6.4 DPBS洗两遍，弃上清，最终使用150μLDPBS重悬细胞。

使用AECANovocyte流式细胞仪对培养得到的NK细胞进行检测，如图6、图7、图 8所示，培养21天的细胞，NK细胞的纯度分别可达99.62％、96.28％、96.78％；其中T 细胞含量为0.06％，0.94％，0.15％。

实施例7 NK细胞杀伤活性检测

7.本发明方法扩增得到的NK细胞杀伤活性检测

使用艾森生物的实时无标记细胞功能分析仪检测不同效靶比NK细胞对SK-BR-3细胞杀伤活性。具体操作步骤如下：

7.1消化NCI-H1975细胞，调整细胞悬液浓度至1×10⁵cells/mL；

7.2将细胞加至实时无标记细胞功能分析仪E-Plate 8检测板上，每孔加入300μL，37℃培养18-24小时。

7.3取实施例3的NK细胞，将100μL的NK细胞悬液或等体积的培养基(空白对照)以不同的效靶比(E:T＝0:1，2.5:1，5:1，10:1)加入E-Plate 8检测板内。

7.4将E-Plate 8检测板置于实时无标记细胞功能分析仪检测台上实时监测，观察NK细胞对NCI-H1975细胞的影响，结果见图9所示：实时监测显示加入NK细胞后，NK细胞对NCI-H1975细胞的杀伤活性随着效靶比的增加而增强。

7.5分析实验结果，在加入NK细胞的时间点，均一化细胞指数值，获得均一化细胞指数 (NCI)，统计加入NK细胞4小时后的NCI值，计算不同效靶比NK细胞对NCI-H1975 的细胞杀伤活性，如图9所示，NK细胞对NCI-H1975细胞的杀伤活性随NK细胞比例增加而增加。

Claims

1.一种体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，包括以下步骤：

(1)分离单个核细胞；

(2)免疫去除CD3⁺T淋巴细胞，去除CD3⁺T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×10⁶cells/ml；

(3)加入无血清培养基、扩增因子；

(4)培养第2-5天全换液；

(5)NK细胞收获；

其特征在于：步骤3中加入的扩增因子为：IL-15、IL-12、IL-21、IL-2和OK432。

2.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于：步骤3中加入的扩增因子终浓度为10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、500-2000U/ml IL-2和0.1-20μg/ml OK432。

3.根据权利要求1所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于：免疫去除CD3⁺T淋巴细胞的方法为免疫磁珠分选、膜泡分选和流式细胞仪分选等；去除CD3⁺T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×10⁶cells/ml。

4.根据权利要求2所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述IL-15浓度为120-350ng/ml，IL-12浓度为100-300ng/ml。

5.根据权利要求2所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述IL-21浓度为100-380ng/ml。

6.根据权利要求2所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述IL-2浓度为1000-1800U/ml。

7.根据权利要求2所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述OK432浓度为0.5-8μg/ml。

8.根据权利要求2所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于所述单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞。

9.根据权利要求2所述体外稳定扩增高纯度、高细胞毒活性NK细胞的方法，其特征在于：优选第4天全换液培养，细胞浓度优选为1×10⁶cells/ml；第4天后根据细胞生长状态补加含扩增所需细胞因子的无血清培养基调整细胞浓度为1×10⁶cells/ml。

10.一种体外扩增NK细胞的应用，其特征在于：采用权利要求1-9任一所述方法制备NK细胞用于肿瘤细胞免疫治疗。