CN112626018A - 一种高纯度的同种异体nk细胞培养基以及体外扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法。通过淋巴细胞分离液从胎盘血中分离单个核细胞，将分离的单个核细胞加入到含CD314抗体、IL‑2、灭活自体血浆等的无血清免疫细胞培养基体系中培养3天；培养第4天和第5天分别添加1次10％灭活自体血浆和1000IU/mL的IL‑2培养，继续培养7天后可见细胞大量扩增，继续培养2天，根据需要补充添加因子。本发明无需预先包被培养瓶，且无需用饲养层细胞，经过14‑16天培养，制备的NK细胞CD3‑CD16+/CD56+细胞表达率高达90％以上，且体外杀瘤活性强，能够解决现有NK培养体系和技术中，NK细胞纯度低、杀伤活性差的问题。

Description

一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法
技术领域
本发明属于NK细胞培养技术领域，涉及一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是天然免疫系统里的重要成员，来源于骨髓淋巴样干细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结，具有快速产生效应细胞因子和杀死病毒感染或肿瘤细胞的能力。NK细胞无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，其可通过快速激活一系列NK激活受体来识别和裂解肿瘤细胞。NK细胞起效快，且不需要肿瘤特异性识别，不受细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)抑制活性限制，具有广谱的抗肿瘤效应。因而，异体NK细胞在肿瘤过继性免疫治疗中发挥重要作用。但是，NK细胞在外周血中所占比例很低(5-15％)，因此在用于过继性免疫治疗之前，对NK细胞进行大量扩增十分必要。临床数据表明输注同种异体NK细胞同样具有安全性，没有任何毒副作用。NK细胞分布于外周血液、肝脏、脾脏、围产期组织(胎盘、脐带)等。相较成体外周血来源NK细胞相比，胎盘血来源NK具备更年轻、无后天污染、溶瘤能力和活性更强等优势，因而具有更有效的细胞免疫治疗潜能。
NK细胞的“动态平衡”主要受细胞表面多种受体蛋白的调控，包括NK细胞活化受体(KAR)和抑制受体(KIR)。NK细胞的活化状态，执行细胞的脱粒、细胞因子释放和细胞杀伤功能是抑制信号和活化信号综合的结果。NK细胞活化受体包括NKG2D(CD314)、CD16、NKp30(CD337)、NKp44(CD336)和NKp46(CD335)等。现有技术中有采用抗NKp46(CD335)和/或抗CD16用于NK细胞的体外增殖培养的活化激活。
然而，现有技术中存在以下问题：
⑴需要包被培养瓶，增加实验操作的复杂性；
⑵需要使用磁珠分选纯化的步骤，增加操作的难度及成本；
⑶现有技术较多使用灭活的K562细胞作为饲养层联合培养，存在一定的安全风险；
⑷现有NK细胞培养技术耗时长(最长达3周)，细胞纯度低；
⑸涉及胎盘血来源NK细胞培养扩增的技术较少。
发明内容
本发明公开了一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法。能够解决现有NK培养体系和技术中，NK细胞纯度低、杀伤活性差的问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种高纯度的同种异体NK细胞培养基，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基(包括但不限于LONZA X-VIVO培养基等)，所述添加物包括：抗CD314、抗CD16、注射用A群链球菌、自体血浆、IL-15、IL-2及IL-18。
优选地，所述无血清免疫细胞培养基在所述高纯度的同种异体NK细胞培养基中的体积百分数为90％。
优选地，各添加物在上述高纯度的同种异体NK细胞培养基中的占比为：
Figure BDA0002902947810000021
本发明将CD314抗体用于NK细胞体外培养的激活。CD314受体是NK细胞的激活受体之一，在自然杀伤细胞(NK)中表达，能够激活杀伤细胞(NK)的先天免疫反应，导致细胞毒性活动。CD314抗体加入能够激活CD314受体，进而启动NK细胞的杀伤活性。此外，本NK细胞培养基添加注射用A群链球菌，注射用A群链球菌(含青霉素)具有直接杀伤肿瘤细胞，激活宿主细胞免疫的功能，并可提高T细胞和NK细胞活性。
本发明还提供了一种高纯度的同种异体NK细胞体外扩增方法，包括：
1)通过淋巴细胞分离液从胎盘血中分离单个核细胞；
2)将分离的单个核细胞加入到培养基1中培养3天，培养基1为添加有抗CD314、抗CD16、注射用A群链球菌、自体血浆、IL-15、IL-2及IL-18的无血清免疫细胞培养基；
3)培养第4天和5天，分别补充一次培养基2进行培养，培养基2含90％体积的无血清免疫细胞培养基，10％体积的自体血浆和1000IU/mL的IL-2；
4)继续培养7天后根据需要补充培养基；
5)第14～16天收获细胞。
优选地，所述培养基1中含有50ng/mLCD314抗体、50ng/mLCD16抗体、10E/mL注射用A群链球菌、10％v/v自体血浆、2000IU/mL的IL-15、2000IU/mL的IL-2、1000IU/mL的IL-18及90％v/v的无血清免疫细胞培养基。
优选地，步骤1)包括：
1-1)转移收集的胎盘血样至T75瓶，记录血样体积；
1-2)另取50mL的离心管，用移液管在离心管底部分别加入15mL人淋巴细胞分离液；
1-3)在15mL人淋巴细胞分离液上，用移液管缓慢地加入15～30mL血样；
1-4)在水平转头离心机中离心，4℃，800g，20min；离心结束后，在不扰动白膜层的情况下，吸出血浆层，转移至50mL离心管；
1-5)将白膜层吸出，转移至另50mL离心管，加入40mL PBS，吹打清洗，20℃，400g，离心10min，此步骤重复一遍。
1-6)弃上清，加入40mL PBS，吹打清洗，20℃，400g，离心10min。
1-7)将血浆管置于56℃水浴锅内保持30min进行灭活，之后置于-20℃冰箱内20min进行冷却；20℃，1500g，10min离心后转移上清至1支新的离心管，标记“自体血浆”，保存于4℃。
优选地，步骤2)～步骤5)中均在37℃，5％CO2培养箱中静置培养。
优选地，步骤3)中，如果细胞密度处于0.7～1.5×106/mL，用培养基2将细胞密度调整至0.7×106/mL；如果细胞密度大于1.5×106/mL，用培养基2将细胞密度调整至1.0×106mL。
优选地，步骤4)中，当细胞密度≥1.5×106/mL时，补充添加有IL-2因子的无血清免疫细胞培养基，稀释细胞至0.7～2.0×106/mL。
更优选地，无血清免疫细胞培养基中IL-2因子的添加量为1000～2000IU/mL。
本方法无需预先包被培养瓶，且无需用饲养层细胞，经过14～16天培养，该方法制备的NK细胞CD3-CD16+/CD56+细胞表达率高达90％以上，且体外杀瘤活性强。
本发明的有益效果在于：
⑴无需包被培养瓶，无需磁珠分选，不需要滋养层细胞无致瘤风险，可快速，在2周左右时间内实现NK细胞的高纯度扩增。纯度高，可达到90％。
⑵培养的步骤相对简单，成本低。
⑶获得的NK细胞杀伤力强。
附图说明
图1流式细胞术检测本发明与现有技术NK细胞纯度结果图。
图2本发明与现有技术NK细胞杀伤活性对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法。
实施例
本实施例的主要实现步骤如下：
1.胎盘血外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分离和血浆的准备
1.1.转移收集的30mL胎盘血样本至T75瓶。该样本为由志愿者自愿捐赠，并签署相应的知情同意书，整个过程符合伦理要求。
1.2.另取50mL的离心管，用移液管在离心管底部分别加入15mL人淋巴细胞分离液。
1.3.在15mL人淋巴细胞分离液上，用移液管缓慢地加入15～30mL血样。
1.4.在水平转头离心机中离心，4℃，800g，20min。
1.5.离心结束后，在不扰动白膜层的情况下，吸出血浆层，转移至50mL离心管。
1.6.将白膜层(PBMC层)吸出，转移至另50mL离心管。加入40mL PBS，吹打清洗，20℃，400g，离心10min。此步骤重复一遍。
1.7.弃上清，加入40mL PBS，吹打清洗，20℃，400g，离心10min。
1.8.将血浆管置于56℃水浴锅内保持30min进行灭活，之后置于-20℃冰箱内20min进行冷却。20℃，1500g，10min离心后转移上清至1支新的离心管，标记“自体血浆”，保存于4℃。
2.细胞接种(Day0)
2.1.用LONZA X-VIVO 15(华雅干细胞有限公司)培养基10mL重悬上述PBMC细胞，并进行细胞计数。
本实施例采用LONZA X-VIVO 15培养基，也可采用其他市售无血清免疫细胞培养基，在此不做限定。
2.2.按照如下体系配制培养体系(培养基1)：
Figure BDA0002902947810000061
2.3.混合均匀。转移至T75细胞培养瓶，轻轻吹打3～5次，混合均匀。将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中静置培养。在整个培养过程中应注意避免剧烈震荡摇晃培养瓶。
3.补充培养基(Day4)
3.1.在培养3天后，用显微镜观察细胞，通常可以观察到有小的小于100个细胞的、松散的克隆团出现。由于细胞增长过快，也会出现大的、致密的克隆团出现。
3.2.在确定培养正常、无污染后，补充10ml的培养基2。培养基2含90％体积的LONZA X-VIVO 15培养基，10％体积的自体血浆，和1000IU/mL的IL-2。配制混合培养基2并平衡至37℃。
3.3.将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
4.第2次补充培养基(Day5～Day14)
4.1.观察细胞，可以观察到培养基颜色变黄、细胞团增大、细胞团密集的现象。用移液管将细胞团吹打成单个细胞，计数。如果细胞密度处于0.7～1.5×106/mL，用培养基2将细胞密度调整至0.7×106/mL。如果细胞密度大于1.5×106/mL，用培养基2将细胞密度调整至1.0×106mL。
4.2.培养第5天，补充培养基2。培养基2的加入量同4.1，根据密度需要调整加入培养基2的体积。
4.3.7天以后，细胞的生长速度会明显加快。当细胞密度≥1.5×106/mL时，采用含适量(1000～2000IU/mL均可)IL-2的LONZA X-VIVO15培养基，将细胞稀释至0.7～2.0×106/mL。
5.培养第14～16天收获细胞进行检测。
对比例
先采用CD16抗体预先一天包被T75培养瓶，4℃冰箱平放过夜。经过分离血浆，经过取PBMC，洗涤细胞等步骤，计数等后种<2×106个细胞于包被好的培养瓶中。以含1000IU/mlIL-2的10mL LONZA X-VIVO 15培养基为基础培养基。而后在第一天基础培养基上加入2500IU/mLIL-15和灭活血浆1.25ml。于第3天补液时加入2500IU/mL IL-15，第5天补液时补充1500IU/mL IL-18和8.75ml血浆，第7天和第9天采用基础培养基补液，于第15天收获细胞。
实验例1.NK细胞纯度检测
1.细胞染色：100μL细胞悬液中分别加入2μL的CD56和CD3抗体，轻微振荡混匀后避光保存20分钟。
2.上机检测：加入400μL PBS混匀后上机检测，配色方案为CD56(APC-Cy7-A)，CD3(FITC)。
3.利用BD FACSCanto II流式细胞仪和BD FACSDiva软件进行流式检测，合理设门并获取>5×104细胞数进行采集分析。
流式细胞检测结果显示，本发明方法培养的NK细胞纯度可达98.5％，明显优于现有技术培养的NK细胞纯度38.9％。见图1。
实验例2.NK细胞杀伤能力实验方案
1.复苏靶细胞：
复苏一支K562细胞，使用1640+10％FBS进行培养，培养2～3天后观察细胞，若细胞状态良好则进行靶细胞数确认实验(所需K562总数需确认最佳靶细胞数后确定)。
2.确认靶细胞数目
2.1.制备靶细胞悬液：吹打K562细胞成均匀细胞悬液，计数，使用靶细胞培养基将细胞悬液密度调至2×106个/ml，以此为基础进行等倍稀释，制备1×106个/ml、0.5×106个/ml、0.25×106个/ml、0.125×106个/ml的细胞悬液；
2.2.取100μL靶细胞悬液，加入96孔板中，制备靶细胞稀释，每浓度3孔；用裂解液裂开细胞。250g离心平板4分钟。将50μl上清转移到酶标分析板中，用检测缓冲液配制底物。加入50μl底物于酶标分析板中。室温避光孵育30分钟，每孔加入50μl终止液。记录490nm吸光度值。
2.3.每孔加入100μL LONZA X-VIVO 15培养基；裂解细胞、收获上清；测量LDH：按说明书操作后一小时内在490nm测量吸光值；确定靶细胞的吸光值至少是培养基背景对照吸光值的两倍时的靶细胞浓度；
3.杀伤实验
3.1.收集效应细胞(NK细胞)，加入LONZA X-VIVO 15培养基，将细胞悬液浓度调至1×107个/mL，以此为基础进行等倍稀释，制备0.5×107个/ml、0.25×107个/ml、0.125×107个/ml、6.2×106个/mL、3.125×106个/mL、1.5×106个/mL的细胞悬液(以靶细胞数5000为例)；
3.2.制备靶细胞(以3.1优化得到细胞数浓度)悬液；每孔加入100μL细胞悬液，效应细胞和靶细胞的比例按32:1、16:1、8:1、4:1、2:1、1:1铺板。并做相应效应细胞自释放组对照。250g离心5min；37℃、5％CO2培养箱孵育>＝4h，孵育结束前45min向靶细胞最大释放孔中20μL裂解液；孵育结束后，450g离心5min；
3.3.测量LDH：每孔50μL上清转移至另一新的96孔板中，融化分析缓冲液，取出12mL，避光平衡到室温，然后将分析缓冲液加入到一瓶底物中，轻轻颠倒混匀，配好后每孔加入50μL底物，避光室温孵育30min后每孔加入50μL终止液；
3.4.数据计算：用针头戳破大的气泡，在加入停止液后1小时内于490nm测量吸收光值
计算公式如下：
Figure BDA0002902947810000091
从图2可知，本发明方法所制备的NK细胞在效靶比8:1，4:1，2:1的杀伤活性分别是(93.1％，87.5％，83.2％)，现有技术的上述效靶比的相应杀伤活性分别是(64.5％，51.3％，39.6％)。本发明方法所制备的NK细胞靶细胞杀伤率优于现有技术制备的NK细胞。

Claims (10)

1.一种高纯度的同种异体NK细胞培养基，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基，所述添加物包括：抗CD314、抗CD16、注射用A群链球菌、自体血浆、IL-15、IL-2及IL-18。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度的同种异体NK细胞培养基，其特征在于，所述无血清免疫细胞培养基在所述高纯度的同种异体NK细胞培养基中的体积百分数为90％。
3.根据权利要求1或2所述的一种高纯度的同种异体NK细胞培养基，其特征在于，各添加物在所述高纯度的同种异体NK细胞培养基中的占比为：
Figure FDA0002902947800000011
4.一种高纯度的同种异体NK细胞体外扩增方法，包括：
1)通过淋巴细胞分离液从胎盘血中分离单个核细胞；
2)将分离的单个核细胞加入到培养基1中培养3天，培养基1为添加有抗CD314、抗CD16、注射用A群链球菌、自体血浆、IL-15、IL-2及IL-18的无血清免疫细胞培养基；
3)培养第4天和5天，分别补充一次培养基2进行培养，培养基2含90％体积的无血清免疫细胞培养基，10％体积的自体血浆和1000IU/mL的IL-2；
4)继续培养7天后根据需要补充培养基；
5)第14～16天收获细胞。
5.根据权利要求4所述的一种高纯度的同种异体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，所述培养基1中含有50ng/mL抗CD314、50ng/mL抗CD16、10E/mL注射用A群链球菌、10％v/v自体血浆、2000IU/mL的IL-15、2000IU/mL的IL-2、1000IU/mL的IL-18及90％v/v的无血清免疫细胞培养基。
6.根据权利要求4所述的一种高纯度的同种异体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤1)包括：
1-1)转移收集的胎盘血样至T75瓶，记录血样体积；
1-2)另取50mL的离心管，用移液管在离心管底部分别加入15mL人淋巴细胞分离液；
1-3)在15mL人淋巴细胞分离液上，用移液管缓慢地加入15～30mL血样；
1-4)在水平转头离心机中离心，4℃，800g，20min；离心结束后，在不扰动白膜层的情况下，吸出血浆层，转移至50mL离心管；
1-5)将白膜层吸出，转移至另50mL离心管，加入40mL PBS，吹打清洗，20℃，400g，离心10min，此步骤重复一遍；
1-6)弃上清，加入40mL PBS，吹打清洗，20℃，400g，离心10min；
1-7)将血浆管置于56℃水浴锅内保持30min进行灭活，之后置于-20℃冰箱内20min进行冷却；20℃，1500g，10min离心后转移上清至1支新的离心管，标记“自体血浆”，保存于4℃。
7.根据权利要求4所述的一种高纯度的同种异体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤2)～步骤5)中均在37℃，5％CO2培养箱中静置培养。
8.根据权利要求4所述的一种高纯度的同种异体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤3)中，如果细胞密度处于0.7～1.5×106/mL，用培养基2将细胞密度调整至0.7×106/mL；如果细胞密度大于1.5×106/mL，用培养基2将细胞密度调整至1.0×106mL。
9.根据权利要求4所述的一种高纯度的同种异体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，步骤4)中，当细胞密度≥1.5×106/mL时，补充添加有IL-2因子的无血清免疫细胞培养基，稀释细胞至0.7～2.0×106/mL。
10.根据权利要求9所述的一种高纯度的同种异体NK细胞体外扩增方法，其特征在于，无血清免疫细胞培养基中IL-2因子的添加量为1000～2000IU/mL。
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