CN114958744A - 一种离体干细胞扩大培养方法和应用 - Google Patents

一种离体干细胞扩大培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，用于解决现有的体外培养条件诱导应激，导致细胞快速增殖，代谢活性增加，失去了定义原代造血干细胞的原始特征，而且，通过使用生长因子/细胞因子/化学物质的混合物，干细胞扩增只取得了有限的成功，此外，造血干细胞体外培养的高成本是产业化和临床应用的另一个障碍的问题，具体涉及一种离体干细胞扩大培养方法和应用；该方法中通过化合物组合与单用VPA对人造血干细胞体外增殖的促进作用，我们的培养体系具有很强的诱导造血干细胞扩增的能力，我们的化合物组合与芳香族受体拮抗剂SR1联用，能大幅度提扩增效率，将有望真正改善临床上脐带血移植的结果，这对临床治疗是非常有价值的发现。

Description

一种离体干细胞扩大培养方法和应用
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种离体干细胞扩大培养方法和应用，更具体涉及一种对脐带血造血干细胞CD34+体外高效扩增的方法与应用。
背景技术
造血干细胞能够自愈并分化为所有类型的血细胞，包括红细胞、髓系和淋巴系。造血干细胞在临床上被用作多种造血系统恶性肿瘤的细胞治疗药物，包括白血病。从脐带血中获得的造血干细胞的体外扩增因其在多种血液病治疗中的应用而成为一个重要的研究领域。该过程有望模拟由基质细胞及其产生的材料组成的正常骨髓生态位。因此，几乎所有的扩展方案都包含早期和晚期作用的细胞因子，以促进造血细胞的生长。目前用于移植的造血干细胞有三种来源，分别是脐带血、外周血和骨髓。由于这些细胞用于临床移植的可用性有限，为了获得足够数量的可移植造血干细胞，人们在过去进行了许多体外扩增的尝试。绝大多数体外扩张造血干细胞的策略都集中在通过内在因子(如转录因子和信号分子)或环境因子(如细胞因子、趋化因子、基质细胞和粘附分子)调节造血干细胞的更新和生存。通过与骨髓间充质间质细胞、永生化间质细胞共培养或过度表达自我更新基因如HOXB4和Sall4b，可以实现合理的干细胞扩增。
然而，这些方法涉及到对基质环境的操纵或对造血干细胞基因组的干扰，冒着意想不到的不利影响的风险。因此，开发一种简单有效的HSC扩张途径势在必行。在过去的二十年里，各种细胞因子、小分子和化学物质被用于体外扩大造血干细胞，包括血小板生成素(TPO)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素(IL)-3、-6、-11、干细胞因子(SCF)、血管生成素(Ang)-1、StemRegenin 1(SR1)和四乙烯五胺(TEPA)。此外，原代间充质干细胞等各种基质细胞可以提高扩增效率。
目前，已经开发出多种方法和策略，从脐带血中体外扩大培养获得的有限数量的造血干细胞。在体外培养中，不同的细胞因子混合物与小分子或化合物的组合可导致造血干细胞细胞数目不同程度的扩张。重要的是，体外培养条件诱导应激，导致细胞快速增殖，代谢活性增加，失去了定义原代造血干细胞的原始特征，而且，通过使用生长因子/细胞因子/化学物质的混合物，干细胞扩增只取得了有限的成功，此外，造血干细胞体外培养的高成本是产业化和临床应用的另一个障碍。因此，进一步优化效率，降低成本仍有很大的需求，需要开发一种方法，使大量具有与初级原始造血干细胞相似特征的功能性造血干细胞得到扩展。
发明内容
为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种离体干细胞扩大培养方法和应用，通过依次进行Buffer和培养基的准备、从脐带血分离单核细胞、从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞、CD34+细胞培养及化合物干预以及抗体染色用于流式细胞术分析五个步骤，实现将离体干细胞扩大培养，解决了现有的体外培养条件诱导应激，导致细胞快速增殖，代谢活性增加，失去了定义原代造血干细胞的原始特征，而且，通过使用生长因子/细胞因子/化学物质的混合物，干细胞扩增只取得了有限的成功，此外，造血干细胞体外培养的高成本是产业化和临床应用的另一个障碍的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种离体干细胞扩大培养方法，包括以下步骤：
步骤一：Buffer和培养基的准备；
步骤二：从脐带血分离单核细胞；
步骤三：从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞；
步骤四：人CD34+细胞培养及化合物干预；
步骤五：抗体染色用于流式细胞术分析。
作为本发明进一步的方案：步骤一中所述的Buffer和培养基的准备的具体过程如下：
在从脐带血分离CD34+细胞的24小时之前，将2mL0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)和33mL质量分数为7.5％的牛血清白蛋白(BSA)加入到465mL缓冲生理盐水(1xPBS)中，制备分离缓冲液，混合后并保持分离缓冲液在4℃下过夜。
作为本发明进一步的方案：步骤二中所述的从脐带血分离单核细胞的具体过程如下：
S21：将脐带血放入一个75cm2的培养瓶中，在室温条件下，用等质量的PBS稀释并混合脐带血，得到稀释脐带血；
S22：确定处理整个脐带血所需的管数(一个50mL的离心管可用于处理35mL稀释脐带血)，在每个试管中加入15mL浓度梯度介质，并将稀释脐带血涂抹在浓度梯度介质的顶部，形成两层；
S23：在离心力为400xg的条件下低速加减速离心30min，离心后，单核细胞位于血浆和密度梯度介质层之间的白色层(淡色层)；
S24：抽吸2/3的血浆，不影响淡黄色涂层，将淡黄色涂层转移到一个新的50mL试管中，从同一个脐带血收集所有的单核细胞，收集到50mL的试管中，直到达到25mL，如果收集到的单核细胞的体积超过25mL，使用新的试管；
S25：将25mL的冷PBS加入含有25mL单核细胞的试管中，混合均匀，在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心10min；
S26：吸出上清液，将细胞颗粒重新悬浮在50mL冷PBS中；
S27：取细胞悬液20μL计数，具体如下：用自动细胞计数器计数吖啶橙/碘化丙啶染色的细胞数量，计算单核细胞的总数；
S28：在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min。
作为本发明进一步的方案：步骤三中所述的从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞的具体过程如下：
S31：准备CD34+抗体偶联磁珠溶液，从单核细胞分离CD34+细胞，具体如下：
将300μL的分离缓冲液与100μL的人FcR人IgG(阻断试剂)和100μL的CD34磁珠混合，得到CD34+抗体偶联磁珠溶液，从每108个单核细胞中分离CD34+细胞，为了从单核细胞中分离更多数量的CD34+细胞，相应地扩大试剂的规模；
S32：将步骤S28中离心的试管中吸取上清液，将微球重悬于CD34+抗体偶联磁珠溶液中(每108个细胞使用500μL溶液)；
S33：混合后在温度为4℃的条件下孵育30min；
S34：向含有细胞混合物的试管中加入冷细胞分离缓冲液，直到管完全充满，之后在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min；
S35：抽吸上清液，在冷细胞分离缓冲液中重悬细胞球(2mL/108细胞)，将2mL细胞悬液混合物转移到15mL的试管中。
S36：将3组15mL的试管装入温度为4℃的预冷的细胞分离器中，第一组试管包含单核细胞，第二组试管将用于收集阴性细胞，第三组试管将用于收集纯化的CD34+细胞；
S37：含阳性组分的离心管在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min，抽吸上清液，将纯化的CD34+细胞重悬于1mL无血清培养基中；
S38：使用自动细胞计数器计数吖啶橙/碘化丙啶染色的细胞。
作为本发明进一步的方案：步骤四中所述的人CD34+细胞培养及化合物干预的具体过程如下：
S41：准备足够容量的培养基，以3.3×104个细胞/mL的密度平板纯化CD34+细胞；其中，培养基为含10μL/mL pen/strep、150ng/mL干细胞因子(SCF)、100ng/mL fms样酪氨酸激酶受体3(FLT3配体)、100ng/mL促血小板生成素(TPO)、50ng/mL白介素3(IL-3)的血清游离培养基；
S42：平板纯化CD34+细胞，12孔板(5×104CD34+细胞/1.5mL培养基/孔)，在温度为37℃，5％CO2加湿的培养箱中培养；
S43：用FACS分析评估分离CD34+细胞的纯度和细胞组成；
S44：将终浓度为1mM的VPA加入细胞因子混合物处理16h后的细胞培养液中；
S45：采用化合物组合VPA+SR1,为了确定VPA和SR1最佳作用浓度，进行了浓度优化实验，加入浓度梯度的VPA(0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM)；
S46：在温度为37℃，5％CO2加湿的培养箱中再培养7天；
S47：7天后计算每组细胞中CD34+CD90+细胞数，可得化合物最佳浓度为0.5mM VPA+0.5μM SR1。
作为本发明进一步的方案：步骤五中所述的抗体染色用于流式细胞术分析的具体过程如下：
S51：准备抗体染色液，染色2×104-6×104细胞和同型液，确定FACS门控策略和非特异性结合水平，稀释后的抗体(1/100APC抗CD34,1/200FITC抗CD90)和各自的同分型放入50μL的分离缓冲液中；
S52：多次移液使细胞培养均质化，计数细胞和移液5×104细胞到1.5mL试管中；
S53：加入1mL分离缓冲液，在室温且离心力为400xg的条件下离心15min；
S54：抽吸上清液，将小球重悬于50μL的染色液中，在室温条件下孵育细胞30min；
S55：加入450μL的分离缓冲液，在室温且离心力为400xg的条件下离心15min；
S56：抽吸上清液，将小球重悬于100μL分离缓冲液中，将细胞置于冰上至少5min，直到进行FACS分析，加入1μL 7-AAD修饰活细胞；
S57：将染色后的细胞样本装入FACS机器，以最低流速获得细胞；
S58：对于每个荧光团，分析同型对照和单染色细胞，建立FITC(CD90)、APC(CD34)和PerCP/Cy5.5门控(7-AAD)染色；
S59：通过对PerCP/Cy5.5阴性部分进行检测，并绘制APC与FITC的比值图，以确定HSPC/HSC在培养液中的存活CD34+、CD90+和CD34+CD90+细胞的百分比，从而确定HSPC/HSC的群体。
作为本发明进一步的方案：所述的方法在对脐带血造血干细胞CD34+体外高效扩增中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的一种离体干细胞扩大培养方法和应用，由于造血干细胞与移植成功率密切相关，由于脐带血干细胞不能像骨髓和动员外周血中的干细胞那样迅速地归巢，细胞数不足会直接导致造血干细胞移植失败，因此细胞量不足的情况我们需要对造血干细胞进行扩增，同时提高脐带血造血干细胞的归巢能力也至关重要。现行造血干细胞体外扩增技术中，细胞因子仍是重要的工具，不同的细胞因子在造血干细胞扩增过程中具有协同作用，扩增效果高于单细胞因子，目前使用最为广泛的细胞因子组合主要包括SCF、TPO和FLT3L,这三种细胞因子组合具有维持造血细胞活力、提高端粒酶活性，以及调节粘附分子和促造血干细胞扩增等特性。而IL-3、IL-6、IL-11和G-CSF均是有细胞分化的倾向，但是IL-6与SCF和FLT3L有着协同效应。这些扩增或重编程的策略或许能产生更多的造血干细胞，但是这些基于病毒介导的外源性基因表达由于安全性问题无法应用到临床上去；
通过依次进行Buffer和培养基的准备、从脐带血分离单核细胞、从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞、CD34+细胞培养及化合物干预以及抗体染色用于流式细胞术分析五个步骤，实现将离体干细胞扩大培养，在体外培养中，VPA治疗2-4天内获得大量的原始造血干细胞，有可能克服造血干细胞数量的损失，化合物组合与单用VPA对人造血干细胞体外增殖的促进作用，本发明中的培养体系具有很强的诱导造血干细胞扩增的能力，使用细胞因子混合物与VPA和SR1治疗相结合，VPA是FDA批准的用于治疗双相情感障碍和其他神经系统疾病的药物，SR1是一种芳香族受体拮抗剂，我们的化合物组合与芳香族受体拮抗剂SR1联用，能大幅度提升扩增效率，将有望真正改善临床上脐带血移植的结果，这对临床治疗是非常有价值的发现。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明中实施例5中CD34+细胞百分比的示意图；
图2是本发明中实施例5中CD34+细胞的克隆数的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例为本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种离体干细胞扩大培养方法，包括以下步骤：
步骤一：Buffer和培养基的准备；
步骤二：从脐带血分离单核细胞；
步骤三：从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞；
步骤四：CD34+细胞培养及化合物干预；
步骤五：抗体染色用于流式细胞术分析。
实施例2：
本实施例为Buffer和培养基的准备的具体过程，包括如下步骤：
在从脐带血分离CD34+细胞的24小时之前，将2mL0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)和33mL质量分数为7.5％的牛血清白蛋白(BSA)加入到465mL缓冲生理盐水(1xPBS)中，制备分离缓冲液，混合后并保持分离缓冲液在4℃下过夜。
实施例3：
本实施例为从脐带血分离单核细胞的具体过程，包括如下步骤：
S21：将脐带血放入一个75cm2的培养瓶中，在室温条件下，用等质量的PBS稀释并混合脐带血，得到稀释脐带血；
S22：确定处理整个脐带血所需的管数(一个50mL的离心管可用于处理35mL稀释脐带血)，在每个试管中加入15mL浓度梯度介质，并将稀释脐带血涂抹在浓度梯度介质的顶部，形成两层；
S23：在离心力为400xg的条件下低速加减速离心30min，离心后，单核细胞位于血浆和密度梯度介质层之间的白色层(淡色层)；
S24：抽吸2/3的血浆，不影响淡黄色涂层，将淡黄色涂层转移到一个新的50mL试管中，从同一个脐带血收集所有的单核细胞，收集到50mL的试管中，直到达到25mL，如果收集到的单核细胞的体积超过25mL，使用新的试管；
S25：将25mL的冷PBS加入含有25mL单核细胞的试管中，混合均匀，在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心10min；
S26：吸出上清液，将细胞颗粒重新悬浮在50mL冷PBS中；
S27：取细胞悬液20μL计数，具体如下：用自动细胞计数器计数吖啶橙/碘化丙啶染色的细胞数量，计算单核细胞的总数；
S28：在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min。
实施例4：
本实施例为从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞的具体过程，包括如下步骤：
S31：准备CD34+抗体偶联磁珠溶液，从单核细胞分离CD34+细胞，具体如下：
将300μL的分离缓冲液与100μL的人FcR人IgG(阻断试剂)和100μL的CD34磁珠混合，得到CD34+抗体偶联磁珠溶液，从每108个单核细胞中分离CD34+细胞，为了从单核细胞中分离更多数量的CD34+细胞，相应地扩大试剂的规模；
S32：将步骤S28中离心的试管中吸取上清液，将微球重悬于CD34+抗体偶联磁珠溶液中(每108个细胞使用500μL溶液)；
S33：混合后在温度为4℃的条件下孵育30min；
S34：向含有细胞混合物的试管中加入冷细胞分离缓冲液，直到管完全充满，之后在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min；
S35：抽吸上清液，在冷细胞分离缓冲液中重悬细胞球(2mL/108细胞)，将2mL细胞悬液混合物转移到15mL的试管中。
S36：将3组15mL的试管装入温度为4℃的预冷的细胞分离器中，第一组试管包含单核细胞，第二组试管将用于收集阴性细胞，第三组试管将用于收集纯化的CD34+细胞；
S37：含阳性组分的离心管在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min，抽吸上清液，将纯化的CD34+细胞重悬于1mL无血清培养基中；
S38：使用自动细胞计数器计数吖啶橙/碘化丙啶染色的细胞。
实施例5：
请参阅图1-2所示，本实施例为人CD34+细胞培养及化合物干预的具体过程，包括如下步骤：
S41：准备足够容量的培养基，以3.3×104个细胞/mL的密度平板纯化CD34+细胞；其中，培养基为含10μL/mL pen/strep、150ng/mL干细胞因子(SCF)、100ng/mL fms样酪氨酸激酶受体3(FLT3配体)、100ng/mL促血小板生成素(TPO)、50ng/mL白介素3(IL-3)的血清游离培养基；
S42：平板纯化CD34+细胞，12孔板(5×104CD34+细胞/1.5mL培养基/孔)，在温度为37℃，5％CO2加湿的培养箱中培养；
S43：用FACS分析评估分离CD34+细胞的纯度和细胞组成；
S44：将终浓度为1mM的VPA加入细胞因子混合物处理16h后的细胞培养液中；
S45：采用化合物组合VPA+SR1,为了确定VPA和SR1最佳作用浓度，进行了浓度优化实验，加入浓度梯度的VPA(0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM)；
S46：在温度为37℃，5％CO2加湿的培养箱中再培养7天；
S47：7天后计算每组细胞中CD34+CD90+细胞数，可得化合物最佳浓度为0.5mM VPA+0.5μM SR1；
其中，图1为脐血来源的CD34+细胞在各种化合物以及改良后的培养基的组合中培养7天后，流式细胞术检测的CD34+细胞百分比，从图中我们可以发现化合物VPA和SR1以及改良的培养基组里CD34+细胞的百分比是最高的；图2为脐血来源的CD34+细胞在添加细胞因子的无血清培养基中和化合物组合培养7天后，每组取1000个细胞经克隆形成实验获得的克隆数。从图中我们可以发现化合物VPA和SR1以及改良的培养基组里CD34+细胞的克隆数是最多的。
实施例6：
本实施例为抗体染色用于流式细胞术分析的具体过程，包括如下步骤：
S51：准备抗体染色液，染色2×104-6×104细胞和同型液，确定FACS门控策略和非特异性结合水平，稀释后的抗体(1/100APC抗CD34,1/200FITC抗CD90)和各自的同分型放入50μL的分离缓冲液中；
S52：多次移液使细胞培养均质化，计数细胞和移液5×104细胞到1.5mL试管中；
S53：加入1mL分离缓冲液，在室温且离心力为400xg的条件下离心15min；
S54：抽吸上清液，将小球重悬于50μL的染色液中，在室温条件下孵育细胞30min；
S55：加入450μL的分离缓冲液，在室温且离心力为400xg的条件下离心15min；
S56：抽吸上清液，将小球重悬于100μL分离缓冲液中，将细胞置于冰上至少5min，直到进行FACS分析，加入1μL 7-AAD修饰活细胞；
S57：将染色后的细胞样本装入FACS机器，以最低流速获得细胞；
S58：对于每个荧光团，分析同型对照和单染色细胞，建立FITC(CD90)、APC(CD34)和PerCP/Cy5.5门控(7-AAD)染色；
S59：通过对PerCP/Cy5.5阴性部分进行检测，并绘制APC与FITC的比值图，以确定HSPC/HSC在培养液中的存活CD34+、CD90+和CD34+CD90+细胞的百分比，从而确定HSPC/HSC的群体；
得出结论：单一化合物能促进造血干细胞扩增的报道很多，但是越来越多的数据表明，多种不同靶向的化合物组合往往表现出更好的协同效应，比单独使用某一种化合物能高效的诱导造血干细胞的增殖。在我们的化合物组合中，我们选用了VPA和SR1组合保留了T细胞在内的体内长期多系重建的潜能，这对于遗传性和获得性免疫缺陷病患者的造血干细胞抑制尤其重要。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：Buffer和培养基的准备；
步骤二：从脐带血分离单核细胞；
步骤三：从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞；
步骤四：人CD34+细胞培养及化合物干预；
步骤五：抗体染色用于流式细胞术分析。
2.根据权利要求1所述的一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，步骤一中所述的Buffer和培养基的准备的具体过程如下：
在从脐带血分离CD34+细胞的24小时之前，将2mL0.5M的乙二胺四乙酸和33mL质量分数为7.5％的牛血清白蛋白加入到465mL缓冲生理盐水中，制备分离缓冲液，混合后并保持分离缓冲液在4℃下过夜。
3.根据权利要求1所述的一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，步骤二中所述的从脐带血分离单核细胞的具体过程如下：
S21：将脐带血放入一个75cm2的培养瓶中，在室温条件下，用等质量的PBS稀释并混合脐带血，得到稀释脐带血；
S22：确定处理整个脐带血所需的管数，在每个试管中加入15mL浓度梯度介质，并将稀释脐带血涂抹在浓度梯度介质的顶部，形成两层；
S23：在离心力为400xg的条件下离心30min，离心后，单核细胞位于血浆和密度梯度介质层之间的白色层；
S24：抽吸2/3的血浆，不影响淡黄色涂层，将淡黄色涂层转移到一个新的50mL试管中，从同一个脐带血收集所有的单核细胞，收集到50mL的试管中，直到达到25mL；
S25：将25mL的冷PBS加入含有25mL单核细胞的试管中，混合均匀，在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心10min；
S26：吸出上清液，将细胞颗粒重新悬浮在50mL冷PBS中；
S27：取细胞悬液20μL计数，具体如下：用自动细胞计数器计数吖啶橙/碘化丙啶染色的细胞数量，计算单核细胞的总数；
S28：在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min。
4.根据权利要求1所述的一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，步骤三中所述的从单核细胞中磁珠分选CD34+细胞的具体过程如下：
S31：准备CD34+抗体偶联磁珠溶液，从单核细胞分离CD34+细胞，具体如下：
将300μL的分离缓冲液与100μL的人FcR人IgG和100μL的CD34磁珠混合，得到CD34+抗体偶联磁珠溶液，从每108个单核细胞中分离CD34+细胞；
S32：将步骤S28中离心的试管中吸取上清液，将微球重悬于CD34+抗体偶联磁珠溶液中；
S33：混合后在温度为4℃的条件下孵育30min；
S34：向含有细胞混合物的试管中加入冷细胞分离缓冲液，直到管完全充满，之后在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min；
S35：抽吸上清液，在冷细胞分离缓冲液中重悬细胞球，将2mL细胞悬液混合物转移到15mL的试管中；
S36：将3组15mL的试管装入温度为4℃的预冷的细胞分离器中，第一组试管包含单核细胞，第二组试管将用于收集阴性细胞，第三组试管将用于收集纯化的CD34+细胞；
S37：含阳性组分的离心管在温度为4℃，离心力为400xg的条件下离心15min，抽吸上清液，将纯化的CD34+细胞重悬于1mL无血清培养基中；
S38：使用自动细胞计数器计数吖啶橙/碘化丙啶染色的细胞。
5.根据权利要求1所述的一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，步骤四中所述的人CD34+细胞培养及化合物干预的具体过程如下：
S41：准备足够容量的培养基，以3.3×104个细胞/mL的密度平板纯化CD34+细胞；其中，培养基为含10μL/mL pen/strep、150ng/mL干细胞因子、100ng/mL fms样酪氨酸激酶受体3、100ng/mL促血小板生成素、50ng/mL白介素3的血清游离培养基；
S42：平板纯化CD34+细胞，12孔板，在温度为37℃，5％CO2加湿的培养箱中培养；
S43：用FACS分析评估分离CD34+细胞的纯度和细胞组成；
S44：将终浓度为1mM的VPA加入细胞因子混合物处理16h后的细胞培养液中；
S45：采用化合物组合VPA+SR1,加入浓度梯度的VPA；
S46：在温度为37℃，5％CO2加湿的培养箱中再培养7天；
S47：7天后计算每组细胞中CD34+CD90+细胞数。
6.根据权利要求1所述的一种离体干细胞扩大培养方法，其特征在于，步骤五中所述的抗体染色用于流式细胞术分析的具体过程如下：
S51：准备抗体染色液，染色2×104-6×104细胞和同型液，确定FACS门控策略和非特异性结合水平，稀释后的抗体和各自的同分型放入50μL的分离缓冲液中；
S52：多次移液使细胞培养均质化，计数细胞和移液5×104细胞到1.5mL试管中；
S53：加入1mL分离缓冲液，在室温且离心力为400xg的条件下离心15min；
S54：抽吸上清液，将小球重悬于50μL的染色液中，在室温条件下孵育细胞30min；
S55：加入450μL的分离缓冲液，在室温且离心力为400xg的条件下离心15min；
S56：抽吸上清液，将小球重悬于100μL分离缓冲液中，将细胞置于冰上至少5min，直到进行FACS分析，加入1μL 7-AAD修饰活细胞；
S57：将染色后的细胞样本装入FACS机器，以最低流速获得细胞；
S58：对于每个荧光团，分析同型对照和单染色细胞，建立FITC、APC和PerCP/Cy5.5门控染色；
S59：通过对PerCP/Cy5.5阴性部分进行检测，并绘制APC与FITC的比值图。
7.权利要求1-6所述的方法在对脐带血造血干细胞CD34+体外高效扩增中的应用。
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