CN114107201B - 一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和扩增培养方法 - Google Patents

一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和扩增培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和细胞扩增培养方法。该培养基为基础培养基中含有3～10％的FBS、10～50U/mL的IL‑2、10～50ng/mL的IL‑15；所述基础培养基选自RPMI 1640培养基、T009培养基、AIMV培养基、DMEM培养基、X‑VIVO培养基中的一种或多种。本发明开辟出了一种新的T细胞亚型——CD3+TCRVα7.2+T细胞的获取和纯化的技术路线，其培养基经济成本较低，操作简单，能够在一定的时间段里面将细胞扩增倍数调整到与常规T细胞接近的程度，解决了CD3+TCRVα7.2+T细胞常见的扩增难度大的问题。

Description

一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和扩增培养方法
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和扩增培养方法。
背景技术
目前关于CD3+TCRVα7.2+T细胞的研究较少，但MAIT细胞(其表型是CD3+TCRVα7.2+CD161+)的获取、培养方式主要有以下几种：
i.取自健康志愿者的新鲜的外周血(PBMC)，用抗体-Microbeads偶联的方式分选获得CD161+的细胞，立即对分出的细胞进行抗体染色，采用流式分选仪获得CD3+TCRVα7.2+CD161+的细胞，采用完全培养基(50％AIMV+50％RPMI1640+10％FBS+谷氨酰胺+β-巯基乙醇)培养，细胞密度范围在5E+05～2E+06个细胞/mL，培养箱环境是37℃，5％CO2(卢湧湧，膀胱癌患者体内粘膜相关恒定T细胞(MAIT)的数量、功能及其抗肿瘤作用研究，2017学位论文，山东大学)。
ii.用抗CD3磁珠和Auto MACS分离CD3+T细胞，纯化后分别用抗CD4、抗CD161和抗TCRVα7.2的抗体染色，经过流式分选获得MAIT细胞(CD4﹣CD161+TCRVα7.2+T)细胞。分选后当天用CD3和CD28的抗体激活三天，洗去抗体后继续扩大培养，培养基为含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640，细胞密度约1E+06个细胞/mL，培养箱环境是37℃，5％CO2(Duan,M.,etal.,Activated and Exhausted MAIT Cells Foster Disease Progression andIndicate Poor Outcome in Hepatocellular Carcinoma.Clin Cancer Res,2019.25(11):p.3304-3316)。
iii.收集健康志愿者的PBMC，采用流式分选仪获得MAIT细胞，原代人MAIT细胞在混合培养基中培养21天。培养基成分包括：50％AIMV、50％RPMI 1640、10％FBS、2％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺、0.1mM丙酮酸钠、15mM的HEPES buffer、PH＝7.2-7.5、50U/mL rhu IL-2、10ng/mL rhu IL-7、50ng/mL rhu IL-12、50ng/mL IL-15、50U/mL IL-18、50μM的2-巯基乙醇。在培养的第1、5、10天分别加入50nM的5-OP-RU，从第10天起去掉其中的IL-12、IL-18和IL-7(Gherardin,N.A.,et al.,Enumeration,functionalresponses and cytotoxic capacity of MAIT cells in newly diagnosed andrelapsed multiple myeloma.Sci Rep,2018.8(1):p.4159)。
iv.取健康志愿者的PBMC，抗CD8磁珠和Auto MACS(Miltenyi Biotech)分离CD8+T细胞，立即对分出的细胞进行抗体染色，采用流式分选仪获得CD3+CD8+TCRVα7.2+CD161+的细胞，用抗CD3和CD28的抗体激活后，采用R10完全培养基(含有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％的青霉素/链霉素、50ng/mL rhu IL-12、50ng/mL IL-15、50U/mL IL-18的RPMI 1640培养基)培养，细胞密度范围在1E+06个/mL左右，培养箱环境是37℃，5％CO2(Leng,T.Q.,etal.,TCR and Inflammatory Signals Tune Human MAIT Cells to Exert SpecificTissue Repair and Effector Functions.Cell Reports,2019.28(12):p.3077-+)。
v.取健康志愿者的PBMC，加入Ficoll离心，密度梯度法分出PBMC后用1640完全培养基(RPMI 1640培养基加入10％FBS、1％青霉素-链霉素、10mM HEPES缓冲液、0.1mM MEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和5.5mM 2-巯基乙醇)重悬，计数。通过负载5-OP-RU的MR1四聚体或与抗CD161和TCRVα7.2的抗体共同染色，流式细胞术检测人MAIT细胞占比(图1)。
用Sulfate Latex Beads与CD28抗体、5-OP-RU/MR1tetramer在4℃摇床孵育12小时，充分洗涤后制备得到5-OP-RU/MR1人工抗原提呈细胞(5-OP-RU/MR1 aAPCs)，只孵育了CD28的beads作为对照。将上述PBMC用1640完全培养基重悬，密度调节到5E+06/mL，装到96孔板，每孔5E+05，培养基补至200μL，每孔加40U/mL的IL-2和0.5μL上述5-OP-RU/MR1aAPCs，充分混匀后在37℃，5％CO2的培养箱中培养。在第三天半数换液，继续培养七天后流式细胞术检测MAIT细胞占比(图2)。收集扩增后的PBMC，加含有0.5％FBS的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后，用200μL RPMI1640完全培养基重悬，加入1μL上述自制的APC-labeled5-OP-RU/MR1tetramer，混匀后在冰上孵育45分钟，用含有0.5％FBS的PBS洗两次后加入一定的PBS重悬，加入抗APC的磁珠，充分孵育后洗涤干净，用MACS柱子分选获得MAIT细胞(图3)。用含有0.5％FBS的PBS洗去MAIT细胞中的分选液后用RPMI 1640完全培养基重悬MAIT细胞，在37℃，5％CO2的培养箱中继续扩增(Liu,C.,T-Cell Receptor Signaling.Springer NatureBook,2020)。
尽管存在以上多种获得MAIT的方法，但是MAIT细胞数量少，在健康人外周血单核细胞(PBMC)中占比1-10％。为了获得足够数量的MAIT细胞，研究人员在MAIT细胞的纯化、激活和扩增方面都用了许多方法：
1)分选：目前关于CD3+TCRVα7.2+T细胞的研究主要是MAIT细胞，表型为CD3+CD161+TCRVα7.2+。一般从PBMC中分选出MAIT细胞，大多采用磁珠分选富集后再进行流式分选，但是这种方式存在明显的缺点：MAIT细胞的占比低，流式分选仪分选细胞所需的实验较长，而整个过程细胞都暴露在外界环境中，容易污染；所得的细胞总量较少，很难扩增。总之，常用的直接从PBMC中纯化MAIT细胞存在明显的耗时久、不容易培养的明显缺点。此外，有部分研究者将MAIT细胞的特异性抗原如5-OP-RU加入PBMC中共培养，当MAIT细胞被诱导至较高比例时采用负载了5-OP-RU的MR1tetramer进行磁珠分选。但是该方法由于抗原的特殊性，容易对研究者带来明显的障碍。据了解，MAIT细胞激活抗原包括5-(2-oxoethylideneamino)-6-d-ribitylaminouracil(5-OE-RU)和5-(2-oxopropylideneamino)-6-d-ribitylaminouracil(5-OP-RU)。这些分子是由核黄素前体5-A-RU与来自中间代谢的甲基乙二醛或乙二醛反应，分别生成5-OP-RU或5-OE-RU。这些抗原对光和温度很敏感，不稳定，需要及时使用。因此，该抗原的特殊性质和保存难度在一定程度上限制了实验的进展和效果。
2)激活：目前关于CD3+TCRVα7.2+T细胞的激活研究也主要是MAIT细胞，MAIT细胞可以被CD3和CD28的磁珠激活，表面有IL-12和IL-18的受体，在培养基中加入IL-12和IL-18的细胞因子也可激活MAIT，一些病毒和细菌也可以激活MAIT细胞。此外，作为MAIT细胞的特异性抗原，5-OP-RU/5-OE-RU或者两者的前体，即5-A-RU常被用来激活或诱导MAIT细胞。现有的商品化CD3/CD28免疫磁珠价格往往达到2-3万元，而用于免疫治疗的细胞制品在临床应用上一般每次用量需要达到108-109数量级，需要多次清洗，培养成本很高且操作复杂。而且如果同时加入多种激活信号，不光有很大的经济负担，也容易导致细胞过度激活，提前进入衰竭的状态，不利于后期的使用。另外，CD3和CD28磁珠也可以用作激活常规的T细胞，如果分选的纯度不高，那么被激活后培养起来的细胞中可能大多数并不是我们的目的细胞MAIT，而是常规T细胞。因此，有必要研究一种成本较低，较为温和且有利于目的细胞持续扩增的激活方式。
3)培养基：根据文献调研，鲜有针对CD3+TCRVα7.2+T细胞的培养基筛选，参考其中的MAIT细胞的培养基多为以下几种：1)采用含有10％FBS的RPMI1640和AIMV培养基的混合培养基(v:v＝1：1)。这种培养基存在一些缺陷，首先，混合培养基不被允许在临床上使用2)也有文献用到含有10％左右FBS的DMEM、RPMI1640、AIMV或者是X-VIVO基础培养基，其中加入一定含量的IL-2，IL-15等因子。这种基础培养基用来培养MAIT细胞难度较大，根据相关文献[3]，目前大多只能在21天内将MAIT细胞扩增30倍左右。3)为了提高细胞的扩增倍数，大量文献中用到了多种因子(如IL-2，IL-7，IL-15，IL-12，IL-18)和化学试剂(如特异性抗原5-OP-RU/5-OE-RU，1％青霉素-链霉素、10mM HEPES缓冲液、0.1mM MEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和5.5mM 2-巯基乙醇等)，但是这些培养方法成本颇高，且容易使细胞进入成熟状态，不利于细胞的持续性扩增和后期的功能试验以及临床研究。
综上所述，MAIT细胞的纯化、激活和扩增方法具有明显的成本高、操作难的特点。有鉴于此，如果能够开发出一种大量扩增CD3+TCRVα7.2+T细胞(包含MAIT)的培养基以及方法，则将大大有利于MAIT的研究。
发明内容
为了能够大量扩增CD3+TCRVα7.2+T细胞，本发明提供一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基，为基础培养基中含有3～10％的FBS、10～50U/mL的IL-2、10～50ng/mL的IL-15；所述基础培养基选自RPMI 1640培养基、T009培养基、AIMV培养基、DMEM培养基、X-VIVO培养基中的一种或多种。
在一些实施方案中，还含有1％±0.5％100X青霉素-链霉素(简称双抗)、1％±0.5％L-谷氨酰胺、1％±0.5％非必需氨基酸。
进一步地，还含有1％双抗、1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸。
在一些实施方案中，还含有5～30ng/mL IL-7、20～50ng/mL IL-12或20～50ng/mLIL-18。
在一些实施方案中，含有20～50ng/mL的IL-15。
在一些实施方案中，为50％RPMI 1640培养基和50％AIMV培养基，其中还含有10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18。
在一些实施方案中，为RPMI 1640培养基，其中还含有5～10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18。
在一些实施方案中，为X-VIVO培养基，其中还含有10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18。
在一些实施方案中，为AIMV培养基，其中还含有10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18。
在一些实施方案中，为DMEM培养基，其中还含有10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18。
在一些实施方案中，为50％AIMV培养基和50％1640培养基，其中还含有10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，20～50U/mL的IL-2,5～20ng/mL IL-7，20～50ng/mL IL-15。
在一些实施方案中，为T009培养基，其中还含有5～10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，20～50U/mL的IL-2，5～20ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15。
在一些实施方案中，为T009培养基，其中还含有5～10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，50U/mL的20～50U/mL的IL-2,20～50ng/mL IL-15。
在本发明中，IL-2、IL-15、IL-7、IL-12、IL-18分别独立地选自重组人白介素(rhuIL)或非重组人白介素。
另一方面，本发明还提供一种CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养方法，包括以下步骤：
S1、细胞采集；
S2、采用方法a或方法b进行CD3+TCRVα7.2+T细胞的分离；所述方法a：采用CD3磁珠分选出CD3+T细胞，再用抗人TCRVα7.2抗体和抗PE/APC/FITC磁珠分选得到CD3+TCRVα7.2+T细胞；所述方法b：采用流式细胞分选技术；
S3、采用方法c、方法d或方法e进行CD3+TCRVα7.2+T细胞的激活；所述方法c：采用rhuCD3抗体和rhuCD28抗体激活；所述方法d：采用MAIT细胞特异性抗原的前体5-A-RU(5-amino-6-d-ribtylaminouracil)和rhuCD28抗体激活；所述方法e：采用rhuCD28抗体激活；
S4、CD3+TCRVα7.2+T细胞的扩增培养：采用如上所述的细胞培养基进行CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养。
在一些实施方案中，所述步骤S1为从细胞培养物、从个体受试者外周血、脐带血或血库的血液样品进行细胞采集。
在一些实施方案中，所述步骤S2中的方法b的流式细胞分选技术中采用抗人CD3抗体、抗人TCRVα7.2抗体和抗人CD161抗体。进一步地，所述步骤S2中的方法b的流式细胞分选技术中还采用了抗人CD45抗体。
在一些实施方案中，所述方法b流式细胞分选技术时采用T009培养基重悬待分选的细胞。
在一些实施方案中，所述步骤S3的方法d中MAIT细胞特异性抗原的前体5-A-RU溶于甲基乙二醛、PBS或无菌水中。
在一些实施方案中，所述步骤S4具体为：所述步骤S3激活后的细胞用如上所述的细胞培养基在37℃5％CO2的培养箱中孵育，每12～72小时后，去上清，加入新鲜的如上所述的细胞培养基。
在一些实施方案中，所述步骤S4具体为：所述步骤S3激活后的细胞用如上所述的细胞培养基调节细胞密度为5E+05～2E+06/mL后在37℃5％CO2的培养箱中孵育，每12～72小时后，吸去上清，加入新鲜的如上所述的细胞培养基调节细胞密度在5E+05～3E+06/mL。进一步地，加入新鲜的如上所述的细胞培养基调节细胞密度在1E+06/mL左右。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
首先，本方案结合流式分选和磁珠分选的方式，开辟出了一种新的T细胞亚型——CD3+TCRVα7.2+T细胞的获取和纯化的技术路线。在流式分选时，还使用了T009这种不含有酚红的培养基，即降低了背景值又保证了细胞的状态。该方法较易实行，成本较低，且效果好。
在细胞活化部分，也是给出了一些成本低的、简便的方法，比如用CD3和CD28抗体铺板代替商业化的CD3/28磁珠；同时，考虑到细胞长期扩增的目的，通过优化得到了一些较温和，利于长期培养细胞，且后期可以用作抗肿瘤的激活方案。
本方案的一大亮点在于筛选了多种培养基，优选了几种常见的且适用于本方案中人源CD3+TCRVα7.2+T细胞培养的培养基，同时优选了培养基中的成分。这些添加的成分比较简单，经济成本较低，操作简单，能够在一定的时间段里面可以将细胞扩增倍数调整到与常规T细胞接近的程度，解决了CD3+TCRVα7.2+T细胞常见的扩增难度大的问题。此外，其中一个实际案例中使用的T009培养基可以用作临床使用。
总的来说，本方案提出了一些关于T细胞亚群CD3+TCRVα7.2+T细胞的获取、纯化、活化和扩增的方案，这些方案简单易行，成本较低，所得到的细胞纯度较高，细胞活率高。这些方案为CD3+TCRVα7.2+T细胞的获取和培养提供了新的参考。本发明所涉及的细胞培养基在2～3周扩增的CD3+TCRVα7.2+T细胞可以达到1500倍，特别是基础培养基为T009培养基的CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是参考文献中PBMC中MAIT占比。
图2是参考文献中MAIT细胞在PBMC中的扩增。
图3是参考文献中磁珠纯化的MAIT细胞。
图4是分选前PBMC中CD3+TCRVα7.2+比例。
图5是磁珠分选1次后CD3+TCRVα7.2+比例。
图6是磁珠分选2次后CD3+TCRVα7.2+比例。
图7是流式分选后CD3+TCRVα7.2+T细胞的纯度大于95％。
图8是分选后的CD3+TCRVα7.2+T中MAIT细胞比例。
图9是优选的培养基培养T细胞和CD3+TCRVα7.2+T细胞。
图10是CD3+TCRVα7.2+T细胞比常规T细胞有更多的CD8亚群。
图11是所培养的CD3+TCRVα7.2+T细胞与常规T细胞都没有明显凋亡。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
实施例中的RPMI 1640培养基、AIMV培养基、DMEM培养基、X-VIVO培养基均购自Gibco公司，T009培养基购自倍谙基公司。
步骤S1、细胞采集
CD3+TCRVα7.2+T细胞的生产包括从细胞培养物或从个体受试者或血库的血液样品中提供CD3+TCRVα7.2+T细胞的步骤，优选来自供体受试者，尤其是健康的受试者，可以从血液样本(包括外周血和脐带血)以及一个或多个处理步骤例如分离、离心、基因工程、洗涤和/或主要孵育获得的样本中获取细胞。在一个具体实施方案中，来自供体的样品包含PBMCs。
在一个具体实施方案中，CD3+TCRVα7.2+T细胞是从它们在受试者体内的任何位置收集的，包括但不限于外周血、外周血单核细胞(PBMCs)、骨髓、脐带血。
在一个具体实施方案中，CD3+TCRVα7.2+T细胞是通过单采血液分离术，特别是通过白细胞分离术收集的。
步骤S2、CD3+TCRVα7.2+T细胞的分离
多种方案可以获得本方案的目的细胞，如Miltenyi Biotec MACSTM细胞分离试剂盒、细胞表面标志物表达和其他市售细胞分离与分离试剂盒；细胞表面标志物抗体和流式分选仪。
1)在一些实施方案中，基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如基于细胞表面标志物的表达来分离，通常是细胞表面标志物与特异性结合这种标志物的抗体或结合体一起孵育，然后通过洗涤，除去多余的未结合的结合物或抗体，再基于阳性选择，收集其中与抗体或结合物结合的细胞。
实施例1：
A.取新鲜的PBMC置于50mL离心管，若为复苏的PBMC，用含有5～10％FBS的RPMI1640培养基按照0.5E+06～2E+06/mL的密度重悬细胞，至少需要养在培养瓶6个小时。然后用10mL PBS重悬，1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次。
B.加入分选液适量，混匀后用台盼蓝计数，同时取1E+06个细胞，流式分析仪检测分选前CD3+TCRVα7.2+T细胞的比例，见图4。
C.按照每0.5E+07～2E+07个细胞加3～20μL的用量加入CD3MicroBeads,human(Miltenyi Biotec)，至多加入100μL，按照每0.5E+07～2E+07个细胞加80～120μL的量加入分选液，混匀细胞。
D.将上述装有细胞的离心管置于4℃环境，避光孵育15～30分钟后取出，加入10mL的PBS混匀，1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次。
E.加入分选液2～5mL，充分重悬细胞。取LS Columns(Miltenyi Biotec)，采用阳性分选获得CD3+T细胞。
F.加入10mL PBS重悬，1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次。加入分选液适量，混匀后用台盼蓝计数。
G.按照每1E+07～3E+07个细胞加3～20μL的量加入抗人TCRVα7.2抗体(Biolegend)，按照每0.5E+07～2E+07个细胞加80～120μL的量加入分选液，混匀细胞。置于室温条件下避光孵育15～30分钟后取出，加入10mL的PBS混匀，1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次。
H.按照每0.5E+07～2E+07个细胞加3～20μL anti-PE/APC/FITC MicroBeads(Miltenyi Biotec)，再按照按照每0.5E+07～2E+07个细胞加80～120μL的量加入分选液，混匀细胞。每0.5E+07～2E+07个细胞加80～120μL的量加入分选液，混匀细胞。置于室温条件下避光孵育10～30分钟。
I.加入PBS，1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次，加入分选液3mL，充分重悬细胞。取LS Columns(Miltenyi Biotec)，采用阳性分选获得CD3+TCRVα7.2+T细胞，并收集CD3+TCRVα7.2-T。
J.分别加入5mL PBS 1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次后，用台盼蓝计数，分别取2E+05流式分析仪检测其中CD3+TCRVα7.2+的比例(图5)。为了提高阳性细胞的占比，可以再用柱子分选一次(图6)。
2)根据细胞充电分选技术，将具有多种表型的目的细胞分离出来，即流式细胞分选技术。在一个实施方案中，对目的细胞上的特异性标志物CD3和TCRVα7.2进行流式检测抗体染色，之后经过流式细胞分选仪获得纯度大于90％的目的细胞。具体实施步骤如下：
实施例2:
A.取步骤S1中的PBMC，用PBS洗去多余的残留物，弃掉上清，加入PBS重悬，用台盼蓝计数，将密度调节至1E+07～3E+07/100μL，取1E+06个细胞作为阴性对照，每100μL各加入0.5～5μL的anti-human CD45(Biolegend)、anti-human CD3抗体(Biolegend)、anti-humanTCRVα7.2抗体(Biolegend)和anti-human CD161抗体(Biolegend)，混匀后置于室温孵育10～30分钟.
B.加入PBS 10mL，按照1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次。
C.细胞用含有3～10％FBS和0.5～3％双抗的T009培养基重悬，密度为5E+06～3E+07/mL。
D.使用BD Influx流式分选仪，采用四路分选，收集CD45+CD3+TCRVα7.2+CD161+、CD45+CD3+TCRVα7.2+CD161-、CD45+CD3+TCRVα7.2-CD161-三种细胞。用流式分析仪(CytekAurora)检测所收集细胞的纯度(图7)。
实施例3：
A.取步骤S1中的PBMC，用PBS洗去多余的残留物，弃掉上清，加入PBS重悬，台盼蓝计数，先用磁珠法分选出CD3+T细胞，然后加入5～15mL PBS，1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次.
B.再加入PBS适量，将密度调节至0.5E+07～3E+07/100μL，取1E+06个细胞作为阴性对照，每100μL各加入0.5～5μL的anti-human CD3抗体(Biolegend)、anti-human TCRVα7.2抗体(Biolegend)和anti-human CD161抗体(Biolegend)，混匀后置于室温孵育10～30分钟.
C.加入5～15mL PBS，1500rpm升9降9的速度离心5分钟，弃去上清，重复一次。
D.用含有3～10％FBS和0.5～3％双抗的T009培养基重悬，密度为5E+06～3E+07/mL。
E.使用BD Influx流式分选仪，采用四路分选，收集CD3+TCRVα7.2+CD161+、CD3+TCRVα7.2+CD161-、CD3+TCRVα7.2-CD161-三种细胞。用流式分析仪(Cytek Aurora)检测所收集细胞的纯度，也可以获得图7中纯度的目的细胞。
F.进一步的，流式检测CD3+TCRVα7.2+T与MAIT(CD3+TCRVα7.2+CD161+)比例，结果显示，CD3+TCRVα7.2+T中含有高比例MAIT细胞(见图8)。
步骤S3和步骤S4、CD3+TCRVα7.2+T细胞的激活和扩增培养
在一些实施方案中，CD3+TCRVα7.2+T细胞在刺激条件下或在刺激剂存在下孵育。这些条件包括那些可以诱导CD3+TCRVα7.2+T细胞增殖、扩增、活化/存活的条件，用于模拟抗原暴露培养细胞，例如用于引入重组抗原受体。这些条件可以包括一种或多种特定介质、温度、氧气含量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何可以激活CD3+TCRVα7.2+T细胞的其它试剂。
1)激活
实施例4：
A.取96孔板，向其中加入50～200μL预先混合的含有10～50ng/mL的rhuCD3和10～50ng/mL rhuCD28抗体的PBS溶液，按照150～500g升3降3的转速离心10分钟，将板子静置在4℃冰箱1～5小时.
B.弃去上清液，再沿着内壁缓缓加入适量的PBS，注意不要碰到板底。
C.将上述步骤S2分选出的细胞用实施例7到14的任意一种培养基重悬，密度在5E+05～3E+06/mL，转移到上述预铺有CD3和CD28抗体的孔板中，体积为100～200μL，放在37℃5％CO2的培养箱中孵育。
D.12～72小时后，小心吸去上清，加入新鲜的实施例7到14的任意一种培养基。
实施例5：
A.取20～70ng MAIT细胞特异性抗原的前体5-A-RU(柯维化学)和20～70ng ngrhuCD28的抗体，均匀稀释在1mL的PBS中.
B.取96孔板，向每孔加入50～200μL上述预先混合的溶液，按照150～500g升3降3的转速离心10分钟，取出后将板子静置在4℃冰箱1～5小时。
C.弃去上清液，再沿着内壁缓缓加入适量的PBS，注意不要碰到板底。
D.将上述步骤S2分选出的细胞用实施例7到14的任意一种培养基重悬，密度在5E+05～3E+06/mL，转移到上述预铺有5-A-RU和CD28抗体的孔板中，体积为100～200μL，放在37℃5％CO2的培养箱中孵育。
E.12～72小时后，小心吸去上清，加入新鲜的实施例7到14的任意一种培养基。
实施例6：
A.取20～70ng 5-A-RU(柯维化学)，按照摩尔比为1:30～1:100的比例加入甲基乙二醛(MGO，Sigma)，混合均匀后取30～50nM，与20～70ng ng rhuCD28的抗体均匀稀释在1mL的PBS中.
B.取96孔板，向每孔加入50～200μL上述预先混合的溶液，按照150～500g升3降3的转速离心10分钟，取出后将板子静置在4℃冰箱1～5小时。
C.弃去上清液，再沿着内壁缓缓加入适量的PBS，注意不要碰到板底。
D.将上述步骤S2分选出的细胞用实施例7到14的任意一种培养基重悬，密度在5E+05～3E+06/mL，转移到上述预铺有5-A-RU/MGO和CD28抗体的孔板中，体积为100～200μL，放在37℃5％CO2的培养箱中孵育。
E.12～72小时后，小心吸去上清，加入新鲜的实施例7到14的任意一种培养基。
2)培养和扩增
关于CD3+TCRVα7.2+T细胞的培养和扩增，主要考虑培养基的种类和其中含有的细胞因子、营养成分等。
实施例7：
A.在第一天将细胞用培养基重悬养在预先铺有rhuCD3抗体和rhuCD28抗体的孔板，选用50％RPMI 1640培养基和50％AIMV培养基，其中还加入了5～10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18，调节密度在5E+05～2E+06/mL，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
B.激活12～72小时后更换新鲜培养基，调节密度在1E+06/mL左右，15天左右扩增了约30倍。
实施例8：
A.在第一天将细胞用培养基重悬养在预先铺有rhuCD3抗体和rhuCD28的抗体的孔板，选用RPMI 1640培养基重悬，其中还加入了5～10％FBS,1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
B.激活12～72小时后更换新鲜培养基，调节密度在5E+05～3E+06/mL，15天左右扩增了约30倍。
实施例9：
A.在第一天将细胞用培养基重悬养在预先铺有rhuCD3抗体和rhuCD28的抗体的孔板，用X-VIVO培养基重悬，其中还加入了5～10％FBS,1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
B.激活12～72小时后更换新鲜的上述培养基，调节密度在5E+05～3E+06/mL，15天左右扩增了约50倍。
实施例10：
A.在第一天将细胞用培养基重悬养在预先铺有rhuCD3抗体和rhuCD28的抗体的孔板，用DMEM培养基重悬，其中还加入了5～10％FBS,1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，10～50U/mL的IL-2，5～30ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL15，20～50ng/mL IL-12，20～50ng/mL IL-18，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
B.激活12～72小时后更换新鲜培养基，调节密度在5E+05～3E+06/mL，15天左右扩增了约20倍。
实施例11：
A.细胞用上述任意一种方式激活后，用50％AIMV和50％1640培养基培养，其中还有5～10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，20～50U/mL的IL-2,5～20ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15。
B.激活后12～72小时更换新鲜培养基，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
C.培养的第1,5,10,15天加入5-A-RU(浓度在0-200nM)，培养17天，最多扩增可以扩增1000倍左右。
实施例12：
A.细胞用上述任意一种方式激活后，用T009培养基培养，其中还加入了5～10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，20～50U/mL的IL-2,5～20ng/mL IL-7,20～50ng/mL IL-15，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
B.激活12～72小时后更换新鲜培养基，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在20天左右扩增了800倍左右。
实施例13：
A.细胞用上述任意一种方式激活后，用T009培养基培养，其中还加入了5～10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，50U/mL的20～50U/mL的IL-2,20～50ng/mL IL-15，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
B.激活12～72小时后更换新鲜培养基，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在20天左右扩增了1300倍左右。
实施例14：
A.细胞用上述任意一种方式激活后，用T009培养基培养，其中还加入了5～10％FBS，1％双抗，1％L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，50U/mL的20～50U/mL的IL-2,20～50ng/mL IL-15，调节密度在5E+05～3E+06/mL，在37℃5％CO2的培养箱中培养。
B.激活12～72小时后更换新鲜培养基，调节密度在5E+05～3E+06/mL，继续扩增。
C.在第1,5,10,15天加入5～50nM的5-A-RU/MGO混合物。
D.隔天补充培养基，20天左右扩增了1500倍左右(见图9)。
实施例15：
A.分选时同时收集CD3+TCRVα7.2+和CD3+TCRVα7.2-T细胞，同时采用上述任意一种活化、培养基进行扩增。
B.第15～20天分别取1E+06～2E+06个细胞，1500rpm离心3分钟，弃去上清，加入适量PBS，重复一次。
C.加入100～200μL PBS重悬细胞，分别加入0.5～10μL抗人CD3抗体、抗人TCRVα7.2抗体、抗人CD4抗体、抗人CD8抗体，混匀后在4℃环境孵育10～30分钟。
D.加入1mL PBS，1500rpm离心3分钟，弃去上清，再加入适量PBS，重复一次。
E.流式细胞仪(Cytek)检测常规T细胞和CD3+TCRVα7.2+T中CD4和CD8T细胞亚型的比例，CD3+TCRVα7.2+T有更多的CD8亚型(见图10)。
实施例16：
A.分选时同时收集CD3+TCRVα7.2+和CD3+TCRVα7.2-T细胞，同时采用上述任意一种活化、培养基进行扩增。
B.第15～20天分别取1E+06～2E+06个细胞，1500rpm离心3分钟，弃去上清，加入适量PBS，重复一次。
C.每个样品管加入100～200μL Annexin V-FITC结合液(Beyotime)，轻轻重悬细胞。加入1～10μL Annexin V-FITC，混匀；加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
D.室温(20～25℃)避光孵育20分钟，孵育过程中可以重悬细胞2～3次以改善染色效果。立即上机检测。
E.结果分析表面，常规T细胞和CD3+TCRVα7.2+T细胞均没有明显的凋亡(见图11)。
本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元件对于实施本发明是必要的。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

Claims (5)

1.一种CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、细胞采集；
S2、采用方法a或方法b进行CD3+TCRVα7.2+T细胞的分离；所述方法a：采用CD3磁珠分选出CD3+T细胞，再用抗人TCRVα7.2抗体和抗PE/APC/FITC磁珠分选得到CD3+TCRVα7.2+T细胞；所述方法b：采用流式细胞分选技术；
S3、采用方法c、方法d或方法e进行CD3+TCRVα7.2+T细胞的激活；所述方法c：采用rhuCD3抗体和rhuCD28抗体激活；所述方法d：采用MAIT细胞特异性抗原的前体5-A-RU和rhuCD28抗体激活；所述方法e：采用rhuCD28抗体激活；
S4、CD3+TCRVα7.2+T细胞的扩增培养：采用CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基进行CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养；所述CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基为基础培养基中含有5～10％的FBS、1％100X青霉素-链霉素、1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、20～50U/mL的IL-2、20～50ng/mL的IL-15；所述基础培养基为T009培养基；
所述步骤S4具体为：所述步骤S3激活后的细胞用所述CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基在37℃5％CO2的培养箱中孵育；在第1,5,10,15天加入5～50nM的5-A-RU/MGO混合物；每12～72小时，去上清，加入新鲜的所述CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基。
2.如权利要求1所述的CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养方法，其特征在于，所述步骤S1为从细胞培养物、从个体受试者外周血、脐带血或血库的血液样品进行细胞采集。
3.如权利要求1所述的CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的方法b的流式细胞分选技术中采用抗人CD3抗体、抗人TCRVα7.2抗体和抗人CD161抗体。
4.如权利要求1所述的CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养方法，其特征在于，所述方法b流式细胞分选技术时采用T009培养基培养待分选的细胞。
5.如权利要求1所述的CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养方法，其特征在于，所述步骤S3的方法d中MAIT细胞特异性抗原的前体5-A-RU溶于甲基乙二醛、PBS或无菌水中。
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