CN103436493B - 雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法，利用多种细胞因子联合大环内酯类免疫抑制剂—雷帕霉素，将人外周血来源的单个核细胞通过体外诱导扩增，培养出大量的调节性γδT细胞。本发明整个诱导、扩增和富集过程简单，可行性强；本发明细胞培养周期短，成本低；诱导效率高，重复性好，可在调节性γδT细胞培养中的应用。本发明诱导的调节性γδT细胞活力好，具有较强的免疫抑制功能，能保证以后的进一步研究，具有很好的推广价值。
Description
技术领域
本发明属于免疫学研究领域，涉及一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法，是应用多种细胞因子（TGF-β1/IL-15/IL-2）联合大环内酯类免疫抑制药物——雷帕霉素协同诱导调节性γδT细胞的生成和扩增。
背景技术
γδT细胞是T淋巴细胞中的一群特殊的细胞亚群，其有独特的结构和生物学功能。与一般的αβT细胞不同，γδT细胞表面受体由γ链和δ链两种糖蛋白链组成，因此而命名；这群细胞识别抗原不需要经细胞表面组织相容性抗原分子提呈，它可直接识别蛋白质、肽类和非肽类抗原，即该过程为非HLA（人类白细胞抗原）限制性，是γδT细胞的一个重要生物学特性。尽管γδT细胞在外周血和淋巴器官中比例非常小，但是其在人体特异性和非特异性免疫系统中均起着非常重要的作用，不但能够防御病原体包括细菌、真菌、病毒和寄生虫的侵染，而且在肿瘤的免疫监视、维持组织自身稳态、炎症反应和炎症后期组织的修复上均发挥重要作用。近几年研究发现，γδT细胞在不同的微环境诱导下可分为不同的亚群，包括γδTh17、γδTh1和调节性γδT细胞（γδTreg）等。
γδTreg是γδT细胞中的一群特殊的细胞亚群，它与一般的调节性αβT细胞一样均表达Foxp3转录因子，其免疫表型以TCRγδ+Foxp3+双阳性为特征（TCR指细胞表面受体）。已有的研究显示该群细胞具有强大的免疫抑制功能，XiaoyanLi等人研究发现γδTreg在抑制和缓解系统性红斑狼疮SLE中发挥很重要的调控作用；随后JianYe等人的研究显示乳腺肿瘤来源的γδTreg细胞可通过免疫衰老的机制发挥对机体特异和非特异性免疫的抑制作用；在我们之前的研究中，我们利用人源化NOD/SCID小鼠首次发现了γδTreg对异基因造血干细胞移植后的移植物抗宿主病（GVHD）所具有的免疫防护作用，即γδTreg的共输注可以一定程度上缓解GVHD的发生。γδTreg细胞已表现出来的重要的免疫负调控作用提示其具有潜在的治疗自身免疫性疾病、实体器官移植排斥反应和异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的作用，并且γδT细胞本身识别抗原的非HLA限制性特征，增加了这群细胞所具有的研究价值和临床应用前景。然而目前对γδTreg的体外诱导扩增方法偏少，因此找到一种新的γδTreg体外诱导培养方法，提高其体外诱导扩增效率，对以后γδTreg的进一步研究及其临床应用均具有很重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法，其主要步骤如下：
（1）人外周血单个核细胞制备：取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备单个核细胞，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培养液重悬细胞；
（2）调节性γδT细胞诱导扩增：细胞接种当日按第0天计算，第0天加入唑来膦酸激活γδT细胞，同时加入IL-2/IL-15/TGF-β1和雷帕霉素培养诱导，在第3、6、9天分别进行半量换液，每次换液时均加入新鲜IL-2/IL-15/TGF-β1和雷帕霉素，浓度同前，于第15天检测培养细胞中调节性γδT细胞的含量；
（3）调节性γδT细胞含量的检测：采用流式细胞术，以γδTCR和Foxp3作为分子标记，γδTCR+为γδT细胞的表型特征，γδTCR+Foxp3+为调节性γδT细胞的表型特征，检测调节性γδT细胞在培养细胞中所占的比例；
（4）调节性γδT细胞的富集：采用免疫磁珠分选方法（MACS）分选γδTCR+细胞群，内包含调节性γδT细胞；
（5）检测富集的调节性γδT细胞的免疫抑制功能：采用流式细胞术，通过CFSE细胞共培养试验检测分析诱导的调节性γδT细胞对新鲜外周血来源单个核细胞的增殖抑制作用。
本发明的另一个目的是所述的培养方法在调节性γδT细胞培养中的应用，所述培养通过雷帕霉素诱导实现。
为进一步深入研究调节性γδT细胞的生物学特性及其以后的临床应用提供基础，本发明利用多种细胞因子（包括唑来膦酸、IL-2、IL-15和TGF-β1）联合大环内酯类免疫抑制剂——雷帕霉素，将人外周血来源的单个核细胞通过体外诱导扩增，培养出大量的调节性γδT细胞。本发明整个诱导、扩增和富集过程简单，可行性强；细胞培养周期短，成本低；诱导效率高，重复性好；诱导的调节性γδT细胞活力好，具有较强的免疫抑制功能，能保证以后的进一步研究，具有很好的推广价值。
附图说明
图1是流式细胞术检测分析不同培养条件下调节性γδT细胞的诱导情况；横坐标表示γδTCR表达强度，纵坐标表示Foxp3表达强度，γδTCR+Foxp3+细胞即表示诱导的调节性γδT细胞；A图为单用IL-2培养组细胞检测结果，仅有少量双阳性调节性γδT细胞（占总细胞的2.13%）；B图为用TGF-β1/IL-15/IL-2培养组细胞检测结果，双阳性细胞比例增加（占29.6%）；C图为联用雷帕霉素和TGF-β1/IL-15/IL-2培养组检测结果，双阳性细胞群比例明显上升（占55.8%），高于单用TGF-β1/IL-15/IL-2培养组。
图2表示多次实验后统计不同培养组中调节性γδT细胞的诱导率大小，即诱导后调节性γδT细胞在总γδT细胞中所占的比例；A组表示单用IL-2培养（γδT组，即对照组），B组表示单用TGF-β1/IL-15/IL-2培养组，C组表示联用雷帕霉素和TGF-β1/IL-15/IL-2培养组。结果表明，与γδT组相比，用TGF-β1/IL-15/IL-2培养后调节性γδT细胞的诱导率显著增加，而联用雷帕霉素后诱导率增加更明显，显著高于单用TGF-β1/IL-15/IL-2组（P＜0.05）。
图3表示联用雷帕霉素诱导组细胞在经免疫磁珠分选（MACS）前后的流式检测结果；左图表示分选前（γδTCR+细胞占总细胞的93%），右图表示分选后（γδTCR+细胞占99%），结果显示分选后γδTCR+细胞比例明显上升，说明γδTCR+细胞得到富集纯化。
图4表示新鲜分离的外周血单个核细胞不分裂（左图）和正常分裂（右图）时流式检测细胞CFSE荧光表达情况；分别作为阴性对照和阳性对照；不分裂条件下未分裂细胞数占总细胞的98.2%，正常分裂条件下未分裂细胞数占15.6%。
图5表示单用TGF-β1/IL-2/IL-15组诱导生成的调节性γδT细胞与新鲜分离的单个核细胞共培养后，单个核细胞的增殖情况（细胞CFSE荧光表达情况）；其中单个核细胞与调节性γδT细胞以不同比例混合（分别为8:1,4:1,2:1,1:1）；由检测结果可以看出，共培养后单个核细胞增殖代数明显减少（与正常分裂时相比），未分裂细胞占的比例分别为35.1%（8:1），44.2%（4:1），56.6%（2:1），62.5%（1:1）；随着调节性γδT细胞比例增加，这种增殖抑制作用逐渐增强。
图6表示联用雷帕霉素和TGF-β1/IL-2/IL-15组诱导生成的调节性γδT细胞与新鲜分离的单个核细胞共培养后，流式检测单个核细胞的增殖情况；单个核细胞与调节性γδT细胞以不同比例混合（8:1,4:1,2:1,1:1）；由检测结果可以看出，共培养后单个核细胞增殖代数明显减少（与正常分裂组相比），未分裂细胞占的比例分别为46.2%（8:1），57.3%（4:1），69.4%（2:1），83.0%（1:1）；随着调节性γδT细胞比例的增加，这种增殖抑制作用逐渐增强；与图5相比较可以看出，在相同的比例下，单个核细胞与联用雷帕霉素诱导生成的调节性γδT细胞共培养后，增殖抑制作用更明显。
图7表示计算不同共培养组中单个核细胞的增殖抑制率大小，反映增殖抑制情况；“TGF-β1”组指调节性γδT细胞来源于单用TGF-β1/IL-15/IL-2诱导，“Rapa+TGF-β1”组指调节性γδT细胞来源于联用雷帕霉素共诱导；共培养比例（单个核细胞:调节性γδT细胞）分别为8:1,4:1,2:1和1:1，γδT组为对照组，主要为了排除非调节性γδT细胞对单个核细胞增殖的影响；由统计结果可得，在相同的共培养细胞比例下，联用雷帕霉素诱导生成的调节性γδT细胞表现更明显的免疫抑制功能（P＜0.05）。
具体实施方式
本实验所用的细胞因子均购自PeproTech公司，流式细胞术检测用单克隆荧光抗体均购自eBioscience公司，唑来膦酸（商品名择泰）为诺华制药有限公司赠送，雷帕霉素（商品名西罗莫司）购自Sigma公司，γδT细胞MACS分选试剂盒购自德国美天旎生物技术公司，荧光染料CFSE购自美国invitrogen生命技术公司。
实施例1人外周血来源单个核细胞制备
1、先将收集的肝素抗凝外周血（浙江省血液中心）与等量PBS（磷酸盐缓冲液）进行1:1稀释；
2、取若干15ml离心管，各加入5ml的人淋巴细胞分离液，再将稀释后的外周血沿管壁缓慢叠加到淋巴细胞分离液上，每个离心管中加入外周血10ml，即5ml淋巴细胞分离液+10ml稀释后的外周血（1:2）；水平离心，500g×20分钟，室温；
3、离心后见管内分为三层，上层为血浆和PBS缓冲液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一层以单个核细胞为主的白色云雾状狭窄带，即为所需要的细胞带；
4、将移液枪的枪头插到云雾层中吸取单个核细胞，置入另一15ml离心管中，加入5倍以上体积的PBS缓冲液，混匀后离心，300g×6min；洗涤两次；
5、末次离心后弃上清，加入含有10%胎牛血清和1%双抗的完全RPMI1640培养液，重悬细胞，调整细胞密度至2×106/ml；接种于细胞培养板上进行培养。
实施例2调节性γδT细胞的诱导培养
1.将培养的细胞分成三大组，包括单用IL-2培养组（γδT组）、用TGF-β1/IL-2/IL-15诱导组（TGF-β1组），以及联用TGF-β1/IL-2/IL-15和雷帕霉素诱导组（联用雷帕霉素组）；各细胞因子都在细胞培养第0天加入，其加入后终浓度见下表1所述；雷帕霉素也在细胞培养第0天加入。
2、于第3、6、9天进行半量换液，并加入各相应的细胞因子，使各细胞因子终浓度保持一致。
3、各细胞因子的储存浓度分别为：唑来膦酸（56mmol/ml），IL-2（2×104U/ml），IL-15（10μg/ml），TGF-β1（1μg/ml），雷帕霉素（10μM）；储存于-20℃。
实施例3分析比较不同培养条件下调节性γδT细胞的诱导情况
目前调节性γδT细胞的体外诱导较普遍采用的是IL-2/IL-15/TGF-β1诱导的方法，本实验在IL-2/IL-15/TGF-β1的基础上，进一步联合应用了雷帕霉素协同诱导，检测比较其诱导效率的改变。
1、分别收集不同诱导培养条件下培养15天的细胞，即仅加IL-2培养组（γδT组，作为对照），用TGF-β1/IL-2/IL-15培养组（TGF-β1组）和联合应用雷帕霉素和TGF-β1/IL-2/IL-15培养组（联用雷帕霉素组），进行流式细胞术检测分析其中调节性γδT细胞的含量。
2、流式细胞术检测调节性γδT细胞含量的方法如下：
（1）、收获细胞置于流式管中，每管106个，用PBS缓冲液洗涤两次，300g×6min离心，弃上清后用40μlPBS缓冲液重悬细胞；
（2）、加入anti-TCRγδ-FITC单抗，混匀后4℃避光孵育30分钟；
（3）、用PBS缓冲液洗涤两次，300g×6min离心，弃上清；
（4）、加入Fix/Perm缓冲液（固定/破膜缓冲液）1ml，混匀后4℃避光孵育30分钟；
（5）、加入1×PermWash缓冲液（破膜的洗涤缓冲液）洗涤两次，300g×6min离心，弃上清；
（6）、用FACS缓冲液40μl重悬细胞，加入anti-Foxp3-PE单抗，混匀后4℃避光孵育30分钟；
（7）、加入1×PermWash缓冲液洗涤两次，300g×6min离心，弃上清后加入500μlPBS缓冲液重悬细胞；
（8）、流式细胞仪上机检测，应用CELL-QUEST软件获取细胞，以TCRγδ+作为γδT细胞的表型特征，以TCRγδ+Foxp3+作为调节性γδT细胞的表型特征，进行相关检测及分析。
3、流式检测结果参见图1和图2；结果显示，与单用TGF-β1/IL-2/IL-15诱导相比，联用雷帕霉素后调节性γδT细胞的诱导率显著增加，诱导后调节性γδT细胞的比例可增加至55.2±8.2%，而单用TGF-β1/IL-2/IL-15组其比例仅增加至26.2±6.7%，作为对照的γδT组（即不加TGF-β1/IL-15和雷帕霉素）为2.4±1.2%。这表明联用雷帕霉素可以有效提高调节性γδT细胞的体外诱导扩增效率。
实施例4免疫磁珠细胞分选技术富集调节性γδT细胞
1、配制缓冲液，由pH7.2的1×PBS、0.5%的牛血清白蛋白和2mMEDTA组成，以下简称缓冲液；缓冲液保持4-8℃，整个磁珠分选过程尽量快速完成，所需要的液体都提前预冷，细胞混合液也保持预冷状态，这样可以减少非特异性标记，提高磁珠分选的纯度；
2、细胞计数，取107个细胞；300×g离心10分钟，弃上清；
3、用40μl预冷的缓冲液对细胞进行重悬；加入10μl的anti-TCRγδ-hapten抗体；充分混匀后4-8℃孵育10分钟；
4、加入30μl的缓冲液，然后再加入20μl的MACSanti-hapten-FITC磁珠；充分混合后4-8℃避光孵育15分钟；
5、加入1-2ml缓冲液，洗涤细胞，300×g离心10分钟，弃上清；
6、用500μl缓冲液重悬细胞；将MS柱放在相应合适的MACS分选器中，并置于磁场中；用500μl缓冲液润洗分选柱；
7、将细胞悬液加到分选柱中，让细胞流出；用3×500μl的缓冲液冲洗分选柱，冲洗时每次等到前一次分选柱中液体流空时再加入新的液体；
8、将分选柱从分选器中移出，置于15ml无菌离心管上；在分选柱中加入1000μl的缓冲液，用分选柱配备的活塞快速压下，收集磁性标记的细胞；
9、将收集的细胞悬液进行离心，300×g离心10分钟，弃上清，用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI1640培养液重悬细胞，可进行后续实验。
用流式细胞术检测细胞分选前后总γδTCR+细胞的比例变化，联用雷帕霉素诱导组细胞分选前后γδTCR+细胞比例的变化参见图3；结果显示分选后总γδTCR+细胞（其中含调节性γδT细胞）比例上升（可达99%），得到富集纯化。
实施例5CFSE细胞共培养试验分析诱导的调节性γδT细胞所具有的免疫抑制作用
1、取平底96孔板，在要进行混合培养的孔中提前进行CD3单抗的包被，其包被过程包括：在相应孔中加入无血清的RPMI1640培养液，0.2ml/孔，然后再加入CD3单抗1μl（5μl/ml），混合均匀后将96孔板置于37℃恒温箱中孵育2小时；
2、用淋巴细胞分离液分离新鲜的人单个核细胞，细胞计数；并进行CFSE标记，其具体过程包括：
（1）配置含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液；将0.05mg的CFSE染料溶解在18μl的DMSO溶剂中，以获得5mM的CFSE染液；
（2）将人单个核细胞在事先37℃预热的0.1%BSA/PBS中重悬；并在重悬细胞中加入5mM的CFSE1μl/ml；充分混匀后，在37℃下避光孵育10分钟；
（3）加入5倍体积的冰预冷的含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，淬灭荧光；在冰上孵育5分钟；
（4）离心300g×6min，弃上清；用新鲜的含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液洗涤三次，弃上清；
（5）用一定体积的含10%胎牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，调整细胞浓度，用于下一步实验；
3、获取富集的含调节性γδT细胞的γδTCR+细胞，进行细胞计数；
4、将调节性γδT细胞和CFSE标记的单个核细胞以一定的比例混合培养于已包被CD3单抗的96孔板中，每孔0.2ml，再加入CD28单抗（5μl/ml）和细胞因子IL-2（终浓度为250U/ml），避光培养4天。
通过流式细胞术检测共培养体系中单个核细胞的增殖情况来分析诱导培养的调节性γδT细胞所具有的免疫抑制功能。新鲜分离的外周血单个核细胞正常分裂（阳性对照）和不分裂（阴性对照）流式检测结果参见图4；单用TGF-β1/IL-2/IL-15组诱导的调节性γδT细胞与单个核细胞共培养后，单个核细胞增殖情况参见图5；联用雷帕霉素组诱导的调节性γδT细胞与单个核细胞共培养后，其单个核细胞的增殖情况参见图6；与正常分裂和不分裂组对比可以看出，单个核细胞与诱导的调节性γδT细胞共培养后，其增殖明显被抑制，且与联用雷帕霉素诱导组的调节性γδT共培养后，增殖抑制更明显。
计算不同共培养组中，单个核细胞的增殖抑制率大小（结果参见图7）；由统计结果可以看出，随着调节性γδT细胞在共培养体系中的比例增加，增殖抑制率也增加，即免疫抑制作用增强；并且与单用TGF-β1/IL-2/IL-15组相比，联用雷帕霉素诱导组的调节性γδT细胞，在相同的共培养比例下，表现更显著的免疫抑制作用（P＜0.05），说明联用雷帕霉素不但能提高调节性γδT细胞的诱导扩增效率，而且还能增强调节性γδT细胞的免疫活性，表现更明显的免疫抑制功能。
Claims (2)
1.一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）人外周血单个核细胞制备：取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备单个核细胞，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培养液重悬细胞；
（2）调节性γδT细胞诱导扩增：细胞接种当日按第0天计算，第0天加入唑来膦酸激活γδT细胞，同时加入IL-2、IL-15、TGF-β1和雷帕霉素培养诱导，在第3、6、9天分别进行半量换液，每次换液时均加入新鲜IL-2、IL-15、TGF-β1和雷帕霉素，浓度同前，于第15天检测培养细胞中调节性γδT细胞的含量；其终浓度分别为2μmol/ml的唑来膦酸、200U/ml的IL-2、50ng/ml的IL-15、8ng/ml的TGF-β1和100nM的雷帕霉素；
（3）调节性γδT细胞含量的检测：采用流式细胞术，以γδTCR和Foxp3作为分子标记，γδTCR+为γδT细胞的表型特征，γδTCR+Foxp3+为调节性γδT细胞的表型特征，检测调节性γδT细胞在培养细胞中所占的比例；
（4）调节性γδT细胞的富集：采用免疫磁珠分选方法分选γδTCR+细胞群，内包含调节性γδT细胞；
（5）检测富集的调节性γδT细胞的免疫抑制功能：采用流式细胞术，通过CFSE细胞共培养试验检测分析诱导的调节性γδT细胞对新鲜外周血来源单个核细胞的增殖抑制作用。
2.根据权利要求1所述的一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法在γδT细胞培养中的应用，所述培养通过雷帕霉素诱导实现。
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Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104232578A (zh) * | 2014-09-01 | 2014-12-24 | 昆明市第一人民医院 | 用于肿瘤免疫治疗的多系活化杀伤细胞的制备方法 |
| GB201421716D0 (en) | 2014-12-05 | 2015-01-21 | King S College London | Cell expansion procedure |
| EP3551749B1 (en) | 2016-12-07 | 2023-09-27 | East Carolina University | Compositions and methods for in vitro cultivation and/or expansion of regulatory t cells |
| CN108004208A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-08 | 南京爱瑞生物科技有限公司 | 一种体外诱导抗原特异性t细胞的方法 |
| CN110195041B (zh) * | 2019-06-20 | 2023-04-25 | 威海正生生物科技有限公司 | 利用ASC三维培养体系获得高活性Tregs细胞的方法 |
| CN117106846A (zh) * | 2020-03-09 | 2023-11-24 | 山东大学齐鲁医院 | 可靠性高的评估干细胞制剂的免疫调控功能的方法 |
| CN114426952A (zh) * | 2020-10-29 | 2022-05-03 | 中国科学技术大学 | 用于白血病的car t细胞疗法的t细胞增效剂及获得增效t细胞的方法 |
| CN113416696B (zh) * | 2021-06-25 | 2022-04-19 | 北京大学人民医院 | 一种免疫调节性γδT细胞及其体外扩增方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102168067A (zh) * | 2011-02-11 | 2011-08-31 | 浙江大学 | 一种调节性t细胞的诱导培养方法 |
| CN102321580A (zh) * | 2011-08-23 | 2012-01-18 | 郑颂国 | 一种治疗自体自身免疫性疾病的调节t细胞及其制备方法 |
| CN102994448A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-03-27 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种体外扩增γδT细胞的方法 |
-
2013
- 2013-08-29 CN CN201310384046.3A patent/CN103436493B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102168067A (zh) * | 2011-02-11 | 2011-08-31 | 浙江大学 | 一种调节性t细胞的诱导培养方法 |
| CN102321580A (zh) * | 2011-08-23 | 2012-01-18 | 郑颂国 | 一种治疗自体自身免疫性疾病的调节t细胞及其制备方法 |
| CN102994448A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-03-27 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种体外扩增γδT细胞的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 不同剂量雷帕霉素对小鼠体内CD4 + CD25 + Treg 细胞的影响;彭磊磊等;《安徽医药》;20110331;第15卷(第3期);284 * |
| 小鼠CD4 + CD25 + Foxp3 + 调节性T 细胞体外扩增;杨明珍等;《中国免疫学杂志》;20121231;109 * |
| 雷帕霉素体外促进小鼠调节性T细胞的分化和增殖;谢江平等;《第二军医大学学报》;20091031;第30卷(第10期);1136 * |
| 雷帕霉素对人CD4+CD25+调节性T细胞体外扩增的影响;郝俊等;《现代免疫学》;20121231;第32卷(第5期);摘要 * |
| 雷帕霉素诱导大鼠体内CD4+ CD25+FoxP3+ 调节性T 细胞的增殖;王吉荣等;《江苏医药》;20100531;第36卷(第10期);1184 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103436493A (zh) | 2013-12-11 |
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