CN117106846A - 可靠性高的评估干细胞制剂的免疫调控功能的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供可靠性高的评估干细胞制剂的免疫调控功能的方法，包括以下步骤：分选将接受干细胞制剂的受体的效应细胞，效应细胞为CD4⁺CD25^‑T细胞；采用抗体包被的扩增磁珠，对分选后的效应细胞进行标准化的效应细胞扩增，扩增磁珠为抗人CD3抗体、CD28抗体预包被的磁珠；检测效应细胞的增殖情况，得到效应细胞增殖被抑制率，并评估待检测干细胞制剂的免疫调控功能。根据本公开，能够提供一种可靠、重复性好的评估干细胞制剂对效应细胞的免疫调控功能的方法。

Description

可靠性高的评估干细胞制剂的免疫调控功能的方法

本申请是申请日为2020年3月9日、申请号为202010156994.1、发明名称为一种评 估干细胞免疫调控功能的方法的分案申请。

技术领域

本公开涉及生物医学工程产业领域，具体涉及一种可靠性高的评估干细胞制剂的免疫调控功能的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

干细胞是一类具有自我更新/多向分化潜能和独特免疫调控功能的细胞，以干细胞为代表的细胞治疗突破药物、手术两种传统治疗方式，已成为生物医学领域最前沿、最有前景的疾病干预策略。

除自我更新和多向分化潜能之外，干细胞具有独特的免疫学特性，并展示出独特的免疫调控功能。目前干细胞已被用于治疗多种类型的免疫异常如自身免疫反应、炎症失控所致的疾病，如1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、急慢性移植物抗宿主反应(GVHD)等。此外，科研人员正在积极推进包括恢复期血浆、干细胞等在重症治疗方面的临床疗效的研究探索，尤其有望在预防、改善重症“炎症瀑布反应”及肺纤维化方面具有其他治疗都无法替代的优势。当前，国内外大量临床前研究已经验证了干细胞治疗自身免疫疾病的有效性和安全性，并有不少研究进入II-III期临床试验阶段。近年来，国际上逐步将干细胞的免疫调控功能当作干细胞作为治疗产品的关键有效性属性，并形成共识、提出了一些建设性意见，如国际细胞治疗协会(International Society of Cell Therapy，ISCT)于2013年建议针对干细胞的各项免疫调控功能建立一套可靠的、重复性好的标准化检测技术，用于评价干细胞作为治疗产品的质量。而我国在《干细胞临床研究管理办法》出台的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》中也明确提出“免疫调控功能作为干细胞生物学有效性的质量评价内容”。

然而，发明人发现，当前国内外针对干细胞制剂的质量检验一般只涉及一般生物学属性(数量、活性、增殖能力等)、微生物安全性(细菌、病毒、真菌和内毒性检测等)、生物学安全性(抗原性、致瘤性等检测)，针对细胞制剂的生物学有效性的质量检测手段相对缺乏，目前也更多集中在表明分子标记物、诱导分化功能检测，尚缺少免疫调控性能这一关键的细胞生物学性能评价。尤其是针对用于糖尿病、自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等)及急慢性炎症性疾病(如新型冠状病毒COVID-19、SARS冠状病毒、埃博拉病毒或者H7N9流感病毒等感染引起的全身炎症反应SIRS)等，免疫调控性能，而不是定向分化能力，才是干细胞最重要的治疗机制。对于用于这部分疾病治疗的细胞制剂，科学客观地评估其免疫调控性能至为重要。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种评估干细胞免疫调控功能的标准化方案。本方法基于混合淋巴细胞反应的基本原理，能够评价干细胞对总淋巴细胞增殖的抑制能力，作为干细胞免疫调控功能的基本性能评估；也能进一步评估干细胞对CD4⁺T淋巴细胞亚群增殖分化的调控效能，以及干细胞对不同免疫细胞释放炎症因子等方面的调控能力。本发明所述方法是一种可靠、重复性好的标准化检测方法，可作为全面综合反映干细胞质量的必要内容，能够反映干细胞制剂的生物学有效性。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

本发明提供了一种评估干细胞免疫调控功能的方法，其包括：基于免疫磁珠分选(magnetic-activated cell sorting，MACS)分选接受干细胞制剂的受体(即接受干细胞治疗的个体)或同一标准供体(作为参照)的效应细胞，采用抗体包被的扩增磁珠进行标准化的效应细胞扩增，基于羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carbo xy fluor esce indiacetate succinimidylester，CFSE)染色标记效应细胞、流式细胞术评估在待检测干细胞单细胞混悬液内混合培养的效应细胞的增殖，以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞免疫调控功能。

具体地，本发明所述的评估干细胞免疫调控功能的方法包括步骤：分离制备效应细胞；CFSE标记效应细胞；效应细胞接种；效应细胞与待检测干细胞混合培养；流式细胞术检测效应细胞在混合细胞中的增殖情况；以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞的免疫调控功能。

本发明所述效应细胞为PBMCs(人外周血单个核细胞)或Tresp细胞(效应性T细胞，此处不是指effector T cell-效应T细胞，而是指T细胞中可能被干细胞调控的效应细胞)。

在本发明的一些实施方式中，所述PBMCs的分离方法包括：取分离好的干细胞制剂受体(即将接受干细胞输注治疗的个体)的PBMCs，去除悬浮细胞中的细胞团，离心，弃干上清液去除死细胞，即得；其中，在一些实施方式中，所述去除悬浮细胞中细胞团的方法可采用本领域的常规方法，或者可采用过30um尼龙网目的方法。

在本发明的一些实施方式中，Tresp细胞采用T细胞分选试剂盒制备。所述T细胞分选试剂盒可用于调节性T细胞、效应性T细胞Tresp的分选，可通过购买获得。

在本发明的一些实施方式中，所述Tresp包括但不限于CD4⁺CD25^-T细胞，而CD4⁺CD25^-T细胞的制备方法包括：标记非CD4⁺细胞，抗体标记CD25⁺细胞，MS柱阴选Tresp细胞。

在一些具体的实施方式中，其操作过程：

标记非CD4⁺细胞：用90μL MACS buffer重悬(每10⁷细胞)后，加入10μL Biotinlabeled Cocktail抗体，混匀，4℃孵育10min；加入20μl anti-Biotin microbeads，4℃孵育15min；加入1mL MACS buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清；加500μL Buffer重悬；LD分离柱阴选除去non CD4⁺细胞(取LD column分离柱置于磁场STAND上的大分选器(Separator，紫色)上，加2mL buffer润洗；加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入1mL buffer洗两遍，收集流过分离柱的所有细胞悬液(即CD4+细胞悬液，包括洗液)；

抗体标记CD25⁺细胞：上述CD4⁺细胞悬液300g离心10min，去上清，加入90μL buffer重悬(每10⁷细胞)；加10μL anti-CD25microbeads(每10⁷细胞)，充分混匀，4℃孵育15min；加1mL buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清；加500μL Buffer重悬即得到抗CD25磁珠标记的细胞悬液；

MS柱阴选Tresp细胞：取LD column分离柱置于磁场STAND上的小分选器(Separator，绿色)上，加500μL buffer润洗；加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入500L buffer洗3次，收集流过分离柱来的细胞悬液(即Tresp细胞：CD4⁺CD25^-细胞悬液)。而将MS柱移除磁场，置于收集的EP管，加1mL buffer立即塞上活塞将细胞悬液挤出收集到无菌EP管，可得到纯化的调节性T细胞(Treg细胞，CD4⁺CD25⁺细胞)。分选得到的细胞用流式细胞仪鉴定纯度；

在本发明的实施方式中，效应细胞增殖情况的检测优选CSFE标记评价的办法，其他如基于LDH的检测(如MTT比色法)、3H-TdR掺入法，或是BrdU标记法，或许可以替代，但在本发明的研究中，CSFE标记从各方面综合考虑更为优选。所述CSFE标记效应细胞的过程包括：CSFE存储液与PBS避光混匀，效应细胞以PBS重悬后与上述避光混匀的溶液迅速混匀；孵育、离心后去上清加入T细胞完全培养基中重悬。

在本发明的一些实施方式中，效应细胞以等体积的PBS重悬。

效应细胞的PBS重悬液与CSFE存储液和PBS避光混匀液的混合体积为1:1；

孵育条件为：室温(25℃)避光下孵育5min；或4-10度避光孵育；

孵育、取300g离心5min后去上清加入2mL含10％FBS的T细胞完全培养基重悬。

本发明所述的CSFE存储液可采用本领域常规使用的存储液，在本发明中，优选溶于DMSO中的CSFE，其浓度为5mmol/L。

在本发明的实施方式中，所述效应细胞接种的过程包括：将CSFE标记的效应细胞以加入了扩增磁珠的T细胞完全培养基重悬，接种于孔板中，每组安排2×3个效应细胞复孔。

本发明所述扩增磁珠为抗人CD3抗体、CD28抗体预包被的磁珠。抗人CD3抗体、CD28抗体预包被的磁珠称扩增磁珠，是由于磁珠能代替抗原刺激及抗原呈递细胞(APC)接触T细胞并直接无选择地激活TCR第一信号和CD28第二信号，从而实现在无需APC呈递的情况下活化T细胞增殖。其中所述磁珠可自行制备或选购Miltenyi公司的MACSiBeadTM或Invitrogen公司的DynabeadsTM。

在本发明的一些实施方式中，扩增磁珠颗粒数与CSFE标记的效应细胞数的比值为4:1到1:1，根据效应细胞混合培养时间和预期扩增代数，优选为2:1；

在本发明的实施方式中，重悬后的细胞数目为5×10⁵到1×10⁶个细胞/mL，优选为5×10⁵个细胞/mL；

在本发明的实施方式中，每孔细胞数目为1×10⁴到1×10⁵个细胞，根据效应细胞适宜接种密度和扩增预期，优选为5×10⁴个细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述含扩增磁珠的T细胞完全培养基的制备方法包括：在vial中充分混匀重悬磁珠，立即吸取混匀后的磁珠(4×10⁷beads/mL)至灭菌EP管，加入等体积或至少500μL基本培养基，离心去上清或置于MACS STAND上，待磁珠被充分吸附到管壁后吸去液体，再以T细胞完全培养基重悬即可。在配置完全扩增培养基前，需进行磁珠清洗。

在本发明的实施方式中，所述效应细胞与待检测干细胞混合培养的过程包括：将待检测干细胞单细胞混悬液加入接种有效应细胞的孔板的3个复孔作为检测孔；将未经CSFE标记的效应细胞的单细胞混悬液加入接种有效应细胞的孔板的另外3个复孔作为对照孔，混匀后培养。

在本发明的实施方式中，培养条件可采用本领域适用于培养干细胞和效应细胞的条件。在本发明的一些实施方式中，较优的培养条件为：37℃、5％CO₂避光以及饱和湿度条件下培养48-96h，优选48h。

在本发明的实施方式中，采用流式细胞术检测效应细胞在混合细胞中的增殖情况包括：收集混合培养的细胞，充分吹打分散细胞和磁珠，于强磁场中收集细胞悬液，离心去培养基，以PBS重悬后流式上机检测，选择并分析CFSE阳性细胞即效应细胞的增殖细胞比例。

在本发明的实施方式中，所述以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞免疫调控功能按照下述公式计算效应细胞增殖被抑制率：

效应细胞增殖被抑制率＝(对照孔增殖细胞比例均值-检测孔增殖细胞比例均值)/对照孔增殖细胞比例均值×100％。

本发明的方法能够评价干细胞对效应细胞(如总体单个核细胞、某种效应性T细胞亚群等)的抑制能力，作为干细胞免疫调控功能的基本性能评估；也能进一步评估干细胞对效应细胞(比如CD4⁺T淋巴细胞亚群)增殖分化的调控效能，以及干细胞对不同免疫细胞释放炎症因子的调控能力。在具体的应用中，本发明的方法能够用于评估在糖尿病、自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等)及急慢性炎症性疾病(如新型冠状病毒COVID-19、SARS冠状病毒、埃博拉病毒或者H7N9流感病毒等感染引起的全身炎症反应SIRS)等的治疗中干细胞对不同免疫细胞释放炎症因子方面的调控能力，且可重复性好、可比性好。

本发明的方法可实现干细胞尤其是不同批次干细胞对受体效应细胞(比如外周血单个核细胞或CD4⁺CD25^-效应细胞)的免疫负性功能。根据临床治疗目的需要，本领域技术人员能够根据本发明的公开调整选择其他可通过抗原呈递细胞活化的细胞亚群作为效应细胞(包括但不限于CD3⁺T细胞亚群、CD3⁺CD8⁺T细胞亚群、CD3⁺CD4⁺T细胞亚群以及某种抗原特异性的淋巴细胞亚群等)。此外，本发明所述方法也可用于其他免疫负性调控细胞(包括但不限于调节性T细胞)等其他用于细胞治疗的细胞制剂的检测和质控。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为检测实施例中流式细胞术上机检测数据图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

试剂盒内容及说明：

T细胞培养基添加物(Supplements，100X)：10mL RPMI1640基本培养基含谷氨酰胺0.2923g HEPES 5.9575gβ-巯基乙醇3.52μL(过滤除菌)；上述Supplements 1mL+RPMI164088mL+灭活FBS 10mL+5000U/ml IL-2 1mL+双抗(1000×)100μL即可制备T细胞完全培养基(加入IL-2的完全培养基4℃下存贮，有效期限1周)；

标准化扩增磁珠(4×107个/mL磷酸盐缓冲液含0.1％人血白蛋白)：抗人CD3抗体、CD28抗体预包被的磁珠称扩增磁珠，由于磁珠能代替抗原刺激及抗原呈递细胞(APC)接触T细胞并直接无选择地激活TCR第一信号和CD28第二信号，从而实现在无需APC呈递的情况下活化T细胞增殖。该磁珠可自行制备或选购Miltenyi公司的MACSiBeadTM或Invitrogen公司的DynabeadsTM。

CFSE(5mmol/L溶于DMSO)-25℃避光冻存；

人重组白介素-2(IL-2)(5000U/mL，100X)；

雷帕霉素(rapamycin)。

其他关键试剂及器材：

外周血单个核细胞(PBMC)分离液；

T细胞分选试剂盒(可用于调节性T细胞、效应性T细胞Tresp(非effector效应T细胞)分选)；

磁场细胞分选架MACS MultiSand，购自Miltenyi Biotec；

本发明所述评估干细胞免疫调控功能的方法包括以下步骤：

A.取分离好的干细胞制剂受体(即将接受干细胞输注治疗的个体)的PBMCs过30um尼龙网目去除悬浮细胞中的细胞团，300g离心10分钟，弃干上清液去除死细胞；

B.可选地，效应细胞分选(以CD4⁺CD25^-T细胞为例)：采用T细胞分选试剂盒分选制备Tresp细胞：

a.标记非CD4+细胞：用90μl MACS buffer重悬(每10⁷细胞)后，加入10μL Biotinlabeled Cocktail抗体，混匀，4℃孵育10min；加入20μL anti-Biotin microbeads，4℃孵育15min；加入1mL MACS buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清；加500μL Buffer重悬；LD分离柱阴选除去non CD4⁺细胞(取LD column分离柱置于磁场STAND上的大分选器(Separator，紫色)上，加2mL buffer润洗；加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入1mL buffer洗两遍，收集流过分离柱来的所有细胞悬液(即CD4⁺细胞悬液，包括洗液)；

b.抗体标记CD25⁺细胞：上述CD4⁺细胞悬液300g离心10min，去上清，加入90μLbuffer重悬(每107细胞)；加10μL anti-CD25microbeads(每10⁷细胞)，充分混匀，4℃孵育15min；加1mL buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清；加500μL Buffer重悬即得到抗CD25磁珠标记的细胞悬液；

c.MS柱阴选Tresp细胞：取LD column分离柱置于磁场STAND上的小分选器(Separator，绿色)上，加500μL buffer润洗；加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入500L buffer洗3次，收集流过分离柱来的细胞悬液(即Tresp细胞：CD4⁺CD25^-T细胞悬液)；将MS柱移除磁场，置于收集的EP管，加1mL buffer立即塞上活塞将细胞悬液挤出收集到无菌EP管，即为纯化的Treg细胞(CD4⁺CD25^-细胞)。分选得到的细胞用流式细胞仪鉴定纯度；

C.扩增磁珠准备：在配置完全扩增培养基前，需进行磁珠清洗：在vial中充分混匀重悬磁珠，立即吸取混匀后的磁珠(4×10⁷beads/mL)适量体积至灭菌EP管，加入等体积或至少500μL基本培养基，300g离心5min去上清(或置于MACS STAND上1min磁珠被充分吸附到管壁后吸去液体)，再以适量体积T细胞完全培养基重悬即可；

D.CSFE标记效应细胞：CSFE存储液(1000×)2μL加入1mL PBS(或按比例对应体积)于EP管中避光混匀，将效应细胞(上述分离的PBMC或Tresp)以等体积PBS重悬；两者1:1加到一起迅速混匀，室温避光孵育5min；300g离心5min去上清，加入2mL含10％FBS的T细胞完全培养基重悬；取300g离心5min再洗一次。

E.效应细胞接种：上述CSFE标记的PBMC或Tresp以加入扩增磁珠(磁珠颗粒数:细胞＝2:1)的T细胞完全培养基重悬(5×10⁵个细胞/mL)，100uL接种于圆底96孔板中，每孔5×10⁴个细胞，每组待检测干细胞安排2×3个效应细胞复孔；

F.检测细胞混合培养：将100uL待检测干细胞单细胞混悬液(5×10⁵个细胞/mL)加入上述含效应细胞的96孔板的3个复孔作为检测孔，100uL步骤C中获得的未标记的效应细胞单细胞混悬液(5×10⁵个细胞/mL)加入上述含效应细胞的96孔板的3个复孔作为对照孔，水平晃动充分混匀，37℃、5％CO₂避光以及饱和湿度条件下培养48h；

G.流式上机检测：收集细胞于EP管，充分吹打分散细胞和磁珠，置于强磁场中1min后，收集细胞悬液，300g 5min离心去培养基；200μL PBS重悬，流式上机检测，画门选择CFSE阳性细胞，直方图分析CFSE阳性细胞(即效应细胞)的增殖细胞比例；

H.以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞免疫调控功能：

效应细胞增殖被抑制率＝(对照孔增殖细胞比例均值-检测孔增殖细胞比例均值)/对照孔增殖细胞比例均值×100％

检测实施例

目的：检测比较常规培养组和炎症因子预处理培养组的P3代脐带间充质干细胞的对1型糖尿病受试者T淋巴细胞的免疫调节性能。

步骤：

1.制备待检测的间充质干细胞单细胞悬液：

购买或按常规操作方式制备来源于同一健康供体的脐带的间充质干细胞(不含血清成分)进行常规培养，细胞在扩增到第三代后，等量分成两份，一份为常规处理组记为A，一份为炎症因子预处理组记为B，B组与A组的差异在于培养基中添加50纳克每毫升浓度重组人细胞因子(IFN-γ)。P3代培养结束后，A、B两组以同样方式收集、制备可用于静脉输注的无血清成分干细胞悬液。

2.采集准备接受干细胞治疗的1型糖尿病患者外周血，分离PBMCs，过30um尼龙网目去除悬浮细胞中的细胞团，300g离心10分钟，弃干上清液去除死细胞；

3.分选患者的CD4⁺CD25^-T细胞作为Tresp细胞，采用T细胞分选试剂盒分选制备Tresp细胞：

a.标记非CD4⁺细胞：用90μL MACS buffer重悬(每10⁷细胞)后，加入10μL Biotinlabeled Cocktail抗体，混匀，4℃孵育10min；加入20μl anti-Biotin microbeads，4℃孵育15min；加入1mL MACS buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清；加500μL Buffer重悬；LD分离柱阴选除去non CD4⁺细胞(取LD column分离柱置于磁场STAND上的大分选器(Separator，紫色)上，加2mL buffer润洗；加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入1mL buffer洗两遍，收集流过分离柱来的所有细胞悬液(即CD4⁺细胞悬液，包括洗液)；

b.抗体标记CD25⁺细胞：上述CD4⁺细胞悬液300g离心10min，去上清，加入90μLbuffer重悬(每10⁷细胞)；加10μL anti-CD25microbeads(每10⁷细胞)，充分混匀，4℃孵育15min；加1mL buffer，4℃300g离心10min用枪吸去上清；加500μL Buffer重悬即得到抗CD25磁珠标记的细胞悬液；

c.MS柱阴选Tresp细胞：取LD column分离柱置于磁场STAND上的小分选器(Separator，绿色)上，加500μL buffer润洗；加上述细胞悬液自然流过分离柱，保持连续加入500L buffer洗3次，收集流过分离柱来的细胞悬液(即Tresp细胞：CD4⁺CD25^-T细胞悬液)；将MS柱移除磁场，置于收集的EP管，加1mL buffer立即塞上活塞将细胞悬液挤出收集到无菌EP管，即为纯化的Treg细胞(CD4⁺CD25^-细胞)。分选得到的细胞用流式细胞仪鉴定纯度；

4.扩增磁珠准备：在vial中充分混匀重悬磁珠，立即吸取混匀后的磁珠(4×10⁷beads/mL)适量体积至灭菌EP管，加入等体积或至少500μL基本培养基，300g离心5min去上清(或置于MACS STAND上1min磁珠被充分吸附到管壁后吸去液体)，再以适量体积T细胞完全培养基重悬即可；

5.CSFE标记效应细胞：CSFE存储液(1000×)2μL加入1mL PBS(或按比例对应体积)于EP管中避光混匀，将效应细胞(上述分离的PBMC或Tresp)以等体积PBS重悬；两者1:1加到一起迅速混匀，室温避光孵育5min；300g离心5min去上清，加入2mL含10％FBS的T细胞完全培养基重悬；取300g离心5min再洗一次。

6.Tresp细胞接种：上述CSFE标记的Tresp以加入扩增磁珠(磁珠颗粒数:细胞＝2:1)的T细胞完全培养基重悬(5×10⁵个细胞/mL)，100uL接种于圆底96孔板中，每孔5×10⁴个细胞，安排3×3个效应细胞复孔；

7.检测细胞混合培养：将上述A、B两组待检测干细胞单细胞混悬液(5×10⁵个细胞/mL)每孔100uL，分别加入上述接种好CSFE标记Tresp的96孔板的3个复孔作为检测孔(即各3个检测孔，共6孔)，100uL步骤4中获得的未标记CSFE的患者Tresp单细胞混悬液(5×10⁵个细胞/mL)加入上述接种好CSFE标记Tresp的96孔板的3个复孔作为对照孔，水平晃动充分混匀，37℃、5％CO₂避光以及饱和湿度条件下培养48h；

8.流式上机检测：收集细胞于EP管，充分吹打分散细胞和磁珠，置于强磁场中1min后，收集细胞悬液，300g 5min离心去培养基；200μL PBS重悬，流式上机检测，画门选择CFSE阳性细胞，直方图分析CFSE阳性细胞(即效应细胞)的增殖细胞比例；

9.以效应细胞增殖被抑制率评估待检测干细胞免疫调控功能：

效应细胞增殖被抑制率＝(对照孔增殖细胞比例均值-检测孔增殖细胞比例均值)/对照孔增殖细胞比例均值×100％

结果如流式细胞术上机检测数据图(图1)和表1所示。

表1

结果分析，图1和表1结果表明：

常规干预组干细胞(A组)对效应细胞的增殖抑制率为47.31％，而炎症因子预处理强化组干细胞(B组)对效应细胞的增殖抑制率提高到65.28％。结果表明，本实施例的方法能够很好的评估1型糖尿病治疗中干细胞对免疫细胞释放炎症因子方面的调控能力。此外，本次检测每组检测复孔之间变异系数均在5％之内，提示检测可重复性好，可比性好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可靠性高的评估干细胞制剂的免疫调控功能的方法，其特征在于，包括以下步骤：

分选将接受干细胞制剂的受体的效应细胞，所述效应细胞为CD4⁺CD25^-T细胞；

采用抗体包被的扩增磁珠，对所述分选后的效应细胞进行标准化的效应细胞扩增，所述扩增磁珠为抗人CD3抗体、CD28抗体预包被的磁珠；

检测所述效应细胞的增殖情况，得到效应细胞增殖被抑制率，并评估所述待检测干细胞制剂的免疫调控功能。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用CFSE标记评价法、基于LDH的检测法、3H-TdR掺入法或BrdU标记法检测所述效应细胞的增殖情况。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用CFSE标记评价法检测所述效应细胞的增殖情况。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，CFSE标记效应细胞的过程包括：将CFSE存储液与PBS在避光的条件下混合得到CFSE混合液；将所述效应细胞使用PBS重悬并与所述CFSE混合液进行混匀；进行孵育、离心后去上清加入T细胞完全培养基中进行重悬，得到CFSE标记效应细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CFSE存储液为通过将CFSE溶于DMSO中得到，且CFSE的浓度为5mmol/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用流式细胞仪上机检测得到所述CFSE标记的效应细胞的增殖细胞比例，进而得到所述效应细胞增殖被抑制率。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用所述扩增磁珠对所述分选后的效应细胞进行标准化的效应细胞扩增之前，还包括对所述扩增磁珠进行清洗。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对所述扩增磁珠进行清洗包括：在试管中充分混匀重悬所述扩增磁珠，吸取预设体积的混匀后的磁珠至灭菌EP管，加入预设体积或至少500μL的基本培养基，300g离心5min后去上清，再使用T细胞完全培养基重悬。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述评估干细胞制剂的免疫调控功能的方法用于评估干细胞对不同免疫细胞释放炎症因子的调控能力。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述评估干细胞制剂的免疫调控功能的方法用于评估糖尿病、自身免疫性疾病和急慢性炎症性疾病的治疗中干细胞对不同免疫细胞释放炎症因子的调控能力。