CN104651309A - 人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法 - Google Patents
人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，属于细胞分选扩增领域。所述的人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，具体步骤如下：1)外周血单个核细胞的分离；2)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞MACS分选；3)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外培养和扩增；最终扩增培养获得人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。本发明中采用免疫磁珠两步法成功分离了人外周血CD4+CD25+Treg细胞，并对其纯度进行了流式鉴定，最终获得的CD4+CD25+Treg细胞纯度达到97％，细胞活性达95％以上。
Description
技术领域
本发明属于细胞分选扩增领域，特别涉及一种人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法。
背景技术
CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)是一种具有免疫调节功能的细胞群，可通过抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、诱导移植物的耐受中发挥重要作用，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方式。1995年，Sakaguchi等首次报道了在自身免疫耐受中存在一类表达IL2受体a链(IL2Ra，CD25)的T细胞亚群，并将这类CD4+CD25+T细胞命名为调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)。随后研究发现，Treg是一种具有免疫调节功能的细胞群，它能分泌IL-10、TGF-B.表达Foxp3及CTLA-4分子等，通过细胞间直接接触或细胞因子间接方式抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌等，在维持机体内环境的稳定、诱导移植物的耐受中发挥重要作用，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的一种重要方式，并与免疫调节、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、移植免疫耐受、母胎免疫耐受等诸多方面有着密切的联系。因此，Treg细胞是目前国内外研究的热点。但目前对T reg细胞的功能和发挥抑制作用的免疫学机制尚未得到完全阐明，对Treg细胞的免疫学特性有必要进一步深入研究。而体外成功分离和培养该细胞，将是对其免疫学特性行进一步研究的必要条件。
随着对CD4+CD25+Foxp3+调节性Treg细胞的深入研究，其临床应用潜能一直是目前研究的热点。然而，CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞仅占正常人外周血CD4+T淋巴细胞的5％-10％，其数量极少，必须能够在体外大量扩增才能满足科研及临床应用的需要。免疫磁珠细胞分选技术(MACS)是本世纪80年代发展起来的一种高效的细胞分离方法，其基本原理是：根据细胞表面抗原能和连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，将其置于外加强磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在强磁场中，没有此种表面抗原的细胞由于不能和连接着磁珠的特异性单克隆抗体结合而无磁性，在强磁场中不滞留，从而分离出目的细胞。该技术并且不需要大型的仪器设备，容易进行无菌操作，对细胞的功能活性影响很小，提取分离后可以进行体外培养，因此在对特定细胞亚群的功能研究中得到了广泛的应用。
因此运用免疫磁珠细胞分选技术(MACS)研制一种人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法具有重要意义。
发明内容
为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法。本发明采用免疫磁珠分选法(MACS法)成功分选出高纯度的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞，并利用CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads联合IL2共同刺激CD4+CD25+Treg细胞，成功扩增了高纯度的Treg细胞。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，具体步骤如下：
1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离
抽取肝素抗凝静脉血30ml，取6个15ml管离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5ml，将5ml外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000转/分20℃离心20min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用；
2)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞MACS分选
将步骤1)中获得的PBMC进行细胞计数，加PBS洗涤，1200转/分离心后倾上清，以MACS buffer 90ul/每107个细胞重悬，加入CD4+T细胞Biotin-Antibody 10ul/每107个细胞，混匀，置于2-8℃孵育5min，加入20ulAnti-Biotin Microbeads/每107个细胞，混匀，2-8℃孵育10min，以MACS buffer将细胞调整至500ul体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为阴选的CD4+T细胞，将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90ul/每107个细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，在2-8℃孵育15min，加入1-2ml MACS buffer洗涤离心，倾去上清，重悬至500ul，过MS柱，把分离器移开，放置1ml MACS buffer于MS柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为阳选的CD4+CD25+T细胞；
3)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外培养和扩增
起始培养细胞数量为2×105，种于96孔板中，用完全培养液200ul进行培养，第0天培养液中加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads，细胞与Dynalbeads磁珠的比例为1:1-1:2，并加入终浓度为500U/ml的IL2，每3-5天进行细胞换液，并且将孔板中的细胞半数转移至另一孔中继续培养，每次换液加入终浓度为200U/ml的IL2继续刺激；扩增培养获得人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。
步骤1)中所述的淋巴细胞分离液优选为购自Sigma公司的淋巴细胞分离液。
步骤2)中所述的MACS buffer购于德国美天旎公司。
MACS分选柱是一类填充有不同规格铁珠的塑料容器，铁珠表面有亲水包被，因此不会损伤细胞。在磁场外MACS分选柱不带有磁性，但是当置于一个永久性磁场—MACS分选器中时，分选柱内的铁珠可以使分选器的磁场增强1000倍，足以滞留仅标记有极少量微珠的目的细胞；磁性标记细胞从分选柱中通过时可以受到均匀的磁力作用，从而提高分选纯度和回收率。步骤2)中所述的MS分选柱细胞容量是2*108总细胞，107个标记细胞；步骤2)中所述的LD分选柱细胞容量是5*108总细胞，108个标记细胞。
步骤2)中所述的LD柱为德国美天旎公司购买的LD分选柱。
步骤4)中所述的完全培养液为添加10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液体，并加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明中我们采用免疫磁珠两步法(阴选加阳选)成功分离了人外周血CD4+CD25+Treg细胞，并对其纯度进行了流式鉴定，最终获得的CD4+CD25+Treg细胞纯度达到97％，细胞活性达95％以上。我们的实验结果说明通过目前已成熟的免疫磁珠技术分离Treg是可行的。然而由于Treg细胞在外周血所占的比例非常少，即使成功分离了高纯度的Treg还要对其进行扩增才能进行随后的细胞共培养等实验。本发明我们使用CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads联合高浓度IL2体外扩增培养CD4+CD25+Treg细胞，发现Treg细胞能正常增殖，且培养2周后，细胞数量扩增20倍，培养3周后，细胞数量扩张达40倍，流式细胞术鉴定其表型仍为CD4+CD25+Foxp+。本发明通过提供的的人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法获得大量CD4+CD25+Foxp+调节性T细胞，扩增前后Treg细胞的纯度及表型无明显变化。
附图说明
图1为应用流式细胞术检测人外周血CD4+CD25+Foxp+Treg占CD4+T细胞的结果图，其中：A.是所有细胞的流式图，画圈部分为淋巴细胞，以淋巴细胞设门，进行下一步的流式鉴定；B.是P1门内CD4+T细胞及CD4-细胞的百分比，并以CD4+T细胞进行设门P2，分析CD4+T细胞亚群情况；C.是P1门里CD4CD25的情况：UL是“左上象限”是指CD4-CD25+占的百分比，UR是右上象限CD4+CD25+占的百分比，LL左下象限是CD4-CD25-百分比，LR是CD4+CD25-百分比；D.是P2门里分析CD4+T细胞里，CD25及Foxp3情况(跟C一样分4个象限)：UL左上象限：CD25-Foxp3+，UR右上象限：CD25+Foxp3+，LL左下象限：CD25-Foxp3-，LR右下象限CD25+Foxp3-。
图2为利用流式细胞术鉴定分选后CD4+CD25+Treg细胞的纯度的结果图，其中：A.是CD4+CD25+双阳细胞占了97.1％；B.CD25+Foxp3+细胞占了96.52％。
图3为Treg加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads和高浓度IL2与96孔板培养的结果图；其中，A为0天时的细胞图；B为7天时的细胞图；C为14天时的细胞图。
图4为Treg加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads和高浓度IL2与96孔板培养的细胞生长曲线图。
图5为流式细胞术检测扩增后细胞Foxp3的表达的结果图；其中：A.是扩增前CD25+Foxp3双阳细胞占了96.52％；B.是扩增后CD25+Foxp3+双阳细胞占了92.56％。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.本实施例所用材料主要如下：
(1)标本来源：外周血标本采自健康志愿者，共3例。年龄25-32岁，中位年龄26岁，男性1例，女性2例。
(2)主要试剂：淋巴细胞分离液购自Sigma公司，CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads购自Dynal Inc.(Oslo，Norway)，CD4+CD25+Treg细胞分选试剂盒、免疫磁珠分选仪(autoMACS Pro Separator)、MACS buffer、LD及MS MACS分离柱均购自德国Miltenyi Biotec公司。细胞培养试剂：RPMI 1640细胞培养液体、青霉素和链霉素双抗、胎牛血清购自Gibco公司，流式抗体：CD4-FITC,CD25-APC、Foxp3-PE及PE同型对照单克隆抗、固定剂、破膜剂均购自BDPharmigin公司。细胞计数仪为Beck-man coulter(美国)，流式细胞仪购自BD公司(BD FACS Verse-Z6511550198)。
2.一种人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，具体步骤如下：
1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离
抽取肝素抗凝静脉血30ml，取6个15ml管离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5ml，将5ml外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000转/分20℃离心20min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用；
2)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞比例的流式检测
将PBMC调整至1×107/ml，取100ul细胞悬液，向其中加入CD4-FITC，CD25-APC各10ul，混匀，室温避光孵育30min，经PBS洗涤离心后分别加入1ml Fixation/Permeabilization破膜剂，室温避光孵育40min，用破膜缓冲液洗涤2次后，加入10ul Foxp3-PE(同型对照管加入10ul小鼠IgG r1-PE)，避光孵育30min，经破膜缓冲液洗涤2次，用500ul PBS重悬，上流式机检测Treg占CD4+T细胞的百分比；
3)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞MACS分选
上述步骤获得的PBMC进行细胞计数，加PBS洗涤，1200转/分离心后倾上清，以MACS buffer 90ul/每107个细胞重悬，加入CD4+T细胞Biotin-Antibody10ul//每107个细胞，混匀，置于2-8℃孵育5min，加入20ul Anti-Biotin Microbeads/每107个细胞，混匀，2-8℃孵育10min，以MACS buffer将细胞调整至500ul体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为CD4+T细胞(阴选)，将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90ul/每107个细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，在2-8℃孵育15min，加入1-2ml MACS buffer洗涤离心，倾去上清，重悬至500ul，过MS柱，把separator移开，放置1ml MACS buffer于MS柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为CD4+CD25+T细胞(阳选)；
4)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外培养和扩增
起始培养细胞数量为2×105，种于96孔板中，用完全培养液200ul进行培养(RPMI 1640细胞培养液体+10％胎牛血清+青、链霉素双抗100U/ml)，第0天培养液中加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads，细胞与磁珠的比例为1:1-1:2，并加入终浓度为500U/ml的IL2，每3-5天行细胞换液，并且将孔板中的细胞半数转移至另一孔中继续培养，每次换液加入终浓度为200U/ml的IL2继续刺激；分别在扩增培养的第0天、7天、14天、21分别进行细胞计数并检测细胞的活性。取扩增培养第0天及第14天细胞行流式细胞术检测扩增前后细胞纯度、主要表面标记及Foxp3的表达情况；具体步骤同步骤2)。
结果数据用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
3.上述人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法的检测结果如下：
(1)正常人外周血Treg的表达情况
应用流式细胞术检测人外周血CD4+CD25+Foxp+Treg占CD4+T细胞的比例，结果显示：人外周血Treg占外周CD4+T细胞的比例约为7.94±1.86％(9.98，6.5，6.34)(见图1)，与国内外报道的5～10％相一致。
(2)分选后Treg纯度鉴定
使用免疫磁珠法将PBMC进行分选，分选出CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-两群细胞，利用流式细胞术鉴定分选后CD4+CD25+Treg细胞的纯度，如图2所示：经过分选后，CD4+CD25+细胞的比例为96.82±0.41％(97，96.35，97.12)，CD4+CD25+Foxp+Treg细胞的纯度可达95.86±0.65％(96.52，95.23，95.84)。细胞活性检测显示均大于95％。
(3)Treg扩增情况
图3显示为Treg加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads和高浓度IL2与96孔板培养0天、7天、14天时的情况。表1与图4是细胞生长曲线图。可见经过2周扩增，Treg细胞数量可扩增置原来的20倍，经过3周的扩增，Treg细胞扩增置原来40倍。
表1为细胞生长曲线结果数据
| 培养天数 | 0天 | 7天 | 14天 | 21天 |
| 细胞数目 | 2×105 | 9×105 | 3×106 | 8×106 |
(4)扩增前后纯度及表型的变化
如图5所示：经2周扩增后，扩增后细胞Foxp3的表达由扩增前95.86±0.65％稍有下降至93.71±1.3％(92.56，93.45，95.12)，但差别无统计学意义(P＞0.05)。
结果显示正常人外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg水平占CD4+T细胞7.94±1.86％，MASC磁珠分选法能够成功分选出CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞，分选平均纯度达96.82±0.41％，细胞活性大于95％；以CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads联合IL2共同刺激CD4+CD25+Treg细胞进行外扩增培养后，细胞有明显扩增。经2周扩增后，细胞扩增倍数达到原细胞数量的倍，扩增后细胞Foxp3的表达由95.86±0.65％稍有下降至93.71±1.3％，但差别无统计学意义(P＞0.05)。免疫磁珠分选法能够分选出高纯度的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞，体外成功扩增CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞，扩增前后Treg细胞的纯度及表型无明显变化。
在本实验中我们采用免疫磁珠两步法(阴选加阳选)成功分离了人外周血CD4+CD25+Treg细胞，并对其纯度进行了流式鉴定，最终获得的CD4+CD25+Treg细胞纯度达到97％，细胞活性达95％以上。我们的实验结果说明通过目前已成熟的免疫磁珠技术分离Treg是可行的。然而由于Treg细胞在外周血所占的比例非常少，即使成功分离了高纯度的Treg还要对其进行扩增才能进行随后的细胞共培养等实验。目前报道，Treg细胞的激活需要经过T细胞受体(TCR)和辅助信号刺激，在体外对IL2的单独刺激、或加入anti-CD3和anti-CD28联合刺激能使人Treg细胞在体外大量扩增[9]。我们使用CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads联合高浓度IL2体外扩增培养CD4+CD25+Treg细胞，发现Treg细胞能正常增殖，且培养2周后，细胞数量扩增20倍，培养3周后，细胞数量扩张达40倍。流式细胞术鉴定其表型仍为CD4+CD25+Foxp+。
本发明的研究结果显示，健康人外周血中存在一定此例的CD4+CD25+Foxp3+T细胞，约占外周血CD4+T细胞的7+1.25％，这与国内外报道的基本一致。经过分选，纯度高，活性好，这为进一步研究CD4+CD25+的免疫学特征、功能以及临床应用打下了坚实基础。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，其特征在于：具体步骤如下：
1)外周血单个核细胞的分离
抽取肝素抗凝静脉血30ml，取6个15ml管离心管，每管小心加入淋巴细胞分离液5ml，将5ml外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，2000转/分20℃离心20min，收集淋巴细胞层中的淋巴细胞，PBS洗涤2次备用；
2)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞MACS分选
将步骤1)中获得的PBMC进行细胞计数，加PBS洗涤，1200转/分离心后倾上清，以MACS buffer 90ul/每107个细胞重悬，加入CD4+T细胞Biotin-Antibody 10ul/每107个细胞，混匀，置于2-8℃孵育5min，加入20ulAnti-Biotin Microbeads/每107个细胞，混匀，2-8℃孵育10min，以MACS buffer将细胞调整至500ul体积，过LD柱，收集过柱后流下来的细胞悬液为阴选的CD4+T细胞，将细胞洗涤离心后，以MACS buffer 90ul/每107个细胞重悬，加入CD25MicroBeads，混匀，在2-8℃孵育15min，加入1-2ml MACS buffer洗涤离心，倾去上清，重悬至500ul，过MS柱，把分离器移开，放置1ml MACS buffer于MS柱上，迅速将细胞打下，收集流下的为阳选的CD4+CD25+T细胞；
3)CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的体外培养和扩增
起始培养细胞数量为2×105，种于96孔板中，用完全培养液200ul进行培养，第0天培养液中加入CD3/CD28单抗包被的Dynalbeads，细胞与Dynalbeads磁珠的比例为1:1-1:2，并加入终浓度为500U/ml的IL2，每3-5天进行细胞换液，并且将孔板中的细胞半数转移至另一孔中继续培养，每次换液加入终浓度为200U/ml的IL2继续刺激；扩增培养获得人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞。
2.根据权利要求1所述的人外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的分选扩增方法，其特征在于：步骤4)中所述的完全培养液为添加10％胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液体，并加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。
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