CN105242046A - 结核感染Treg/Th17细胞的检测方法 - Google Patents

结核感染Treg/Th17细胞的检测方法 Download PDF

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邓少丽
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Abstract

本发明涉及一种细胞的检测方法，具体涉及一种结核感染Treg/Th17细胞的检测方法；Treg/Th17细胞与感染血液结合并且对结核感染Treg/Th17细胞进行检测；采用本方案的结核感染Treg/Th17细胞的检测方法检测准确。

Description

结核感染Treg/Th17细胞的检测方法
技术领域
本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种结核感染Treg/Th17细胞的检测方法。
背景技术
结核病是威胁人类健康的重大传染病之一，据WHO统计，人群中约1/3的人感染了结核杆菌。在抗结核感染过程中，细胞免疫特别是T细胞免疫在抗结核免疫保护中起着重要作用。在结核抗原和共刺激分子共同作用下，初始CD4+T淋巴细胞可分化为辅助型T细胞(Thelpercell，包括Th1、Th2、Th17)和调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)。Th17细胞(CD4+IL-17+)是一类以产生IL-17为主的T细胞亚群，是重要的促炎类辅助T细胞，在抗结核感染及多种炎症反应中发挥重要作用。Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)是一类特异性表达转录因子Foxp3，是重要的具有免疫抑制功能的T细胞，可通过分泌多种细胞因子(如IL-10、TGF-β等)等发挥免疫抑制功能的作用。Th17细胞和Treg细胞在抗结核感染免疫过程中既相互作用又相互拮抗，Th17细胞有助于机体清除体内的病原体，但过度活化可使炎症反应加重从而引起病理损伤；Treg细胞则可抑制过度的炎症反应和病理损伤，但Treg细胞的过度活化也对T细胞的特异性免疫应答反应产生抑制，从而有碍于机体内病原体的清除。因此，对Th17细胞和Treg细胞在抗结核感染过程中的分化、发育、相互作用等的研究将有助于判断疾病严重程度，为结核病的免疫防治提供理论依据。
发明内容
本发明意在提供一种结核感染Treg/Th17细胞的检测方法。
本方案中的结核感染Treg/Th17细胞的检测方法，包括Treg细胞和Th17细胞的检测，Treg细胞检测包括，取流式细胞检测专用反应管分别加入抗人系列单抗CD45-ECD、CD4-FITC、CD25-PC5和CD127-PE各5ul共计20ul于管底；(2)混匀待测样本后加入50ul样本于管底；(3)室温下避光孵育30分钟→加入溶血剂甲酸625ul，在漩涡混匀器上立即震荡混匀10s钟；(4)再加入265ul溶血终止剂，立即漩涡震荡混匀；(5)室温下1200g离心5分钟；(6)弃上清液，用0.5mlPBS缓冲液重悬细胞；(7)漩涡震荡混匀后上机检测；(8)选择Navios操作菜单中的Treg细胞检测程序；(9)以CD45+CD4+的T淋巴细胞设门；(10)分析Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)的含量；
Th17细胞检测包括，(11)取200ul全血标本，用RPMI1640(不含小牛血清-FBS)1:1等体积稀释；(12)加入流式检测专用管中，依次加入：10ul1ug/mlPMA工作液+8ul50ug/mlIonomycin工作液+6.8ul0.1mg/mlMonensin工作液(或8ul0.5mg/mlBFA工作液)，混匀；(13)37℃，5％CO2培养箱培养4-6小时；(14)依次加入CD3-PC5、CD45-ECD、CD4-FITC抗体各5ul,室温避光孵育15分钟；(15)每管中加入100ulFix&Perm中的ReagentA，室温，避光孵育15分钟；(16)每管中加入3mLPBS，1200g离心5分钟，弃除上清；(17)每管中加入100ulFix&Perm中的ReagentB(即破膜和溶血液)，同时各管中加入相应的IL-17-PE；(18)室温下避光孵育15分钟。每管中加入3mLPBS，1200g离心5分钟，弃除上清；(19)0.5mLPBS重悬细胞，上机检测。
本次研究共纳入研究对象181例，所有研究对象依据临床表现和预先指定的分组标准进行分组，其中结核感染活动期组66例，包括41例初次确诊感染结核的患者和24例治愈后复发的患者，结核潜伏性感染患者57例，健康对照人群58例。
通过分析结核感染不同病程时期患者体内Treg细胞和Th17细胞的表达后发现，活动期组Treg细胞和Th17细胞的比例明显高于在潜伏期组和正常对照组(Treg细胞:9.61±2.26％VS6.31±1.44％和9.61±2.26％VS4.16±1.01％P<0.05；Th17细胞：3.08±0.80％VS1.31±0.50％和3.08±0.80％VS1.15±0.46％P<0.05)，潜伏期组Treg细胞的比例明显高于正常对照组(6.31±1.44％VS4.16±1.01％P<0.05)，但潜伏期组Th17细胞的比例和正常对照组相比无明显差异(1.31±0.50％VS1.15±0.46％P>0.05)。通过研究发现，在结核病潜伏期和活动期患者外周血中，Treg细胞及Th17细胞都表现出明显差异。为进一步研究Treg细胞和Th17细胞在区分结核病活动性感染和潜伏性感染中的临床应用，依据各组中Treg细胞和Th17细胞的表达情况拟合出ROC曲线用以评价各淋巴细胞亚群在区分结核病不同病程中的诊断效益。
附图说明
图1为Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)流式细胞术分析图；
图2为Th17细胞(CD4+IL-17+)流式细胞分析图，其中B2象限为Th17细胞含量；
图3(a)为各组间Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)表达差异，*p<0.05；
图3(b)为各组间Th17细胞(CD4+IL-17+)表达差异，*p<0.05；
图4(a)为Treg细胞用于区分结核感染潜伏期和活动期的ROC曲线，95％CI(0.839—0.938)；
图4(b)为Th17细胞用于区分结核感染潜伏期和活动期的ROC曲线，95％CI(0.684—0.756)。
具体实施方式
本次研究选择2013年12月至2014年7月到本院就诊的结核患者123例，依据临床表现和实验室检查[6-7]将其分为活动期组(66例)和潜伏期组(57例)。活动期组男39例，女26例，年龄16～68岁，平均(36.2±16.8)岁；潜伏期组男28例，女30例，年龄20～65岁，平均(33.2±13.6)岁。活动期组包括初次确诊感染结核的患者和治愈后复发的患者，TSPOT.TB结果和TST结果均为阳性；潜伏期组包括既往感染过结核而目前没有证据表明处于活动期的结核患者，TSPOT.TB结果和/或TST结果为阳性。上述患者诊断均参照中华医学会结核病学分会制定的结核诊断和治疗指南中的标准，并同时排除肝、肾功能严重障碍患者，自身免疫性疾病患者，应用糖皮质激素等免疫抑制剂的患者。选择同期到本院体检的58例健康体检者作为对照组，TSPOT.TB和TST结果均为阴性，其中男27例，女31例，年龄16～76岁，平均(37.7±20.4)岁。
依据病史、实验室检查及结核病诊断标准将纳入的研究人员分为三组：活动期组、潜伏期组和健康对照组。活动期组包括肺结核临床诊断病例和其他结核确诊病例。其中临床诊断病例包括连续3次痰涂片检查结果为阴性，而肺部影像学检查结果提示为活动性肺结核相关，且结核菌素试验(TST)、抗结核抗体检查强阳性，经诊断性治疗后有效且伴有咳嗽、咳痰、咯血等肺结核可疑症状的病例。其他结核确诊病例包括痰涂片抗酸染色检查阳性和或阴性而培养结核杆菌阳性及病变部位病理学诊断为结核杆菌病变的病例。潜伏期组有结核感染的临床症状体征，T-spot检测阳性，但是其他实验室检查以及影像学检查未提示为结核感染者。正常对照组为同期入院患者，无结核感染临床症状体征，T-spot检测和其他实验室检查以及影像学检查均未提示为结核感染者。
实验试剂名称及其来源
名称来源
PBS缓冲液美国Thermo公司
RPMI-1640培养基美国Thermo公司
T-SPOT试剂盒美国OxfordImmunotec公司
DMEM培养基美国Gibco公司
Ficoll淋巴细胞分离液上海鑫乐公司
鼠抗人IL-10ELISA试剂盒上海鑫乐公司
鼠抗人IL-17ELISA试剂盒上海鑫乐公司
细胞因子刺激素佛波酯(PMA)美国eBioscience公司
离子霉素(Ionomycin)美国eBioscience公司
阻断剂Monensin美国eBioscience公司
CD45-ECD美国BeckmanCoulter公司
CD4-FITC美国BeckmanCoulter公司
CD25-PC5美国BeckmanCoulter公司
CD127-PE美国BeckmanCoulter公司
CD3-PC5美国BeckmanCoulter公司
IL-17-PE美国eBioscience公司
破膜剂PerFix-nc美国BeckmanCoulter公司
溶血剂甲酸上海鑫乐公司
溶血终止液(氯化钠)上海鑫乐公司
溶血终止液(硫酸钠)上海鑫乐公司
蒸馏水大坪医院药剂科
AMI-V培养基美国Thermo公司
台盼蓝染液美国Thermo公司
实验仪器及其来源
LBII-4A1生物安全柜新加坡ESCO公司
600A低速离心机北京白洋公司
VS-1300L-U超净工作台苏州安泰公司
普通冰箱BCD-254博西家电公司
HB-100恒温水浴箱杭州博日公司
HF212UVCO2孵箱香港HealForce公司
普通光学显微镜日本Olympus公司
加样枪德国Eppendorf公司
隔水式恒温培养箱上海跃进公司
BP310S电子天平德国Sartorius公司
TYXH-I旋涡混合器上海比郎公司
流式细胞仪(Navios)美国BeckmanCoulter公司
酶标仪WellscanMK3芬兰LeiboCo.Finland公司
全自动洗板机上海中科公司
细胞计数板苏州安泰公司
6孔培养板苏州安泰公司
15ml尖底离心管苏州安泰公司
MDF-382E超低温冰箱日本Panasonic公司
TS-1摇床海门其林贝尔公司
5ml枸橼酸钠抗凝管美国BD公司
5ml静脉采血管促凝管美国BD公司
5mlEDTAK2抗凝管美国BD公司
实验方法
一、T细胞斑点试验(TSPOT.TB)
结核病患者在入院确诊后第2天清晨用枸橼酸钠抗凝管抽取静脉血10mL，健康者在体检当天早晨抽取静脉血10mL。血液样本必须室温保存和当天检测。
(1)分离PBMCs
用RPMI1640培养液等体积和全血样本混匀→按体积比2-3：1轻轻的加在Ficoll淋巴细胞分离液上层，室温下1000g，离心22分钟→用吸液管吸取白色云雾状PBMCs层转移至15ml尖底离心管中，加入RPMI1640培养液至10ml→600g离心7分钟，弃上清用1mlRPMI1640培养液1ml重悬沉淀→再加RPMI1640培养液至10ml，350g离心7分钟→弃上清液加0.7mlAMI-V培养液重悬沉淀。
(2)细胞计数与稀释
要求每个检测孔含有25万个细胞，每个样本检测需要4个孔，每个检测孔都必须加入足够的细胞。取10ul细胞终液加入到40ul台盼蓝染液中混匀→冲池到计数板计数栅格里的细胞数→计算细胞终溶液的浓度→配制每100ul含有25万个细胞的标准溶液500ul。
(3)培养板加样与孵育
从包装袋中取出培养板条，嵌入培养板内恢复至室温→加入50ul细胞培养液至每个空白对照孔→加入50ul抗原A溶液至每个必要的检测孔内→加入50ul抗原B溶液至每个必要的检测孔内→加入50ul植物血凝素溶液至每个细胞功能控制孔中→每个患者样本使用4个检测孔，每个检测孔加入100ul细胞终止液(含25万个活细胞)→37℃，保持湿润的含有5％CO2的培养箱孵育16-20小时。
(4)斑点形成与计数
孵育后取出培养板倒掉培养液→每孔加入PBS缓冲液200ul后摇匀→倒掉PBS缓冲液，重新加入缓冲液200ul后摇匀，重复洗涤3次→→每个反应孔加入50ul的200倍稀释的浓缩标记抗体试剂，2-8℃孵育1小时→弃去标记抗体工作液，用PBS缓冲液重复洗涤3次→每个反应孔加入50ul底物显色溶液室温孵育7分钟→用蒸馏水彻底洗涤培养板终止反应→在通风处干燥培养板→计数每个反应孔内深蓝色清晰的斑点，结果以6个和6个以上确定为有反应。
二、Treg细胞的检测
结核病患者在入院确诊后第2天清晨用EDTA抗凝管抽取静脉血5mL，健康者在体检当天早晨抽取静脉血5mL。血液样本必须室温保存和当天检测。
(1)样本前处理
取流式细胞检测专用反应管分别加入抗人系列单抗CD45-ECD、CD4-FITC、CD25-PC5和CD127-PE各5ul共计20ul于管底→混匀待测样本后加入50ul样本于管底→室温下避光孵育30分钟→加入溶血剂甲酸625ul，在漩涡混匀器上立即震荡混匀10s钟→再加入265ul溶血终止剂，立即漩涡震荡混匀→室温下1200g离心5分钟→弃上清液，用0.5mlPBS缓冲液重悬细胞→漩涡震荡混匀后上机检测。
(2)Treg细胞上机检测
选择Navios操作菜单中的Treg细胞检测程序→以CD45+CD4+的T淋巴细胞设门→分析Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)的含量。
三、Th17细胞的检测
结核病患者在入院确诊后第2天清晨用EDTA抗凝管抽取静脉血5mL，健康者在体检当天早晨抽取静脉血5mL。血液样本必须室温保存和当天检测。
(1)样本前处理
取200ul全血标本，用RPMI1640(不含小牛血清-FBS)1:1等体积稀释→加入流式检测专用管中→依次加入：10ul1ug/mlPMA工作液+8ul50ug/mlIonomycin工作液+6.8ul0.1mg/mlMonensin工作液(或8ul0.5mg/mlBFA工作液)，混匀→37℃，5％CO2培养箱培养4-6小时。(不能超过6个小时)→依次加入CD3-PC5、CD45-ECD、CD4-FITC抗体各5ul,室温避光孵育15分钟→每管中加入100ulFix&Perm中的ReagentA(即固定液)，室温，避光孵育15分钟→每管中加入3mLPBS，1200g离心5分钟，弃除上清。(此时需用剩余的些许PBS轻轻震荡来重悬细胞，以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难)→每管中加入100ulFix&Perm中的ReagentB(即破膜和溶血液)，同时各管中加入相应的IL-17-PE→室温下避光孵育15分钟。每管中加入3mLPBS，1200g离心5分钟，弃除上清→0.5mLPBS重悬细胞，上机检测。
(2)Th17细胞上机检测
选择Navios操作菜单中的Th17细胞检测程序→以CD45+CD3+的T淋巴细胞设门→分析Th17细胞(CD4+IL-17+)的含量。
四、IL-10和和IL-17的检测
结核病患者在入院确诊后第2天清晨用枸橼酸钠抗凝管抽取静脉血5mL，健康者在体检当天早晨抽取静脉血5mL,1200g离心5分钟后收集上清液200ul冻存于-80℃备用。将待测样本和鼠抗人IL-17和IL-10试剂盒恢复至室温→按试剂盒说明书要求稀释标准品并分别设置复孔加样，每个浓度2孔，共计10孔。→加样：分别设置空白对照孔，待测样本孔。在酶标板上先加入样本稀释液40ul，然后再加入10ul样本→37℃恒温水浴箱中封板孵育30分钟→小心揭开封板膜，弃去液体，甩干后每孔加入稀释好的洗涤液。静置30s后弃去。重复3次，拍干→每孔中加入IL-17或IL-10酶标试剂50ul，空白孔除外→用封板膜封板后置于37℃恒温水浴箱中孵育30分钟→小心揭开封板膜，弃去液体，甩干后每孔加入稀释好的洗涤液。静置30s后弃去。重复3次，拍干→显色：每孔中加入50ul显色剂A，再加入50ul显色剂B，轻轻震荡混匀后37℃避光显色15分钟→终止：每孔加入50ul终止液终止反应→立即上酶标仪450nm波长测定吸光度(OD)值。测定需在终止反应后15分钟内进行，以确保结果准确性→依据标准品已知浓度拟合曲线换算出各样本中IL-17或IL-10的含量，报告以pg/ml为单位。
五、统计学分析
计量资料以X±S表示，各组间差异检验根据样本数据方差是否齐性，采用t检验或秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义，通过ROC曲线评价各指标用于区分结核病不同病程的诊断效益，采用SPSS17.0统计分析软件进行统计分析。
研究结果
本次研究共纳入研究对象181例，所有研究对象依据临床表现和预先指定的分组标准进行分组，其中结核感染活动期组66例，包括41例初次确诊感染结核的患者和24例治愈后复发的患者，结核潜伏性感染患者57例，健康对照人群58例。研究人群临床资料统计情况见表1。
表1：研究人群临床资料一览表
Th17细胞和Treg细胞在结核感染不同阶段的表达情况
Th17细胞和Treg细胞在抗结核感染过程中都具有重要作用，因此我们对结核感染不同阶段患者体内外周血单个核细胞中Th17细胞(CD4+IL-17+)和Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)的含量进行了测定，见图1和图2。
图2的Th17细胞(CD4+IL-17+)流式细胞分析图，其中B2象限为Th17细胞含量通过分析结核感染不同病程时期患者体内Treg细胞和Th17细胞的表达后发现，活动期组Treg细胞和Th17细胞的比例明显高于在潜伏期组和正常对照组(Treg细胞:9.61±2.26％VS6.31±1.44％和9.61±2.26％VS4.16±1.01％P<0.05；Th17细胞：3.08±0.80％VS1.31±0.50％和3.08±0.80％VS1.15±0.46％P<0.05)，潜伏期组Treg细胞的比例明显高于正常对照组(6.31±1.44％VS4.16±1.01％P<0.05)，但潜伏期组Th17细胞的比例和正常对照组相比无明显差异(1.31±0.50％VS1.15±0.46％P>0.05)。见图3(a)和图3(b)。
细胞因子IL-10和IL-17在结核感染不同阶段的表达情况
为进一步了解Th17细胞和Treg细胞在结核感染不同阶段的变化情况，我们通过ELISA的方法对其分泌的主要细胞因子IL-10和IL-17也进行了检测。结果发现活动期组IL-10和IL-17的表达明显高于在潜伏期组和正常对照组(P<0.05)，潜伏期组IL-10的表达明显高于正常对照组(P<0.05)，但潜伏期组IL-17的表达和正常对照组无明显差异(P>0.05)。这一变化趋势和Th17细胞和Treg细胞的变化趋势相同，进一步证实了Th17细胞和Treg细胞及其细胞因子IL-10和IL-17在抗结核感染过程中的重要作用。见表2。
表2各组间IL-10及IL-17表达差异
a：P＜0.05，与对照组相比较：
b：P＜0.05，与潜伏期组相比较。
Treg细胞和Th17细胞在区分结核病不同病程中的作用
通过研究发现，在结核病潜伏期和活动期患者外周血中，Treg细胞及Th17细胞都表现出明显差异。为进一步研究Treg细胞和Th17细胞在区分结核病活动性感染和潜伏性感染中的临床应用，依据各组中Treg细胞和Th17细胞的表达情况拟合出ROC曲线用以评价各淋巴细胞亚群在区分结核病不同病程中的诊断效益。Treg细胞及Th17细胞用于区分结核感染潜伏期和活动期ROC曲线见图4(a)和图4(b)。
结论
结核杆菌自发现以来因其顽强的生命力和复杂的免疫机制一直以来未能得到有效的控制，特别是近年来合并HIV感染的结核患者与非典型结核感染患者发病率呈逐年上升趋势，使得结核病有死灰复燃的迹象。CD4+T细胞在抗结核感染细胞免疫中发挥了重要作用，在TGF-β和IL-6等细胞因子共同作用下初始CD4+T细胞可分化为Th17细胞并分泌细胞因子(IL-17、IL-21、IL-23等)促进机体的炎症反应；而在TGF-β单独刺激时则可分化发育为Treg细胞表达FOXP3并分泌细胞因子(IL-10、TGF-β等)抑制机体过度的炎症反应。Th17细胞和Treg细胞在分化发育中相互联系，在免疫功能上又相互拮抗，研究发现多种疾病的发生和进展过程与这两类细胞的数量与功能的异常密切相关。
既往研究发现，活动性肺结核和正常对照相比，免疫抑制性细胞因子IL-10显著升高，Treg细胞比例显著增加，提示结核病的发生与进展与Treg细胞发挥的免疫抑制功能相关。本研究还发现在潜伏性结核感染患者体内IL-10和Treg细胞的表达较正常对照组也有所增加，这可能与机体长期处于结核杆菌刺激状态下导致效应T细胞增殖活化过程受到抑制相关，因此我们推测Treg细胞可作为评估结核患者免疫功能的指标，对区别结核病不同阶段，指导用药及疗效观察等具有指导意义。Th17细胞及其细胞因子IL-17能够增强宿主抵抗力，在多种细菌感染中都发挥着重要作用，IL17联合IL-22还能上调抗菌因子β-防御素等增强对机体对细菌感染的抵抗作用。关于Th17细胞和Treg细胞在结核病中的作用，目前国内外研究报道的结论各不相同，有研究认为Th17细胞的过量表达和结核病的严重程度相关[26]，也有研究发现活动性结核患者Th17细胞的表达受到抑制，本研究发现活动性结核患者体内的Th17细胞数量显著高于潜伏性感染患者和正常对照组，而潜伏性感染和正常对照组间Th17细胞无明显差异，这可能与Treg细胞的免疫抑制作用相关。我们推测结核感染活动期机体固有免疫被激活，同时分泌大量细胞因子刺激Th17细胞增殖进而引起一系列免疫病理损伤；与此同时，Treg细胞发挥免疫抑制功能作用于Th17细胞降低过度炎症反应及机体免疫损伤，但目前还没有直接证据表明Treg细胞能够抑制Th17细胞及IL-17的产生。也有研究报道Th17细胞及分泌的IL-17并不参与机体抗结核的免疫病理损伤，这可能与机体免疫应答能力相关，本研究中我们发现CD4+T细胞绝对值与结核感染不同阶段具有一定相关性，说明机体T细胞免疫应答能力与结核感染的转归具有直接作用。
综上所述，CD4+T细胞的分化发育对机体免疫调节和宿主防御能力的平衡具有重要意义，其中Th17细胞及其细胞因子起到促进炎症和加强免疫反应的作用，而Treg细胞及其细胞因子起到抑制机体过度炎症反应从而发挥免疫抑制作用。本研究通过直接检测外周血中Treg细胞和Th17细胞的含量，能反应机体最真实的免疫状况；也有研究人员通过结核特异性抗原刺激后外周血后再检测，可反应机体免疫应答状况。文中通过Treg细胞和Th17细胞区分结核潜伏期和活动期ROC曲线是基于我们研究初期拟定的结核分组标准而评判的，因此其诊断效益与真实的诊断效益有所差别。
本研究提示可将Treg细胞作为结核病患者免疫功能评估的分子标记，有利于区别结核感染后的不同病程，协同Th17细胞可分析结核病患者免疫功能异常的机制，从而提高结核病免疫防治的效果。

Claims (1)

1.结核感染Treg/Th17细胞的检测方法，其特征在于：用EDTA抗凝管抽取感染静脉血5mL，包括Treg细胞和Th17细胞的检测，Treg细胞检测包括，
(1)取流式细胞检测专用反应管分别加入抗人系列单抗CD45-ECD、CD4-FITC、CD25-PC5和CD127-PE各5ul共计20ul于管底；
(2)混匀待测样本后加入50ul样本于管底；
(3)室温下避光孵育30分钟，加入溶血剂甲酸625ul，在漩涡混匀器上立即震荡混匀10s钟；
(4)再加入265ul溶血终止剂，立即漩涡震荡混匀；
(5)室温下1200g离心5分钟；
(6)弃上清液，用0.5mlPBS缓冲液重悬细胞；
(7)漩涡震荡混匀后上机检测；
(8)选择Navios操作菜单中的Treg细胞检测程序；
(9)以CD45+CD4+的T淋巴细胞设门；
(10)分析Treg细胞(CD4+CD25highCD127low)的含量；
Th17细胞检测包括，
(11)取200ul全血标本，用RPMI1640(不含小牛血清-FBS)1:1等体积稀释；
(12)加入流式检测专用管中，依次加入：10ul1ug/mlPMA工作液+8ul50ug/mlIonomycin工作液+6.8ul0.1mg/mlMonensin工作液(或8ul0.5mg/mlBFA工作液)，混匀；
(13)37℃，5％CO2培养箱培养4-6小时；
(14)依次加入CD3-PC5、CD45-ECD、CD4-FITC抗体各5ul,室温避光孵育15分钟；
(15)每管中加入100ulFix&Perm中的ReagentA，室温，避光孵育15分钟；
(16)每管中加入3mLPBS，1200g离心5分钟，弃除上清；
(17)每管中加入100ulFix&Perm中的ReagentB(即破膜和溶血液)，同时各管中加入相应的IL-17-PE；
(18)室温下避光孵育15分钟。每管中加入3mLPBS，1200g离心5分钟，弃除上清；
(19)0.5mLPBS重悬细胞，上机检测。
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