CN103063837A - 一种检测分枝杆菌感染的试剂、方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测分枝杆菌感染的试剂、方法和试剂盒。试剂中包含SEQIDNO1-7所代表的蛋白、多肽或类似物。方法通过试剂与宿主T细胞相接触，检测确定T细胞是否识别所述蛋白、多肽或类似物，从而判断分枝杆菌感染状态。试剂盒包括上述用于检测分枝杆菌感染试剂。本发明的试剂、检测方法和试剂盒检测的敏感性、特异性高，检测范围广并且制造方便、成本低廉。

Description

一种检测分枝杆菌感染的试剂、方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学检验领域，涉及一种微生物分子生物学检测方法，尤其涉及一种检测结核感染的试剂、方法和试剂盒。

背景技术

结核病是当今一个主要的公共健康问题，它的病原体是结核杆菌，属于分枝杆菌属。全世界每年大约有800-1000万新发结核病例，每年有200-300万人因此而失去生命，结核病是引起成年人死亡的头号传染病。据WHO报道，全球三分之一的人口（约20亿）已感染了结核杆菌，如不采取措施，近10年内还将有约3亿人受结核杆菌感染。据第四次全国流行病学调查显示，我国受结核杆菌感染人数超过4亿，每年有13万人死于结核病，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二。

在全面实施DOTS（直接督导治疗）策略后，中国的结核发病率并没有如预期地出现下降，这与潜在的大量未被诊断的潜伏感染以及痰菌阴性结核病人未被及时诊断有关，这些感染者是一个巨大的结核病源库，DOTS计划只能针对发病的肺结核患者，而对于消灭潜伏感染的病人或者痰菌阴性的症状不典型的患者没有贡献。现在，发达国家已经充分注意到这一现象，在7年前甚至更早已经启动对潜伏感染患者的干预。全球结核控制的一项策略是在高危人群中实施有效的筛查计划，这样可以鉴别出那些有潜伏感染的病人，通过治疗他们来预防结核。而其中最突出的问题是如何准确迅速地发现潜伏感染者和高危人群并加以控制。

目前诊断结核患者中主要采用的方法有：胸部X光片、涂片镜检、培养法、TST皮试等。其中X光片无法早期及时发现；涂片法敏感性特异性差；培养法耗时长，需要4-8周时间；TST皮试实验则特异性差，无法准确区分BCG(卡介苗)接种者和结核病患者。

特异性抗原诊断一直是确认和评估病原体感染及感染状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值，已经在HBV、HCV、HIV等疾病的诊断方面获得了广泛的应用。由于人体在对抗结核杆菌的感染中，细胞免疫起到了关键性的作用，所以寻找结核杆菌特异性的T细胞抗原和检测T细胞免疫反应已经成为今年来研究的热点。国际上已有报道的T-SPOT试剂正是使用结核杆菌的特异性抗原ESAT-6和CFP-10，以Elispot方法诊断结核早期感染(中国专利公开号：1350546)。

但是ESAT-6、Cfp-10这两个抗原属于结核杆菌早期分泌蛋白，在结核持续感染中分泌量减少，导致检测的敏感性不足，局限了该试剂的推广。另一方面有研究显示T-SPOT试剂在发展中国家的效果并不理想，推测可能与发展中国家非结核分枝杆菌感染率高有关。另外T-SPOT试剂价格昂贵，每一人份约合80美金，在发展中国家很难推广。

发明内容

为了解决上述现有技术中的问题，本发明的目的是提供了一种特异性高、能够检测应用范围广且成本低廉的检测结核感染的试剂、方法和试剂盒。

本发明的目的之一是提供一种检测分枝杆菌感染的试剂，所述试剂中包含SEQ ID NO 1-7所代表的蛋白、多肽或类似物中的任何一种或多种。

SEQ ID 1：pagesvlhtwnstvarsgth

SEQ ID 2：pggsatgglrggltgsyspp

SEQ ID 3：elvfdigagegaltahlvra

SEQ ID 4：vgvlrerfpgitvvhadaas

SEQ ID 5：lpgrpfrvvanppygissrl 

SEQ ID 6：tllapnsglvaadlvlqral

SEQ ID 7：maglniyvrrwrtalhatvsalivailglaitpvasaataratlsvtstwqtgfiarftitnsstapltdwklefdlpagesvlhtwnstvarsgthyvlspanwnriiapggsatgglrggltgsysppsscllngqypct

在本发明的较佳实施例中，所述类似物包括类似肽或通过生物素/抗生物素蛋白链菌素系统将多个类似肽的MHC II分子聚合在一起的聚合分子，所述类似肽与SEQ ID NO 1-7所代表的氨基酸序列同源。

本发明的另一目的是提供一种应用上述试剂检测分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1，使权利要求1所述的试剂与宿主T细胞相接触，所述试剂中包含SEQ ID NO 1-7所代表的蛋白、多肽或其类似物中的任何一种或多种；

步骤2，通过测定T细胞与蛋白、多肽或类似物接触后状态是否发生变化，从而确定T细胞是否识别所述蛋白、多肽或类似物：

能够识别所述蛋白、多肽或类似物的，则判定为阳性、感染分支杆菌；

不能识别所述蛋白、多肽或类似物的，则判定为阴性、未感染分支杆菌。

在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤2中的变化包括T细胞开始分泌细胞因子或分泌量增加，T细胞大小、数量(增殖)或表面标志的改变。

如权利要求3所述检测分枝杆菌的方法，其特征在于，所述T细胞可在宿主的外周血液、肺泡灌洗液、胸腔积液、淋巴结、淋巴液及其它包含T细胞组织中检出。

在本发明的另一较佳实施例中，所述T细胞为CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或γδT细胞。

在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤2中包括预先加入抗体与所述细胞因子结合；通过测定抗体或抗体复合物的存在来检测确定所述T细胞开始分泌细胞因子或分泌量增加。

在本发明的另一较佳实施例中，所述细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IP-10、IL-12、TNF-α。

本发明的另一目的是提供一种用于上述方法检测分枝杆菌的试剂盒，包括如权利要求1所述的检测分枝杆菌感染的试剂。

在本发明的另一较佳实施例中，试剂盒还包括真空肝素管、用于ELISA实验检测IFN-γ的工具、包装试剂的包装盒和瓶子；所述工具包括植物血凝集素(PHA)、酶标板、IFN-γ抗体、洗板液、样品稀释液、IgG一抗、酶偶联二抗、显色液和终止液。

本发明的试剂、检测方法和试剂盒检测的敏感性、特异性高，既能够检测活动性的结核患者、又能够检测潜伏性的结核患者和健康人群，检测范围广并且制造方便、成本低廉。

附图说明

图1所示是含SEQ ID NO 1所示的蛋白/多肽的试剂在对宿主检测所得的IFN-γ量的值；

图2所示是含SEQ ID NO 2所示的蛋白/多肽的试剂在对宿主检测所得的IFN-γ量的值；

图3所示是含SEQ ID NO 3所示的蛋白/多肽的试剂在对宿主检测所得的IFN-γ量的值；

图4所示是含SEQ ID NO 4所示的蛋白/多肽的试剂在对宿主检测所得的IFN-γ量的值；

图5所示是含SEQ ID NO 5所示的蛋白/多肽的试剂在对宿主检测所得的IFN-γ量的值；

图6所示是含SEQ ID NO 6所示的蛋白/多肽的试剂在对宿主检测所得的IFN-γ量的值。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明做详细的阐释。

本发明应用于结核杆菌感染。结核杆菌感染通常指的是患有活动性或潜伏性结核杆菌的人群。也可以是健康的接触者，其已暴露于结核杆菌中。因此，本发明也可用于调查健康接触人群受结核感染情况。

本发明的一种检测分枝杆菌感染的试剂中包含SEQ ID NO 1-7所代表的蛋白、多肽或类似物中的任何一种或多种。

本发明的由SEQ ID 1-7代表的氨基酸序列，完整或部分地来自于结核分枝杆菌基因Rv1987，Rv1988所编码的蛋白。并且，本发明中涉及所有氨基酸序列都是从N端到C端的。

本发明中的蛋白和多肽可以是天然分离的，也可以是人工合成的。优选的方法是，由较长的融合蛋白制备或由其他多肽经过物理或化学裂解所产生。

在其他实施方案中，所用的多肽也可由固相甲酰基化合成仪合成。

本发明中的类似物，是指其特性与上述蛋白或多肽相同，包括其同样可以特异性的与T细胞或抗体结合。优选的是该类似物具有相同的形状、大小、柔韧性、电子排布等。

典型的类似物是类似肽。它可与SEQ ID 1-7所代表的氨基酸序列同源。与另一肽同源的肽通常具有至少75%的同源性，优选至少90%、95%的同源性。一般，同源肽的不同来自于氨基酸残基的替换、插入、缺失和修饰。其可发生在序列的N端、C端或其他任何位置上。优选的是类似物可以结合到相同的主要组织相容性复合体（MHC）分子上，且类似物中处于等价位置上的氨基酸与同源肽中的那些是相同的或保守的。

上述的修饰，通常指的是天然的转录后修饰或人工修饰。修饰可提供化学部分的改变，包括氨基、乙酰基、羟基、卤素基团和碳水化合物基团。优选的是氨基酸侧链的修饰，即形成一个或多个非天然氨基酸。

另一种有代表性的类似物是一种通过生物素/抗生物素蛋白链菌素系统将多个结合同源肽或类似肽的主要组织相容性复合体（MHC） II分子聚合在一起的聚合分子。此类似物典型地抑制肽/MHC II类复合物与T细胞受体的结合，或能与此复合物特异的抗体结合。

本发明的一种应用上述试剂检测分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1，使权利要求1所述的试剂与宿主T细胞相接触，所述试剂中包含SEQ ID NO 1-7所代表的蛋白、多肽或其类似物中的任何一种或多种；

步骤2，通过测定T细胞与蛋白、多肽或类似物接触后状态是否发生变化，从而确定T细胞是否识别所述蛋白、多肽或类似物：

能够识别所述蛋白、多肽或类似物的，则判定为阳性、感染分支杆菌；

不能识别所述蛋白、多肽或类似物的，则判定为阴性、未感染分支杆菌。

本发明中的T细胞通常在体内被来自结核杆菌的抗原预先致敏，这些T细胞可在宿主的外周血液、肺泡灌洗液、胸腔积液、淋巴结、淋巴液及其它包含T细胞组织中被检出。并且，T细胞可以是未加工过的，也可以是体外分离的或者是体内的。优选的是采用包含T细胞的、未经分离的外周抗凝全血。

在其他的实施例中，也可使用从血液或其他样本中分离的单核细胞（PBMC），其中包括T细胞和APC。APC是抗原递呈细胞，可将抗原肽递呈给T细胞。APC可以是天然生成的或者是人工APC。典型的APC是在体外新分离的细胞或经过培养的细胞。

优选的一种体内检查以确定T细胞识别蛋白或多肽的方法是通过迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，DTH）的出现来指示肽在体内的识别，例如检查硬化、红斑或水肿等。通常通过体内注射本发明或施给表达本发明的多核苷酸。

此外，本发明中的识别，通常是通过测定T细胞与本发明接触后T细胞状态的变化来确定的。这种变化主要由于MHC/肽复合物与TCR(T细胞受体)特异的结合而诱发的T细胞的激活，可以是T细胞开始分泌细胞因子或分泌量增加，也可以是T细胞大小、数量(增殖)或表面标志的改变。所述T细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IP-10、IL-12、TNF-α等，优选的是检测T细胞因子IFN-γ。

在本发明的一个实施例中，采用预先加入抗体与T细胞分泌的细胞因子相结合，然后通过测定抗体或抗体复合物的存在来检测所述的因子。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是商品化购买的或者使用标准技术制备的。测定细胞因子的方法通常是领域内常用的方法，如体外酶联免疫反应法（Elisa）、酶联免疫斑点试验法（Elispot）、或免疫印迹法（Immunoblotting）等。

在本发明的实施例中，检测的细胞因子是T细胞分泌的IFN-γ。使用的检测系统是体外酶联免疫反应(ELISA)分析。IFN-γ与固定在固相载体上的第一IFN-γ抗体特异结合，然后是用酶联标记第二IFN-γ抗体特异结合一抗复合物。也可使用生物素偶联的第二IFN-γ抗体结合一抗复合物，然后使用酶联的抗生物素蛋白链菌素与生物素特异结合。最后通过酶的显色底物形成有色的溶液，通过吸光度的改变来检测T细胞分泌IFN-γ，同时使用已知浓度的IFN-γ作为标准品进行定量。

在另一个实施例中，使用的检测系统也可是酶联免疫斑点试验(ELISPOT)。

同时，本发明中的检测T细胞与本发明试剂的结合也可以通过FACS（流式细胞仪）仪器来进行。通常在已接触的T细胞的出现频率是10^-3-10^-6，如果被分选细胞的频率高于正常对照值，则可定量确定细胞已接触此抗原。

另外，在检测分枝杆菌的过程中，本发明的蛋白、多肽或类似物与T细胞接触的时间长短可以根据所测定的识别方法有所变化。T细胞与蛋白或多肽一起孵育的典型时间是6小时到5天不等，优选的，在使用全血时是20-24小时，而使用1：5或1：10稀释后的全血时是3-5天，体内检测时是2-3天。加入蛋白或多肽的浓度是0.1-100ug/ml。其中，优选使用10 ug/ml的多肽溶液。

本发明的一种试剂盒，包括一种或多种本发明的蛋白或多肽或类似物其包括真空肝素管。在其他实施例中，还可包括植物血凝集素(PHA)、酶标板、IFN-γ抗体、洗板液、样品稀释液、IgG一抗、酶偶联二抗、显色液、终止液等用于ELISA实验检测IFN-γ的工具，以及用于包装上述试剂的包装盒和瓶子。

试剂盒中的多种蛋白或多肽可以是单独使用，也可以混合、连续使用，以提高检测的敏感性。试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照所选用的抗原对绝大多数个体的T细胞均能产生应答，如市售的PHA(植物血凝素)。阴性对照通常不加入抗原成分，选用培养基或其他缓冲液。

以下将结合具体实施例对本发明的蛋白/多肽试剂、方法做详细说明，具体实施例是在本发明的试剂盒中进行的。

实施例1

从外周全血检测IFN-γ的分泌：

1)      采取肝素抗凝静脉血至采血管中；

2)      加入本发明的多肽/蛋白溶液至终浓度为10 ug/ml，盖上盖子，37度培养箱培养24小时，选用5 ug/ml 植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）作为阳性对照和培养基作为阴性对照；

3)      取出室温下3000rpm离心10min，吸取上清液。

使用ELISA方法进行IFN-γ的定量：

1．包被：IFN-γ抗体溶解于包被缓冲液中，加入96孔酶标板中（Nunc），100 ul/孔，4℃过夜；

2．洗板：洗涤液200 ul/孔，洗2次；

3．封闭：封闭液，300ul/孔，室温孵育2h；

4．洗板：洗涤液300 ul/孔，洗3次；

5．加入全血培养上清液：加入稀释后的一抗100 ul/孔，室温孵育1h；

6．洗板：洗涤液300 ul/孔，洗5次；

7．加酶标二抗：新鲜稀释的辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，HRP)标记抗体100ul/孔，室温孵育1h；

8．洗板：洗涤液300 ul/孔，洗5次；

9．显色：新鲜配置的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色液，100 ul/孔，室温，5-10min；

10．终止：2M H₂SO₄，50 ul/孔；

11．测定：酶标仪检测450nm，以第一个空白磷酸盐缓冲液（PBS）对照孔调零后测各孔OD值。

统计和判定方法：

如图1至6中所示，本发明的包含SEQ ID NO 1-7所示的蛋白/多肽的试剂在对宿主检测所得的IFN-γ量的值。其中，黑色三角和圆点显示的是结核感染（TB）组，方块点显示的健康人（Control）对照组；纵坐标显示的是IFN-γ量。

以对照组为研究对照，抗原孔减去阴性对照孔的IFN-γ量进行接受者操作特性曲线分析(ROC)，选择最优值作为判定结核感染的阈值。在本实施例中，经过计算，阈值为12.5 pg/ml，若抗原孔减去阴性对照孔的IFN-γ量大于阈值且大于阴性对照孔的IFN-γ量，即判断为阳性、感染结核分枝杆菌；反之为阴性、未感染结核分枝杆菌。

利用SPSS（Statistics Package for Social Science）对两组之间进行统计分析，采用非配对分组t-检验（independent group t-test）进行组别间差别的显著性测定，若P<0.05，为样品间存在显著性差异。

结核感染组和对照组是从2010年起在复旦大学附属华山医院组织招募的。从受测者中抽取的血液样品经过肝素或EDTA抗凝处理。结核患者为：临床结核分枝杆菌培养阳性，临床检查与X射线检查结果相符，且接受治疗的时程少于三周。对照组为不明原因发热待查病人，后明确诊断排除结核感染的病例，HIV检测为阴性。

蛋白/多肽的临床验证结果：

结果如表1中所示，结核感染者对抗原的应答率显著高于对照组。而对照组对抗原蛋白产生阳性应答较低，特异性均大于95%。

表1：两组人群全血对多肽/蛋白的应答结果

实施例2

从外周血中分离单核细胞(PBMC)：

4)      采取静脉血5ml至10ml至采血管中；

5)      将采血管室温下3000rpm离心10min，吸取中间层白色细胞，重悬于8ml细胞培养基RPMI1640(购于Gibco公司)中；

6)      在15ml离心管中加入4ml Ficoll(购于Amresco公司)淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液轻轻加入淋巴细胞分离液上层。3000rpm室温离心20min；

7)      吸取离心后的中间层细胞于新离心管中，加入RPMI1640重悬，混匀，2000rpm离心5min；

8)      弃上清，加入5ml红细胞裂解液(购于Invitrogen公司)，室温孵育10min。

9)      加入RPMI1640重悬，混匀，2000rpm离心5min，弃上清；

10)  重悬细胞于1ml AIV-M培养基中(购于Gibco)，取细胞与typan blue（台盼蓝） 1：1混合，加入血细胞计数板进行计数；

11)  根据计数结果，用培养基稀释细胞。

用ELISPOT方法检测IFN-γ的分泌：

1)      在96孔PVDF板( 购于Millipore公司)上使用10ug/ml IFN-γ mAB预包被过夜；

2)      用培养基RPMI 1640洗涤2遍，使用RPMI 1640+10% FBS(胎牛血清) 4℃封闭1小时；

3)      每孔中加入100ul浓度为5×10⁵个/ml的PBMC细胞。实验组中分别将蛋白或多肽分别加入孔中，终浓度为10ug/ml；阳性对照孔中加入终浓度为5ug/ml的PHA；阴性对照孔中加入100ul AIV-M；

4)      37℃、5% CO2培养箱中孵育22小时；

5)      弃细胞液，用含0.05% Tween20 PBS洗涤平板5次，每次250ul/孔；

6)      加入100ul 1ug/ml的生物素化抗IFN-γ Mab(单克隆抗体)，室温孵育2小时；

7)      再用含0.05% Tween20 PBS缓冲液洗板5次，加入1:1000的抗生物素蛋白酶链素-辣根过氧化物酶偶联物，37℃孵育1小时；

8)      再用PBS缓冲液洗板5次，甩干；

9)      最后加入HRP底物溶液50ul/孔，室温下静置反应5-25min。蒸馏水洗涤2遍，晾干；

10)  显微镜下计斑点数，精确的斑点阅读与计数建议采用计算机辅助成像分析系统进行。

结果判定：

阳性结果：斑点数≥6个，且大于2倍阴性对照孔斑点数。

阴性结果：斑点数≤6个，或小于2倍阴性对照孔斑点数。

通常，在精确计数前用肉眼或放大镜观察，可通过斑点数直接判断阳性或阴性结果。阳性即为感染结核分枝杆菌；阴性即为未感染结核分枝杆菌。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  复旦大学附属华山医院

 

<120>  一种检测分枝杆菌感染的试剂、方法和试剂盒

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  PRT

<213>  结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

 

<400>  1

 

Pro Ala Gly Glu Ser Val Leu His Thr Trp Asn Ser Thr Val Ala Arg

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Gly Thr His

            20 

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  PRT

<213>  结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

 

<400>  2

 

Pro Gly Gly Ser Ala Thr Gly Gly Leu Arg Gly Gly Leu Thr Gly Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Tyr Ser Pro Pro

            20 

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  PRT

<213>  结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

 

<400>  3

 

Glu Leu Val Phe Asp Ile Gly Ala Gly Glu Gly Ala Leu Thr Ala His

1               5                   10                  15     

 

 

Leu Val Arg Ala

            20 

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  PRT

<213>  结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

 

<400>  4

 

Val Gly Val Leu Arg Glu Arg Phe Pro Gly Ile Thr Val Val His Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Asp Ala Ala Ser

            20 

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  PRT

<213>  结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

 

<400>  5

 

Leu Pro Gly Arg Pro Phe Arg Val Val Ala Asn Pro Pro Tyr Gly Ile

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Arg Leu

            20 

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  PRT

<213>  结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

 

<400>  6

 

Thr Leu Leu Ala Pro Asn Ser Gly Leu Val Ala Ala Asp Leu Val Leu

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Arg Ala Leu

            20 

 

 

<210>  7

<211>  142

<212>  PRT

<213>  结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）

 

<400>  7

 

Met Ala Gly Leu Asn Ile Tyr Val Arg Arg Trp Arg Thr Ala Leu His

1               5                   10                  15     

 

 

Ala Thr Val Ser Ala Leu Ile Val Ala Ile Leu Gly Leu Ala Ile Thr

            20                  25                  30         

 

 

Pro Val Ala Ser Ala Ala Thr Ala Arg Ala Thr Leu Ser Val Thr Ser

        35                  40                  45             

 

 

Thr Trp Gln Thr Gly Phe Ile Ala Arg Phe Thr Ile Thr Asn Ser Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Thr Ala Pro Leu Thr Asp Trp Lys Leu Glu Phe Asp Leu Pro Ala Gly

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Ser Val Leu His Thr Trp Asn Ser Thr Val Ala Arg Ser Gly Thr

                85                  90                  95     

 

 

His Tyr Val Leu Ser Pro Ala Asn Trp Asn Arg Ile Ile Ala Pro Gly

            100                 105                 110        

 

 

Gly Ser Ala Thr Gly Gly Leu Arg Gly Gly Leu Thr Gly Ser Tyr Ser

        115                 120                 125            

 

 

Pro Pro Ser Ser Cys Leu Leu Asn Gly Gln Tyr Pro Cys Thr

    130                 135                 140        

Claims (10)

1.一种检测分枝杆菌感染的试剂，其特征在于，所述试剂中包含SEQ ID NO 1-7所代表的蛋白、多肽或类似物中的任何一种或多种。

2.如权利要求1所述的检测分枝杆菌感染的试剂，其特征在于，所述类似物包括类似肽或通过生物素/抗生物素蛋白链菌素系统将多个类似肽的MHC II分子聚合在一起的聚合分子，所述类似肽与SEQ ID NO 1-7所代表的氨基酸序列同源。

3.一种应用如权利要求1所述的试剂检测分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，使权利要求1所述的试剂与宿主T细胞相接触，所述试剂中包含SEQ ID NO 1-7所代表的蛋白、多肽或其类似物中的任何一种或多种；

步骤2，通过测定T细胞与蛋白、多肽或类似物接触后状态是否发生变化，从而确定T细胞是否识别所述蛋白、多肽或类似物，

能够识别所述蛋白、多肽或类似物的，则判定为阳性、感染分支杆菌；

不能识别所述蛋白、多肽或类似物的，则判定为阴性、未感染分支杆菌。

4.如权利要求3所述检测分枝杆菌的方法，其特征在于，所述步骤2中的变化包括T细胞开始分泌细胞因子或分泌量增加，T细胞大小、数量(增殖)或表面标志的改变。

5.如权利要求3所述检测分枝杆菌的方法，其特征在于，所述T细胞可在宿主的外周血液、肺泡灌洗液、胸腔积液、淋巴结、淋巴液及其它包含T细胞组织中检出。

6.如权利要求5所述检测分枝杆菌的方法，其特征在于，所述T细胞为CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或γδT细胞。

7.如权利要求4所述检测分枝杆菌的方法，其特征在于，所述步骤2中包括预先加入抗体与所述细胞因子结合；通过测定抗体或抗体复合物的存在来检测确定所述T细胞开始分泌细胞因子或分泌量增加。

8.如权利要求4或7所述检测分枝杆菌的方法，其特征在于，所述细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IP-10、IL-12、TNF-α。

9.一种用于如权利要求3所述方法检测分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的检测分枝杆菌感染的试剂。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括真空肝素管、用于ELISA实验检测IFN-γ的工具、包装试剂的包装盒和瓶子；所述工具包括植物血凝集素(PHA)、酶标板、IFN-γ抗体、洗板液、样品稀释液、IgG一抗、酶偶联二抗、显色液和终止液。

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