CN105866406A - 鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法 - Google Patents

鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法，包括以下步骤：利用结核分枝杆菌特异性的抗原和分枝杆菌属特异性抗原分别与待测的离体T细胞接触，并检测该T细胞释放的细胞因子；将所述结核分枝杆菌特异性的抗原和分枝杆菌属特异性抗原检测结果进行比较，根据比较结果判断所述待测的离体T细胞为结核分枝杆菌感染或非结核分枝杆菌感染。本发明的方法，利用分枝杆菌属特异性抗原，结合MTB特异性的检测的ELISPOT检测法，可以同时鉴定MTB和NTM感染。对医生的临床诊断及用药具有重要的指导意义。

Description

鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法
技术领域
本发明属于生物医学检验领域，涉及细胞免疫学检验方法，具体地说，涉及一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法。
背景技术
结核病(tuberculosis,TB)是全世界范围内最普遍的慢性传染性疾病之一，主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起，此外其它分枝杆菌尤其是非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)感染所致大约占临床病例的5％～15％，后者在艾滋病合并结核时比例更高。据统计，全球大约有1/3人口感染了Mtb，其中5％～10％的感染者为结核病患者，每年约有800万～900万新发活动性肺结核病例，200万～300万因结核病而死亡。
非结核分枝杆菌(NTM)是分支杆菌属内除MTB和麻风分支杆菌以外的其他结核分支杆菌。迄今共发现154中NTM和13个亚种，仅少部分对人体治病。引起NTM病的常见菌种为鸟—胞内分枝杆菌复合体(Mycobacterium avium complex或Mycobacteriumavium-intracellulare complex，MAC)，感染患者多见慢性呼吸系统症状，与肺结核相同，其临床表现容易与MTB感染引起的肺结核病混淆，不易鉴别。而大多数NTM对常用的抗MTB药物均耐药，为此，在临床中结核病治疗前，对MTB和NTM感染的区分和鉴定十分重要。传统方法鉴别NTM时，需要使用分离培养基培养出分枝杆菌菌株后，再利用分子生物学的方法进行鉴定，这样的方法耗时长，且对检测器材要求较高，不利于临床使用。
因此，我们缺乏一种可以快速诊断MTB或NTM感染引起的结核病的有效方法。
此外，MTB感染率很高，发病率相对较低，但结核潜伏感染(latent tuberculosisinfection,LTBI)者在机体免疫功能降低或其他情况下可转变为结核病患者，且在很大程度上与活动性结核病患者一起成为结核病危险的传染源。LTBI是结核菌感染后的一种亚临床状态，无临床症状、细菌学及放射检查常阴性、结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test,TST)即纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)试验可呈现阳性。但由于PPD试验不能鉴别自然感染与卡介苗(BCG)接种，其结果可导致MTB感染率调查结果偏高，因此迫切需要研究开发更为特异、可靠的检测方法和试剂。
酶联免疫斑点测定(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)是近年新建立的一种细胞免疫学检测方法，其基本原理是在ELISA方法基础上建立，可在体外检测抗原(多肽)特异性免疫细胞释放细胞因子(如γ-干扰素等)，是一种基于抗原特异性细胞免疫反应的新型免疫检测技术，已被证明在结核(包括菌阳与菌阴肺结核、肺外结核)诊断、LTBI检测、治疗效果监测等方面有潜在的应用价值。有研究显示该技术不受BCG接种影响，与PPD试验相比具有更高的特异性、能显著提高艾滋病合并结核的检测率。目前，在国外，基于ELISPOT原理、商业化的T-SPOT.TB(Oxford Immunotec,Abingdon,UK)，基于ELISA原理的QuantiFERONTB1Gold(QFT-G)与QuantiFERON-TB1Gold In-tube(QFT-IT)(Cellestis,Carnegie,Victoria,Australia)的结核γ干扰素释放试验已被多个国家批准使用，在许多欧美国家已被列入LTBI和结核接触者检测指南中；但由于价格较贵而限制了在我国广泛使用，且有数据显示对中国人群的检测有相对较低的敏感性，有研究提示这可能与人群对不同多肽片段的反应表现出一定的种族差异有关；同时，我国研究的几款ELISPOT试剂中的结核多肽多数不是自主研发的。此外，上述所有试剂都是针对MTB感染检测，尚无MTB与NTM感染同时并鉴别检测的ELISPOT报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的问题，本发明提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法。
本发明所采用的技术方案为：
鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法，包括以下步骤：
利用结核分枝杆菌特异性的抗原和分枝杆菌属特异性抗原分别与待测的离体T细胞接触，并检测该T细胞释放的细胞因子；
将所述结核分枝杆菌特异性的抗原和分枝杆菌属特异性抗原检测结果进行比较，根据比较结果判断所述待测的离体T细胞为结核分枝杆菌感染或非结核分枝杆菌感染。
进一步地，如果所述结核分枝杆菌特异性的抗原和分枝杆菌属特异性抗原检测均呈阳性，则所述待测的离体T细胞为结核分枝杆菌感染；如果如果所述结核分枝杆菌特异性的抗原检测结果呈阴性而所述分枝杆菌属特异性抗原检测结果呈阳性，则所述待测的离体T细胞为非结核分枝杆菌感染。
进一步地，所述结核分枝杆菌特异性的抗原包括多肽E6、E7、C14中的一种或几种。
进一步地，所述检测方法利用ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色、四聚体染色、Immunoblotting、T细胞增殖实验中的一种或几种方法，检测所述T细胞释放的细胞因子。
进一步地，所述检测方法利用IFN-γ抗体为识别工具，检测所述T细胞释放的细胞因子。
进一步地，所述T细胞来源于血液、肺泡灌洗液、胸水、脑脊液、淋巴结。
本发明的有益效果为：
本发明的方法，利用分枝杆菌属特异性抗原，结合MTB特异性的检测的ELISPOT检测法，可以同时鉴定MTB和NTM感染，对医生的临床诊断及用药具有重要的指导意义。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为本发明的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的试剂盒检测孔及对照孔设置、结果示意图，其中，检测1设置MTB特异性E6+E7+C14混合多肽；检测2设置分枝杆菌属特异性混合多肽；对照1：为阳性(PMA+Inomycin)对照；对照2：阴性对照；T1和T2分别为平行对照的T-SPOT.TB。
具体实施方式
【实施例1】本实施例包括一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的试剂盒
请参照图1，本试剂盒包括检测孔、对照孔和平行对照孔，其中的检测试剂设置为：
检测1：MTB特异性E6+E7+C14混合多肽
检测2：分枝杆菌属特异性混合多肽；
对照1：阳性对照：PMA+Inomycin)；
对照2：阴性对照：不加多肽；
T1和T2分别为平行对照的T-SPOT.TB检测。
检测步骤如下：
1结核病人分离单核细胞(PBMC)分离用Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC，PBMC重悬于R10培养液(RPMI1640培养液中含10％小牛血清)备用。
2ELISPOT分析选择带PVDF膜96孔板作为反应板，用抗人γ-干扰素(IFNγ)单克隆抗体(mAb)包被过夜，第二天加入5×105PBMC和相应检测试剂。第三天，依次加入生物素标记抗人IFNγmAb，链霉亲合素-碱性磷酸酶作反应,BCIP/NBT显色。结果在ELISPOTReader上读取。以SFC(Spot-forming cells)/106PBMC＞50作为判断为阳性。
结果判断：
1)检测1(+)、检测2(+)：MTB感染；
2)检测1(-)、检测2(+)：NTM感染；
3)检测1(-)、检测2(-)：无分枝杆菌感染。
【实施例2】检测结果
实验室进行小量肺结核患者(共273例，包括有菌种鉴定结果92例和仅痰涂阳性85例合计菌阳患者187例，以及痰涂与痰培养均阴性的菌阴患者86例)外周血试验检测，结果如表1和表2所示。
表1 85例MTB与7例NTM感染性菌阳肺结核患者外周血ELISPOT检测结果
表2 95例痰涂阳性(菌阳)肺结核与86例菌阴肺结核患者外周血ELISPOT检测结果
以上结果提示，无论是菌阳还是菌阴肺结核均有一些比例的NTM感染所致。因此，无论是结核病(菌阳与菌阴肺结核、肺外结核等)患者，还是LTBI者，若用常规的ELISPOT试剂盒检测，可能会丢失、降低一部分感染检测的阳性率；而本发明或许在一定程度上可以弥补这方面的不足。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (6)

1.鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染的检测方法，包括以下步骤：
利用结核分枝杆菌特异性的抗原和分枝杆菌属特异性抗原分别与待测的离体T细胞接触，
并检测该离体T细胞释放的细胞因子；
将所述结核分枝杆菌特异性的抗原和分枝杆菌属特异性抗原检测结果进行比较，根据比较结果判断所述待测的离体T细胞为结核分枝杆菌感染或非结核分枝杆菌感染。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，如果所述结核分枝杆菌特异性的抗原和分枝杆菌属特异性抗原检测均呈阳性，则所述待测的离体T细胞为结核分枝杆菌感染；如果如果所述结核分枝杆菌特异性的抗原检测结果呈阴性而所述分枝杆菌属特异性抗原检测结果呈阳性，则所述待测的离体T细胞为非结核分枝杆菌感染。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌特异性的抗原包括多肽E6、E7、C14中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，利用ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色、四聚体染色、Immunoblotting、T细胞增殖实验中的一种或几种方法，检测所述T细胞释放的细胞因子。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，利用IFN-γ抗体为识别工具，检测所述T细胞释放的细胞因子。
6.根据权利要求1-5所述的检测方法，所述T细胞来源于血液、肺泡灌洗液、胸水、脑脊液、淋巴结。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2019234196A1 (en) * 2018-06-06 2019-12-12 Fundació Institut D'investigació En Ciències De La Salut Germans Trias I Pujol In vitro method for the diagnosis or detection of non-tuberculous mycobacteria

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