CN111621477B

CN111621477B - 一种t细胞分选方法

Info

Publication number: CN111621477B
Application number: CN202010448480.3A
Authority: CN
Inventors: 吕璐璐; 石琳; 谢志明; 杨晓燕; 靳霞; 田皞靓; 孟欢
Original assignee: Heyuan Biotechnology Tianjin Co ltd
Current assignee: Heyuan Biotechnology Tianjin Co ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: WO2021238924A1; CN111621477A

Abstract

本申请涉及一种T细胞的分选方法，其包括以下的步骤：a)使待分选的细胞与分选磁珠混合；其中所述分选磁珠包含磁珠颗粒和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包含牛血清蛋白，且不包含叠氮钠；所述分选磁珠结合CD4或CD8，其中结合CD4的所述分选磁珠和/或结合CD8的所述分选磁珠的用量为每1.25μL‑5μL所述分选磁珠混合每10⁷个所述待分选细胞；b)分选得到T细胞。

Description

一种T细胞分选方法

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种T细胞分选方法。

背景技术

T细胞作为免疫细胞中重要的组成部分，是一类十分复杂的不均一体，其不断在体内更新，在同一时间可以存在不同发育阶段或共能的亚群。T细胞通过自身或与其他免疫细胞的相互协调，在识别抗原、产生免疫应答、维持机体生理平衡等方面发挥着重要作用。近几年来，以T细胞为基础的细胞免疫治疗发展迅速，作为一项新的治疗手段，在临床上相对于传统疗法发挥了其独特优势。例如，在抗肿瘤领域，基于T细胞及其的过继性细胞疗法(ACT)越来越多的显示出良好的治疗效果。过继性细胞疗法是指依赖在体外刺激和扩增的自体或者异体淋巴细胞(例如T细胞，CAR-T细胞等)回输到人体中，以达到抗肿瘤的效果。而及时并成功制备和输注自体或异体的T细胞或CAR-T细胞是实施有效CAR T细胞疗法的障碍。

目前已有多种自生物组织中分离获得T细胞的方法，例如，免疫磁珠分离方法或者流式细胞分离方法等。流式细胞分离法通常对细胞损伤较大，并且可能会对分选出来的细胞造成污染，影响后续操作；而免疫磁珠分离方法也存在分选得率低，细胞纯度不够高，或者生物安全性低的问题。因此，需要开发更高效的T细胞分选方法。

发明内容

本申请提供了一种利用能够结合CD4或CD8的磁珠和小型细胞分选装置分离获取T细胞的方法，所述分选磁珠的用量为每1.25μL-5μL所述分选磁珠混合每10⁷个所述待分选细胞，所述磁珠缓冲液中不含有叠氮钠，该方法具有至少如下技术效果：

1)获取的T细胞纯度高，通过细胞计数具有90％以上的细胞纯度；

2)T细胞分选得率高，通过细胞计数具有50％以上的细胞得率；

3)所用试剂中不含有叠氮钠，对细胞损伤小，具有良好的生物安全性。

本申请提供了一种T细胞的分选方法，其包括以下的步骤：

a)使待分选的细胞与分选磁珠混合；

其中所述分选磁珠包含磁珠颗粒和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包含牛血清蛋白，且不包含叠氮钠；

所述分选磁珠结合CD4或CD8，其中结合CD4的所述分选磁珠和/或结合CD8的所述分选磁珠的用量为每1.25μL-5μL所述分选磁珠混合每10⁷个所述待分选细胞；

b)分选得到T细胞。

在某些实施方式中，所述待分选的细胞包括PBMC细胞。

在某些实施方式中，每2.5μL结合CD4的所述分选磁珠和每2.5μL结合CD8的所述分选磁珠与每10⁷个所述待分选细胞混合。

在某些实施方式中，所述牛血清蛋白的含量为0.01-0.5wt％。

在某些实施方式中，所述磁珠颗粒的粒径为40nm-5μm。

在某些实施方式中，所述分选磁珠的密度为每毫升分选磁珠可分选10⁹～10¹¹个T细胞。

在某些实施方式中，所述分选包括磁场分选。

在某些实施方式中，所述分选包括使用小型细胞分选装置分选。

在某些实施方式中，所述小型细胞分选装置包括分选柱。

在某些实施方式中，所述分选包括在所述磁场分选之前进行离心。

在某些实施方式中，所述分选包括在所述磁场分选之后进行离心。

在某些实施方式中，所述分选包括在所述磁场分选之后洗脱。

在某些实施方式中，所述待分选细胞的分选得率为45％以上。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“磁珠”通常是是指可以用本领域技术人员熟知的方法制备的磁性固体珠形颗粒。例如，胶体珠、微球、纳米颗粒等。用于生成这样的磁珠的方法是该领域众所周知的。该磁珠可以是处于溶液或悬浮液中，或者使用之前处于冻干的状态。冻干的磁珠可以在与样品接触之前使用适当的缓冲液中处理。例如，所述颗粒的直径尺寸可以为最小20nm和最大1400nm；例如，所述颗粒具有50至100nm直径的尺寸。例如，可以有至少一种抗原识别部分与所述磁珠偶联，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述磁珠能够特异性结合对应细胞成分特异性的至少一种抗原。所述磁珠可以包括例如，铁磁性颗粒、超顺磁性颗粒和顺磁性颗粒等。“铁磁性”材料通常是指能在移除磁场时保持磁性特性的物质。“顺磁性”材料通常是指只具有弱的磁化率，并且当磁场被移除时很快失去其弱磁性。“超顺磁性”材料是通常是指高度磁敏感的，或者说，当它们被放置在磁场中时成为强磁性的，但是像顺磁材料那样，磁场被移除时迅速地失去其磁性。

在本申请中，术语“分选”通常是指将某种目标细胞(例如T细胞)自混合物(例如血液、淋巴、PBMC等)中分离出来的过程。其不必是100％分离，例如可以是混合物中40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或以上的目标细胞的分离；分离获得的目标细胞也不必是100％纯的，例如可以是基本纯的，例如可以是70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或以上细胞纯度。

在本申请中，术语“小型细胞分选装置”通常是指能够通过磁场将带有磁性标记(例如本申请的葡聚糖铁珠)的细胞(例如本申请的CD4或CD8细胞)与非磁性细胞分离的设备。例如，所述小型细胞分选装置可以包括分选柱和分选管、管架、磁性分离器。例如，所述分选柱可以包括Miltenyi Biotec市售所得的MS柱、LS柱、XS柱、CliniMACS Tubing SetsTS and LS，所述管架可以包括Miltenyi Biotec市售所得的丙烯酸管架所述磁性分离器可以包括MidiMACS^TM分离器，QuadroMACS^TM分离器，VarioMACS^TM分离器，SuperMACS^TMII分离器，或者MultiMACS^TMCell24分离器Plus。

在本申请中，术语“CD4”通常是指CD4受体，全称“表面抗原分化簇4受体”(Clusterof Differentiation 4receptors)。在生物医药领域，CD4是免疫细胞(例如:辅助T细胞、单核球、巨噬细胞和树突细胞)表面的糖蛋白分子。其被发现于1970年代晚期，在1984年以前被称为leu-3和T4。通常，CD4受体是辅助T细胞的表面标记(surface markers)之一，也是辅助T细胞行使其功能的重要受体。当抗原呈递细胞(例如是巨噬细胞、树突细胞及B细胞本身)将外来病菌分解，把抗原与主要组织相容性复合体结合后，呈递给辅助T细胞(即与辅助T细胞表面的CD4受体结合)。

在本申请中，术语“CD8”通常是指CD8(分化簇8)受体，是指一种作为T细胞受体(TCR)的共受体的跨膜糖蛋白。通常情况下，与TCR一样，CD8与主要的组织相容性复合体(MHC)分子结合，但对MHC I类蛋白具有特异性。CD8有两种亚型，即α和β，分别由不同的基因编码。在人类中，这两个基因都位于2号染色体的2p12位。CD8主要在细胞毒性T细胞的表面表达，但也可以在自然杀伤细胞，皮质胸腺细胞和树突状细胞中发现。CD8分子可以作为细胞毒性T细胞群体的标志物。

在本申请中，术语“PBMC”通常是指外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC，是指任何拥有圆形或近圆形细胞核的外周血细胞。这些细胞可以包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞，而红血球和血小板由于没有细胞核不属于此类；而粒细胞(包括中性粒细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)拥有多叶的核，也不属于此类。在某些实施方式中，可以使用ficoll(一种可分离血液层的亲水性多糖)和梯度离心从全血中提取PBMC。例如，将血液分离成血浆上层，然后是一层PBMC和一层多形核细胞(如中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞的底部部分。

在本申请中，术语“T细胞”通常是指胸腺衍生的细胞，其参与各种细胞介导的免疫反应。例如所述T细胞可以包括：辅助性T细胞(Helper T cells,Th)，所述辅助性T细胞T细胞能够协助体液免疫和细胞免疫；细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells,Tc)，所述细胞毒性T细胞能够杀伤靶细胞。例如，所述T细胞可以具有细胞表面标志CD8。例如，所述T细胞可以具有细胞表面标志CD4。

发明详述

一方面，本申请提供了一种T细胞的分选方法，其包括以下的步骤：

a)使待分选的细胞与分选磁珠混合；

b)分选得到T细胞。

例如，所述待分选的细胞可以包括呈不同量的不同表型或亚群的细胞悬浮液或混合物，例如在全血、外周血、白细胞分离法(leukapheresis)、血沉棕黄层、脐带血和骨髓中的细胞。例如，所述待分选的细胞包括PBMC细胞。

例如，所述待分选的细胞可以包含红细胞、血小板和白细胞，如T细胞、调节性T细胞、B-细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞，粒细胞和/或造血干细胞。

例如，所述磁珠颗粒的粒径可以为40nm-5μm。例如，所述磁珠颗粒的粒径可以为40nm-60nm、40nm-70nm、40nm-80nm、40nm-90nm、40nm-100nm、50nm-100nm、3μm-5μm。例如，所述磁珠颗粒的粒径可以为50nm、3.5μm、4.5μm。

例如，所述磁珠颗粒可以包括铁磁、超顺磁、或顺磁固相，例如胶体颗粒、微球、纳米颗粒。所述颗粒可在缓冲液中或呈冻干状态使用。

例如，所述磁珠颗粒的磁性取决于所述颗粒中的铁含量，其可以如磁铁矿、或磁赤铁矿等氧化铁的形式存在。

例如，所述磁珠颗粒可以含有例如每颗粒0.5pg-500pg、每颗粒lpg-50pg的铁。例如所述磁珠颗粒可包括MACSiBead颗粒，其可以通过例如标准磁铁，例如MACSiMAG分离器(Miltenyi Biotec)而被保留。例如，具有3.5μm直径的MACSiBeads颗粒可含有干重3％-10％w/w的铁。

例如，所述磁珠颗粒可以含有例如每颗粒0.lfg至50fg、每颗粒0.lfg至10fg的铁。例如所述磁珠颗粒可包括MicroBead颗粒，其可以通过例如标准磁铁与分选柱的组合而被保留，例如QuadroMACS^TM分离器与可以从Miltenyi Biotec获得的LS柱组合。所述MicroBead颗粒可具有50-100nm的直径，每颗粒含有干重30％-60％w/w的铁。例如，所述MicroBead颗粒可具有50的直径。

例如，可通过直径在铁含量之外或代替铁含量表征本申请的磁珠颗粒。例如，所述磁性颗粒的尺寸可以为单分散性的，例如，所述磁珠颗粒呈现1-5μm、例如2.5-3.5μm、例如3μm-5μm的平均直径。例如，所述磁珠颗粒直径的cv小于15％，例如小于10％。例如所述磁珠颗粒可具有10-250nm的平均直径，例如30-150nm，例如，40-100nm，例如，40-60nm，其直径的cv例如小于60％，例如小于30％。

例如，所述磁珠颗粒(干燥)的铁含量的确定可通过以下进行：用酸(例如磷酸)降解氧化铁，通过分析工具定量溶解的铁离子，例如使用用于铁测试的Merck Spectroquant检测试剂盒光度法确定有色络合物。可通过颗粒计数器或用Neubauer室采用显微镜法确定磁珠悬浮液的颗粒计数。相同磁珠悬浮液中的质量浓度可通过以下确定：通过洗涤将确定体积的磁珠悬浮液的珠材料转移到水中，通过干燥除去所述水并称量固体残留物。在已知干燥珠材料的质量浓度和已知所述干燥珠材料的铁含量的情况下，知道珠悬浮液的颗粒数可计算颗粒的铁含量。例如，具有44.5mg/ml干重珠、1.36x 10⁹个颗粒/mg和在干燥珠材料中4.61％w/w的铁含量的MACSiBead的每颗粒包含1.51pg的铁。

例如，颗粒计数可以是非直接得到，而是可以根据Aaron B.Kantor、Ian Gibbons、Stefan Miltenyi、和Jiirgen Schmitz在“细胞分离方法和应用(Cell SeparationMethods and Applications Ed.Diether Recktenwald,Andreas Radbruch，MarcelDekker，New York，1998p.153-171)中所述，通过假定为球形，并使用通过DLS测量得到的流体动力学直径和2.5mg/mL的颗粒密度计算单个颗粒的重量而估算。例如，具有100nm的尺寸，10mg/mL的干重，以及在干燥珠材料中40％w/w的铁含量的Microbead的每颗粒包含0.53fg的铁。

例如，所述磁珠颗粒可以包含葡聚糖。例如，所述磁珠颗粒可以包含葡聚糖铁珠。

例如，可以用不同工艺参数制造磁珠，生成不同尺寸的颗粒。颗粒尺寸可通过Beckman Coulter Delsa Nano和Coulter Counter Z2仪器表征。

例如，所述分选磁珠包含抗CD4或CD8的抗体，所述分选磁珠分别通过所述抗体结合CD4或CD8。所述CD4或CD8可以包含表达于细胞(例如T细胞)表面的CD4或CD8。所述抗体包括抗CD4鼠单克隆抗体、抗CD8鼠单克隆抗体。例如，所述分选磁珠包含偶联CD8鼠单克隆抗体的葡聚糖铁珠和/或偶联CD4鼠单克隆抗体的葡聚糖铁珠。

例如，结合CD4的所述分选磁珠和/或结合CD8的所述分选磁珠的用量为每1.25μL-5μL所述分选磁珠混合每10⁷个所述待分选细胞。

例如，每1.25μL结合CD4的所述分选磁珠和每1.25μL结合CD8的所述分选磁珠与每10⁷个所述待分选细胞混合。

例如，每2.5μL结合CD4的所述分选磁珠和每2.5μL结合CD8的所述分选磁珠与每10⁷个所述待分选细胞混合。

例如，每5μL结合CD4的所述分选磁珠和每5μL结合CD8的所述分选磁珠与每10⁷个所述待分选细胞混合。

例如，所述牛血清蛋白的含量为0.01-0.5wt％。例如，所述牛血清蛋白的含量为0.01-0.1wt％。例如，所述牛血清蛋白的含量为0.01-0.2wt％。例如，所述牛血清蛋白的含量为0.01-0.3wt％。例如，所述牛血清蛋白的含量为0.01-0.4wt％。例如，所述牛血清蛋白的含量为0.1-0.5wt％。

例如，所述分选磁珠的密度为每毫升分选磁珠可分选10⁹～10¹¹个T细胞。例如，所述分选磁珠的密度为每7.5ml分选4×10¹⁰个T细胞。例如，所述分选磁珠的密度为每7.5ml分选4×10¹⁰个T细胞。例如，所述分选磁珠的密度为每2ml分选1×10⁹个T细胞。所述分选磁珠的密度为每1ml分选1×10⁹个T细胞。

例如，所述磁珠颗粒可通过Miltenyi Biotec市售所得，例如，CliniMACS CD4Reagent、CliniMACS CD8 Reagent。例如，所述磁珠颗粒可通过Stemcell市售所得，例如，EasySep^TMHuman CD4 Positive Selection Cocktail II、CliniMACS CD8 Reagent；EasySep^TMHuman CD8 Positive Selection Cocktail II。例如，所述磁珠颗粒可通过Thermo市售所得，例如，Dynabeads^TMCD4、Dynabeads^TMCD8。

例如，所述分选包括磁场分选。例如，所述磁场分选可以包括在高梯度磁场中将带有磁性标记(例如本申请的葡聚糖铁珠)的细胞(例如本申请的CD4或CD8细胞)与非磁性细胞分离。例如，将带有磁性标记(例如本申请的葡聚糖铁珠)的细胞(例如本申请的CD4或CD8细胞)与非磁性细胞的悬浮液引导通过配备有经受强磁场的铁磁性基质的柱体，磁性标记的细胞保留在铁磁性基质上，而非磁性细胞被去除，之后通过从磁场中移除柱体并从铁磁性基质中冲洗细胞以收获磁性标记的细胞。

例如，所述分选包括使用小型细胞分选装置分选。例如，所述小型细胞分选装置包括分选管和分选柱。例如，所述分选柱可以被置于所述分选管内。

例如，所述分选柱可以包含能够产生高梯度磁场的基质。例如，所述分选柱可以包含当其被置于磁性分离器中时能够产生高梯度磁场的基质。

例如，所述基质包含铁磁材料。例如，所述铁磁材料可以是球形，也可以是非球形的其他颗粒，或者具有适宜的孔隙率的集成三维网格。例如，所述铁磁材料可以用涂层涂覆，所述涂层可以保持颗粒彼此之间的相对位置。例如，涂层可以是清漆。例如，所述铁磁材料球/颗粒的尺寸大于约100μm，例如，大于约200μm且小于约2000μm，例如，大于约200μm且小于约1000μm，最例如，约280μm。可用于高梯度磁分选(HGMS)的分离基质可参见美国专利申请08/377,744以及美国专利No.5,235,235。例如，柱的空隙体积，即所述过滤器部分未被基质占据的间隙体积小于约800μl，例如，小于约700μl，例如，小于约500μl，例如，约400μl。例如，重力流速大于约200μl/min，例如大于约400μl/min，例如大于约700μl/min。

例如，所述分选管可以由聚酰胺、聚苯乙烯、聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯、聚碳酸酯、聚甲醛、丙烯酸类如聚甲基丙烯酸甲酯、PET、聚乳酸或聚酰胺等制成。例如，当基质用漆涂料＝＝涂覆时，可以由能够与漆结合的塑料制成，例如树脂，例如PCTG(用乙二醇改性的聚环己二甲基对苯二甲酸酯)。可以通过由亲水性材料(例如，亲水性塑料制造柱体)制成亲水性的，例如，可以用亲水性材料例如聚乙烯吡咯烷酮涂覆分选管的内侧。

例如。可以用多孔玻璃料或网格定位在矩阵的顶端附近基质顶部附近。多孔玻璃料或网格例如可由玻璃或塑料或金属网制成，并且所具有的孔径大于或等于基质的孔径且小于基质粒径。

例如，适用于所述分选柱的PBS缓冲液重力流速可以包括1.3-2.0ml/min。例如，所述PBS缓冲液可以包含0.4％-0.6％的牛血清白蛋白(BSA)。例如，所述PBS缓冲液可以包含0.5％的牛血清白蛋白(BSA)。例如，所述PBS缓冲液可以包含EDTA。例如，所述PBS缓冲液的Ph值可以为约7.2。例如，所述PBS缓冲液为脱气缓冲液。

例如，所述分选管的空隙体积可以包括300μL-500μL。例如，所述分选管的空隙体积可以包括400μL。例如所述分选管的储存器体积可以包括8mL。

例如，所述分选柱的细胞样品量可以包括10⁵-10⁸标记细胞/10⁷-2×10⁹总细胞数。

例如，所述小型细胞分选装置还可以包括磁性分离器。所述磁性分离器用于产生磁场。例如可以包含MACS分离器。例如，所述MACS分离器选自如下的磁性分离器：MidiMACS^TM分离器，QuadroMACS^TM分离器，VarioMACS^TM分离器，SuperMACS^TMII分离器，或者MultiMACS^TMCell24分离器Plus。

例如，所述所述小型细胞分选装置还可以包括MACS管架。例如，所述MACS管架可以包括丙烯酸管架。例如，所述管架为15mL管架。例如，MACS MultiStand。

例如，所述分选包括在所述磁场分选之前进行离心。例如，所述离心包括对待分选的细胞与分选磁珠混合后进行离心，包括每组加入1.5-3ml分选洗液，例如2ml分选洗液，250-350g离心，例如300g离心，离心8-12分钟，例如，离心10分钟。

例如，所述磁性分选包括将管架置于生物安全柜内，利用QuadroMACS Separator设置磁场，每组一个分选管，将Miltenyibiotec LS分选柱置于磁场中，分选管下方放置50ml离心管用于接收CD4-CD8-细胞，向分选管中加入1-5ml(例如1ml、2ml、3ml、4ml或5ml)分选洗液润洗吸附柱，之后将离心后加入500ul分选洗液重悬的待分选的细胞与分选磁珠的混合物加入分选管中，待细胞悬液全部流入分选管吸附柱时，再次加入1-5ml(例如1ml、2ml、3ml、4ml或5ml)分选洗液进行清洗，清洗1-3次。例如2次，例如3次。

例如，所述分选包括在所述磁场分选之后洗脱。例如，所述洗脱包括将分选柱从磁场中移出，分别架于15ml离心管上，加入3-5ml分选洗液进行洗脱。例如，加入4ml分选洗液。

例如，所述分选包括在所述磁场分选之后进行离心。例如，所述离心包括对收集的洗脱液进行离心，所述洗脱液中包含目的细胞(例如T细胞)，分别加入5-15ml培养基(例如7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、或12ml)洗涤，250-350g离心，例如300g离心，离心8-12分钟，例如，离心10分钟。

例如，所述待分选细胞的分选得率为45％以上。例如，分选得率为48.2％、48.7％、55.2％、53.8％、63.5％、70.5％、71％。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的方法，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1

1.用Ficoll(购自GE，货号17-1440-02)密度梯度离心的方法分离得到的外周血单个核细胞(PBMC)，计数后按照每组1x10⁷个细胞，准备各个实验组，将分组的PBMC细胞离心，1200rpm，4℃，离心7分钟。分别用80ul分选洗液(每20ml的CliniMACS PBS/EDTA Buffer(购自美天旎(Miltenyi)，货号：200-070-025)加入0.5ml含20％HSA的人血白蛋白注射液)重悬细胞。

2.按照每1x10⁷个细胞中分别各加入20ul、10ul、5ul、2.5ul和1.25ul的CD4磁珠(购自美天旎(Miltenyi)，货号：200-070-132(276-01))和CD8磁珠(购自美天旎(Miltenyi)，货号：200-070-115(275-01))，混匀，置于2-8℃，静置15分钟，期间每隔5分钟混匀一次。

3.从2-8℃取出细胞悬液，每组加入2ml分选洗液，混匀，300g，离心10分钟。

4.弃上清，每组加入500ul分选洗液重悬细胞。

5.将管架(购自Miltenyibiotec，型号：130-042-303)置于生物安全柜(购自HealForce，型号：HFsafe 1200LCB2)内，利用磁性分离器进行分选，磁性分离器购自Miltenyibiotec，型号：QuadroMACS Separator，每组使用一个分选管，将LS分选柱(购自Miltenyibiotec，型号：130-042-401)置于磁场中，分选管下方放置50ml离心管，用于接收CD4-CD8-细胞，向分选管中加入3ml分选洗液，润洗吸附柱。

6.将步骤4所得的每组的细胞悬液分别全部加入分选管中，待细胞悬液全部流入分选管吸附柱时，再次加入3ml分选洗液进行清洗，重复清洗3次。

7.将所有分选管从磁场中移出，分别架于15ml离心管上，加入3-5ml分选洗液进行洗脱。

8.向洗脱收集的细胞悬液中分别加入10ml KBM581培养基(购自Corning，型号：88581-CM)洗涤，300g，离心10分钟。

9.弃上清，分别加入3ml的分选洗液重悬，取样计数后备用，按以下公式计算T细胞得率：

T细胞得率＝分选后细胞总数/PBMC中CD3+细胞数。

所得结果如表1中所示。

10.选择另一来源的外周血单个核细胞(PBMC)，重复步骤1-9，所得结果如表2所示。

表1和表2中列出了分选前、分选后不同细胞占细胞总数的比率，以及CD3+T细胞的细胞得率。

表1 CD4和CD8分选磁珠配合小型细胞分选装置的数据结果(样品1)

表2 CD4和CD8分选磁珠配合小型细胞分选装置的数据结果(样品2)

由表1和表2的结果可知，CD4/CD8分选磁珠用量在1.25/1.25ul/10⁷细胞到5/5ul/10⁷细胞的条件下，分选获得的CD3+细胞纯度和细胞得率都比较高，能够更加高效的分选获取T细胞。

Claims

1.一种T细胞的分选方法，所述分选为磁场分选，其包括以下的步骤：

a)使待分选的细胞与分选磁珠混合；

其中所述分选磁珠包含磁珠颗粒和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包含牛血清蛋白，且不包含叠氮钠，其中所述待分选的细胞为PBMC细胞；

所述分选磁珠为结合CD4的分选磁珠和结合CD8的分选磁珠；结合CD4的所述分选磁珠为CliniMACS CD4 Reagent，货号200-070-132；结合CD8的所述分选磁珠为CliniMACS CD8Reagent，货号200-070-115；其中结合CD4的所述分选磁珠的用量为每1.25μL-5μL所述分选磁珠混合每10⁷个所述待分选细胞，结合CD8的所述分选磁珠的用量为每1.25μL-5μL所述分选磁珠混合每10⁷个所述待分选细胞；

b) 分选得到T细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中每2.5μL结合CD4的所述分选磁珠和每2.5μL结合CD8的所述分选磁珠与每10⁷个所述待分选细胞混合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述牛血清蛋白的含量为0.01-0.5 wt%。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分选包括使用小型细胞分选装置分选。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述小型细胞分选装置包括分选柱。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述分选包括在所述磁场分选之前进行离心。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述分选包括在所述磁场分选之后进行离心。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述分选包括在所述磁场分选之后洗脱。