CN108441473B - 一种体外富集cd8+*t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养T细胞的方法，该方法可以提高CD8+T细胞：CD4+T细胞比率并且/或者提高

Description

一种体外富集CD8+*T细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种体外培养T细胞的方法。更具体地，本发明涉及一种能够提高CD8+T细胞：CD4+T细胞比率并且/或者提高T 细胞含量的体外培养T细胞方法。
背景技术2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013 年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。根据中国医学科学院肿瘤医院、国家癌症中心赫捷院士、全国肿瘤登记中心主任陈万青教授等在《CA：A Cancer Journal for Clinjicians》杂志发表的2015年中国癌症统计数据：2015年我国肿瘤新发病例为 429.2万；报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50％，达到每年2160万人(Chen, W.,et al.(2016)."Cancer statistics in China,2015."CACancer J Clin 66(2): 115-132.)。
针对肿瘤，传统的手术切除、化疗、放射线治疗，对正常组织有伤害，具有局限性，效果有限。近年来出现的靶向疗法在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，不会伤及肿瘤周围的正常组织细胞。但分子靶向药物存在以下问题：有效性低，某种药物只能对特定突变基因型肿瘤产生作用；在肿瘤基因突变产生药物耐受性的情况下靶向药物的长期治疗效果下降；可能引起严重的不良反应；部分肿瘤不能通过靶向药物得到有效治疗。
近年来，随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。自 2013年以来，免疫疗法不断获得突破性进展，临床研究也取得了一定成功，是当前肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。
细胞免疫治疗目前已经广泛开展，从早期的LAK(lymphokine activated killercells，淋巴因子激活的杀伤细胞)细胞治疗尝试，发展到CIK(Cytokine Induced KillerCell，细胞因子激活的杀伤细胞)、DC-CIK(树突状细胞-细胞因子激活的杀伤细胞)细胞治疗等。
肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)细胞是体内杀伤肿瘤细胞的直接效应细胞，通过细胞表面的T细胞受体(T cell receptor， TCR)识别肿瘤细胞表面呈递的肿瘤抗原和HLA分子复合物，激活CTL细胞内一系列反应，通过分泌穿孔素、颗粒酶等直接杀伤肿瘤细胞。近年来科学家们研究了肿瘤突变产生的新表位对机体抗肿瘤作用的影响，有望推动肿瘤特异性T细胞治疗技术的进步和临床应用。现有临床研究表明，肿瘤组织处的肿瘤特异性突变，尤其是免疫原性区域抗原的突变，能够产生新的、肿瘤特异性抗原，这些抗原能够激发体内特异性T细胞免疫反应，产生的T细胞表面TCR亲和力较高，从而有效发挥肿瘤细胞杀伤功能。然而肿瘤组织处的免疫耐受环境限制了特异性T细胞的有效激活和功能发挥，需要体外环境下实施人为干预，对突变抗原特异性T细胞进行体外扩增和活化。
CD8+T细胞通过T细胞表面表达的T细胞受体(TCR)特异性识别靶细胞表面呈递的MHC-I/表位多肽复合物分子，通过CD8分子结合靶细胞表面MHC-I分子，募集CD3分子并将信号传递至CD3胞内的ITAM活化基序，由此产生T细胞激活的第一信号。在此基础之上，辅助激活分子CD28与B7-1等分子相互作用，产生T细胞激活所需的第二信号，产生细胞毒性T细胞(CTL)反应。新鲜外周血中CD4+/CD8+T细胞比例大约为1:1至2:1。CD8+T细胞是发挥特异性杀伤功能的主要细胞亚群，而目前尚无成熟的体外高效定向扩增CD8+T细胞的方法，因此，体外高效CD8+ T细胞定向增殖培养技术和试剂的开发对于提高以CTL为基础的肿瘤治疗具有重要意义。
此外，在T细胞分化过程中，T细胞经历
Figure RE-GDA0001703965250000021
T细胞(初始T细胞)、效应性T细胞、效应性记忆性T细胞和中枢记忆性T细胞的不同时期，其分化增殖的能力各不相同，在免疫细胞治疗过程中，终末分化的T细胞由于其分化增殖能力相对较差，而早期T细胞(特别是
Figure RE-GDA0001703965250000022
T细胞)能够有效抵制终端分化或“耗竭”，维持高复制潜力，在过继性免疫治疗中优于其他细胞亚群，在体内能够快速反应并且能够大量增殖，对于肿瘤等的治疗具有更加持久的作用时间。初始T细胞不仅是数量最多的细胞亚群而且是具有最强的体外扩增能力和最有利于T细胞受体转基因表达的细胞亚群(Hinrichs CS,et al.(2011).“Human effectorCD8 T cells derived from naive rather than memory subsets possess superiortraits for adoptive immunotherapy.”Blood 117:808-814)。因此，T细胞培养过程中产生的
Figure RE-GDA0001703965250000031
T 细胞对于后期免疫细胞治疗效果具有重要意义。
基于上述内容，现有技术需要一种提高
Figure RE-GDA0001703965250000032
T细胞含量或者提高CD8+T细胞：CD4+T细胞比率的培养方法；并且，本领域对于能够提高
Figure RE-GDA0001703965250000033
T细胞含量、同时提高CD8+T细胞：CD4+T细胞比率的培养方法存在需求。
发明内容
为解决现有技术的上述问题而做出本发明，其涉及一种体外细胞培养方法。根据本发明的培养方法，能够实现下述效果中的任一种或者其二者同时实现：提高CD8+T 细胞：CD4+T细胞的比率；提高
Figure RE-GDA0001703965250000034
T细胞的含量。
根据本发明的一个方面，本发明的培养方法包括以下步骤：
1)获得分离的外周血淋巴细胞(PBMC)细胞；
2)对分离的PBMC细胞进行分选，获得富含CD4+T细胞和CD8+T细胞的T细胞悬液；以及
3)将上述T细胞悬液置于预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板中进行培养，并添加IL-2。
根据本发明的一个方面，本发明的培养方法包括以下步骤：
1)获得分离的外周血淋巴细胞(PBMC)；
2)对分离的PBMC进行分选，获得富含CD4+T细胞和CD8+T细胞的T细胞悬液；以及
3)将上述T细胞悬液置于预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板中进行培养，并添加IL-2和IL-7。
在本发明的上述培养方法的步骤1)中，获得PBMC的方法没有特别限制，本领域技术人员可以根据本领域的常规技术手段从受试者中获得PBMC。例如，
在本发明的上述培养方法的步骤2)中，对PBMC进行分选的方法也没有特别限制，本领域技术人员可以根据本领域的常规技术手段进行细胞分选，只要其能够在不损害本发明效果的前提下获得富集的CD4+T细胞和CD8+T细胞即可。例如，分选可以采用分选柱进行。
在本发明的培养方法的步骤3)中，采用的IL-2的浓度可以在大约100U/ml至1000U/ml的范围内，例如大约100U/ml、大约300U/ml或者大约1000U/ml。
在本发明的培养方法的步骤3)中，采用的IL-7的浓度可以在20-200U/ml的范围内，例如具体采用大约20U/ml或者大约200U/ml。
在本发明的培养方法的步骤3)中，预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板可以，例如通过以下方式获得：将含有终浓度为大约2.5μg/ml的CD3抗体和终浓度为大约0.5μg/ml的CD28抗体的PBS缓冲液加入到细胞培养板后37℃孵育2小时。
在本发明的培养方法的步骤3)中，添加到细胞培养板的PBS缓冲液的用量没有特别限定，只要其能够实现本发明的目的即可。例如，当采用6孔细胞培养板时，可以按照2ml/孔的用量添加上述PBS缓冲液。当采用24孔细胞培养板时，可以按照 500μl//孔的用量添加上述PBS缓冲液。
在本发明的培养方法的步骤3)中，加入到细胞培养基的T细胞悬液的密度没有特别限定，优选地可以为0.5-1×106/ml，例如0.5×106/ml。
在本发明的培养方法的步骤3)中，在培养中采用的培养基没有特别限定，只要其能够用于细胞培养、不会不利地影响本发明的目的即可。例如，可以采用GT-T5511 无血清细胞培养基。此外，细胞培养可以在例如37℃、5％CO2和100％湿度条件下的条件下进行。细胞培养可以进行，例如7-12天。
本发明还涉及一种用于培养富集人CD4+/CD8+
Figure RE-GDA0001703965250000041
T细胞悬液的体系，其包含：IL-2；IL-7；预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板。在该体系中，采用的IL-2的浓度可以在大约100U/ml至1000U/ml的范围内，例如大约100U/ml、大约 300U/ml或者大约1000U/ml；采用的IL-7的浓度可以在20-200U/ml的范围内，例如具体采用大约20U/ml或者大约200U/ml。
上述体系中的预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板可以通过将含有CD3 抗体和CD28抗体的PBS缓冲液加入到细胞培养板后于37℃孵育2小时而得到。其中，加入到细胞培养板的CD3抗体的终浓度可以为大约2.5μg/ml，加入到细胞培养板的CD28抗体的终浓度可以为大约0.5μg/ml，但并不局限于该数值，本领域技术人员可以根据本发明对抗体浓度做出适当调整，只要其不影响本发明的效果即可。
具体实施方式
本发明通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
实施例1、志愿者外周血淋巴细胞(PBMC)的分离
本发明所用的淋巴细胞来自个体的静脉外周血。经过筛选的个体经临床医生体检合格后，由试验者告知具体项目流程及所需血液量，经志愿者同意并签署知情同意书，由临床医务人员对志愿者进行采血。最终本项目筛选了2例健康志愿者V26和V27，采血时使用含有EDTA-K2抗凝的9ml一次性真空采血管(购自 BD公司)，每名志愿者采血约20-25ml，采血后将血样立即颠倒防止凝血。
1)、先将新鲜采集的外周血用冷却的磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4，经 121℃高压灭菌)稀释一倍，将稀释后的血样以5：3的比例加入到15ml人外周血淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物技术有限公司，LTS1077)中，缓慢加入以避免界面混乱；
2)、将淋巴细胞分离液和血样的混合物转入离心管，在25℃下用高速冷冻离心机(购自ThermoFisher公司)离心，将升降速设置为升速2，降速2，以700g 离心30分钟；
离心后的样品分四层，从管底往上依次是红细胞层、淋巴细胞分离液层、白色云雾状的单个核细胞层(包括淋巴细胞和单核细胞)、血浆层，将最上层血浆用巴斯德移液管吸出弃掉，之后小心吸出单个核细胞层并移至新的无菌离心管中，由此制得粗纯PBMC细胞；
3)、用等体积的磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)稀释粗纯PBMC细胞，之后在25℃下以300g的离心力离心10分钟；弃掉上清，重复上述步骤一次；加入适量氯化钠注射液重悬细胞后开始计数；获得分离的PBMC细胞备用。
实施例2、T细胞分选
通过免疫磁珠法对上述分离的PBMC细胞中的T淋巴细胞进行分选富集，以获得CD4+T细胞和CD8+T细胞为主的高纯度T细胞悬液，用以进行后续培养。
1)首先将上述获得的分离的PBMC细胞按照每1×107细胞与20μl的CD4 抗体偶联磁珠(购自德国美天旎生物技术有限公司，130-045-101)、20μl的CD8 抗体偶联磁珠(购自德国美天旎生物技术有限公司，130-045-201)和含0.5％胎牛血清(FBS，购自美国Gibco公司品牌澳洲来源，10270-106)和含2mM EDTA-Na 的80μl PBS-F缓冲液缓冲液(以PBS为溶剂，FBS和EDTA-Na为溶质而配置的用于T细胞分离的缓冲液，其中溶质浓度为0.5％和2mM)进行混合，之后置4℃进行孵育15分钟。然后对于每107个细胞加1-2ml PBS-F缓冲液，于室温300g离心10分钟。
2)用移液枪小心吸除细胞上清液，加500μl PBS-F缓冲液将细胞沉淀重悬(一般小于108个细胞加500μl缓冲液重悬)，并通过200目一次性无菌滤网(购自德国美天旎生物技术有限公司，130-101-812)过滤，去除细胞悬液中的杂质，以使得细胞在后续步骤中能够顺利通过分选柱(MS分选柱，购自德国美天旎生物技术有限公司，130-042-201)。由此，获得与CD4抗体偶联磁珠和CD8抗体偶联磁珠结合的PBMC细胞。
3)将购自德国美天旎生物技术有限公司的MS分选柱放置在强磁场 (OctoMACSSeparator，购自德国美天旎生物技术有限公司，130-042-108)中，用0.5ml PBS-F缓冲液润洗2次，至最后一次润洗PBS-F缓冲液完全流出分选柱后，获得经处理的MS分选柱备用。
4)将上述步骤2)获得的CD4和CD8抗体磁珠结合的PBMC细胞缓慢加入到步骤3)处理后的MS分选柱，此时结合到CD4抗体磁珠和CD8抗体磁珠的T细胞在磁场作用下滞留在MS分选柱中，而未结合磁珠的其他细胞则沿分选柱流出，即为流穿细胞。用500μl的PBS-F缓冲液分三次缓慢加入到分选柱，使分选柱内未结合磁珠的细胞完全洗脱出分选柱，以便获得更高纯度的结合到CD4 抗体磁珠和CD8抗体磁珠的T细胞。
5)将含有结合到CD4抗体磁珠和CD8抗体磁珠的T细胞的分选柱从磁场移出，加入1ml的PBS-F缓冲液，用MS分选柱活塞推出分选柱内与磁珠结合的CD4/CD8T细胞，于300g离心10分钟，弃掉上清后用2ml淋巴细胞、DC细胞培养基(购自TAKARA公司，GT-T551，下同)清洗两次，获得以CD4+T细胞和CD8+T细胞为主的高纯度T细胞悬液。
流式细胞术分析：在磁珠分选过程中，取上述步骤5)获得CD4+和CD8+T 细胞总数约为1×106的细胞悬液，分别进行CD4和CD8荧光抗体染色，之后用流式细胞分析(FACS)对分群效果进行评价，发现对于两例个体V26和V27获得的T细胞悬液经分群染色后CD4+T细胞占比分别为58.50％和36.55％，CD8+T 细胞占比分别为31.28％和43.90％。基于这样的结果进行计算，确定在个体V26 中的CD8+T细胞与CD4+T细胞之比约为0.53：1，在个体V27中的CD8+T细胞与CD4+T细胞之比约为1.20：1。
实施例3、T细胞体外培养和刺激扩增
1)将上述步骤5)获得的富含CD4+和CD8+T细胞的高纯度T细胞分别进行以下A、B两种处理方式，以便在不同刺激组合形式及培养方式条件下比较T 细胞增殖水平及扩增的T细胞亚群和分化水平。具体处理方式如下：
A处理：
以含6％人体自身血清(HS，购自Sigma公司)和终浓度为300IU/ml白细胞介素-2(IL-2)(购自双鹭药业)的GT-T551培养基(来源同上)重悬计数至浓度为约5×105细胞/ml的细胞悬液，将细胞悬液加入到6孔细胞培养板内，每孔2ml 细胞悬液，在37℃、5％CO2和100％湿度条件下进行培养，以备后续刺激处理。
将上述细胞置于预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板中进行培养，并添加终浓度为300U/ml的IL-2：在进行实施例2的上述步骤5)时，将CD3抗体 (克隆号为OKT-3，功能性等级纯化(Functional Grade Purified)，浓度为1mg/ml，购自BioXCell公司，BE0001-2)和CD28抗体(克隆号为CD28.2，功能性等级纯化(Functional Grade Purified)，浓度为1mg/ml，购自BioXCell公司，BE0291)，分别以终浓度2.5μg/ml和0.5μg/ml稀释到一份PBS缓冲液中，并按照2ml/孔(6 孔板)或500μl/孔(24孔板)加入后37℃孵育2小时；每孔加入2mlDPBS(购自Gibco公司，A12856-01)，漂洗1次；每孔再加入2ml GT-T551细胞培养基(来源同上)漂洗1次。弃掉孔内上清溶液，并将上述步骤5)中分选出的富含CD4+ 和CD8+ T细胞的高纯度T细胞以5×105/ml浓度加入到如前所述得到的预包被有 CD3抗体和CD28抗体的孔板中进行培养，并添加终浓度为300U/ml的IL-2；
B处理：
在A处理的基础上添加终浓度为20U/ml的IL-7(购自PeproTech公司， 200-07)。
将分别按照上述A、B处理的T细胞在37℃、5％CO2和100％湿度的条件下培养10天。分别对所培养的T细胞进行计数，每组取不少于5×105的细胞以备后续流式细胞分析检测，从而对刺激后的T细胞数量、T细胞亚群和分化特征等进行定性和定量检测。
实施例4.T细胞分化特征分析
1)CD4+/CD8+T细胞亚群分析
对实施例3中分别经过A、B处理并培养10天之后的细胞取样，以进行流式细胞检测，评价CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例。
取培养后T细胞约5×105个，以室温300g离心10分钟，弃掉上清后用1ml 的PBS缓冲液进行2次离心清洗；最后一次离心后用50μl PBS重悬，加入 PE-Cy7-anti-CD8抗体(购自BD Biosciences公司，557843)和APC-Cy7-anti-CD4 抗体(购自BD Biosciences公司，557871)各1个反应量，室温孵育15分钟，之后用1ml的PBS缓冲液离心清洗两次，300g离心10分钟。
最后一次离心后用500μl PBS缓冲液进行重悬，加入流式管(购自海门BD) 中在双激光流式细胞分析仪中(购自Beckman Coulter公司，CytoFLEX，下同) 检测，所得数据经CytoExpert进行分析。
表1、V26和V27样本经过处理后的结果(单位为所述细胞占所有细胞的百分比)
Figure RE-GDA0001703965250000081
Figure RE-GDA0001703965250000091
经过A、B处理培养后第10天，来自两例个体的样本经处理后CD8+ T细胞 /CD4+T细胞的比例均有显著提高。
2)
Figure RE-GDA0001703965250000092
T细胞含量分析
对实施例3中分别经过A、B处理并培养10天之后的细胞取样，具体为取约 5×105细胞，于300g离心10分钟，弃掉上清后用1ml的PBS缓冲液进行2次离心清洗；最后一次离心后用50μl PBS重悬，加入APC-anti-CD45RA抗体(购自 BioLegend公司，304112)和PE-anti-CD62L抗体(购自BioLegend公司，304806) 各1个反应量，室温孵育15分钟，之后用1ml PBS离心清洗两次，以1500转/分钟转离心5分钟。最后一次离心后用500μl PBS缓冲液进行重悬，并将其加入流式管(来源同上)中准备上机检测(来源同上)。
结果表明，在在两种处理过程中，来自V26和V27两例健康人的样本中的
Figure RE-GDA0001703965250000093
T细胞亚群比例都显示出随培养时间的延长呈增长的趋势。
在V26样本中，经过A处理培养的
Figure RE-GDA0001703965250000094
T细胞在第10天的比例从第0天的 47.71％提高到48.11％，而B处理中的
Figure RE-GDA0001703965250000095
T细胞在第10天的比例从第0天的 47.71％提高到71.12％。这样的结果显示，与A处理相比，B处理更显著地提高
Figure RE-GDA0001703965250000096
T细胞的含量，比A处理高出近23.01％。
在V27样本中，经过A处理培养的
Figure RE-GDA0001703965250000097
T细胞在第10天的比例从第0天的 56.56％降低到31.00％，而B处理中的
Figure RE-GDA0001703965250000098
T细胞在第10天的比例从第0天的 56.56％提高到65.97％。这样的结果显示，与A处理相比，B处理显著地提高
Figure RE-GDA0001703965250000099
T细胞的含量，比A处理高出近34.97％。
表2、V26和V27样本经过处理后的结果(单位为所述细胞占所有细胞的百分比)
Figure RE-GDA00017039652500000910
Figure RE-GDA0001703965250000101
根据本实施例的结果，发现预包被CD3/CD28抗体并采用一种或两种白介素进行处理能够显著提高高CD8+ T细胞/CD4+ T细胞的比例。此外，预包被 CD3/CD28抗体、采用两种白介素(即IL-2和IL-7)进行处理不仅能够提高CD8+ T细胞/CD4+T细胞的比例，还可以明显提高T细胞的含量，从而可以提供具有活力更高的T细胞。本发明随后进行了一系列实验，对不同用量的白介素IL-2 和IL-7的组合进行了进一步优化，具体见实施例5。
实施例5.刺激物组合优化
在本实施例中，发明人进一步对刺激条件和刺激物组合进行了优化。
本实施例在T细胞培养孔中分别加入：
A1.IL-2(100U/ml)
B1.IL-2(300U/ml)
C1.IL-2(1000U/ml)
D1.IL-2(300U/ml)+IL-7(20U/ml)(即实施例3中的B处理)
E1.IL-2(300U/ml)+IL-7(200U/ml)
表3、V26和V27样本经过处理后的结果(单位为所述细胞占所有细胞的百分比)
Figure RE-GDA0001703965250000103
通过本实施例发现，对于提高CD8细胞与CD4细胞的比例这一目的而言，所有五组处理均能实现这一效果，表明100U/ml至1000U/ml的IL-2对于实现上述细胞比例的提高是合适的。综合效果和成本经济，优选300U/ml的IL-2。
然而，单独使用IL-2而不使用IL-7进行处理(处理A1、B1和C1)不能兼顾细胞含量的提高。与之成对比，采用IL-2和IL-7(处理D1和E1)不仅能够高CD8细胞与CD4细胞的比例，还可以提高细胞含量。综合考虑两种效果，优选D1组合(采用300U/ml的IL-2和20U/ml的IL-7)。
A1、B1、C1三组处理培养的T细胞在第10天均具有较高比例的CD8+和
Figure RE-GDA0001703965250000114
T细胞，提示100U/ml、300U/ml和1000U/ml的IL-2浓度是合适的。D1、E1两组处理培养的T细胞在第10天均具有较高比例的CD8+和T细胞，特别是
Figure RE-GDA0001703965250000116
细胞比例，高于A-C三组；其中D组处理培养的T细胞在第10天具有更高比例的CD8+和
Figure RE-GDA0001703965250000117
T细胞，可最为最优组合，用于临床治疗。

Claims (5)

1.一种体外细胞培养T细胞的方法，其包括以下步骤：
1)获得分离的外周血淋巴细胞(PBMC)细胞；
2)对分离的PBMC进行分选，获得富含CD4+T细胞和CD8+T细胞的T细胞悬液；以及
3)将上述T细胞悬液置于预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板中进行培养，并添加IL-2和IL-7，其中IL-2的浓度在100U/ml至1000U/ml的范围内，IL-7的浓度在20-200U/ml的范围内，并且
所述预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板通过以下方式获得：将含有终浓度为2.5μg/ml的CD3抗体和终浓度为0.5μg/ml的CD28抗体的PBS缓冲液加入到细胞培养板后于37℃孵育2小时。
2.根据权利要求1所述的体外细胞培养方法，其中IL-2的浓度为300U/ml，IL-7的浓度为20U/ml。
3.根据权利要求1所述的体外细胞培养方法，其中加入到细胞培养基的T细胞悬液的密度为0.5-1×106/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其中分选通过分选柱进行。
5.一种用于培养富集人
Figure FDA0002226084360000011
T细胞悬液的体系，其包含：
IL-2；
IL-7；
预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板，
其中所述预包被CD3抗体和CD28抗体的细胞培养板通过将含有CD3抗体和CD28抗体的PBS缓冲液加入到细胞培养板后于37℃孵育2小时而得到，其中，加入到细胞培养板的CD3抗体的终浓度为2.5μg/ml，加入到细胞培养板的CD28抗体的终浓度为0.5μg/ml，并且
IL-2的浓度在100U/ml至1000U/ml的范围内，IL-7的浓度在20-200U/ml的范围内。
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