KR20210010509A - 무혈청 배양에 의해 키메라 항원 수용체 t 세포를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
무혈청 배양에 의해 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) PBMC 세포를 제공하는 단계; (b) PBMC 세포에 대해 음성 분류 처리를 수행하여 분류된 PBMC 세포를 수득하는 단계; (c) 분류된 PBMC 세포를 활성화하여 활성화된 T 세포를 수득하는 단계; (d) 키메라 항원 수용체를 발현하는 바이러스 벡터를 사용하여 활성화된 T 세포를 형질감염시켜 형질감염된 T 세포를 수득하는 단계; (e) 형질감염된 T 세포로부터 바이러스를 제거하여 바이러스-제거된 T 세포를 수득하는 단계; 및 (f) 바이러스-제거된 T 세포를 확장 배양시켜 키메라 항원 수용체 T 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 생물학적 기술 분야, 특히 무혈청 배양에 의해 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체 T 세포 면역요법은 T 세포가 scFv 단편과 세포내 신호 도메인을 갖도록 하는 새로운 유형의 의료 치료 기술로, 이는 유전자 편집을 통해 종양-연관 항원을 특이적으로 인식함으로써 T 세포 표적화, 사멸 및 지속성을 증강시킬 수 있다. 최근 수년간, 키메라 항원 수용체 T 세포 면역요법은 임상 종양 면역요법에서 좋은 수행능을 보여 왔으므로, 종양의 임상 치료에 대한 희망을 가져 왔다.
키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 프로세스는 비교적 복잡하며, 많은 작업, 예컨대 세포 활성화, 분류, 형질감염 및 확장 배양을 수반한다. 프로세스 흐름, 시설 및 시약 선택과 같은 임의의 링크가 불충분하면, 세포 제제의 품질에 중요한 영향을 미치며, 이는 결국 키메라 항원 수용체 T 세포의 활력, 수율, 안전성 및 후속 임상 효과에 영향을 미칠 것이다.
통상의 세포 배양 프로세스에서 중요한 성분으로서의 혈청은 세포에 대한 독성 및 부작용이 있는 일부 물질을 함유하고 있다. 추가로, 혈청의 품질은 배치에 따라 크게 다르다. 또한, 미코플라스마, 바이러스 및 다른 위험이 혈청 수집 프로세스에서 야기될 수 있으며, 이는 세포 요법의 개발을 심각하게 방해한다.
현재 시판되는 키메라 항원 수용체 T 세포의 무혈청 제조를 위한 만족스럽고 효율적인 프로세스가 없으므로, 키메라 항원 수용체 T 세포 면역요법의 추가 개발, 촉진 및 적용에 심각한 영향을 미치고 있다.
따라서, 관련 기술 분야에서는 무혈청 세포 배양에 기반하여 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는 안전하고 효율적인 방법을 개발하는 것이 시급히 요망된다.
본 발명의 목적은 무혈청 세포 배양에 기반하여 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는 안전하고 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 측면에서,
(a) 무혈청 배지에 재현탁되는 PBMC 세포를 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)에서의 PBMC 세포에 대해 음성 분류 처리를 수행하여 분류된 PBMC 세포를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 분류된 PBMC 세포를 활성화하여 활성화된 T 세포를 수득하는 단계;
(d) 키메라 항원 수용체를 발현하는 바이러스 벡터를 사용하여 단계 (c)에서 수득된 활성화된 T 세포 상에서 유전자 형질감염을 수행하여 형질감염된 T 세포를 수득하는 단계;
(e) 형질감염된 T 세포로부터 바이러스를 제거하여 바이러스-제거된 T 세포를 수득하는 단계; 및
(f) 바이러스-제거된 T 세포를 확장 배지에 재현탁하고 확장 배양을 수행하여 키메라 항원 수용체 T 세포를 수득하고, 키메라 항원 수용체 T 세포가 미리 결정된 양에 도달할 때 키메라 항원 수용체 T 세포를 수거하는 단계이며, 여기서 확장 배지는 세포 인자를 함유하는 무혈청 배지인 단계
를 포함하는, 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는 무혈청 방법이 제공된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 무혈청 배지가 상기 방법의 모든 단계에서 사용된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (a)에서, PBMC 세포는 소생된 PBMC 세포이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, PBMC 세포는 자가 또는 동종이계이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, PBMC 세포는 인간으로부터 유래된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)에서, 음성 분류 처리는 클리니MACS(CliniMACS)를 이용한다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에서, 활성화를 위해 항-CD3/CD28 항체가 활성화 처리를 수행한다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)에서, 활성화 처리는 기본 배지 및 첨가제를 함유하는 활성화 배지에서 수행된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 기본 배지는 하기 군: LONZA X-VIVO, LIFE CTS AIM V, LIFE 옵트마이저(OpTmizer) SFM, RPMI 1640, 이뮤노컬트(ImmunoCult™)-XF 및 스템리네아(Stemlinea)으로부터 선택된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 첨가제는 하기 군: 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 혈청 알부민, 식물-유래 재조합 알부민 또는 그의 조합, 바람직하게 재조합 알부민으로부터 선택된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 알부민 농도는 0.01% 내지 50% (W/V), 바람직하게 0.05% 내지 30% (W/V), 보다 바람직하게 0.1% 내지 20% (W/V)이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 활성화 처리는 하기 군: 항체 코팅 처리, 유리 항체 처리, 활성화 자기 비드 처리 또는 그의 조합으로부터 선택된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 활성화 처리에 있어서, 항체 농도는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 활성화 처리에 있어서, 활성화 자기 비드 대 세포의 수의 비율은 0.25 내지 5:1, 바람직하게 0.5 내지 3:1이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 활성화 처리 시간은 3일 내지 8일이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (d)에서, 바이러스 벡터는 하기 군: 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스 (AAV), 아데노바이러스 또는 그의 조합으로부터 선택된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 유전자 형질감염의 감염 다중도 (MOI)는 0.5 내지 30, 바람직하게 1 내지 20, 보다 바람직하게 2 내지 10이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (e)에서, 바이러스 제거 처리는 형질감염된 세포를 무혈청 배지에 재현탁하고, 세포를 원심분리하고, 상청액을 흡입하여 바이러스-제거된 T 세포를 수득하는 것을 포함한다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (f)에서, 미리 결정된 양은 1x109 내지 1x1011, 바람직하게 2X109 내지 2X1010이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (f)에서의 확장 배지는 세포 인자를 추가로 함유한다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 세포 인자는 하기 군: IL-2, IL-15, IL-7 또는 그의 조합으로부터 선택된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 각각의 세포 인자의 농도는 독립적으로 1 내지 100 ng/ml, 바람직하게 2 내지 80 ng/ml, 보다 바람직하게 5 내지 50 ng/ml이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (f)에서, 확장 배양은 하기 군: 배양 플라스크, 배양 백 또는 그의 조합으로부터 선택되는 용기에서 수행된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 배양 플라스크는 하기 군: G-Rex 배양 플라스크, T75 배양 플라스크 또는 그의 조합으로부터 선택된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 용기는 G-Rex 배양 플라스크이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 확장 배양 시간은 8일 내지 14일이다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 단계 (f)에서, 확장 배양에서는, 용기 변경 작업이 수행되지 않는다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 하기 군: CD19, CD23 등으로부터 선택된 표적을 향한다.
본 발명의 제2 측면에서, 키메라 항원 수용체 T 세포가 제공된다. 키메라 항원 수용체 T 세포는 청구항 1에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는 무혈청 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 제3 측면에서, (a) 청구항 2에서의 키메라 항원 수용체 T 세포 및 (b) 제약상 허용되는 담체를 함유하는 세포 제제가 제공된다.
대안적인 바람직한 실시양태에서, 세포 제제는 액상 제제 (예를 들어, 주사제)이다.
본 발명의 범위 내에서, 전술한 본 발명의 기술적 특징과 하기에 구체적으로 기재되는 기술적 특징 (예를 들어, 실시양태)은 서로 조합하여 새롭거나 바람직한 기술적 솔루션을 형성할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
공간 제한으로 인해, 이들은 하나씩 기재되지 않는다.
도 1은 상이한 배지에서의 CAR-T 세포의 성장 곡선 상의 변화를 도시한다.
도 2는 G-Rex 배양 플라스크, 배양 백 및 T75 배양 플라스크에서의 CAR-T 세포의 성장 곡선 상의 변화를 도시한다.
도 3은 G-Rex 배양 플라스크, 배양 백 및 T75 배양 플라스크에서의 CAR-T 세포의 양성률 곡선 상의 변화를 도시한다.
도 4는 CAR-T 세포의 증식에 대한 상이한 세포 배양 첨가제의 효과를 도시한다.
도 5는 상이한 분류 방법에서 세포의 증식률을 도시한다.
도 2는 G-Rex 배양 플라스크, 배양 백 및 T75 배양 플라스크에서의 CAR-T 세포의 성장 곡선 상의 변화를 도시한다.
도 3은 G-Rex 배양 플라스크, 배양 백 및 T75 배양 플라스크에서의 CAR-T 세포의 양성률 곡선 상의 변화를 도시한다.
도 4는 CAR-T 세포의 증식에 대한 상이한 세포 배양 첨가제의 효과를 도시한다.
도 5는 상이한 분류 방법에서 세포의 증식률을 도시한다.
광범위하고 심층적인 연구 후에, 본 발명자들은 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하기 위한 독특하고 혁신적인 무혈청 배양 프로세스를 처음으로 개발하였다. 본 발명의 무혈청 배양 방법에 근거하여, 키메라 항원 수용체 T 세포의 배양 성공률과 수율을 상승시킬 수 있을 뿐만 아니라 CAR-T 세포에 대한 혈청의 독성 부작용을 피할 수 있고 혈청으로 인해 도입된 위험을 상당히 감소시키거나 없앨 수 있으므로, 키메라 항원 수용체 T 세포 면역요법의 추가 개발 및 촉진에 도움을 제공할 수 있다. 이를 기준으로 하여, 본 발명이 완성된다.
전문 용어
방법
본 발명에서는, 양성 분류 또는 음성 분류가 사용될 수 있다. 바람직한 분류 방법은 MACS를 기반으로 하는 분류 방법이다. 예를 들어, 클리니MACS 기술이 분류에 사용될 수 있다.
MACS는 고도로 특이적인 세포 분류 기술이다. 주요 성분은 MACS 마이크로 스피어, MACS 분류 컬럼 및 MACS 분리기를 포함한다. MACS 마이크로 스피어는 고도로 특이적인 모노클로날 항체와 커플링된 초상자성 입자이다. MACS 분류 컬럼은 영구 자기장의 MACS 분리기에 배치된다. 음성 분류는 세포 혼합물로부터 비-표적 세포에서의 자기 마커를 제거하는 방법이며, 즉 비-자기적으로 표지된 세포가 표적 세포이다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 원하는 표적 세포를 수득하도록, 음성 분류를 위한 클리니MACS 또는 클리니MACS플러스 분류 기술 (및 장치)을 채택한다.
전형적으로, 본 발명에서 분류된 세포는 본질적으로 CD3 양성 세포로 구성된다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본원에 사용된 바와 같이, 키메라 항원 수용체 (CAR)는 세포외 도메인, 임의적 힌지 영역, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 임의적 신호 펩티드 및 표적 특이적 결합 요소 (항원 결합 도메인으로서 공지되기도 함)를 포함한다. 세포내 도메인은 공동 자극 분자 및 ζ 쇄 부분을 포함한다. CAR이 T 세포에서 발현되면, 세포외 세그먼트가 특이적 항원을 인식한 다음, 세포내 도메인을 통해 신호를 변환시켜, 세포 활성화 및 증식, 세포 용해 독성, 및 세포 인자, 예컨대 IL-2 및 IFN-γ의 분비를 유발하고, 종양 세포에 영향을 미치며, 종양 세포가 성장하지 못하도록 하거나 또는 사멸되도록 촉진시키거나 또는 다른 방식으로 영향을 받게 하고, 환자의 종양 부담을 감소시키거나 제거하게 한다. 항원 결합 도메인은 바람직하게, 공동 자극 분자 및 ζ 쇄로부터의 하나 이상의 세포내 도메인과 융합된다.
제제
본 발명은 본 발명의 제3 측면에 구체적으로 기재된 바와 같은 세포 제제를 제공한다. 구현 방식에서, 세포 제제는 (a) 본 발명의 제2 측면에 기재된 키메라 항원 수용체 T 세포 및 (b) 제약상 허용되는 담체를 함유한다. 구현 방식에서, 세포 제제는 액상 제제 (예를 들어, 주사제)이다.
본 발명은 하기 주요 이점을 갖는다:
(a) 통상의 세포 배양과 비교해서, 본 발명의 배양 방법은 세포에 대한 독성 부작용이 있는 물질의 도입을 방지하고 키메라 항원 수용체 T 세포의 배양 성공률과 안전성을 크게 개선시키기 위해 무혈청 배지 및 G-Rex와 같은 배양 시스템을 채택한다.
(b) 본 발명의 배양 방법은 특별히 최적화된 프로세스 흐름을 채택함으로써, 키메라 항원 수용체 T 세포의 배양의 유효성, 특히 수거된 CAR-T 세포의 양성률 및 수율을 상당히 개선시킨다.
본 발명은 구체적 실시양태와 연계해서 추가로 기재될 것이다. 이들 실시양태는 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다. 하기 실시양태에서 구체적 조건을 나타내지 않는 실험 방법은 정상적으로 통상의 조건, 예컨대 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 조건을 따르거나, 또는 제조업체가 권장하는 조건을 따른다. 달리 명시되지 않는 한, 백분율 및 부는 중량 백분율 및 중량 부이다.
시약
무혈청 배지: 기본 배지 + 알부민
실시양태 1
배지 선택
1.1 냉동보존되거나 신선한 PBMC
300x106개 내지 1000x106개의 세포 수를 갖는 냉동보존되거나 신선한 PBMC를 취하고, 이러한 PBMC를 무혈청 배지에 재현탁시킨다.
1.2 분류
CD19 및 CD14 표지화 자기 비드를 사용하여 PBMC를 표지시키고 이를 30분 동안 인큐베이션하고, 요구 사항에 따라 클리니MACS 상에서의 분류에 필요한 파이프를 설치하고, 세포 인큐베이션의 완료 후, 음성 분류 작업을 수행하여 CD19 표지된 및 CD14 표지된 불순물 세포를 제거하고, 주요 성분으로서 CD3 양성 세포를 갖는 것으로 분류된 세포를 수득한다.
1.3 세포 활성화
CD3/CD28을 사용하여, 분류로부터 수득된 세포를 활성화한 다음, 1.0%의 최종 농도의 알부민을 함유하는 무혈청 배지 (IL-2가 보충됨)를 사용하여 3x106 내지 6x106/ml의 세포 밀도 하에 접종된 배양을 2일 동안 수행한다.
1.4 유전자 형질도입
세포를 원심분리하고, 상청액을 폐기한 다음, MOI 2-10에 따라 필요한 용적의 렌티바이러스를 부가하고, 무혈청 배지 (1.0%의 최종 농도의 알부민을 함유함)에 재현탁한 다음, 액체를 배양 플라스크로 옮기고 이를 37℃, 5% CO2 하에 배양한다 (12 내지 48시간).
여기서, 렌티바이러스는 표적 CAR 유전자를 발현하는 바이러스 벡터이다.
1.5 바이러스 제거
세포 현탁액을 200 내지 300 g에서 6 내지 8분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡입하여 버리고 세포를 재현탁한 다음, 세포를 무혈청 배지 (1.0%의 최종 농도의 알부민을 함유함)로 옮기고 IL-2를 50 내지 500 IU/ml의 농도로 부가함으로써, 바이러스-제거된 T 세포를 수득한다.
1.6 확장 배양
바이러스-제거된 T 세포를 G-Rex 배양 플라스크로 옮기고, 37℃, 5% CO2 하에 확장 배양을 수행한다.
3일 내지 10일의 확장 배양 후, G-Rex 병을 인큐베이터로부터 꺼내고, 세포를 잘 혼합하고, 샘플을 채취하여 세포를 계수하고, IL-2를 50 내지 500 IU/ml의 농도로 보충하고, 배양을 지속하고, 세포 산출량이 1x109 내지 1x1010개의 CAR-T 세포에 도달할 때 수거한다.
1.7 결과
수거된 세포에서, CAR-T 양성률은 20% 초과인 것으로 결정되었다.
실시양태 2.
실험 소모품의 선택
2.1 PBMC 소생, 분류, 세포 활성화 및 유전자 형질도입
냉동보존된 PBMC의 소생, 분류, 세포 활성화, 유전자 형질도입에 대해 실시양태 1에서와 동일한 방법을 사용한다.
2.2 바이러스 제거
전술한 세포 현탁액을 200 내지 300 g에서 6 내지 8분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡입하여 버리고 세포를 가볍게 두드려 재현탁되도록 하여 바이러스-제거된 T 세포를 수득한다.
2.3 확장 배양
바이러스-제거된 T 세포를 배지 (옵트마이저 SFM+1.0% 알부민)로 옮기고, IL-2 (최종 농도는 25 IU/ml이다)를 부가한 다음, G-Rex 배양 플라스크, 배양 백 및 T75 배양 플라스크로 각각 옮긴 다음, 37℃, 5% CO2 하에 배양을 지속한다.
3일 동안 배양을 지속한 후, G-Rex 배양 플라스크, 배양 백 및 T75 배양 플라스크로부터 각각 샘플을 채취하고, 세포를 계수하고 세포 밀도와 세포 생존율을 기록한다. 시험을 위해 샘플을 비축한다.
IL-2 (최종 농도는 25 IU/ml이다)를 보충한 다음, 지속적으로 배양하기 위해 인큐베이터에 다시 넣는다.
1일 동안 배양을 지속한 후, G-Rex 배양 플라스크, 배양 백 및 T75 배양 플라스크로부터 각각 샘플을 채취하고, 세포를 계수하고 세포 밀도와 세포 생존율을 기록한다. 시험을 위해 샘플을 비축한다.
2일 동안 배양을 지속한 후, G-Rex 배양 플라스크, 배양 백 및 T75 배양 플라스크로부터 각각 샘플을 채취하고, 세포를 계수하고 세포 밀도와 세포 생존율을 기록한다. 시험을 위해 샘플을 비축한다.
2.4 결과
도 2에 도시된 바와 같이, CAR-T 세포는 배양 백 및 배양 플라스크에서보다 G-Rex 배양 시스템에서 제3일 내지 제5일에 더 신속한 세포 증식률을 나타냈으며; 도 3에 도시된 바와 같이, CAR-T 세포는 G-Rex에서 높은 수준의 CAR 양성률을 유지할 수 있었고 적절한 정도는 세포 배양 백 및 배양 플라스크에서보다 더 적었으며; 요약하면, 단시간에 많은 수의 CAR-T 양성 세포가 필요한 경우, G-Rex는 세포 배양 백 및 배양 플라스크에 비해 더 높은 증식률과 더 높은 양성률의 이점을 갖고 있다.
실시양태 3.
세포 배양 첨가제 실험
3.1 방법
본 실시양태에서는, 상이한 첨가제 IL-2, IL-7, IL-15 또는 그의 조합을 세포 배양 배지에 부가하였고, 총 5개의 실험군이 있었다.
<표 1>
냉동보존된 PBMC의 소생, 분류, 자기 비드 표지된 활성화, 유전자 형질도입, 자기 비드 제거, 바이러스 제거 및 확장 배양을 수행하기 위해 실시양태 1에서와 동일한 방법을 사용한다.
1) 사용된 배지는 옵트마이저 SFM+알부민 (최종 농도는 1.0%였다)이다.
2) IL-2를 부가하는 단계 모두를, 배양을 위해 표 1에서의 실험군 2 내지 5에 상응하는 세포 인자로 대체하였다.
3.2 결과
도 4에 도시된 바와 같이, 배양 시스템에서 세포 인자 IL-2, IL-7 및 IL-15의 조합은 세포 증식 증가에 대하여 가장 좋은 효과를 보였으며, CAR-T 세포의 양을 증가시키는 데 도움이 되었다.
실시양태 4.
양성 분류와 음성 분류의 비교 실험
4.1 연구 목적:
양성 분류 방법 및 음성 분류 방법을 각각 사용하여 세포 배양에 미치는 동일한 PBMC의 효과를 비교한다.
4.2 세포 분류:
소생된 PBMC를 분류 완충액에 재현탁하고, 이를 2개의 동일한 부분으로 나누며 각각 음성 분류 CD19+CD14+ 및 양성 분류 CD3+를 수행한다.
4.3 세포 활성화:
분류된 세포를 배양 배지에 접종하고, 활성화 자기 비드를 부가하고, 이들을 잘 혼합하고, 이들을 배양한다.
4.4 바이러스 형질감염:
배양이 둘째 날에 도달했을 때 활성화된 세포의 수를 계산하고, MOI (2 내지 10)를 기반으로 하여 필요한 렌티바이러스 벡터의 수를 계산하고, 상응하는 렌티바이러스 벡터를 취하고, 이를 배양 배지에 고르게 재현탁하고, 원심분리하여 원래의 세포 상청액을 제거하고, 재현탁을 위해 렌티바이러스 벡터 현탁액을 부가하고, 배양을 지속한다.
4.5 바이러스 및 활성화 자기 비드를 제거한다:
배양 제3일에, 원심분리에 의해 바이러스를 제거하고 자기 그레이트에 의해 활성화 자기 비드를 제거하고, 배양 배지를 부가하여 배양을 지속한다.
배양 제8일에 시험을 시행한다.
4.6 결과
그 결과가 표 2 및 도 5에 제시된 바와 같다:
<표 2>
음성 분류 방법에 의해 PBMC로부터 수집된 표적 세포의 비율은 양성 분류 방법에 의해 PBMC로부터 수집된 표적 세포의 비율에 근접하였지만, 세포 증식 프로세스에 대해서와 같이, 음성 분류 방법이 양성 분류 방법과 비교해서 뚜렷한 증가를 나타냈다. 요약하면, 음성 분류 방법의 사용이 결국, 더 많은 양성 세포 CD3의 수거로 이어졌다.
본 발명에서 언급된 모든 문서는 각각의 문서가 개별적으로 참고문헌으로서 인용된 것처럼 본원에 참고문헌으로서 인용되었다. 추가로, 본 발명의 상기 교시된 내용을 판독한 후, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명에 대해 다양한 변화 또는 변경을 수행할 수 있으며, 이러한 등가 형태가 또한 본 출원의 청구범위에 의해 한정된 범위 내에 속할 것임을 이해해야 한다.
Claims (10)
- (a) 무혈청 배지에 재현탁되는 PBMC 세포를 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)에서의 PBMC 세포에 대해 음성 분류 처리를 수행하여 분류된 PBMC 세포를 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 분류된 PBMC 세포를 활성화하여 활성화된 T 세포를 수득하는 단계;
(d) 키메라 항원 수용체를 발현하는 바이러스 벡터를 사용하여 단계 (c)에서 수득된 활성화된 T 세포 상에서 유전자 형질감염을 수행하여 형질감염된 T 세포를 수득하는 단계;
(e) 형질감염된 T 세포로부터 바이러스를 제거하여 바이러스-제거된 T 세포를 수득하는 단계; 및
(f) 바이러스-제거된 T 세포를 확장 배지에 재현탁하고 확장 배양을 수행하여 키메라 항원 수용체 T 세포를 수득하고, 키메라 항원 수용체 T 세포가 미리 결정된 양에 도달할 때 키메라 항원 수용체 T 세포를 수거하는 단계이며, 여기서 확장 배지는 세포 인자를 함유하는 무혈청 배지인 단계
를 포함하는, 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는 무혈청 방법. - 제1항에 있어서, 무혈청 배지가 모든 단계에서 사용되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (c)에서, 활성화 처리가 기본 배지 및 첨가제를 함유하는 활성화 배지에서 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 기본 배지가 하기 군: LONZA X-VIVO, LIFE CTS AIM V, LIFE 옵트마이저 SFM, RPMI 1640, 이뮤노컬트™-XF 및 스템리네아로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 첨가제가 하기 군: 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 혈청 알부민, 식물-유래 재조합 알부민 또는 그의 조합, 바람직하게 재조합 알부민으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (f)에서의 확장 배지가 세포 인자를 추가로 함유하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 인자가 하기 군: IL-2, IL-15, IL-7 또는 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (f)에서, 확장 배양이 하기 군: 배양 플라스크, 배양 백, 또는 그의 조합으로부터 선택되는 용기에서 수행되는 것인 방법.
- 제1항에 기재된 바와 같은 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는 무혈청 방법에 의해 제조되는 키메라 항원 수용체 T 세포.
- (a) 제2항에서의 키메라 항원 수용체 T 세포 및 (b) 제약상 허용되는 담체를 함유하는 세포 제제.
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