CN102321580A - 一种治疗自体自身免疫性疾病的调节t细胞及其制备方法 - Google Patents
一种治疗自体自身免疫性疾病的调节t细胞及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102321580A CN102321580A CN201110243223A CN201110243223A CN102321580A CN 102321580 A CN102321580 A CN 102321580A CN 201110243223 A CN201110243223 A CN 201110243223A CN 201110243223 A CN201110243223 A CN 201110243223A CN 102321580 A CN102321580 A CN 102321580A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- antibody
- concentration range
- tgf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种在体外诱导自身免疫性疾病患者T细胞转化成为治疗自体自身免疫性疾病的调节T细胞的方法及制得的调节T细胞。该方法包括如下步骤：将分离的原始T细胞给予抗CD3/CD28抗体刺激，同时给予由以下(1)～(4)成分组成的复合配方进行刺激：(1)IL-2，IL-1，IL-7，TNF-α和IL-15中的任何一种或多种；(2)TGF-β；(3)维甲酸，棕榈酸盐，视黄醛，合成的类视黄醇，异维A酸，依曲替酯和曲古菌素A中的任何一种或多种；和(4)氮胞啶和/或1-b-d-呋喃核糖-2(1h)-嘧啶。该调节T细胞可应用于制备预防或治疗自身免疫性疾病或保护器官移植免疫排斥的药物。
Description
技术领域
本发明属于细胞治疗领域，特别涉及一种治疗自身免疫性疾病或预防器官移植排斥的诱导性调节T细胞及其制备方法。
背景技术
调节T细胞(regulatory T cells)或者抑制性T细胞(suppressor T cells)是体内重要的一群细胞，在调节正常人免疫性自我稳定性方面起了重要的作用。主要抑制针对自身组织的抗原产生的自身免疫反应。这群细胞的缺乏，减少和功能下降均与自身免疫性疾病的发生和发展有密切关系。这群细胞表达一个调节T细胞特征性的蛋白质：Foxp3。这群细胞目前至少有二群，一群产生于胸腺中，为自然发生的，称为自然的调节T细胞，或称“nTregs”。另外一群是从胸腺外通过转化诱导产生的调节T细胞，称诱导性调节T细胞，或称“iTregs”。
虽然nTregs在免疫稳定性中起了重要的作用，并且，注射这些细胞到多种自身免疫性疾病中能够很好的预防疾病的发生和发展，但是，使用这群细胞到已经发病的系统性红斑狼疮小鼠和胶原诱导性关节炎小鼠中，它们的治疗效果不甚理想甚至缺乏。几个因素限制了自然调节T细胞的对自身免疫性疾病的治疗效果。一是缺乏充分的数量，二是它们在炎症状态下缺乏免疫抑制能力，三是它们在炎症状态下的不稳定性，它们可以转化成为T辅助细胞或者效应细胞，这个时候它们不仅不能够抑制异常的免疫反应，反而加重异常的免疫反应并且可能恶化疾病。
体外诱导性调节T细胞是指通过某种/某些细胞因子，使常规的非调节T细胞变化称为调节T细胞。使用IL-10能够诱导Tr1调节T细胞，这群细胞产生高水平的IL-10，但是不表达Foxp3，通过IL-10来抑制免疫反应。Tr1因为产生高水平的IL-10，明显不适合于某些自身免疫性疾病的治疗。比如，系统性红斑狼疮的病人，其血清中含有高水平的IL-10。IL-10可能刺激B细胞，产生大量的自身免疫性反应的自身抗体。因此，产生高水平的IL-10对这些疾病的治疗不合适。另外一群是TGF-β转化诱导的调节T细胞，这群细胞可能通过释放活性TGF-β来抑制免疫反应，它们表达Foxp3。TGF-β转化诱导的调节T细胞是另外的治疗自身免疫性疾病的选择，但是，TGF-β却不能够诱导人的CD4+细胞变化成为调节T细胞(Tran DQ et al.Blood.2007；110：2983-90)。另外，TGF-β更不能够诱导自身免疫性疾病状态下的细胞变化成为调节T细胞(见本发明的结果，下文)。因此，为治疗自身免疫性疾病和另外的炎症性疾病考虑，提供一个新的能够诱导自身免疫性疾病患者的细胞转化成为调节T细胞的方法，会为治疗这些疾病提供新的治疗手段。
6％的人群患有自身免疫性疾病。目前这类疾病缺乏治愈手段。目前的药物治疗均是对症治疗，长期使用，有严重的毒副作用。50％的病人在首次诊断后的二十二年内死亡。如果病人产生了肾脏的并发症，必须使用免疫抑制剂。但是，使用免疫抑制剂之后，10％的病人会在二年内死亡。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对目前缺乏治疗自身免疫性疾病的诱导性调节T细胞的缺陷，提供一种诱导T细胞转化成为治疗自身免疫性疾病细胞的调节T细胞的方法及所得到的调节T细胞。该方法能够诱导自身免疫性疾病的动物或人的T细胞转化成为调节T细胞，该调节T细胞能够治疗自身免疫性疾病并且保护器官移植的免疫排斥。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种体外诱导T细胞转化成为治疗自身免疫性疾病的调节T细胞的方法，包括如下步骤：将分离的原始T细胞给予抗CD3/CD28抗体刺激，同时给予由以下(1)～(4)成分组成的复合配方进行刺激：
(1)IL-2，IL-1，IL-7，TNF-α和IL-15中的任何一种或多种，优选IL-2；
(2)TGF-β，优选TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3中的任何一种或多种；
(3)维甲酸，棕榈酸盐，视黄醛，合成的类视黄醇，异维A酸，依曲替酯和曲古菌素A中的任何一种或多种，优选维甲酸；
和(4)氮胞啶和/或1-b-d-呋喃核糖-2(1h)-嘧啶，优选氮胞啶。
本发明中，“原始T细胞”是指未曾暴露于特异抗原的T细胞，也称
T细胞。本发明可以以
T细胞为开始细胞群，也可以以
CD8+细胞和/或
CD4+细胞为开始细胞群，优选狼疮病小鼠的
CD4+细胞，胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠的
CD4+细胞，或活动期系统性红斑狼疮病人(SLE)静脉血中的分离的
CD4+细胞。
调节T细胞的转化诱导需要使T细胞得以激活。本发明使用抗CD3/CD28抗体进行刺激激活，所述的“抗CD3/CD28抗体”是指抗CD3抗体和抗CD28抗体两种抗体同时进行刺激。
本发明可以使用抗CD3/CD28抗体包埋的磁珠，通常可选用现有用于T细胞激活、扩增的商业化磁珠产品；也可以采用可溶性抗CD3/CD28抗体，或者培养皿内壁包被的抗CD3/CD28抗体进行刺激激活。除此之外，本发明也包括采取抗CD2抗体，CD2配体，LFA-3，刀豆素A(Concanavalin A，Con A)和金黄葡萄球菌内毒素B(staphylococcus enterotoxin，BSEB)中的任何一种或者多种进行刺激，该方法同样能够激活T细胞。这些激活T细胞的刺激因子的的总浓度在0.1到5.0μg/ml的范围内效果较佳。磁珠的浓度是1∶1到1∶20(1个磁珠对20个细胞)，优选1∶5(一个磁珠对5个细胞)。
本发明中，同时还给予所述的四种成分组成的复合配方进行刺激。该复合配方比任何单独成分使CD4+细胞诱导产生显著增高的Foxp3的表达水平。Foxp3是调节T细胞的表型标志。标志着它们能够抑制体外T细胞的增生和细胞因子的分泌。另外，注射这些细胞到体内，它们能够抑制免疫反应引起的疾病，是确定调节T细胞的最好功能标志。该复合配方的使用而不是任何单独成分的使用能够诱导产生调节T细胞，这些诱导产生的调节T细胞能够显著的抑制体外T细胞的反应能力。这些诱导产生的调节T细胞在注射之后能够显著的减轻自身免疫性疾病的症状。该复合配方比任何单独成分诱导产生的调节T细胞，产生显著延长疾病动物的存活。
本发明所述的该复合配方中包括但不限制细胞因子IL-2。包括另外一些细胞因子IL-1，IL-7，TNF-α和IL-15也可以单独或者结合使用，因为这些细胞因子与IL-2有相同的作用原理。IL-2可以是任何形式的活性的IL-2。在人的细胞，重组的人的IL-2是优先建议使用的。重组的人的IL-2(符合GMP标准)可以从R&D Systems(Minneapolis，MN)购买。总的说来，在培养转化诱导调节T细胞时，IL-2的浓度范围是1Unit/ml到300Units以上/ml。
本发明中所述的“Transforming growth factor-β”or“TGF-β”是指任何TGF-βs家族的活性成员，包括3个同分异构体的TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3；参见Massague，J.(1980)，J.Ann.Rev.Cell Biol 6：597.Lymphocytes andmonocytes produce the β1 isoform of this cytokine(Kehrl，J.H.et al.(1991)，IntJ Cell Cloning 9：438-450)。在人的细胞，重组的TFG-β被优先考虑使用。总的说来，在培养转化诱导调节T细胞时，TGF-β的浓度范围从大约2pg/ml到大约50ng/ml。
本发明中所述的维甲酸(all-trans retinoic acid，atRA)是维生素A的代谢衍生物。相似的，另外一些维生素A的衍生物，比如棕榈酸盐(palmitate)，视黄醛(retinal)，合成的类视黄醇(synthetic retinoids)如AM80(Tamibarotine)，异维A酸(isotretinoin)和依曲替酯(etretinate)也被建议使用和保护。通常，atRA的浓度范围是大约0.1到大约2.0μM。因为atRA主要通过促进Foxp3基因的组蛋白的乙酰化来促进调节T细胞的表型和功能的，因此，另外一些成分，比如曲古菌素A(trichostatin A)等有抑制Foxp3去乙酰化酶作用的成分也被包括在本发明中。
本发明的复合配方中所用的氮胞啶(azacytidine，azaC)是甲基化转移酶的抑制剂，抑制Foxp3基因位点的甲基化，促进调节T细胞的稳定性和功能性。除azaC之外，另外甲基化转移酶的抑制剂，比如1-b-d-呋喃核糖-2(1h)-嘧啶(1-b-D-ribofuranosyl-2(1H)-pyrimidinone)也同时包含在本发明中。azaC的浓度范围是大约0.1到大约2.0Mm。
本发明将分离的原始T细胞，置于含有所述的抗CD3/CD28抗体和(1)～(4)四种成分的细胞培养介质中，培养3～7天，即得到调节T细胞。所用的细胞培养介质是常规的T细胞培养介质，本发明优选AIM-V或者EX-VIVO 15培养液。培养的条件也是常规的T细胞培养条件，本发明优选37℃培养，培养密度优选3x106个细胞/cm2。培养介质优选每48小时换液一次，每三天或者根据细胞密度(超过1.5x106个细胞/cm2)进行分瓶培养，每隔2～3天分瓶培养一次。
因此，本发明的诱导T细胞转化成为治疗自身免疫性疾病的调节T细胞的方法的一较佳实施例包括如下步骤，将分离的原始T细胞给予抗CD3/CD28抗体刺激，抗CD3/CD28抗体的浓度范围是0.1到5.0μg/ml，同时给予由以下(1)～(4)成分组成的复合配方进行刺激：
(1)IL-2，IL-1，L-7，TNF-α和IL-15中的任何一种或多种，它们的浓度范围是1Unit/ml到300Units/ml；
(2)TGF-β，其浓度范围是2pg/ml到50ng/ml；
(3)维甲酸，棕榈酸盐，视黄醛，合成的类视黄醇，异维A酸，依曲替酯和曲古菌素A中的任何一种或多种，它们的浓度范围是0.1到2.0μM；
和(4)氮胞啶和/或1-b-d-呋喃核糖-2(1h)-嘧啶，它们的浓度范围是0.1到2.0μM。
本发明的诱导T细胞转化成为治疗自身免疫性疾病的调节T细胞的方法的另一较佳实施例包括如下步骤，将分离的原始CD4+细胞给予抗CD3/CD28抗体包裹的微小磁珠进行刺激，同时给予IL-2，TGF-β，atRA和azaC刺激，刺激浓度是：抗CD3/CD28抗体0.1到5.0μg/ml，磁珠浓度1∶1到1∶20(1个磁珠对20个细胞)，IL-2是1Unit/ml到300Units/ml，TGF-β是2pg/ml到50ng/ml；atRA是0.1到2.0μM，azaC是0.1到2.0μM；刺激时间为3-7天。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明采用全新的技术方法，结合使用细胞因子IL-2，TGF-β，atRA and AzaC能够诱导各种自身免疫性疾病患者的原始CD4+和CD8+细胞或者整个T细胞，在抗CD3/CD28刺激下，分化成为具有免疫抑制活性的“调节T细胞”。注射这些细胞(从动物疾病中诱导)到自身免疫性疾病动物模型和这些细胞(从人的SLE患者诱导)到动物人性化的模型均显著抑制疾病的进展。使用这些细胞可能为未来治疗免疫性疾病的治疗提供一个新的技术方法和手段。使用病人自己的细胞可能为个体化治疗自身免疫性疾病奠定重要的基础。另外，这些细胞也对器官移植的免疫排斥有重要的保护价值。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1显示复合配方诱导狼疮小鼠CD4+细胞表达高水平的Foxp3。图1A.狼疮小鼠的CD4+细胞被抗CD3/CD28抗体包埋的磁珠(1∶5，即一个磁珠对5个细胞)刺激4天之后，Foxp3在CD4+CD25+细胞群中的表达情况。对照细胞1：这些细胞加了IL-2，对照细胞2：加IL-2和TGF-β；对照细胞3：加IL-2，TGF-β和atRA。CD4+iTregs：加IL-2，TGF-β，atRA和AzaC。注：iTreg细胞而不是对照细胞表达高水平的Foxp3。图1B.数据是4个分开试验的数据结合，统计学比较了CD4+iTregs和对照细胞。图1C.Foxp3在这些细胞中的动态表达(第二天，第四天和第七天)。提示复合配方不仅增加，而且也维持高水平的Foxp3表达水平。
图2显示复合配方诱导的狼疮小鼠CD4+细胞显著地抑制体外T细胞的增生。图2A.狼疮小鼠的T细胞被绿色荧光素(CFSE)标记。这些细胞被抗CD3抗体进行刺激，20％的对照细胞或CD4+iTregs细胞被加到另外一些培养孔中。三天之后，检测CFSE的稀释情况(即T细胞增生情况)(以百分比显示)。图2A中的细胞为CD8+细胞门，排除了CFSE稀释的细胞中混有对照CD4+细胞或CD4+iTregs细胞的可能性。图2A为4个分开的实验的代表数据。2B.各种细胞对狼疮小鼠的T细胞增生的抑制情况转化成为抑制百分比。图2B是4个实验的综合数据。注：对照细胞1没有任何免疫抑制活性，对照细胞2和3有一点免疫抑制活性。由复合配方诱导的CD4+细胞变成了最理想的调节T细胞，因为他们有强的抑制T细胞的增生能力。
图3显示复合配方诱导的狼疮小鼠CD4+细胞显著地抑制狼疮小鼠的蛋白尿水平和肾小球的抗原抗体复合物的沉淀。图3A.对照细胞和CD4+iTregs用图1相似的方法诱导。5x106细胞个对照细胞1，2，3或CD4+iTreg细胞被静脉注射到24周龄的BWF1小鼠中。这些小鼠在24周时已经有了显著的蛋白尿。32周时，我们进一步检测各个组别的小鼠的蛋白尿水平。图是每组5个小鼠的综合数据。实验被重复一次并且有相似的结果。图3B.3A实验的小鼠在32周时候被处死，肾脏组织制成冰冻切片，免疫荧光染色，确定IgG1的表达情况。显示在接受CD4+iTreg细胞的小鼠，肾脏肾小球的抗原抗体复合物的沉淀水平最小。
图4显示复合配方诱导的狼疮小鼠的CD4+细胞治疗狼疮小鼠之后，能够显著延长疾病小鼠的存活。实验如图3所示。动物的存活被统计了。注：仅仅注射CD4+iTreg细胞能够显著延长狼疮小鼠的存活。
图5显示复合配方诱导的胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠的CD4+细胞能够控制关节炎疾病的进展。对照细胞和CD4+iTreg细胞按照图3的方法相似地从已经患病的CIA小鼠中进行诱导。5x106细胞个对照细胞1，2，3或CD4+iTreg细胞被静脉注射到14天前已经被II型胶原和佐剂免疫的DBA/1小鼠中，小鼠的关节炎的严重性被标准的计分方法所记录。结果显著，仅仅CD4+iTreg细胞显著地抑制了关节炎的严重程度。
图6显示复合配方也能够诱导活动期的SLE病人的CD4+细胞成为CD4+iTreg细胞。首先从活动期SLE病人身上获得静脉血并且制备成为
CD4+细胞。这些细胞用抗CD3/CD28包埋的磁珠进行刺激，结合IL-2(对照细胞1)，IL-2+TGF-β(对照细胞2)，IL-2+TGF-β+atRA(对照细胞3)和IL-2+TGF-β+atRA+Azac(CD4+iTreg细胞)进行诱导。从该SLE病人中制备20x106PBMC并且注射到SCID common gamma chain KO小鼠中，这些小鼠会发展成为xeno-GVHD，这些小鼠在接受细胞注射之后的22天全部死亡。同时注射对照细胞1几乎没有保护效果。同时注射对照细胞2和3，适当的延长了小鼠的存活。但是，同时注射CD4+iTreg细胞显著地延长了小鼠的存活。各个试验组至少包括6个小鼠，试验被重复了一次并且有相似的结果。
具体实施方式
本发明以原始T细胞为开始细胞群，给予抗CD3/CD28抗体刺激，同时给予IL-2，TGF-β，atRA和azaC刺激，从而使之转化成为调节T细胞，这些调节T细胞对自身免疫性疾病的治疗有疗效。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
首先制备狼疮小鼠的CD4+细胞。取24周龄以上的自发性狼疮小鼠BWF1(美国Jackson Laboraotry公司)数只。用蛋白尿试纸检测小鼠的蛋白尿水平。待水平达到或者超过500mg/dL，表示小鼠已经患有典型的狼疮疾病。将小鼠常规处死之后，无菌状态下分离脾脏。研碎脾脏，获得脾脏单细胞悬液。通过一个尼龙毛的柱子，把脾脏单细胞分成尼龙膜粘附的细胞和尼龙膜非粘附细胞。这些尼龙膜非粘附细胞悬液被加抗PE荧光染料标记的CD11b，CD220，CD44抗体(每1x106个细胞，加1μg抗体)。如果制备CD4+细胞，则另外加抗PE荧光染料标记的CD8+抗体，如果制备CD8+细胞，则另外加抗PE荧光染料标记的CD4+抗体。4℃冰箱中孵育20分钟。然后加抗PE抗体结合的磁珠孵育20分钟(4℃)，之后把细胞转到MACS(德国公司)的分离柱子中。与柱子分离的细胞部分就是
CD4+或者CD8+细胞。这些细胞制成之后，用抗体标记(CD62L和CD4+)，这些细胞通常表达99％的CD4和CD62L(L-选择素)，表示为纯化的未接触抗原的原始T细胞。
这些细胞用AIM-V和EX-VIVO 15培养液进行稀释和培养。细胞计数之后，在12孔培养皿中，每孔加入3x106细胞，然后加入下面列出的多种成分。保证总体积在2ML。在37℃培养箱中，细胞培养3-7天，优选4天。
在每个培养孔中加入6x105个抗CD3/CD28抗体包被的磁珠(美国Invitrogen公司)。加IL-2(终浓度为40Units/ml)，TGF-β(终浓度为2ng/ml)，atRA(0.5μM)和AzaC(0.5μM)进行培养。
本发明(CD4+iTregs)：抗CD3/CD28抗体包埋的磁珠(1∶5，一个磁珠对5个细胞)，加了IL-2，TGF-β，atRA和AzaC，浓度见上。
对照细胞1：抗CD3/CD28抗体包埋的磁珠(1∶5，一个磁珠对5个细胞)，加了IL-2(40units/ml).
对照细胞2：抗CD3/CD28抗体包埋的磁珠(1∶5，一个磁珠对5个细胞)，加IL-2(40units/ml)和TGF-β(2ng/ml)；
对照细胞3：抗CD3/CD28抗体包埋的磁珠(1∶5，一个磁珠对5个细胞)，加IL-2(40units/ml)，TGF-β(2ng/ml)和atRA(0.5μM)。
这些细胞37℃培养，培养介质每48小时换液一次，细胞密度超过3x106个细胞/cm2分瓶培养一次。培养4天后，收获细胞，离心，去除上清液。然后在2x105个细胞中加20μl PBS，2μl抗CD25和2μl抗CD4抗体。表面染色之后，才对细胞进行固定和穿透。之后，加抗Foxp3抗体，2μl，在冰上20分钟之后，用PBS洗涤去掉多余的未结合的抗体，在流式细胞仪上进行分析。结果见图1。从图1A可见，本发明细胞而不是对照细胞1～3表达高水平的Foxp3。从图1C可见，本发明复合配方不仅增加，而且也维持高水平的Foxp3表达水平。
实施例2
对照细胞和本发明的调节T细胞按照实施例1的方法制备。
然后从狼疮小鼠中制备T细胞。具体方法是：小鼠常规处死之后，无菌状态下分离脾脏。研碎脾脏，获得脾脏单细胞悬液。通过一个尼龙毛的柱子，把脾脏单细胞分成尼龙膜粘附的细胞和尼龙膜非粘附细胞。这些尼龙膜非粘附细胞悬液被加抗PE荧光染料标记的CD11b，CD220，CD44抗体(每1x106个细胞，加1μg抗体)。4℃冰箱中孵育20分钟。然后加抗PE抗体结合的磁珠孵育20分钟(4℃)，之后把细胞转到MACS(德国公司)的分离柱子中。与柱子分离的细胞部分就是
T细胞。这些细胞制成之后，用抗体标记(CD62L和CD3+)，这些细胞通常表达99％的CD3和CD62L(L-选择素)，表示为纯化的未接触抗原的原始T细胞。
这些细胞然后与一种绿色荧光Carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE)羧基荧光素琥珀酰亚胺酯进行结合标记。标记的时候使用CFSE终浓度为1μM。37℃，10分钟，避光。之后，用PBS洗涤细胞3次。这些细胞用抗CD3抗体(0.25μg/ml)进行刺激，20％的对照细胞或CD4+iTregs细胞被加到另外一些培养孔中。三天之后，检测CFSE的稀释情况(即T细胞增生情况)(以百分比显示)。图2A中的细胞为CD8+细胞门(可以在流式细胞仪上设定)，排除了CFSE稀释的细胞中混有对照CD4+细胞或CD4+iTregs细胞的可能性。图2A为4个分开的实验的代表数据。在图2B中，各种细胞对狼疮小鼠的T细胞增生的抑制情况转化成为抑制百分比。图2B是4个实验的综合数据。
实施例3
用实施例1的方法获得调节T细胞。这些细胞收集之后，用PBS洗涤三次。之后，将5x106细胞个对照细胞1，2，3或CD4+iTreg细胞，溶于200μl的PBS中，通过尾静脉注射到24周龄的BWF1小鼠(美国Jackson Laboratory公司)中。这些小鼠在24周时已经有了显著的蛋白尿，表示这些注射的小鼠已经发病。32周时(即注射这些细胞治疗之后的8周)，我们进一步检测各个组别的小鼠的蛋白尿水平。图3A是每组5个小鼠在32周时蛋白尿水平检测的综合数据。实验被重复了一次并且有相似的结果。
在注射细胞治疗的8周(即小鼠32周龄)时候将小鼠处死，取肾脏组织制成冰冻切片，免疫荧光染色，确定IgG1的表达情况。结果见图3B，可见在接受CD4+iTreg细胞的小鼠，肾脏肾小球的抗原抗体复合物的沉淀水平最小。
实施例4
统计实施例3的小鼠的存活率，结果见图4。图4显示复合配方诱导的狼疮小鼠的CD4+细胞治疗狼疮小鼠之后，能够显著延长疾病小鼠的存活。仅仅注射CD4+iTreg细胞能够显著延长狼疮小鼠的存活。
实施例5
对照细胞和CD4+iTreg细胞按照实施例3的方法相似地从已经患病的CIA小鼠中的
CD4+细胞进行诱导。
胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠模型的制备：用II型胶原和佐剂免疫DBA/1小鼠(美国Jackson Laboratory公司)，并且用标准的计分方法记录小鼠的关节炎的严重性(Brand DD，Latham KA，Rosloniec EF.Collagen-inducedarthritis.Nat Protoc.2007；2(5)：1269-75)。
按照实施例3的方法，将5x106细胞个对照细胞1，2，3或CD4+iTreg细胞静脉注射到14天前已经被II型胶原和佐剂免疫的DBA/1小鼠中。每天记录小鼠的关节炎情况，计算总关节炎炎症分数，结果见图5。图5显示本发明复合配方诱导的胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠的CD4+细胞能够控制关节炎疾病的进展。并且效果显著，仅仅CD4+iTreg细胞显著地抑制了关节炎的严重程度。
实施例6
从活动期系统性红斑狼疮病人(SLE)病人身上获得静脉血。采用密度梯度离心法用淋巴细胞分离液(Cellgro，Manassas，USA)分离肝素抗凝的病人外周血中的单个核细胞(PBMC)。采用花环沉降法用绵羊红细胞分离PBMC中的E+细胞。在E+细胞中加入用小鼠杂交瘤细胞OKT8(anti-humanCD8)、L243(anti-human HLA-DR)、OKMI (anti-human CD11b)、3G8(anti-human CD16)、UCHL-1(anti-human CD45RO)制备的抗体(美国加州BD公司)，4℃孵育20分钟，加入Dynabeads Goat anti-Mouse IgG(美国加州Invitrogen公司)，4℃震荡15分钟，静置于磁场中，让结合了磁珠的阳性细胞充分吸附于靠磁场的管壁，轻轻吸取细胞悬液，即可获得
CD4+T细胞悬液。可将该过程重复一次，以提高纯度。
这些细胞用抗CD3/CD28包埋的磁珠进行刺激，结合IL-2(对照细胞1)，IL-2+TGF-β(对照细胞2)，IL-2+TGF-β+atRA(对照细胞3)和IL-2+TGF-β+atRA+Azac(CD4+iTreg细胞)进行诱导。诱导的方法同实施例1。
从该SLE病人中制备20×106PBMC，溶解在200μl的PBS中，然后通过尾静脉注射到SCID common gamma chain KO小鼠(美国JacksonLaboratory公司)中。这些小鼠会发展成为xeno-GVHD(异种供体抗宿主的免疫反应)，这些小鼠在接受细胞注射之后的22天全部死亡。同时注射对照细胞1几乎没有保护效果。同时注射对照细胞2和3，适当的但无显著意义地延长了小鼠的存活。但是，同时注射CD4+iTreg细胞显著地延长了小鼠的存活。同时注射的时候，是把5x106个对照细胞或者CD4+iTreg细胞与20×106PBMC进行混匀，溶解在300μl的PBS中，然后通过尾静脉注射到SCID common gamma chain KO小鼠(美国Jackson Laboratory公司)中。各个试验组至少包括6个小鼠，试验被重复了一次并且有相似的结果。结果见图6，显示本发明复合配方也能够诱导活动期的SLE病人的CD4+细胞成为CD4+iTreg细胞。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种在体外诱导自身免疫性疾病患者的T细胞转化成为治疗该自体自身免疫性疾病的调节T细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：将分离的原始T细胞给予抗CD3/CD28抗体刺激，同时给予由以下(1)～(4)成分组成的复合配方进行刺激：
(1)IL-2，IL-1，IL-7，TNF-α和IL-15中的任何一种或多种；
(2)TGF-β；
(3)维甲酸，棕榈酸盐，视黄醛，合成的类视黄醇，异维A酸，依曲替酯和曲古菌素A中的任何一种或多种；
和(4)氮胞啶和/或1-b-d-呋喃核糖-2(1h)-嘧啶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的原始T细胞是
CD4+细胞和/或
CD8+细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗CD3/CD28抗体用抗CD2抗体，CD2配体，LFA-3，刀豆素A和金黄葡萄球菌内毒素B中的任何一种或者多种替代。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤，将分离的原始T细胞给予抗CD3/CD28抗体刺激，抗CD3/CD28抗体的浓度范围是0.1到5.0μg/ml，同时给予由以下(1)～(4)成分组成的复合配方进行刺激：
(1)IL-2，IL-1，L-7，TNF-α和IL-15中的任何一种或多种，它们的浓度范围是1Unit/ml到300Units/ml；
(2)TGF-β，其浓度范围是2pg/ml到50ng/ml；
(3)维甲酸，棕榈酸盐，视黄醛，合成的类视黄醇，异维A酸，依曲替酯和曲古菌素A的任何一种或多种，它们的浓度范围是0.1到2.0μM；
和(4)氮胞啶和/或1-b-d-呋喃核糖-2(1h)-嘧啶，它们的浓度范围是0.1到2.0μM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤，将分离的原始CD4+细胞给予抗CD3/CD28抗体包裹的微小磁珠进行刺激，同时给予IL-2，TGF-β，维甲酸和氮胞啶刺激，刺激浓度是：抗CD3/CD28抗体0.1到5.0μg/ml，磁珠浓度1个磁珠对1个细胞到1个磁珠对20个细胞，IL-2是1Unit/ml到300Units/ml，TGF-β是2pg/ml到50ng/ml；维甲酸是0.1到2.0μM，氮胞啶是0.1到2.0μM；刺激时间为3-7天。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的刺激时，所用的细胞培养介质是AIM-V或者EX-VIVO 15培养液，37℃培养3～7天，细胞培养密度是1.5x106个细胞/cm2，培养介质每48小时换液一次，每三天或者根据细胞的密度超过1.5x106个细胞/cm2进行分瓶培养，每隔2～3天分瓶培养一次。
7.如权利要求1～6任一项所述的方法制备的调节T细胞。
8.如权利要求7所述的调节T细胞在制备预防或治疗自身免疫性疾病或保护器官移植免疫排斥的药物中的应用。
9.一种体外诱导T细胞转化成为治疗自体自身免疫性疾病的调节T细胞的刺激组合物，其特征在于，包括以下组分：
(1)IL-2，IL-1，L-7，TNF-α和IL-15中的任何一种或多种，它们的浓度范围是1Unit/ml到300Units/ml；
(2)TGF-β，其浓度范围是2pg/ml到50ng/ml；
(3)维甲酸，棕榈酸盐，视黄醛，合成的类视黄醇，异维A酸，依曲替酯和曲古菌素A中的任何一种或多种，它们的浓度范围是0.1到2.0μM；
和(4)氮胞啶和/或1-b-d-呋喃核糖-2(1h)-嘧啶，它们的浓度范围是0.1到2.0μM。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，还包括抗CD3/CD28抗体，或者抗CD2抗体，CD2配体，LFA-3，刀豆素A和金黄葡萄球菌内毒素B中的任何一种或者多种，它们的浓度范围是0.1到5.0μg/ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110243223A CN102321580A (zh) | 2011-08-23 | 2011-08-23 | 一种治疗自体自身免疫性疾病的调节t细胞及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110243223A CN102321580A (zh) | 2011-08-23 | 2011-08-23 | 一种治疗自体自身免疫性疾病的调节t细胞及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102321580A true CN102321580A (zh) | 2012-01-18 |
Family
ID=45449417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110243223A Pending CN102321580A (zh) | 2011-08-23 | 2011-08-23 | 一种治疗自体自身免疫性疾病的调节t细胞及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102321580A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102839153A (zh) * | 2012-09-13 | 2012-12-26 | 济南泰生生物技术有限公司 | 一种以cd3+cd8+为主的活化淋巴细胞的扩增、冻存及复苏方法 |
| CN103436493A (zh) * | 2013-08-29 | 2013-12-11 | 浙江大学 | 雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法 |
| WO2016074580A1 (zh) * | 2014-11-14 | 2016-05-19 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高cd4阳性t淋巴细胞存活率和活性的试剂及其应用 |
| CN106754698A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-31 | 刘晓明 | 一种用于人外周血t细胞的分离及激活的方法 |
| CN108004209A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-05-08 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种脐血调节性t细胞体外扩增方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101126076A (zh) * | 2007-07-12 | 2008-02-20 | 郑颂国 | TGF-β诱导的调节T细胞及其形成方法和应用 |
| WO2009126877A2 (en) * | 2008-04-11 | 2009-10-15 | University Of Southern California | Methods and compositions for accelerating the generation of regulatory tcells ex vivo |
-
2011
- 2011-08-23 CN CN201110243223A patent/CN102321580A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101126076A (zh) * | 2007-07-12 | 2008-02-20 | 郑颂国 | TGF-β诱导的调节T细胞及其形成方法和应用 |
| WO2009126877A2 (en) * | 2008-04-11 | 2009-10-15 | University Of Southern California | Methods and compositions for accelerating the generation of regulatory tcells ex vivo |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《PLOS ONE》 20101217 Ling Lu 等 Characterization of Protective Human CD4+CD25+ FOXP3+ Regulatory T Cells Generated with IL-2,TGF-beta and Retinoic Acid 第5卷, 第2期 * |
| LING LU 等: "Characterization of Protective Human CD4+CD25+ FOXP3+ Regulatory T Cells Generated with IL-2,TGF-β and Retinoic Acid", 《PLOS ONE》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102839153A (zh) * | 2012-09-13 | 2012-12-26 | 济南泰生生物技术有限公司 | 一种以cd3+cd8+为主的活化淋巴细胞的扩增、冻存及复苏方法 |
| CN103436493A (zh) * | 2013-08-29 | 2013-12-11 | 浙江大学 | 雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法 |
| CN103436493B (zh) * | 2013-08-29 | 2016-02-03 | 浙江大学 | 雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法 |
| WO2016074580A1 (zh) * | 2014-11-14 | 2016-05-19 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高cd4阳性t淋巴细胞存活率和活性的试剂及其应用 |
| CN105597090A (zh) * | 2014-11-14 | 2016-05-25 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 一种提高cd4阳性t淋巴细胞存活率和活性的试剂及其应用 |
| CN106754698A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-31 | 刘晓明 | 一种用于人外周血t细胞的分离及激活的方法 |
| CN108004209A (zh) * | 2017-12-11 | 2018-05-08 | 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 | 一种脐血调节性t细胞体外扩增方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1730260B1 (en) | Regulatory t cells and their use in immunotherapy and suppression of autoimmune responses | |
| US20200071663A1 (en) | Methods for eliminating at least a substantial portion of a clonal antigen-specific memory t cell subpopulation | |
| JP6445437B2 (ja) | Ｂ細胞の増加及び評価方法並びに疾患治療のための増加ｂ細胞の使用方法 | |
| CN102517253B (zh) | 一种脐带血调节性t细胞体外扩增及低温保存方法 | |
| US7122340B2 (en) | Regulatory T cells; methods | |
| KR20040053133A (ko) | 세포의 활성화 및 증식 | |
| JP2006516197A (ja) | 細胞の活性化および拡大の方法 | |
| JP2021052774A (ja) | 新しい免疫調節細胞およびその製造方法 | |
| JP2019504632A (ja) | Ｎｋ細胞培養用培地添加キット、及びキットを用いるｎｋ細胞培養方法 | |
| Moore et al. | Alloreactive regulatory T cells generated with retinoic acid prevent skin allograft rejection | |
| US8603815B2 (en) | CD4+ CD25− T cells and Tr1-like regulatory T cells | |
| Yang et al. | Amelioration of acute graft‐versus‐host disease by adoptive transfer of ex vivo expanded human cord blood CD4+ CD25+ forkhead box protein 3+ regulatory T cells is associated with the polarization of Treg/Th17 balance in a mouse model | |
| CN102321580A (zh) | 一种治疗自体自身免疫性疾病的调节t细胞及其制备方法 | |
| Daniele et al. | Treg cells: Collection, processing, storage and clinical use | |
| JP2006280307A (ja) | 制御性ｔ細胞の製造方法 | |
| JP2017012010A (ja) | 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物 | |
| EP2859092B1 (en) | Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 | |
| US20150110738A1 (en) | Methods and compositions for generating and using allogeneic suppressor cells | |
| US8323969B2 (en) | Preparation of regulatory T cells using ICAM-1 co-stimulation | |
| EP1227822A2 (en) | Methods for restoring or enhancing t-cell immune surveillance following naturally or artifically induced immunosuppression | |
| US20040175373A1 (en) | Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation | |
| US6511848B2 (en) | Process for producing and multiplying lymphocytes | |
| KR101746875B1 (ko) | 면역조절 ｔ 세포를 포함하는 자가면역 질환 세포치료제 | |
| JP3381224B2 (ja) | リンパ球を生産し、そして増加させる方法 | |
| AU663711B2 (en) | Method of enhancing the immunotherapeutic activity of immune cells by depletion/positive selection of cell subsets |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120118 |