CN114058583B - 一种体外诱导外周血单核细胞扩增nk细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，总共培养十五天，包括如下步骤：(1)将包被组合物置于细胞培养容器中进行孵育包被，获得包被培养容器；(2)在培养的第一至第六天，在上述包被培养容器中用诱导培养基培养从外周血中分离获得的PBMC，获得诱导培养液；(3)在培养的第七至第十二天，将步骤(2)所得的诱导培养液经离心后，弃上清，保留沉淀，再加入增殖培养基进行培养，获得增殖培养液；(4)在培养的第十三至第十五天，在上述增殖培养液中加入活化培养基进行培养，即成。本发明可以高效、选择性的扩增外周血PBMCs中的NK细胞，增殖倍数高达946～1037倍，且获得的NK细胞的细胞毒活性显著高于直接由PBMCs中分离获得的NK细胞。

Description

一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞属于先天免疫细胞的一部分，其特征在于它们的细胞毒能力以及激活后的趋化因子和细胞因子分泌，它们是抵御包括恶性肿瘤在内的疾病的第一道防线。与T细胞、B细胞不同的是，NK细胞不需要预先致敏，而是由一系列具有激活或抑制功能的受体以独特的方式进行调控即可发挥非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞。
NK细胞具有强大的杀死肿瘤细胞或防止肿瘤细胞转移的能力，NK细胞参与对抗肿瘤细胞的各种途径：NK细胞使用的策略是当NK淋巴细胞附着肿瘤细胞时可能表达凋亡配体，例如TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)或肿瘤坏死因子家族成员如FasL，然后与肿瘤细胞上的相关受体相互作用，随后通过caspase级联诱导细胞凋亡。其他途径是通过分泌穿孔素和颗粒酶作为免疫突触形式溶解肿瘤细胞的直接途径，此外可能还可通过针对FcYRIIIA(CD16)受体发挥ADCC效应的途径。
在外周血单核细胞(PBMCs)中，NK细胞的数量很少，仅占总量的5-20％。通过体外扩增克服NK细胞数量有限的问题能够为各种恶性疾病开发NK细胞免疫疗法提供巨大的帮助。因此，开发一种高效、安全的NK细胞体外扩增培养基具有重要的临床和科研应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法。
本发明的另一目的在于提供
本发明采用技术方案如下：
一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，总共培养十五天，包括如下步骤：
(1)将包被组合物置于细胞培养容器中进行孵育包被，然后弃去包被组合物，获得包被培养容器；
(2)在培养的第一至第六天，在上述包被培养容器中用诱导培养基培养从外周血中分离获得的PBMC，获得诱导培养液；
(3)在培养的第七至第十二天，将步骤(2)所得的诱导培养液经离心后，弃上清，保留沉淀，再加入增殖培养基进行培养，获得增殖培养液；
(4)在培养的第十三至第十五天，在上述增殖培养液中加入活化培养基进行培养，即成；
上述包被组合物以PBS为溶剂，含有48-52μg/mL的BSA、8-12ng/mL的CD3 mAb和8-12ng/mL的CD16 mAb；
上述诱导培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有8-12ng/mL的CD137 mAb、480-520IU/mL的IL-2、8-12ng/mL的IL-15和15-22ng/mL的IL-12；
上述增殖培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有180-220μg/mL的灵芝多糖、17-22ng/mL的IL-12、17-22ng/mL的IL-18和17-22ng/mL的IL-21；
上述活化培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有45-53μg/mL的酵母多糖、480-520IU/mL的IL-2和8-12ng/mL的IL-15。
在本发明的一个优选实施方案中，所述包被组合物以PBS为溶剂，含有50μg/mL的BSA、10ng/mL的CD3 mAb和10ng/mL的CD16 mAb。
在本发明的一个优选实施方案中，所述诱导培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有10ng/mL的CD137 mAb、500IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-15和20ng/mL的IL-12。
在本发明的一个优选实施方案中，所述增殖培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有200μg/mL的灵芝多糖、20ng/mL的IL-12、20ng/mL的IL-18和20ng/mL的IL-21。
在本发明的一个优选实施方案中，所述活化培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有50μg/mL的酵母多糖、500IU/mL的IL-2和10ng/mL的IL-15。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)的培养的过程中，需要加入自体血浆，该自体血浆的量为所述诱导培养液的15％。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)的培养的过程中，需要加入自体血浆，该自体血浆的量为其中培养基的10％。
本发明的另一技术方案如下：
一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的试剂盒，具有包被组合物、诱导培养基、增殖培养基和活化培养基；
上述包被组合物以PBS为溶剂，含有48-52μg/mL的BSA、8-12ng/mL的CD3 mAb和8-12ng/mL的CD16 mAb；
上述诱导培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有8-12ng/mL的CD137 mAb、480-520IU/mL的IL-2、8-12ng/mL的IL-15和15-22ng/mL的IL-12；
上述增殖培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有180-220μg/mL的灵芝多糖、17-22ng/mL的IL-12、17-22ng/mL的IL-18和17-22ng/mL的IL-21；
上述活化培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有45-53μg/mL的酵母多糖、480-520IU/mL的IL-2和8-12ng/mL的IL-15。
在本发明的一个优选实施方案中，所述包被组合物以PBS为溶剂，含有50μg/mL的BSA、10ng/mL的CD3 mAb和10ng/mL的CD16 mAb；
所述诱导培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有10ng/mL的CD137 mAb、500IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-15和20ng/mL的IL-12；
所述增殖培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有200μg/mL的灵芝多糖、20ng/mL的IL-12、20ng/mL的IL-18和20ng/mL的IL-21；
所述活化培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，含有50μg/mL的酵母多糖、500IU/mL的IL-2和10ng/mL的IL-15。
在本发明的一个优选实施方案中，还包括采集PBMS和自体血浆的试剂。
本发明的有益效果是：本发明可以高效、选择性的扩增外周血PBMCs中的NK细胞，增殖倍数高达946～1037倍，且体外扩增培养后的NK细胞的细胞毒活性显著高于直接由PBMCs中分离获得的NK细胞，具有更高的临床和科研应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1的培养过程中的细胞数目变化情况图。
图2为本发明实施例1的培养过程中的NK细胞的比例变化情况图。
图3为本发明实施例2中的应用细胞流式仪检测NK细胞表面标志物情况图。
图4为本发明实施例2中的细胞活率变化情况图。
图5为本发明实施例2中的细胞细菌感染情况图。
图6为本发明实施例2中的细胞霉菌感染情况图。
图7为本发明实施例2中的细胞支原体感染情况图。
图8为本发明实施例2中的实施例1获得的NK细胞与对比例1获得的NK细胞对Raji的杀伤情况对比图。
图9为本发明实施例2中的细胞培养上清中IFN-γ的浓度检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)在含5％BSA的10mL PBS中加入10uL的CD3 mAb和CD16 mAb，充分混匀后获得包被组合物，将其加入到T75细胞培养瓶中，置于4℃过夜孵育；
(2)使用含枸橼酸钠抗凝剂的一次性负压采血管抽取10mL的外周血，将用10mL移液管将外周血小心沿管壁加入到含10mL样本密度分离液的50mL离心管，25℃，600g离心30min。离心结束后，取出离心管，可以观察到离心管内的液体从上至下分为4层，分别是淡黄色血浆层，白色环状PBMC层，分离液层和红细胞层；
(3)将血浆层用移液枪转移至新的15mL离心管中，置于56℃水浴锅中30min，然后-20℃静置10min，最后800g，离心15min，获得自体血浆置于4℃保存备用；
(4)将PBMC层用移液枪转移至新的15mL离心管中，补充PBS至12mL，充分混匀后，25℃，600g离心10min，弃上清，再加入5mLPBS重悬细胞沉淀，25℃，300g离心10min，弃上清，加入GT-T551无血清培养基1mL，充分混匀，加入到弃去所述包被组合物的T75细胞培养瓶中，补充4mL诱导培养基和500uL的自体血浆，置于培养箱中培养；培养第3天和第5天补充5mL诱导培养基和500uL的自体血浆；
(5)培养至第7天，收集细胞液，25℃，300g离心10min，加入1mL增殖培养基重悬细胞沉淀，充分混匀后补充24mL增殖培养基和2.5mL自体血浆，充分混匀后置于T225细胞培养瓶中继续培养；培养第9天和第11天分别补充60mL和270mL增殖培养基及剩余的自体血浆，并转移至640cm2细胞培养袋中继续培养。
(6)培养至第13天，补充500mL的活化培养基继续培养。
(7)培养至第15天，收集细胞液，25℃，300g离心10min，获得的NK细胞用无血清细胞冻存液冻存，-80℃短期冻存，液氮罐中长期冻存。
本实施例中，包被组合物、诱导培养基、增殖培养基和活化培养基的配方如下表所示：
本实施例的培养过程中的细胞数目变化情况如图1所示，其中NK细胞的比例变化情况如图2所示。
对比例1
从25mL外周血中分离获得PBMCs，加入500uL的无血清RMPI-1640培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液加入到聚苯乙烯圆底试管中，再加入25uL的分离试剂(EasySepTM，Catalog#18000)，充分混匀后室温孵育5min。充分涡旋RapidSphereTM半分钟，然后将25uL的RapidSphereTM加入到细胞悬液中，并补充2mL的无血清RMPI-1640培养基，充分混匀后将试管置于磁极中，室温孵育3min后，保持试管在磁极中，快速倒转试管，将上清液倒入新的15mL离心管中，25℃，300g离心5min，弃去上清，加入人源NK细胞完全培养基重悬后加入到60mm细胞培养板，置于培养箱中培养，获得NK细胞。
实施例2
对实施例1获得和培养过程中的细胞以及对比例1获得的细胞进行如下处理，并进行对比和分析。
(1)将配制好封闭液(50mL的3％BSA in PBS)，放在细胞间4℃保存。收集实施例1培养至第15天的细胞培养液，并加入PBS洗涤两次，25℃，300g离心5min，去除PBS。加入1mL封闭缓冲液在室温下孵育细胞30min。将细胞按照100uL含有106个细胞分成3份，分别加入混合均匀的同型对照抗体和CD3、CD16抗体、CD56混合抗体(均为10uL/100uL)以及无任何抗体组，室温孵育30～45min。加入1mL PBS，充分吹打混匀，25℃，300g离心5min，去除PBS，重复两次。弃上清，每管加入500uL的PBS充分混匀，并转移至1.5mL流式管中，用锡箔纸盖住细胞，最后进行上机检测，结果如图3所示。
(2)对实施例1培养过程中不同时间点所获得的细胞进行如下处理：充分混匀细胞悬液后，取20uL细胞悬液并加入20uL的台盼蓝溶液，充分混匀后取10uL混悬液，加入血细胞计数板中，计数并计算细胞活率，结果如图4所示，细胞培1～15day中，细胞活率均在90％以上，且在7～15day细胞活率稳定在95％左右。
(3)对实施例1培养至第15天的细胞培养液进行如下处理：取细胞培养上清，25℃，300g离心5min，取100uL上清，将其涂布于制备好的LB固体培养板中，以自来水和无菌双蒸水分别作为阳性对照和阴性对照，细胞的细菌感染情况如图5所示，其中，A为自来水阳性对照，B为无菌双蒸水阴性对照，C为上述上清。
(4)对实施例1培养至第15天的细胞培养液进行如下处理：取细胞培养上清，25℃，300g离心5min，取100uL上清，将其涂布于制备好的PDA固体培养板中，以自来水和无菌双蒸水分别作为阳性对照和阴性对照，细胞的霉菌感染情况如图6所示，其中，A以自来水为阳性对照，B为无菌双蒸水阴性对照，C为上述上清。
(5)实施例1和对比例1获得的细胞(分别对应图7中的NK cells和PBMCs)培养3-6天后，取其培养上清液进行PCR反应。为排除细胞培养基抑制PCR反应，阳性对照中加入等量的细胞上清液。配制第一轮PCR反应液(YEASEN，货号40601ES10)，按照下列条件进行PCR反应：
充分融解PCR Mix，再配制第二轮PCR反应液(YEASEN，货号40601ES10)，按上述条件进行第二轮PCR反应，反应结束后，取7μL的PCR反应液直接进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，获得的细胞的支原体感染情况如图7所示，其中，Positive Control为合成的支原体DNA阳性对照，Negative Control为无菌双蒸水阴性对照，PBMCs为对比例1获得的外周血单核细胞培养上清液，NK cells为实施例1诱导扩增的NK细胞培养上清液。
(6)收集处于良好生长状态的Raji细胞，用含1％FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为2×105/mL，接种100uL到相应的48孔板；分别收集生长状态良好的由对比例1获得的NK细胞(AUOTO-NK)和使用实施例1培养至第15天的NK细胞(PROL-NK)，用含1％FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为2×105/mL，1×106/mL和2×10^6/mL，接种100uL到相应的12孔板，使得效靶比分别为1∶1，5∶1和10∶1；由于效应细胞、靶细胞都会有自发性释放LDH的情况，培养基中也可能含有可使四唑盐转化为甲臜的物质，因此，除了上述不同效靶比的实验组，实验还需要设置多个对照组，分别为：
对照组1：靶细胞最大释放LDH；
对照组2：靶细胞自发释放LDH；
对照组3：效应细胞自发释放LDH。
最后，细胞毒性计算公式如下：
％细胞毒性＝(实验孔LDH-效应细胞LDH-靶细胞LDH)/(靶细胞最大LDH-靶细胞自发LDH)
对比例1和实施例1所获得的NK细胞对Raji的杀伤情况如图8所示，AUOTO-NK为对比例1中由外周血单核细胞中通过磁珠分离法获得的NK细胞，PROL-NK为实施例1中经诱导扩增培养基扩增培养获得的NK细胞。
(7)实验前30min，拿出IFN-γ ELISA检测试剂盒(Solabio，货号SEKH-0046)，恢复至室温，洗板3次并甩干。在反应孔中加入100μL标准品及检测样本(实施例1培养至第15天的细胞和对比例1所获得的细胞，依次对应图9中的NK cells和PBMCs)封板后于37℃孵箱孵育90min，孵育结束后洗板4次。然后加入100μL生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育60min，孵育结束后洗板4次。然后加入100μl酶结合物工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育30min，孵育结束后洗板5次。加入100μL显色底物至反应孔中，封板后于37℃避光显色15min，加入50μL终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值，结果如图9所示，其中，Blank为空白对照，PBMCs为对比例1中从外周血中分离获得的外周血单核细胞培养上清，NK cells为实施例1中经诱导扩增培养基扩增培养获得的NK细胞培养上清。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的方法，其特征在于：总共培养十五天，包括如下步骤：
（1）将包被组合物置于细胞培养容器中进行孵育包被，然后弃去包被组合物，获得包被培养容器；
（2）在培养的第一至第六天，在上述包被培养容器中用诱导培养基和自体血浆培养从外周血中分离获得的PBMC，获得诱导培养液，该自体血浆的量为所述诱导培养液的15%；
（3）在培养的第七至第十二天，将步骤（2）所得的诱导培养液经离心后，弃上清，保留沉淀，再加入增殖培养基和自体血浆进行培养，获得增殖培养液，自体血浆的量为增殖培养基的10%；
（4）在培养的第十三至第十五天，在上述增殖培养液中加入活化培养基进行培养，即成；
上述包被组合物以PBS为溶剂，由48-52 μg/mL的BSA、8-12 ng/mL的CD3 mAb和8-12ng/mL的CD16 mAb组成；
上述诱导培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由8-12 ng/mL的CD137 mAb、480-520IU/mL的IL-2、8-12 ng/mL的IL-15和15-22 ng/mL的IL-12组成；
上述增殖培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由180-220 μg /mL的灵芝多糖、17-22 ng/mL的IL-12、17-22 ng/mL的IL-18和17-22 ng/mL的IL-21组成；
上述活化培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由45-53 μg /mL的酵母多糖、480-520 IU/mL的IL-2和8-12 ng/mL的IL-15组成。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述包被组合物以PBS为溶剂，由50 μg/mL的BSA、10 ng/mL的CD3 mAb和10 ng/mL的CD16 mAb组成。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述诱导培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由10 ng/mL的CD137 mAb、500 IU/mL的IL-2、10 ng/mL的IL-15和20 ng/mL的IL-12组成。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述增殖培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由200 μg /mL的灵芝多糖、20 ng/mL的IL-12、20 ng/mL的IL-18和20 ng/mL的IL-21组成。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述活化培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由50 μg /mL的酵母多糖、500 IU/mL的IL-2和10 ng/mL的IL-15组成。
6.一种体外诱导外周血单核细胞扩增NK细胞的试剂盒，其特征在于：具有包被组合物、诱导培养基、增殖培养基和活化培养基；
上述包被组合物以PBS为溶剂，由48-52 μg/mL的BSA、8-12 ng/mL的CD3 mAb和8-12ng/mL的CD16 mAb组成；
上述诱导培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由8-12 ng/mL的CD137 mAb、480-520IU/mL的IL-2、8-12 ng/mL的IL-15和15-22 ng/mL的IL-12组成；
上述增殖培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由180-220 μg /mL的灵芝多糖、17-22 ng/mL的IL-12、17-22 ng/mL的IL-18和17-22 ng/mL的IL-21组成；
上述活化培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由45-53 μg /mL的酵母多糖、480-520 IU/mL的IL-2和8-12 ng/mL的IL-15组成。
7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述包被组合物以PBS为溶剂，由50 μg/mL的BSA、10 ng/mL的CD3 mAb和10 ng/mL的CD16 mAb组成；
所述诱导培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由10 ng/mL的CD137 mAb、500 IU/mL的IL-2、10 ng/mL的IL-15和20 ng/mL的IL-12组成；
所述增殖培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由200 μg /mL的灵芝多糖、20 ng/mL的IL-12、20 ng/mL的IL-18和20 ng/mL的IL-21组成；
所述活化培养基以RMPI-1640基础培养基为溶剂，由50 μg /mL的酵母多糖、500 IU/mL的IL-2和10 ng/mL的IL-15组成。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：还包括采集外周血单核细胞和自体血浆的试剂。
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