CN115125204A - 具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及体外培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞体外培养领域，公开了一种具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及体外培养的方法。该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体，避免了使用饲养层细胞共培养激活和扩增犬自然杀伤细胞带来的临床风险，降低了犬自然杀伤的制备成本和技术要求。通过该组合物培养得到的犬自然杀伤细胞能够高效扩增，而且得到的自然杀伤细胞纯度高，避免其他非自然杀伤细胞的存在引起的细胞毒性和细胞因子风暴等副作用，降低临床应用风险。

Description

具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及体外培养的 方法
技术领域
本发明涉及细胞体外培养领域，具体涉及一种具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及体外培养的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞。NK细胞可以选择性杀伤肿瘤细胞，病毒感染细胞，衰老细胞等靶细胞，在肿瘤免疫治疗，病毒疾病免疫治疗，抗衰老治疗中发挥重要作用。在临床应用中，NK细胞主要是通过培养外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)获得，体外培养可以扩增并纯化NK细胞，使其达到临床应用的数量和纯度要求。
目前，NK细胞的体外培养方法主要有饲养层细胞共培养法和单纯细胞因子刺激法。但是，在宠物犬上，高效的临床级的NK细胞体外培养方法未见有报道。
饲养层细胞共培养法是指将一些特定的细胞经有丝分裂阻断剂或者辐照处理所得的细胞，这些细胞保持代谢活性但不增殖，可以提供一些细胞生长所必需的细胞因子。比如经100/125-Gy-辐照后的K562细胞系(一种人源的慢性髓系白血病肿瘤细胞系)、EL08-1D2(小鼠胚胎干细胞源饲养细胞系)或者人类Epstein-Barr病毒转化的淋巴母细胞系，上述细胞经过基因改造后均可作为饲养层用于NK细胞的体外共培养，目前常用的是K562细胞。但是，饲养层细胞共培养法存在两个缺陷。第一，制备基因改造的饲养层细胞技术要求高，成本高。第二，饲养层细胞比如K562细胞本身为癌细胞，如果用此类细胞作为饲养层，不可避免的带来了临床应用的风险。
单纯细胞因子刺激法是指在不使用饲养层细胞共培养的情况下，加入相应细胞因子，使PBMC中的NK细胞激活并增殖。目前有多种细胞因子可用于体外激活并扩增NK细胞。但是各个物种NK细胞扩增培养所需的细胞因子可能存在不同。目前较为清楚的是人类和小鼠的NK细胞需要的细胞因子。但在宠物犬中，NK细胞增殖所需要的细胞因子及其用量尚不清楚，直接套用人类和小鼠的细胞因子配方，犬NK细胞增殖能力欠佳，扩增后的NK细胞纯度较低，不能满足临床需要。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的饲养层细胞共培养技术的技术要求高，成本高，并存在风险和单纯细胞因子刺激法使犬NK细胞增殖能力低，扩增后的NK细胞纯度低不能满足临床需要的问题，提供了一种高效的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其体外培养的方法，该组合物及其体外培养的方法，可以避免使用饲养层细胞对的宠物犬NK细胞进行体外培养，成本和技术要求低，可以提高NK细胞的增值能力，并确保扩增后的NK的纯度，使NK细胞用于宠物犬临床治疗和保健。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物，该组合物含有糖皮质激素类、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体。
本发明第二方面提供一种犬自然杀伤细胞的体外培养方法，该方法包括：将犬外周血单个核细胞与上述的组合物混合进行激活培养。
通过上述技术方案，本发明在体外扩增犬NK细胞时，不使用饲养层细胞，避免了使用肿瘤细胞饲养带来的临床应用风险，使后续细胞回输治疗更为安全，本发明能够高效的在体外从犬PBMC中扩增培养犬的NK细胞，使其细胞数量在载体外扩增20倍以上。仅需静脉采血减小了对宠物机体的伤害。使用本发明的激活组合物还可以获得高纯度的NK细胞，避免其他非NK细胞的存在引起的副作用，产生细胞毒性和细胞因子风暴等，降低风险，提高临床使用的安全性。
附图说明
图1是金毛寻回犬NK细胞体外激活过程中不同时间的显微镜照片；
图2是金毛寻回犬NK细胞体外扩增过程中不同时间的显微镜照片；
图3是金毛寻回犬NK细胞体外扩增细胞增殖曲线；
图4是金毛寻回犬NK细胞体外扩增细胞表型变化图；
图5是拉布拉多寻回犬NK细胞体外激活过程中不同时间的显微镜照片；
图6是拉布拉多寻回犬NK细胞体外扩增过程中不同时间的显微镜照片；
图7是拉布拉多寻回犬NK细胞体外扩增细胞增殖曲线；
图8是拉布拉多寻回犬NK细胞体外扩增细胞表型变化图；
图9是犬NK细胞体外扩增后纯度鉴定结果图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的“PBMC”通常是指外周血单个核细胞。“NK细胞”是指自然杀伤细胞。“IL-2”是指人白介素2。“IL-15”是指人白介素15。KE为消除速率常数，表示单位时间内机体能消除药物的固定分数或百分比。IL-2的单位IU是通过生物检定的方法，检测0.1ng/mL的IL-2刺激CTLL-2细胞增殖的最小量，得到具有一定生物效能的最小效价单元为“单位”(u)的国际单位。
本发明第一方面提供一种具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物，该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体。
根据本发明，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述糖皮质激素的含量为0.06-0.3μg(如0.06μg、0.065μg、0.066μg、0.067μg、0.0068μg、0.069μg、0.07μg、0.071μg、0.072μg、0.073μg、0.074μg、0.075μg、0.076μg、0.08μg、0.085μg、0.09μg、0.1μg、0.15μg、0.2μg、0.25μg、0.3μg或上述数值之间的任意值)、人白介素2的含量为2-8IU(如2IU、2.1IU、2.2IU、2.3IU、2.4IU、2.5IU、2.6IU、2.7IU、2.8IU、2.9IU、3IU、3.1IU、3.5IU、4IU、4.5IU、5IU、6IU、7IU、8IU或上述数值之间的任意值)、人白介素15的含量为0.2-0.8ng(如0.2ng、0.21ng、0.22ng、0.23ng、0.24ng、0.25ng、0.26ng、0.27ng、0.28ng、0.29ng、0.3ng、0.31ng、0.35ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng或上述数值之间的任意值)、和CD16单克隆抗体的含量为1-4ng(如1ng、1.1ng、1.2ng、1.3ng、1.4ng、1.5ng、1.6ng、1.7ng、1.8ng、1.9ng、2.0ng、2.1ng、2.5ng、3.0ng、3.5ng、4ng或上述数值之间的任意值)。
根据本发明一种更优选的实施方式，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述糖皮质激素的含量为0.07-0.15μg、人白介素2的含量为2-4IU、人白介素15的含量为0.2-0.6ng、和CD16单克隆抗体的含量为1-2ng。
根据本发明，对糖皮质激素的选择没有特别的要求，只要属于糖皮质激素的物质即可，优选选自泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松中的至少一种，更优选为氢化可的松。
根据本发明更优选的实施方式，所述组合物中还包括RPMI-1640培养基、胎牛血清和灭活的A群链球菌(Streptococcus pyogenes)中的至少一种，更优选同时包括RPMI-1640培养基、胎牛血清和灭活的A群链球菌。
根据本发明更优选的实施方式，所述RPMI-1640培养基和胎牛血清的体积比为4-20：1(如：4：1、5.7：1、6.7：1、7.3：1、8.1：1、8.5：1、9：1、9.5：1、10.1：1、10.8：1、11.5：1、12.3：1、13.3：1、19：1、20：1或上述数值之间的任意值)，优选为7.3-11.5：1。
根据本发明，相对于总量为1mL的RPMI-1640培养基和胎牛血清，所述CD335单克隆抗体的含量优选为50-200ng(如50ng、51ng、52ng、53ng、54ng、55ng、56ng、57ng、58ng、59ng、60ng、65ng、70ng、75ng、80ng、90ng、100ng、150ng、200ng或上述数值之间的任意值)。
根据本发明更优选的实施方式，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述灭活的A群链球菌的含量为0-0.0008KE(如0.0001KE、0.00015KE、0.00016KE、0.00017KE、0.00018KE、0.00019KE、0.0002KE、0.00021KE、0.00022KE、0.00023KE、0.00024KE、0.00025KE、0.0003KE、0.00035KE、0.0004KE、0.0006KE、0.0008KE或上述数值之间的任意值)，优选为0.0002-0.0004KE。
根据本发明，灭活的A群链球菌为注射用A群链球菌，如经青霉素处理的A群溶血性链球菌的冻干品(沙培林)，可以商购获得。
本发明第二方面提供一种犬自然杀伤细胞的体外培养方法，该方法包括：将犬外周血单个核细胞与上述的组合物混合进行激活培养。
根据本发明的方法，优选地，所述组合物的用量使得犬外周血单个核细胞在混合体系中的初始细胞密度≥3×106个细胞/mL。
根据本发明的方法，所述激活培养的条件优选包括：温度为36-38℃，饱和湿度(一般为41.8-46.3g/m3)，CO2含量为5-10％。“饱和湿度”是指单位容积空气中所能容纳的水汽量的最大限度，随温度的变化而变化。
根据本发明的方法，所述体外培养的方法还包括将激活培养后的细胞进行分离和扩增。其中，分离可以采用常规的方法进行，例如，可以采用离心分离。
根据本发明的方法，所述扩增的条件优选包括：饱和湿度(一般为41.8-46.3g/m3)，温度为36-38℃，CO2含量为5-10％。
根据本发明的方法，优选地，所述扩增离心分离的条件为：250-400g，5-15min。
根据本发明的方法，所述扩增使用的培养液优选包括人白介素2、人白介素15、RPMI-1640培养基和胎牛血清。
根据本发明的方法，所述扩增使用的培养液中RPMI-1640培养基和胎牛血清的体积比优选为4-20：1(如：4：1、5.7：1、6.7：1、7.3：1、8.1：1、8.5：1、9：1、9.5：1、10.1：1、10.8：1、11.5：1、12.3：1、13.3：1、19：1、20：1或上述数值之间的任意值)，更优选为7.3-11.5：1。
根据本发明更为优选的实施方式，所述扩增使用的培养液中，相对于总量为1mL的RPMI-1640培养基和胎牛血清，人白介素2的含量为1000-4000IU(如1000IU、1001IU、1002IU、1003IU、1004IU、1005IU、1006IU、1007IU、1008IU、1009IU、1010IU、1011IU、1015IU、1020IU、1030IU、1050IU、1100IU、1150IU、1200IU、1300IU、1600IU、2000IU、2200IU、2800IU、3600IU、4000IU或上述数值之间的任意值)，进一步优选为1000-2000IU。
根据本发明更为优选的实施方式，所述扩增使用的培养液中，相对于总量为1mL的RPMI-1640培养基和胎牛血清，人白介素15的含量为10-50ng(如10ng、10.5ng、11ng、12ng、13ng、14ng、15ng、16ng、17ng、18ng、19ng、20ng、25ng、30ng、40ng、50ng或上述数值之间的任意值)，进一步优选为10-20ng。
根据本发明的方法，所述NK细胞体外激活还包括在激活培养前分离获得PBMC的步骤，具体可以包括采血后除去血浆后得到的血细胞沉淀和分离。获得PBMC采用对犬自身伤害最小的静脉采血的方式获得犬的外周血。分离需要将犬的外周血的新鲜抗凝血加入样本稀释液进行稀释，再将稀释后的血细胞加于淋巴细胞分离液(商购获得)液面上，第一次离心。取离心后第二层环状乳白色单个核细胞(即PBMC)加入细胞清洗液混匀，第二次离心。弃上清在加入细胞清洗液重悬细胞，第三次离心。
根据本发明更为优选的实施方式，所述犬的新鲜抗凝血的用量以实际需要的量为标准即可。
根据本发明的方法，所述PBMC分离时需要加入样本稀释液、淋巴细胞分离液和细胞清洗液，和激活组合物以及扩增培养液相互配合可以获得更好的扩增效果。
根据本发明更为优选的实施方式，所述样本稀释液含有肝素钠、生理盐水和犬血白蛋白。
根据本发明的方法，所述样本稀释液中生理盐水和犬血白蛋白的体积比为49-199：1(如：49：1、99：1、199：1或上述数值之间的任意值)。
根据本发明更为优选的实施方式，相对于总量为1mL的生理盐水和犬血白蛋白，肝素钠的含量为50-200μg(如50、53、55、57、60、65、70、80、90、100、150、200或上述数值之间的任意值)，进一步优选为50-100μg。
根据本发明的方法，所述新鲜抗凝血和样本稀释液的体积比为1：1-2。
根据本发明一种更为优选的实施方式，所述细胞清洗液含有生理盐水和犬白蛋白。
根据本发明的方法，所述细胞清洗液中生理盐水和犬白蛋白的体积比为13.3-32.3：1(如：19.3：1、19：1、32.3：1或上述数值之间的任意值)。
根据本发明的方法所述样本稀释液和细胞清洗液中犬白蛋白的浓度为0.2-0.8g/mL。
根据本发明更为优选的实施方式，犬血白蛋白选自犬血白蛋白注射液。
根据本发明的方法，所述混匀PBMC时，细胞清洗液的加入量以PBMC的体积为基础补足至8-13mL。
根据本发明的方法，所述重悬细胞时，细胞清洗液的加入量以细胞整体的体积为基础补足至8-13mL。
根据本发明的方法，所述第一次离心的条件可以为23-28℃，400-500g，20-30min。第二次离心的条件可以为200-300g，5-15min。
根据本发明的一种更为优选的实施方式，可根据实验需要计数，对PBMC重复重悬离心，以达到实验需要的绝对数量的细胞。
根据本发明一种最优选的实施方式，所述方法包括以下步骤：
将分离获得的犬的PMBC加入按7.3-11.5：1体积比混合RPMI-1640培养基和胎牛血清以及0.0002-0.0004KE/mL的沙培林、0.074-0.148μg/mL的氢化可的松、2-4IU/mL的人白介素2、0.2-0.6ng/mL的人白介素15、1-2ng/mL的CD335单克隆抗体和1-2ng/mL的CD16单克隆抗体混合的激活组合物，加入的激活组合物的用量使PMBC的细胞密度为≥3×106个细胞/mL，培养至观察到出现聚团状细胞克隆后，加入按7.3-11.5：1体积比混合RPMI-1640培养基和胎牛血清的液态组合物与1000-2000IU/mL的人白介素2人和20-30ng/mL的白介素15混合的扩增培养液进行扩增，加入扩增培养液的用量将细胞密度重新调整为≥3×106个细胞/mL。按照该优选的实施方式能够进一步提高扩增倍数，确保扩增后NK细胞的纯度，避免其他体外培养方法带来的风险，提高犬的临床安全性。
本发明中，“RPMI-1640培养基”是指未添加胎牛血清的RPMI-1640培养基，其主要成分如下：
L-精氨酸，200±0.001mg/L；L-天冬酰胺，50±0.001mg/L；L-天冬氨酸，20±0.001mg/L；L-胱氨酸，50±0.001mg/L；L-谷氨酸，20±0.001mg/L；甘氨酸，10±0.001mg/L；L-组氨酸，15±0.001mg/L；L-羟脯氨酸，20±0.001mg/L；L-异亮氨酸，50±0.001mg/L；L-亮氨酸，50±0.001mg/L；L-赖氨酸盐酸盐，40±0.001mg/L；L-蛋氨酸，15±0.001mg/L；L-苯丙氨酸，15±0.001mg/L；L-脯氨酸，20±0.001mg/L；L-丝氨酸，30±0.001mg/L；L-苏氨酸，20±0.001mg/L；L-色氨酸，5±0.001mg/L；L-酪氨酸，20±0.001mg/L；L-缬氨酸，20±0.001mg/L；硝酸钙，100±0.001mg/L；硫酸镁，100±0.001mg/L；无水磷酸二氢钠，800±0.001mg/L；氯化钾，400±0.001mg/L；氯化钠，6000±0.001mg/L；碳酸氢钠，2000±0.001mg/L；对氨基苯甲酸，1±0.001mg/L；生物素，0.2±0.001mg/L；氯化胆碱，3±0.001mg/L；D-泛酸钙，0.25±0.001mg/L；叶酸，1±0.001mg/L；烟酰胺，1±0.001mg/L；盐酸吡哆醇，1±0.001mg/L；核黄素，0.2±0.001mg/L；盐酸硫胺素，1±0.001mg/L；维生素B12，0.005±0.001mg/L；i-肌醇，35±0.001mg/L；D-葡萄糖(葡萄糖)，2000±0.001mg/L；谷胱甘肽(还原)，1±0.001mg/L；酚红，5±0.001mg/L。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，细胞计数参数通过细胞计数器检测得到，所得细胞数量为绝对数量；细胞生长状态观测通过麦克奥迪AE31倒置显微镜观察，通过高分辨率显微镜相机MOTICAM-10照相；离心通过TDZ5-WS型号的离心机进行离心；细胞培养在FORMA3111(水套式)型号的培养箱中；NK体外扩增增殖曲线通过细胞计数方法测得；NK体外扩增细胞表型通过流式细胞仪检测。RPMI-1640培养基为GIBCO公司牌号为31870074的市售品，胎牛血清为GIBCO公司牌号为10091的市售品，沙培林为国药集团鲁亚(山东)制药有限公司的市售品，氢化可的松为国药集团容生制药有限公司的市售品，人白介素2为山东泉港药业有限公司的市售品，人白介素15为PEPROTECH公司牌号为AF-200-15的市售品，CD16单克隆抗体为eBioscience公司牌号为16-0166-82的市售品，CD335单克隆抗体为eBioscience公司牌号为16-3359-82的市售品，CD3单克隆抗体为eBioscience公司牌号为16-0037-81的市售品，淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司牌号为LDS1077的市售品，肝素钠为SIGMA公司牌号为H3149的市售品，犬血白蛋白注射液为北京安健生物科技有限公司的市售品。上述试剂中除人白介素15在-20℃保存，其余试剂均于4℃保存。
实施例和对比例
按表1所示的体积百分数混合RPMI-1640培养基和胎牛血清得到液态组合物共10mL，再在液态组合物中加入沙培林、氢化可的松、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体、CD16单克隆抗体，得到体外激活组合物，其中各原料用量见表1，表1中沙培林、氢化可的松、IL-2、IL-15、CD335和CD16的用量是指相对于总量为1mL的RPMI-1640培养基和胎牛血清的用量。
按体积比9：1混合RPMI-1640培养基和胎牛血清得到液态组合共50mL，再在液态组合物中加入1000IU/mL的人白介素2和10ng/mL的人白介素15，得到体外扩增培养液。
测试例1
步骤1：取10mL金毛犬的抗凝血按体积比1:1加入样本稀释液(99体积％的生理盐水+1体积％的0.2g/mL的犬血白蛋白注射液，再加入相对于总量为1mL的生理盐水和犬血白蛋白注射液含量为50μg的肝素钠)混匀，在15mL的离心管中加入5mL淋巴细胞分离液，吸取5mL稀释后的血液轻轻加于分离液液面上，不可破坏分离液界面，25℃，450g，离心25min。吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到新的15mL离心管中，再加入10mL细胞清洗液(99体积％的生理盐水+1体积％的0.2g/mL的犬血白蛋白注射液)，混匀细胞，250g，离心10min。弃上清，加入5mL细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。
步骤2：激活：计数PBMC，加入实施例1的体外激活组合物调整细胞密度至3×106个细胞/mL后置于44g/m3饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱中进行培养，记为第0天。其使用实施例1的体外激活组合物激活第0天(A)，激活第1天(B)，激活第2天(C)，激活第3天(D)的细胞激活过程中使用倒置显微镜观察，通过显微镜相机照相获得的结果，见图1。
步骤3：扩增：第3天收集激活培养的细胞计数，300g，离心10min。根据计数结果加入实施例1的体外扩增培养液调整细胞密度至3×106个细胞/mL，置于44g/m3饱和湿度、37℃、5％CO2的培养箱继续培养，第4-18天，每三天观察细胞生长状态，使用显微镜相机照相，计数。300g，离心10min换液，吸弃一半上清，加入新鲜犬NK扩增培养液重新将细胞密度调整至3×106个细胞/mL，重悬后继续培养。加入体外扩增培养液扩增第1天(A)，扩增第5天(B)，扩增第10天(C)，扩增第15天(D)的细胞体外扩增过程使用倒置显微镜观察，通过显微镜相机照相获得的结果，见图2。利用细胞计数绘制NK体外扩增细胞增殖曲线重复三次见图3。利用流式细胞仪检测细胞表面标记CD3、CD56和CD16，NK体外扩增细胞表型变化见图4。细胞数量的变化参见表2。
测试例2-9
按照同测试例1的方法，不同的是，改变为使用实施例2-6和对比例1-3的体外激活组合物的组分和用量，细胞数量的变化参见表2。
测试例10
按照测试例1的方法，不同的是，不添加步骤2中的实施例1的体外激活组合物，直接添加体外扩增培养液进行扩增培养，细胞数量的变化参见表2。
测试例11
按照测试例1的方法，不同的是，犬种品类换为拉布拉多，其使用实施例1的体外激活组合物激活第0天(A)，激活第1天(B)，激活第2天(C)，激活第3天(D)的细胞激活过程使用倒置显微镜观察，通过显微镜相机照相获得的结果，见图5。其使用实施例1的体外激活组合物后再加入体外扩增培养液扩增第1天(A)，扩增第5天(B)，扩增第10天(C)，扩增第15天(D)的细胞体外扩增过程使用倒置显微镜观察，通过显微镜相机照相获得的结果，见图6。利用细胞计数绘制NK体外扩增细胞增殖曲线重复三次见图7。利用流式细胞仪检测细胞表面标记CD3,CD56和CD16，NK体外扩增细胞表型变化见图8。
利用流式细胞仪，检测NK细胞的特异性细胞表面标记CD56，测试例1金毛犬和测试例2拉布拉多犬两个品种的犬PBMC使用实施例1的体外激活组合物激活后加入体外扩增培养液扩增后NK细胞纯度参见图9。
表1体外激活组合物配方表
Figure BDA0003752948110000121
Figure BDA0003752948110000131
表2激活和扩增前后细胞的绝对数量
Figure BDA0003752948110000132
通过图1和图5可知，激活第0天，镜下观察，PBMC大部分细胞为悬浮生长，细胞呈圆形，折光度较高，只有少量贴壁生长的单核细胞。激活第3天，出现少量呈聚团状细胞克隆，标志了NK已被激活并伴随有少量的增殖。
通过图2和图6可知，扩增过程中，一般在半换液后第1天即可见NK细胞的增殖，增殖的NK细胞呈典型的葡萄串样克隆状生长，且克隆随着培养时间的延长体积不断增大，克隆内细胞数量不断增多。
通过图3和图7可知，在激活期间以及扩增培养的第1至第3天(即培养的前6天)，NK细胞增殖速度缓慢，细胞数量缓慢增多。但从培养第6天开始，在扩增培养液的存在下经过扩增培养三天后NK细胞进入指数生长期，细胞快速增殖，细胞数量显著增多。至培养结束，细胞数量扩增30倍以上。
通过图4和图8可知，PBMC培养前，CD3+的T细胞占70％左右，而CD3-CD56+和CD3-CD16+的NK细胞只占1％左右。在加入激活组合物使NK细胞激活产生更多的CD56，CD3+的T细胞占比逐渐减少，CD3-CD56+CD16+的NK细胞占比逐渐增加，第三天发现聚团状细胞克隆激活完成之后加入扩增液培养，至培养结束，CD3+的T细胞的比例降为5％以下，而CD3-CD56+和CD3-CD16+的NK细胞的比例升至80％以上。
通过图9可知，测试的两个品种犬PBMC激活扩增培养后，CD56+NK细胞的纯度均在80％以上。
虽未示出，测试例2中NK细胞体外激活和扩增过程的显微镜照片、增殖曲线、细胞表型和纯度等变化与图1-9类似。测试例3-6显微镜照片与图1-9类似，增殖曲线变化和细胞表型的趋势相似。
通过表2的结果可以看出，采用本发明犬NK细胞激活培养物的实施例1和实施例2具有提高犬NK细胞体外扩增效率明显更好的效果。
按照收获的NK细胞总数除以PBMC总数可知，扩增18天后，扩增倍数在20倍以上。若按照收获的NK细胞总数除以PBMC中的NK细胞数，扩增18天后，扩增倍数在600倍以上。对于犬的NK细胞来说本申请达到了高效的效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物，其特征在于，该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述糖皮质激素的含量为0.06-0.3μg、人白介素2的含量为2-8IU、人白介素15的含量为0.2-0.8ng、CD16单克隆抗体的含量为1-4ng；
优选地，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述糖皮质激素的含量为0.07-0.15μg、人白介素2的含量为2-4IU、人白介素15的含量为0.2-0.6ng、CD16单克隆抗体的含量为1-2ng。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述糖皮质激素为泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松和地塞米松中的至少一种，优选为氢化可的松。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中还包括RPMI-1640培养基、胎牛血清和灭活的A群链球菌(Streptococcus pyogenes)中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述RPMI-1640培养基和胎牛血清的体积比为4-20：1；
和/或，相对于总量为1mL的RPMI-1640培养基和胎牛血清，所述CD335单克隆抗体的含量为50-200ng。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，所述灭活的A群链球菌的含量为0-0.0008KE，优选为0.0002-0.0004KE；
和/或，所述灭活的A群链球菌优选为沙培林。
7.一种犬自然杀伤细胞的体外培养方法，其特征在于，该方法包括：将犬外周血单个核细胞与权利要求1-6中任意一项所述的组合物混合进行激活培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述组合物的用量使得犬外周血单个核细胞在混合体系中的初始细胞密度≥3×106个细胞/mL；
和/或，所述激活培养的条件包括：饱和湿度，温度为36-38℃，CO2含量为5-10％。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述体外培养的方法还包括将激活培养后的细胞进行分离和扩增；所述扩增的条件包括：饱和湿度，温度为36-38℃，CO2含量为5-10％；所述扩增使用的培养液含有人白介素2、人白介素15、RPMI-1640培养基和胎牛血清。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述扩增使用的培养液中RPMI-1640培养基和胎牛血清的体积比为4-20：1；
和/或，相对于总量为1mL的RPMI-1640培养基和胎牛血清，人白介素2的含量为1000-4000IU，优选为1000-2000IU；人白介素15的含量为10-50ng，优选为20-30ng。
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