CN113939585A - 人同种异体肝源性祖细胞的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制造人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)群的方法。所述方法包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基。

Description

人同种异体肝源性祖细胞的制备
说明书
背景技术
本发明涉及人同种异体肝源性祖细胞(HALPC或HALPCs)及其制造。这些细胞有时也称为人成体肝源性祖细胞或异源性人成体肝源性祖细胞(HHALPC或HHALPs)。
肝脏是调节体内平衡的关键器官，并且是许多重要代谢路径的场所。在复杂的代谢路径中只要有一种蛋白减损便可能是高度有害的。重要肝脏酶的大量存在显著增加发生各种肝病的风险。整体上，有200种不同的肝脏代谢的先天型缺陷存在，在2500个活新生儿中便有1位儿童受影响。目前的治疗和长期的管理不是足够有效的。正位肝脏移植(OLT)具高度侵入性，不可逆性，受限于供体移植物短缺和需要先进技术的手术。由于肝细胞制剂的品质，肝细胞移植(LCT)可以仅发挥短期至中期的效用。
干细胞或祖细胞，特别是肝祖细胞的用途已在使用来自不同生物体的肝组织，以及在胎儿或成年肝组织的文献中得到确认(Schmelzer E et al.,2007；Sahin MB et al.,2008；Azuma H et al.,2003；Herrera MB et al.,2006；Najimi M et al.,2007；DarwicheH and Petersen BE,2010；Shiojiri N and Nitou M,2012；Tanaka M and Miyajima A,2012)。据信这些细胞在体外暴露于肝原性刺激后和/或在体内施用后潜在地提供具有形态和功能特征(通常与肝分化如第I/II阶段酶活性有关)的细胞。
这些由其产生的肝祖细胞或类肝细胞可用于细胞移植以及在开发新药上用于测试药物，因为其代表在药物代谢上和药理学或毒物学体外筛选上的原代(primary)人肝细胞的替代物(Dan YY,2012；Hook LA,2012)。
WO 2016/030525和WO 2017/149059公开了允许获得具有特定表达图谱和改善生物学特征的人成体肝源性祖细胞(HALPC)的细胞培养条件。例如，WO2016/030525描述了在培养所述细胞的方法中使用基础培养基制剂，例如威氏培养基E(William’s medium E)、杜尔贝科改性伊格尔培养基(DMEM)，优选地补充有哺乳动物血浆或血清，特别是胎牛血清(即FCS或FBS)。在WO 2016/030525中也描述了，除了提供营养素和/或生长促进剂之外，添加了牛、人或其他动物血清的液体培养基也可以促进特定细胞类型的生长/粘附或消除/分离。
本发明的目的是提供一种制造人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)的有效方法。另一个目的是提供用于制造具高生产量的人同种异体肝源性祖细胞的方法，并且其能进行具商业吸引力的分批式处理次数。又另一个目的是提供用于制造人同种异体肝源性祖细胞的稳定方法，其中所述方法确保具有一致性质量并且符合GMP标准的高产量细胞。
发明内容
本发明涉及人肝源性祖细胞，特别是人同种异体肝祖细胞(HALPC)，也称为异源性人成体肝源性祖细胞(HHALPC)或人成体肝源性祖细胞(HALPC)，以及涉及其制造。
在一个方面，本发明涉及一种制造人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)群的方法，其包括以下步骤：
(a)提供获自人肝脏的原代肝细胞的悬浮液；
(b)在导致产生具有伸长形状和间充质形态的细胞群的条件下培养包含在所述悬浮液中的原代肝细胞；
(c)在导致步骤(b)中产生的细胞群扩增的条件下培养步骤(b)中产生的细胞群；
(d)收获步骤(c)中获得的扩增细胞群；
其中在步骤(c)中获得的所述扩增细胞群的细胞为人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)，所述细胞表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且可选地表达至少一种肝标志物和/或展现肝-特异性活性；并且
其中步骤(b)的培养条件包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基。
在另一方面，所述无异源无血清培养基的特征还在于其含有小于30ng/mL的表皮生长因子(EGF)。
在又一方面，所述方法的步骤(c)还包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基。
在又一方面，本发明涉及能够通过所述方法获得的分离的人同种异体肝源性祖细胞(HALPCs)群。此外，本发明涉及所述HALPCs，其用于治疗肝病。
附图说明
图1描绘了通过相差显微术观察到(100-倍放大率)的在无血清无异源培养基A中培养的所产生HALPCs(P0)的形态(接种密度66,666个细胞/cm2)。
图2是以无异源无血清培养基A进行生产运行从产生P0和后续扩增传代1至5次的整体培养时间(图中以空心圆绘出)，相比于含有胎牛血清(FCS)的参照含血清培养基(图中以实心或实体圆绘出)的图形比较。对于血清培养基方法而言，至P5的整体培养时间在以48天的整体培养时间结束的所有传代中都较高，相比之下，对于使用无异源无血清培养基A制造观察到总计29天的时间。
图3是含血清的参照培养基中制造HALPCs的每次接种理论产量，相比于使用无异源无血清培养基A制造的每次接种理论产量的图形比较。相比于参照培养基，可测定出在无异源无血清培养基中进行的方法具有高出理论产量几乎50倍的差异。
图4示出了发生在使用无异源无血清培养基根据本发明或以使用包含牛血清的培养基的常规方法制备的另外可相比的HALPCs中的克隆(左)和非克隆(右)染色体异常的水平。
图5示出了在使用无异源无血清培养基根据本发明或以使用包含牛血清的培养基的常规方法制备的另外可相比的HALPCs中的HGF和PGE2的分泌。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及一种制造人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)群的方法，其包括以下步骤：
(a)提供获自人肝脏的原代肝细胞的悬浮液；
(b)在导致产生具有伸长形状和间充质形态的细胞群的条件下培养包含在所述悬浮液中的原代肝细胞；
(c)在导致步骤(b)中产生的细胞群扩增的条件下培养步骤(b)中产生的细胞群；
(d)收获步骤(c)中获得的扩增细胞群；
其中在步骤(c)中获得的所述扩增细胞群的细胞为人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)，所述细胞表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且可选地表达至少一种肝标志物和/或展现肝-特异性活性；
其中步骤(b)的培养条件包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基。
在另一方面，本发明涉及一种制造人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)群的方法，其包括以下步骤：
(a)提供获自人肝脏的原代肝细胞的悬浮液；
(b)在导致产生具有伸长形状和间充质形态的细胞群的条件下培养包含在所述悬浮液中的原代肝细胞；
(c)在导致步骤(b)中产生的细胞群扩增的条件下培养步骤(b)中产生的细胞群；
(d)收获步骤(c)中获得的扩增细胞群；
其中在步骤(c)中获得的所述扩增细胞群的细胞为人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)，所述细胞表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且可选地表达至少一种肝标志物和/或展现肝-特异性活性；
其中步骤(b)的培养条件包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基，并且其中所述无异源无血清培养基的特征还在于其含有小于30ng/mL的表皮生长因子(EGF)。
步骤(c)或(d)中获得的人同种异体肝源性祖细胞的特征可以可选地在于其表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且其分泌HGF；此外其可以也分泌PGE2。
在一个优选的实施方式中，本发明的方法还包括步骤(e)，所述步骤确定步骤(c)中获得的扩增细胞群的细胞为人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)，所述细胞表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且可选地表达至少一种肝标志物和/或展现肝-特异性活性。
在另一个实施方式中，步骤(c)或(d)中获得的人同种异体肝源性祖细胞对于α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)、CD140b为阳性，并且可选地对于白蛋白(ALB)为阳性；以及对于细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。
在另一方面，本发明涉及用于制造人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)群的方法，其包括以下步骤：
(a)提供获自人肝脏的原代肝细胞的悬浮液；
(b)在导致产生具有伸长形状和间充质形态的细胞群的条件下培养包含在所述悬浮液中的原代肝细胞；
(c)在导致步骤(b)中产生的细胞群扩增的条件下培养步骤(b)中产生的细胞群；
(d)收获步骤(c)中获得的扩增细胞群；并且
(e)确定步骤(c)中获得的扩增细胞群的细胞共表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物与一个或多个选自甲胎蛋白(AFP)、α-1-抗胰蛋白酶(alpha-1antitrypsin)、HNF-4和MRP2转运蛋白的肝标志物，以及可选的肝标志物白蛋白；
其中步骤(b)的培养条件包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基。
在另一方面，本发明涉及用于制造人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)的群的方法，其包括以下步骤：
(a)提供获自人肝脏的原代肝细胞的悬浮液；
(b)在导致产生具有伸长形状和间充质形态的细胞群的条件下培养包含在所述悬浮液中的原代肝细胞；
(c)在导致步骤(b)中产生的细胞群扩增的条件下培养步骤(b)中产生的细胞群；
(d)收获步骤(c)中获得的扩增细胞群；并且
(e)确定步骤(c)中获得的扩增细胞群的细胞共表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物与一个或多个选自甲胎蛋白(AFP)、α-1-抗胰蛋白酶)、HNF-4和MRP2转运蛋白的肝标志物，以及可选的肝标志物白蛋白；
其中步骤(b)的培养条件包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基，并且其中所述无异源无血清培养基的特征还在于其含有小于30ng/mL的表皮生长因子(EGF)。
根据本发明方法的步骤(a)包括提供获自人肝脏的原代肝细胞的悬浮液。
涉及从人肝脏获得原代肝细胞悬浮液(其在本文也可称为肝细胞悬浮液，或缩写为LCS)的子步骤可包括以下：松弛细胞间紧密连结，肝脏消化，肝脏破坏，过滤，以离心分离肝细胞，并且可选地冷冻保存最终的肝细胞悬浮液。
解离人(成体)肝脏或其部分以形成原代肝细胞群的步骤包括：获得肝脏或其部分，其包括完全分化的肝细胞以及一定量的可用于制造肝祖细胞或干细胞的原代细胞。
如本文所用的，术语“肝祖细胞”是指无特化和增殖-感受态细胞，其通过培养分离自肝脏的细胞产生，并且这些细胞或其后代可产生至少一种相对更特化的细胞类型。肝祖细胞产生的子代可沿着一个或多个谱系分化，从而渐增地产生更特化的细胞(但优选为肝细胞或肝-活化细胞)，其中这些子代本身仍可以为祖细胞，或甚至最终产生分化的肝细胞(例如，完全特化的细胞，特别是呈现类似于这些原代人肝细胞的形态学和功能特征的细胞)。术语“干细胞”是指能自我更新的祖细胞，即可在无分化下增殖，由此肝细胞的后代或至少其部分基本上仍保留母干细胞的未特化或相当低特化表型、分化潜能和增殖感受性。此术语是涵盖能基本上无限制的自我更新的干细胞，即其中后代或其部分的进一步增殖的能力相比于母细胞基本上不会降低，以及展现有限的自我更新的干细胞，即其中后代或其部分的进一步增殖的能力相比于母细胞明显下降。
如所述的，术语“成体人肝源性祖细胞”与“人成体肝源性祖细胞”、“异源性人成体肝源性祖细胞”或“人同种异体肝祖细胞”使用上为同义的，缩写为“HHALPC”或“HHALPCs”或“HALPC”或“HALPCs”。这些细胞是代表可如本文所述获得的特定类型的人肝源性祖细胞。目前发明人优选的为术语“人同种异体肝祖细胞”。
以产生多样细胞类型的能力为基准，祖细胞或干细胞通常可描述为全能的(totipotent)、多能的(pluripotent)、多潜能的(multipotent)或单能的(unipotent)。单个“全能”细胞是定义为能成长，即发育成整个生物体。“多能”细胞不能生长成整个生物体，但能产生源自于所有三胚层，即中胚层、内胚层和外胚层的细胞类型，并可以产生生物体的所有细胞类型。“多潜能”细胞为能产生至少一种来自生物体的两种以上不同器官或组织中的每一种的细胞类型，其中所述细胞类型可源自相同或不同的胚胎层，但不能产生生物体的所有细胞类型。“单能”细胞仅能分化成一种细胞谱系的细胞。
肝脏或其部分是获自“受试者”、“供体受试者”或“供体”，其可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。肝脏的部分可为得自肝脏任何部分的组织样品并且可包括存在肝脏中的不同细胞类型。术语“肝脏”是指肝脏器官。术语“部分的肝脏”一般而言是指得自肝脏器官的任何部分的组织样品，不限于所述部分的量或其是源自于肝脏器官的哪一个区域。优选地，存在肝脏器官中的所有细胞类型也可代表所述肝脏的部分。肝脏的部分的量可至少部分是由实际考虑获得足够原代肝细胞以用于合理实施本发明方法的需求来推断。因此，部分的肝脏可代表肝脏器官的百分比(例如，至少1％、10％、20％、50％、70％、90％以上，通常w/w)。在其他非限制性实例中，肝脏的部分可以由重量来定义(例如，至少1g、10g、100g、250g、500g以上)。例如，肝脏的部分可以是肝叶，例如右叶或左叶，或在劈离肝手术期间或肝活组织检查期间所切除的包括大量细胞的任何片段或组织样品。
根据本发明所使用的细胞是分离自人肝脏或人肝脏的部分。更优选地，肝祖细胞或干细胞是分离自成体人肝脏或其部分。术语“成体肝脏”是指产后，即出生后任何时间，优选地足月的受试者的肝脏，并且可以是例如出生后至少1天、1周、1个月或1个月以上年龄，或至少1岁、5岁、10岁以上。因此，“成体肝脏”或成熟肝脏可在另外以常规的术语“新生儿”、“婴儿”、“儿童”或“成人”所描述的人受试者中发现。本领域技术人员应理解，肝脏可以在不同时间出生后区间内达到实质发育成熟。在一个优选的实施方式中，细胞分离自新生人肝脏或肝脏的部分(例如，肝叶)。
供体受试者可为活体或死亡，由技术接受的标准来决定，例如，“心-肺”标准(通常涉及不可逆的循环和呼吸功能停止)或“脑死”标准(通常涉及不可逆的整个脑部，包括脑干的全部功能停止)。收获可以涉及本领域中已知的程序，例如，活组织检查、大部切除(resection)或局部切除(excision)。
本领域技术人员应理解，至少一些方面从供体受试者收获肝脏或其部分，可根据相关法律和伦理规范。举例来说但不限于此，从活人供体收获肝脏组织可以必需与维持供体进一步的生命兼容。
因此，通常仅可以从活人供体移除部分肝脏，例如使用活组织检查或切除，使得在供体中维持足够程度的生理肝功能。
肝脏或其部分可获自具有持续循环，例如心跳，并且持续呼吸功能，例如肺呼吸或人工呼吸器的人供体。受制于伦理和法律规范，供体可以需要或不需要脑死(例如在脑死的人中可以允许移除全肝或其部分，不需与人供体的进一步存活兼容)。从这些供体收获肝脏或其部分为有利的，因为组织尚未遭受实质缺氧(缺乏氧化作用)，其通常是因缺血所导致(循环中止)。
作为另一选择，肝脏或其部分可获自人供体，其在收获此组织时已停止循环，例如无心跳，和/或呼吸功能停止，例如无肺呼吸或无人工呼吸器。当这些供体的肝脏或其部分可能已遭受至少一些程度的缺氧时，也可从这些组织分离活的祖细胞或干细胞。肝脏或其部分可在供体循环(例如心跳)停止后约24小时内收获，例如约20小时内，例如约16小时内，更优选地约12小时内，例如约8小时内，甚至更优选地约6小时内，例如约5小时内，约4小时内或约3小时内，又更优选地约2小时内，并且最优选地约1小时内，例如在供体循环(例如心跳)停止后约45、30或15分钟内。
收获的组织可冷却至约室温或低于室温的温度，但通常避免冷冻组织或其部分，特别是当冷冻可以导致晶核形成或冰晶生长时。例如，组织可保持在约1℃至室温、约2℃至室温、约3℃至室温或约4℃至室温的任何温度，并且有利地可保持在约4℃。如本领域中所知，组织也可置于“冰上”。组织可全程冷却或就部分缺血时间进行冷却，即供体循环停止之后的时间。即，组织可进行温缺血，冷缺血，或温缺血和冷缺血的组合。收获的组织在处理之前可如此保持例如至多48小时，优选地小于24小时，例如小于16小时，更优选地小于12小时，例如10小时，小于6小时，小于3小时，小于2小时或小于1小时。
在进一步处理此组织之前，收获的组织可有利地例如完全或至少部分浸入适合的介质中和/或可以用适合的介质灌流。本领域技术人员能选择在处理之前的时间内可支持细胞存活的适合的介质。
从肝脏或肝脏的部分分离原代肝细胞可根据本领域中已知的方法来进行，例如，如EP1969118、EP3039123、EP3140393或WO2017149059(参见实施例1)中所述的。
首先从解离的肝脏或其部分获得原代肝细胞的悬浮液。如本文所用的术语“解离”是指部分或完全破坏组织或器官的细胞组织，即部分或完全破坏组织或器官的细胞和细胞组分之间的联结，以获得所述组织或器官的细胞悬浮液。此悬浮液可包括单独或单个的细胞，以及自然粘附一起以形成两种以上细胞的集簇或团块的细胞。解离优选地不会引起(或引起的可能性小)细胞存活力降低。用于解离肝脏或其部分以从其获得原代细胞群(悬浮液)的适合方法可为任何本领域中公知的方法，包括但不限于酶消化、机械分离、过滤、离心及其组合。特别地，用于解离肝脏或其部分的方法可包括酶消化肝组织以释放肝细胞，和/或机械破坏或分离肝组织以释放肝细胞。通过肝活组织检查获得的肝组织小薄片可根据以下步骤(c)直接用来进行细胞培养，无需酶或机械破坏。
如上所述用于解离肝脏或其部分的方法记载于文献中，例如广泛使用的两个以上步骤的胶原蛋白酶灌流技术，其已用全肝或肝脏片段进行各种调节及修正。将肝组织用于37℃预热的含有阳离子螯合剂(例如EDTA或EGTA)的无二价阳离子的缓冲溶液灌流。缓冲溶液可包括盐溶液(例如HEPES，Williams E培养基)或其中也可包括例如NaCl和KCl盐的任何其他平衡盐溶液等。这能破坏将细胞结合一起的桥粒结构。
然后以含有二价阳离子，例如Ca2+和Mg2+的缓冲溶液和用于消化组织的基质降解酶灌流。通常是通过温和的机械破坏和/或经由过滤器压制来释放原代肝细胞，以机械性完成细胞解离步骤。此过滤器可具有能使细胞通过大约0.1mm、0.25mm、0.50mm、1mm以上的筛子尺寸。具有逐渐变小的筛子尺寸的连续过滤器可用于逐步解离组织及释放细胞。用含有蛋白酶抑制剂、血清和/或血浆的缓冲液洗涤解离的细胞以使用于灌流程序中的胶原蛋白酶和其他酶失活，并且然后通过低速离心(例如10x g至500x g)使其成团，从而从混合物中分离。如果非全部，则大部分的活细胞可成团，而基本上消除死细胞和细胞碎片，随后以冰冷的缓冲溶液洗涤以净化细胞悬浮液。原代肝细胞的数量和质量根据组织的质量、所使用不同溶液的组合物以及酶的类型和浓度而可以不同。酶通常为胶原蛋白酶，但也可使用链霉蛋白酶、胰蛋白酶、透明质酸酶、嗜热菌蛋白酶及其组合。胶原蛋白酶可以由纯度较差的酶组合物所组成和/或表现出蛋白酶活性，其可以引起影响活细胞的质量和数量的不期望的反应，这进而可通过选择足够纯度和质量的酶制剂来避免。收获原代肝细胞的其他方法可排除酶消化技术且可包括用含有蔗糖的溶液灌流肝脏，然后进行机械破坏。
如本文所定义和通过解离肝脏或其部分所获得的原代细胞群通常可为异源性，即，其可包括属于一种或多种属于任何肝构成细胞类型的细胞类型，包括已存在肝实质和/或在肝非实质部分的祖细胞或干细胞。如本文所用的，术语“原代细胞”包括存在于细胞悬浮液中的细胞，其来自受试者的组织或器官(例如肝脏)，通过以适当的技术解离存在此移除组织或器官中的细胞获得。
示例性的肝构成细胞类型包括但不限于肝细胞、胆管细胞(胆道细胞)、库佛氏细胞(Kupffer细胞)、肝星状细胞(Ito细胞)、卵圆细胞和肝内皮细胞。上述术语具有技术上已建立的意义，并且在本文是广义理解为包括如此分类的任何细胞类型。
术语“肝细胞”涵盖上皮肝细胞和主质肝细胞，其包括但不限于不同大小或倍数体(例如二倍体、四倍体、八倍体)的肝细胞。根据解离肝脏的方法和/或任何用于分分级分离或富集最初的肝细胞制剂和/或其他细胞类型的方法，以物理性质(尺寸、形态学)、存活力、细胞培养条件或通过应用任何适合技术的细胞表面标志物表达为基准，原代细胞群可包括不同比例的肝细胞(总细胞的0.1％、1％、10％以上)。
如本文所定义及通过解离肝脏(或其部分)获得的原代细胞群可立即用于确定作为新鲜原代肝细胞的悬浮液的细胞培养物。人肝细胞悬浮液(LCS)是由从人捐赠的肝脏分离出的分散的人原代肝细胞所组成。
作为另一选择，获得的原代人肝细胞可以使用常用的技术储存为低温保存的制剂以长期保存。在一个实施方式中，用于根据本发明的制造方法中的原代人肝细胞悬浮液可以低温保存的产品(储存于≤-130℃)来获得和使用，在使用前将其解冻(例如在37℃水浴中)并以解冻的溶液洗涤。
在一些实施方式中，用于本发明方法中的肝细胞悬浮液中的肝细胞浓度可大于7.5×106个细胞/mL，例如10×106个细胞/mL或20×106个细胞/mL。
根据本发明方法的步骤(b)包括在导致产生细胞群，即具有伸长形状和间充质形态的人同种异体肝源性祖细胞或HALPC的条件下培养在提供的人原代肝细胞悬浮液中包含的人原代肝细胞。
原代肝细胞可于完全合成的支持体上(例如塑料或任何聚合物)或预先涂覆饲养细胞、蛋白提取物或任何其他生物来源的物质的合成支持体上直接培养，使得类似的原代细胞粘附和增殖，并且产生具有所需标志物和形态的同种异体肝祖细胞群。
原代肝细胞在维持其粘附和增殖和/或产生同质细胞群的细胞培养基中培养。根据本发明的一个优选的实施方式，在步骤(b)中使用包括纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基，其中所述培养基的特征还在于其含有小于30ng/mL的表皮生长因子，或作为另一选择，不含表皮生长因子(EGF)。在还优选的实施方式中，培养基包括浓度分别不大于25ng/mL或不大于约10ng/mL，或不大于5ng/mL的表皮生长因子。如本文所理解的，细胞培养基为支持分离的肝祖细胞存活和/或生长的液体培养基。液体培养基可在细胞导入其中之前、同时或之后加入培养环境或系统中。术语“细胞培养基”、“细胞培养介质”或“培养基”一般可指包括可用于细胞维护和生长的营养素的水性液体或胶状物质。在本发明的内容中，使用液体培养基。
根据本发明，用于步骤(b)和/或后续步骤例如步骤(c)的细胞培养基为无血清的。按照其常规的定义，“血清”是从全血样品获得的，其中使样品发生凝结，并且随后通过适当的技术，通常通过离心从液体组分(血清)分离所形成的凝块和血液样品的细胞组分。用于培养步骤(b)以及优选地在任一种或所有后续的方法步骤，例如步骤(c)中的培养基可不含源自任何来源(无论是动物和/或人)的血清。换言之，不存在这样的血清。然而，该定义并非排除从血清所分离出的个别组分的存在，例如高纯化血清白蛋白。
可用于步骤(b)和/或后续方法步骤例如步骤(c)的细胞培养基也是无异源的。如本文所用的术语“无异源”可理解为“无动物组分”(ACF)，并且是指这样的培养基(或基质)，其不含有非人动物衍生或来源的组分。换言之，细胞培养基不含有任何动物来源的成分，或可能已使用动物宿主细胞或动物表达培养所制造的成分。如本文所用的，术语“动物”是理解为任何非人动物，例如非人哺乳动物，例如非人灵长类、胎牛、小牛或成体牛、马、猪、羔羊、山羊、狗、兔、小鼠或大鼠。
在一个具体实施方式中，培养基为化学成分确定的培养基，这是指所述培养基不包括源自人血清的人纯化组分，但仅有重组的组分，其也优选地由非动物表达培养来制造。
如所述的，虽然其本身无血清，但用于根据本发明方法的步骤(b)和/或本方法的后续步骤例如步骤(c)的细胞培养基可包括纯化的天然或重组人血清白蛋白作为单个组分。在一个具体实施方式中，根据本发明方法的步骤(b)和/或后续方法步骤例如步骤(c)中所用的细胞培养基包括重组人血清白蛋白。
在另一个实施方式中，培养基中纯化的天然或重组人血清的量不超过0.2重量％，或为0.01％至2重量％。
在又另一个实施方式中，培养基包括植物(例如水稻)表达的重组人血清白蛋白。
如果重组人血清白蛋白或任一种重组蛋白或其组合或生物因子用于或补充到本方法的步骤(b)(或步骤(c))中所用的培养基中，则优选的是所述蛋白或因子也无异源，即不使用任何动物宿主细胞或培养条件或不使用动物组分来制造或生产。
脂质和脂质载剂也可用于补充细胞培养基。这些脂质和载剂可包括但不限于固醇类，例如胆固醇、脂肪酸(或脂肪酸的衍生物，例如酯)，例如亚油酸、ω-3或ω-6脂肪酸。如本文所用的，这些脂肪酸衍生物包括在词语“脂肪酸”的范围内。在一个优选的实施方式中，至少一些脂质与作为培养基特征的纯化的天然或重组人血清白蛋白结合或缔合。
在一个实施方式中，培养基包括胆固醇和一种或多种脂肪酸衍生物。
在一个实施方式中，如上所定义和用于根据本发明方法中的无异源无血清培养基包括脂质，优选地选自一种或多种脂肪酸的脂质，其中这些脂质与纯化的天然或重组人血清白蛋白结合。
在一个实施方式中，包括在培养基中并且与人血清白蛋白结合的一种或多种脂质可为脂肪酸，例如饱和或不饱和C13至C22脂肪酸，或其衍生物，例如酯或盐。在另一个实施方式中，与人血清白蛋白结合的脂肪酸选自肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、异油酸、γ-次亚油酸、α-次亚油酸、双同γ-次亚油酸、花生油酸、11-二十碳烯酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、芥酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、蜜氨酸(meads’acid)和神经酸中的任一种或任一种的组合。在其他实施方式中，包括在培养基中并与天然或重组人血清白蛋白结合的脂肪酸选自肉豆蔻酸、亚油酸、一种或多种次亚油酸和二十碳五烯酸中的任一种或其组合。在又另一个实施方式中，包括在培养基中并与重组人血清白蛋白结合的脂肪酸选自二十碳五烯酸、山萮酸、芥酸、二十二碳四烯酸和二十二碳五烯酸中的任一种或其任意组合。在又另一个实施方式中，包括在培养基中并与重组人血清白蛋白结合的脂肪酸选自蜜氨酸和神经酸中的一种或其组合。
术语“与人血清白蛋白缔合或结合”(天然形式或重组分子)，是指脂质或脂肪酸，其与白蛋白上一个或多个结合位置结合，例如经由疏水性结合，或通过静电或氢键作用。可选地，所述脂质可与人血清白蛋白共价连接或缀合。
在另一个实施方式中，作为本发明无异源无血清培养基特征的与脂质结合的人天然或重组人血清白蛋白可通过将人血清白蛋白用任一种上述所定义的脂肪酸或其混合物预处理来获得或能够获得。
根据本发明用于培养肝祖细胞的细胞培养基可包括生长因子的混合物，以供其适当生长、增殖、维持所需的标志物和/或生物活性或长期储存。
根据本发明方法的步骤(b)和/或后续方法步骤例如步骤(c)中所用的细胞培养基可包括一种或多种生长因子，但其特征在于其含有小于30ng/mL的EGF，并且可选地不含EGF。据此还优选的实施方式为培养基包括浓度分别不大于25ng/mL，或不大于约10ng/mL，或不大于5ng/mL的表皮生长因子。
术语“生长因子”如本文所用是指影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移的生物活性物质，并且单独或当通过其他物质调节时，可以影响生物体的发育、形态学和功能变化。生长因子通常可通过作为配体与存在细胞内的受体(例如表面或细胞内受体)结合来作用。本文的生长因子可特别是包括一条或多条肽链的蛋白类实体。术语“生长因子”涵盖以下家族的成员：成纤维细胞生长因子(FGF)家族、骨形态发生蛋白(BMP)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、转化生长因子β(TGF-β)家族、神经生长因子(NGF)家族、表皮生长因子(EGF)家族、胰岛素相关生长因子(IGF)家族、肝细胞生长因子(HGF)家族、介白素-6(IL-6)家族(例如，抑癌蛋白M)、造血生长因子(HeGFs)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)家族或糖皮质激素。
在另一个实施方式中，根据本发明的无异源无血清培养基包括小于30ng/mL的EGF，或优选地小于10ng/mL的EGF，或可选地不含EGF，但包括至少三种其他的生长因子，其选自上文列出的生长因子中的任一种。
在一个实施方式中，根据本发明培养基可包括小于30ng/mL的EGF，或可选地不含EGF，但可包括至少一种选自由转化生长因子β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)组成的组中的生长因子或其组合。
在一个实施方式中，本发明方法中所用的生长因子可为人或人重组的生长因子。
在其他实施方式中，所述细胞培养基的特征在于其含有小于25ng/mL或小于10ng/mL或小于5ng/mL的任一种人生长因子
在另一个实施方式中，所述细胞培养基不含表皮生长因子，即不包括任何表皮生长因子(EGF)。
在其他实施方式中，所述培养基的特征在于其含有小于25ng/mL，或小于10ng/mL或小于5ng/mL的EGF。优选地，细胞培养基含有小于10ng/mL的表皮生长因子。
如本文所用的，术语“表皮生长因子”或“EGF”是指与受体EGFR结合的生长因子，并且可选地不仅可包括肽EGF本身，也可包括在本领域中被视为属于EGF-蛋白家族的任一种肽或其组合。所述术语可包括天然(人)以及重组人EGF。
在本文上下文中，并且为了避免疑问，就培养基而言，生长因子例如EGF的含量应理解为是指在与任何细胞混合之前的个别培养基的组合物。显然，在HALPCs的情况中，培养的细胞本身可以分泌生长因子。换言之，在本发明一个实施方式中，培养基在与细胞组合之前并不含EGF。
用于本发明上下文中的培养基可包括无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P、Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲液(例如，HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如，谷胱甘肽)和碳源(例如，葡萄糖，丙酮酸盐如丙酮酸钠，乙酸盐如乙酸钠)等。
培养基也可进一步供应有一种或多种另外的组分。例如，可使用另外的补充物以为细胞供应必需的微量元素和物质，以便优化生长和扩增。这些补充物包括胰岛素、转铁蛋白、硒盐及其组合。可加入另外的抗氧化剂补充物，例如β-巯基乙醇。在本发明的一个实施方式中，用于本发明上下文中的培养基补充有选自抗坏血酸或其盐的抗氧化剂。在另一个实施方式中，可以向培养基补充氨基酸，例如L-谷氨酰胺，其已知当在溶液中时较为不稳定。
也可补充激素，其可包括但不限于D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、雌二醇、氢化可的松、胰岛素、泌乳素、黄体素、生长抑素/人生长激素(HGH)、促甲状腺素、甲状腺素和L-甲状腺原氨酸(thyronine)。以三碘甲状腺原氨酸(triiodithyronine)、α-生育酚乙酸酯和胰高血糖素培养对于肝细胞也是有利的。
在一个实施方式中，根据本发明方法中(例如步骤(b)和/或步骤(c)中)所用的无异源无血清培养基包括：
(i)纯化的天然或重组人转铁蛋白，并且其中所述人转铁蛋白可选地经铁化合物预处理过；
(ii)重组人胰岛素；以及
(iii)硒化合物，例如亚硒酸钠。
无异源无血清培养基中的人转铁蛋白(天然或重组)的量优选地不超过约0.1重量％。在一个实施方式中，作为培养基的特征的人转铁蛋白的量为0.0001％至0.1重量％，例如0.001重量％至0.1重量％。
无异源无血清培养基中重组人胰岛素的量优选地不超过约0.05重量％。在一个实施方式中，人重组胰岛素的量为0.001重量％至0.05重量％。
在另一个实施方式中，根据本发明方法中(即步骤(b)和/或步骤(c)中)所用的无异源无血清培养基包括：
(i)重组人转铁蛋白，其中所述人转铁蛋白可选地经铁化合物预处理，并且进一步可选地其中所述重组人转铁蛋白为植物表达的重组人转铁蛋白，例如水稻表达的重组人转铁蛋白；
(ii)重组人胰岛素；以及
(iii)硒化合物，例如亚硒酸钠。
在另一个实施方式中，根据本发明方法中(例如步骤(b)和/或步骤(c)中)所用的无异源无血清培养基包括：约0.01-2重量％的纯化天然或重组人血清白蛋白，不大于30ng/mL或优选地不大于10ng/mL的表皮生长因子；并且其中所述无异源无血清培养基还包括：
(i)约0.0001-0.1重量％的纯化天然或重组人转铁蛋白，并且其中所述人转铁蛋白可选地经铁化合物预处理；
(ii)约0.001至0.05重量％的重组人胰岛素；以及
(iii)硒化合物，例如亚硒酸钠。
在本方法的另一个实施方式中，无异源无血清培养基包括人纤连蛋白和/或人玻连蛋白，例如重组人纤连蛋白和/或重组人玻连蛋白。
在另一个优选的实施方式中，培养基包括碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)，也称为BFGF、FGF-2、FGFB、HBGF-2、成纤维细胞生长因子2。如果存在的话，其优选地是以约30pg/mL以上的水平来使用，例如约30至约10,000pg/mL。其也可以约100pg/mL以上的水平来使用，例如约100至约10,000pg/mL。
在还优选的实施方式中，所述培养基除了FGF2以外还包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)。如果存在的话，FGF1可例如以约5pg/mL以上的水平来使用，例如约5至约500pg/mL。特别有用的也为约5至约100pg/mL。
在另外优选的实施方式中，所述培养基还包括粒细胞集群刺激因子(G-CSF)，可选地约1至约100pg/mL的水平。在一个实施方式中，无异源无血清培养基包括约100至约10,000pg/mL的水平的FGF2，约5至约100pg/mL的水平的FGF1，并且约1至约100pg/mL的水平的G-CSF。
在又另一个实施方式中，无异源无血清培养基包括葡萄糖，并且其中所述葡萄糖的含量不高于约2.5重量％，并且可选地不高于约1重量％。在另一个实施方式中，无异源无血清培养基包括葡萄糖，其中所述葡萄糖的含量为约0.001-2.5重量％，或可选地约0.001-1重量％。
如本文所理解的，术语重量％或重量百分比为组合物中的组分的重量，其是以组合物总重量的百分比来表示。
在又另一个实施方式中，无异源无血清培养基包括谷氨酰胺或其盐，或能释放谷氨酰胺或其盐的化合物。能释放谷氨酰胺或其盐的化合物可为谷氨酰胺的前药。
在又另一个实施方式中，用于根据本发明方法的培养步骤中的无异源无血清培养基包括：
(iv)无机盐，包括钙、铁(II)、铁(III)、钾、铜(II)、镁、钠和锌的盐；
(v)氨基酸，包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸；
(vi)维生素，包括D(+)-生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟碱酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素和维生素B12；以及可选的
(vii)DL-硫辛酸、次黄嘌呤、亚油酸、酚红钠、腐胺、丙酮酸盐和/或胸苷；并且
其中培养基的pH调节至pH 6.9-7.5。
无异源无血清培养基可通过将单个的组分组合来制备，或其可以本文提供的指南为基准从市售产品来选择。例如，可以使用的市售无异源无血清培养基，可选地根据本文所公开的可选的特性和/或偏好调节后，目前包括但不限于
Figure BDA0003369122690000161
MSC ExpansionXSFM(FUJIFILM Irvine Scientific)和
Figure BDA0003369122690000162
MSC Expansion kit XF(MiltenyiBiotech)，包括任何GMP等级或其等效物，例如MSC-Brew GMP培养基(Miltenyi Biotech)。这些培养基目前也不含EGF或含有浓度小于30ng/mL的EGF。
用于步骤(b)的培养的接种密度可以可选地分别为约5,000至约100,000个细胞/cm2，约10,000至约80,000个细胞/cm2，或约20,000至约66,666个细胞/cm2。
步骤(b)中所定义的原代肝细胞的培养在培养中使肝祖细胞产生和增殖，并且可持续直到肝祖细胞或干细胞充分增殖。
根据本发明，细胞是培养一段时间直到产生细胞群，即观察到具有伸长形状和间充质形态的人同种异体肝源性祖细胞或HALPC。
在一个实施方式中，培养是持续直到细胞群达到特定程度的汇合度。如本文所用的术语“汇合度”是指培养细胞的密度，其中细胞相互接触，基本上覆盖所有可供生长的表面(即，完全汇合)。汇合可通过标准成像(例如显微术)和本领域中常用的分析方法来测定。
在一个实施方式中，步骤(b)的持续时间可经选择，使得达到至少40％的汇合度。在其他实施方式中，步骤(b)进行直至达到约至少50％、70％或至少90％以上的汇合度。在其他实施方式中，步骤(b)进行直至达到至少80％汇合度。
在又另一个实施方式中，细胞可在步骤(b)中培养至少7天，至少10天或至少12天。优选地，从步骤(b)的原代细胞群产生祖细胞，其中达到至少80％汇合度是在平均(均值)6至12天内，优选地平均7至10天内发生。
发明人已发现，使用包括纯化天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基，并且其中所述无异源无血清培养基的特征在于其含有小于30ng/mL的表皮生长因子，显著地降低了步骤(b)以及从肝细胞悬浮液产生HALPCs的持续时间。此时间优势可促成整体制造时间缩短并大幅降低制备HALPCs的相关成本。
在步骤(b)期间产生的HALPC具有伸长形状和间充质形态。例如，使用相差显微镜可观察到这些细胞的形状为类成纤维细胞，其支持类间充质样貌。人间充质干细胞的伸长形状和间充质样貌是描述在本领域和综合文献中。HALPC的伸长形状和间充质形在参照图1中示出，其描绘了以相差显微术(100-倍放大率)所观察的培养的HALPC。在支持培养基上所述细胞可以集簇和/或集群的形式以层状产生和增殖。
HALPC为源自人成体肝脏并且表达间充质和肝标志物的人间充质肝祖细胞。除了形态学评估之外，从步骤(b)产生的肝祖细胞可以可选地通过允许测试在此阶段已有的相关标志物的技术来进一步表征，例如如EP3140393或WO2017149059中所述。在用于鉴别这些标志物并测量其为阳性或阴性的技术中，蛋白质印迹法(Western Blot)、流式细胞免疫细胞化学(Flow Cytometry immunocytochemistiy)和ELISA为优选的，因为这些技术能以蛋白水平测试标志物，即使在此步骤仅可获得低量的肝祖细胞。
肝祖细胞的确切标志物样貌可以在一定程度上取决于所需的细胞亚型和其他因子，例如细胞的微环境或其年龄。一般而言，根据本发明制备的HALPCs(例如，在步骤(c)或步骤(d)中获得的细胞)的共同点在于其表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波型蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且其可选地表达至少一种肝标志物和/或展现一种肝特异性活性。
在一个优选的实施方式中，HALPCs的特征在于其表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波型蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且其分泌肝细胞生长因子(HGF)，并且还可选地分泌前列腺素E2(PGE2)。在相关的实施方式中，HALPCs对于α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)、CD140b和可选地白蛋白(ALB)为阳性，并且对于细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。
在另一个优选的实施方式中，如根据本发明方法的步骤(c)或(d)获得的HALPCs的特征在于其表达CD90、CD73、波型蛋白和ASMA，或对于CD90、CD73、波型蛋白和ASMA为阳性。
如所述的，肝祖细胞为至少一种肝标志物及至少一种间充质标志物阳性。其可具有至少一种肝特异性活性。例如，肝标志物包括但不限于HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和α-1-抗胰蛋白酶，并且还可包括白蛋白(ALB)。间充质标志物包括但不限于波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)和CD140-b。肝特异性活性包括但不限于尿素分泌、胆红素缀合、分泌α-1-抗胰蛋白酶和CYP3A4活性。
在一个可选地的实施方式中，该方法在步骤(b)之后，例如一旦达到至少40％的定义汇合度，可直接包括另一步骤，即步骤(b)中获得的所产生细胞群表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且其可选地表达至少一种肝标志物和/或展现一肝特异性活性。
在另一个的可选的实施方式中，该方法在步骤(b)之后，例如一旦达到至少40％的定义汇合度，可直接包括另一步骤，即步骤(b)中获得的所产生细胞群共表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物与一种或多种选自甲胎蛋白(AFP)、α-1-抗胰蛋白酶、HNF-4和MRP2转运蛋白的肝标志物以及可选的肝标志物白蛋白。
该方法的步骤(c)是在导致步骤(b)中产生的细胞群扩增的条件下培养步骤(b)中产生的细胞群，而步骤(d)包括收获所述扩增的细胞群。
在步骤(c)中，原代细胞是在维持其粘附和同质细胞群增殖的细胞培养基中培养，其在至少一传代后，逐渐富集肝祖细胞或干细胞。这些肝祖细胞可快速扩增以产生更充足的细胞，从而获得具有所需性质之后代达至少2、3、4、5代以上传代。
术语“传代”或“传代培养”是指细胞的次培养(subculture)，其可通过收获和再接种细胞培养物或通过置换培养基而进行，例如目的是延长细胞寿命或扩增其数量。在本发明的方法中，在扩增步骤(c)中于粘附培养条件下使细胞生长的第一阶段后所进行的传代培养在本文称为“第一传代”(或传代1，P1)。细胞可传代培养至少一次且优选地两次或三次。在第1传代之后的各传代在本文是以加1的数字来指称，例如传代2、3、4、5或P1、P2、P3、P4、P5等。传代培养可包括以下步骤：(i)将获自步骤(b)的细胞或更早期的传代接种或植入适合细胞生长和扩增的基质上，在导致其扩增的条件下培养这些细胞，并且(ii)将培养的细胞与培养基质彼此相互分离和解离。
在一个实施方式中，根据本发明方法的步骤(c)包括将步骤(b)中产生的细胞群传代培养至少两次。在另一个实施方式中，该方法的步骤(c)包括将步骤(b)中产生的细胞群传代培养至多四次或五次。最终收获扩增的HALPC群可在P5之后或可选地在P4之后进行。在另一个实施方式中，该方法的步骤(c)包括将步骤(b)中产生的细胞群传代培养三或四次。在一个实施方式中，当达到至少40％汇合度时进行细胞在步骤(c)期间的传代培养。在其他实施方式中，当达到约至少50％、70％或至少90％以上的汇合度时进行步骤(c)中的单一传代培养。在另一个实施方式中，当达到至少大于或等于80％汇合度时进行步骤(c)中的传代培养。
在又另一个实施方式中，其中步骤(c)包括5次传代培养的步骤(c)的持续时间，为25至45天，或25至30天。当步骤(c)包括2或3次传代培养时，步骤(c)的持续时间为10至24天，或12至21天。在本发明的又另一个实施方式中，步骤(c)的各传代培养的持续时间为5至8天，优选地6-7天。
在一个优选的实施方式中，步骤(c)的培养条件还包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基。在另一个实施方式中，步骤(c)包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白及小于约30ng/mL的EGF或小于约10ng/mL的EGF的无异源无血清培养基，或其中所述培养基不含有EGF。优选地，无异源无血清培养基的特征还在于其展现出一个或多个上述实施方式中就用于步骤(b)中的培养基所描述的特性。
此外，这些无异源无血清培养基可用于步骤(c)的一个或多个传代培养。在另一个优选的实施方式中，整个步骤(c)是仅使用如针对步骤(b)所描述的无异源无血清培养基来进行。
步骤(c)中，分离的肝祖细胞可平铺或接种至使细胞粘附其上的基质，并于如本文所定义的液体培养基中培养并且持续其进一步的增殖。
原代肝祖细胞可例如在步骤(c)中于常规的单层培养系统中，例如以可选地包括表面处理或增进或使细胞粘附和增殖的涂层的堆积腔室形式培养和增殖。作为另一种选择，且优选地，步骤(c)在生物反应器中进行。
生物反应器为细胞培养系统，其提供受控制的环境以及以可复制、标准化方式调节适于细胞增殖和扩增的合适条件。相比于静置或传统的单层培养，例如“2D”平面培养系统(例如T-烧瓶)，生物反应器为可扩展且可用于较大规模或甚至工业规模的细胞制造。
优选地，生物反应器与微载体组合使用，所述微载体作为基质并提供步骤(b)所产生的肝细胞或步骤(c)正在经历传代的细胞的粘附的表面积。微载体可选自任一种本文所述的实施方式。
在一个实施方式中，该生物反应器为搅拌槽生物反应器。搅拌槽生物反应器可包括叶轮系统以供均匀搅拌，并且在培养和扩增期间搅动细胞悬浮液。
在优选的实施方式中，该生物反应器分别为卧式搅拌槽生物反应器或立式搅拌槽反应器。卧式搅拌槽生物反应器通常具有配置用来围绕垂直轴旋转的叶轮系统，例如通过安装在垂直方向轴承或轴杆的叶片，一般是在向上或向下的方向移动液体，即培养基。卧式搅拌槽类型的生物反应器的实例为旋转烧瓶(spinner flask)或旋转反应器(spinnerreactor)，有时只称为“旋转瓶(spinner)”。
另一方面，立式搅拌槽反应器配置有搅拌器或叶轮系统，所述搅拌器或叶轮系统可安装在水平方向轴承或轴杆上以便沿着水平轴旋转。在一个实施方式中，立式搅拌槽反应器为直立轮反应器，其中叶轮系统为混合轮的形式。立式搅拌槽反应器的实例为PBS直立轮反应器(PBS Biotech,Inc)。
可用于本发明内容中作为例示的其他市售生物反应器的实例包括
Figure BDA0003369122690000201
或
Figure BDA0003369122690000202
Mini、Allegro STR(Pall Corp.)、
Figure BDA0003369122690000203
250、
Figure BDA0003369122690000204
Biostat
Figure BDA0003369122690000205
(Sartorius-Stedim)和
Figure BDA0003369122690000206
STR(Merck-Millipore)。
在一个备选的实施方式中，该生物反应器不是搅拌槽反应器，而是包括替代叶轮的搅动工具的反应器，例如摇摆移动或摇动式生物反应器，其为整合或适用于摇动平台的生物反应器，所述摇动平台在运行时提供细胞培养波动或涡流。
可用于本发明的生物反应器可包括至少一个适用于容纳或装盛细胞培养物的容器；搅拌或搅动工具；以及一个或多个端口，其可以可选地为整体或部分的容器，并且适用于例如导入或补充液流(例如培养基或气体)的输入和/或输出，或用于导入微载体、细胞、营养素组分或适用于收获或洗涤细胞。优选地，生物反应器和导入生物器的所有的装置或组件皆为无菌的，并在无菌条件下作业。
在一个实施方式中，该生物反应器为一次性的生物反应器，其中所述生物反应器是经调节而适用于适合容纳培养组合物(例如培养基、微载体、细胞等)的一次性的容器或器皿(例如包袋)。
可并行使用一个或多个生物反应器进行步骤(c)中的细胞扩增。生物反应器也可以可选地也并行包括一个或多个，即多个适合装盛细胞培养物的容器的系统。
生物反应器的体积(即适合装盛细胞培养物及在其中发生细胞扩增的容器的体积)可以可选地分别为约0.1至约1,000升，或约0.2至约500升，或约0.5升(即500ml)至约200升。在其他实施方式中，生物反应器的体积为0.1至5升，例如3升，或5升，10升或50升。
在一个优选的实施方式中，方法步骤(c)包括使用两个以上不同的生物反应器，特别是连续使用两个(或更多个)具有基本上不同内体积的生物反应器。例如，步骤(b)中所产生的细胞群可以首先在体积约0.5L至约10L的生物反应器中扩增，并且随后转置于或在内体积约10L至约100L的不同生物反应器中传代培养。
步骤(c)的传代培养可进一步包括以下步骤：(i)将获自步骤(b)的细胞或更早期的步骤(c)的传代物接种至微载体上，在根据任一种本文所述的实施方式的生物反应器中，在导致其扩增的条件下培养这些细胞，并且(ii)将培养的细胞与培养基质彼此相互分离和解离。
如本文所理解的，术语“微载体”(或另一种选择“微珠”)为在培养期间可粘附或锚定细胞的颗粒状基质。微载体一般为小的、球状颗粒或珠粒，通常具有90至400μm的平均直径。如本文所用的表述“微载体”可指单个珠粒或多个珠粒。
微载体添加到细胞培养基作为粘附-依赖性细胞的生长表面。特别地，相比于单层细胞培养，微载体提供较高的表面-体积比，并可获得更好的过程控制。
潜在适合的微载体可以基于合成的聚合物，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸、聚乙交酯、聚己内酯，或者聚乳酸、聚乙交酯、聚己内酯的共聚物，例如聚乳酸-乙交酯(PLGA)。在一个实施方式中，使用基于合成聚合物的微载体，其基本上是无孔的。
在另一个实施方式中，所述微载体基于天然聚合物，或可选地改性的生物聚合物，例如包含多肽或多糖的聚合物。适合的实例包括但不限于基于明胶、海藻酸盐、胶原蛋白、交联聚半乳糖醛酸(PGA)、交联右旋糖酐、糖胺聚糖、纤维素或纤维素的衍生物(例如醚或酯)的微载体。可选地，基于可选地改性的生物聚合物的微载体为多孔的。
在另一个实施方式中，微载体可以为可消化或生物可降解的微载体。可消化的微载体可例如通过使用适合的酶和/或通过化学试剂，例如溶剂或螯合剂进一步消化、降解(或溶解)。在将对细胞存活的损伤或减少最小化的同时，可消化微载体对于细胞扩增方法为有利的，并可增加收获的活细胞。
如果使用可消化微载体，微载体的消化作为根据本发明方法的步骤(c)的子步骤或中间步骤来进行，例如在另一步骤的扩增和传代之前，作为从微载体分离扩增细胞的部分。微载体的消化也可以作为根据本发明步骤(d)的方法的部分来进行，以便于收获步骤(c)中获得的扩增细胞。
在一个实施方式中，根据本发明方法所使用的微载体为可消化微载体，例如Ca2+交联聚半乳糖醛酸(PGA)聚合物微载体，其可在收获阶段之后通过以EDTA和果胶酶处理来消化。
在根据本发明方法的一个优选的实施方式中，微载体选自聚苯乙烯、明胶、交联右旋糖酐、交联纤维素、具有氧化硅的聚乙烯、聚乙烯醇(PVA)和可消化的微载体。
微载体，即组成微载体的微珠表面，可涂覆有帮助细胞粘附的生物相容性物质。特别地，在本发明方法的上下文中，基于合成聚合物的微载体优选地呈现涂层，而且对于基于特定生物聚合物的微载体，涂层可用于进一步增强珠的特性。
在一个实施方式中，微载体是涂覆有促进细胞粘附的生物相容性物质，可选地其中所述涂层为合成涂层、合成聚合物、生物聚合物或微载体的化学表面改性。
如本文所用的，术语“涂层”或“涂覆”是指施用微载体基质核心的处理，其改变微载体颗粒或基质核心的性质，包括但不限于，例如表面电荷、细胞粘附或结合亲和力、多孔性、密度、微载体直径和其他物化性质。如本文所用的术语“涂覆”不仅可包括施用微载体基质“核心”的物理层，还包括“化学涂层”，即任何化学改性或表面改性部分与微载体基质表面的共价缀合。
优选地，所述涂层为蛋白或多肽涂层。该涂层特别地可包括一种或多种胞外基质(ECM)或ECM-结合蛋白或肽。适合的涂层包括但不限于胶原蛋白，优选人胶原蛋白；明胶或其他肽涂层，例如包括纤连蛋白或纤连蛋白肽；玻连蛋白或玻连蛋白肽；层粘连蛋白或层粘连蛋白肽或任何其他胞外基质(ECM)蛋白或肽衍生物，及其组合。这些涂层优选地经调节适用于并且适合促进细胞对基质的粘附。
一些微载体可利用专属的涂层。专属的无异源涂层的实例包括来自Corning的
Figure BDA0003369122690000231
或Synthemax
Figure BDA0003369122690000232
或来自SoloHill Eng的NunclonTM。
在其他实施方式中，微载体涂层不含有多肽。反之，该涂层可为合成或人工涂层，例如玻璃涂层，特别是高硅玻璃。在其他实施方式中，该涂层为化学涂层或微载体基质表面的化学改性。在一个实施方式中，表面改性包括导入阳离子三甲基铵基团。在其他实施方式中，该表面可经二乙氨基乙基(DEAE)部分改性，例如在DEAE-纤维素或DEAE改性的交联右旋糖酐(例如Cytodex 1)的情况。
取决于微载体基质的材料和/或涂层的选择(如果施加的话)，所述微载体颗粒或珠可具有表面电荷。在一些实施方式中，所述微载体具有不带电或中性的表面。在其他实施方式中，该微载体具有带正电荷的表面。在其他实施方式中，该微载体具有些微带负电荷表面。带电的表面可通过以带电的涂层涂覆、以物理上或经由化学改性或表面核心基质的处理来获得。
能使微载体基质表面为中性或不带电的包括胶原蛋白、聚苯乙烯、右旋糖酐、高硅玻璃或聚乙烯醇。带正电荷的表面在另一方面可通过利用经涂覆或处理过的微载体来获得，例如涂覆有阳离子胶原蛋白、阳离子三甲基铵或二乙氨基乙基的微载体。
取决于材料的选择，微载体可以可选地分类为可以包括玻璃或塑料的刚性微载体(例如聚苯乙烯微载体)或软性膨胀型微载体(例如，明胶、海藻酸或右旋糖酐微载体)。
在本发明的一个实施方式中，该微载体通过选自以下的表面处理涂覆：肽涂层，例如胶原蛋白、明胶或纤连蛋白；玻璃涂层，例如高硅玻璃；以及化学或表面带电涂层，例如阳离子三甲基铵或二乙氨基乙基。
在一个优选的实施方式中，本发明上下文中所用的微载体和/或其涂层为无异源，即不含任何非人、动物组分。特别地，优选的是任何多肽基质微载体或经改性或经多肽或蛋白涂覆的微载体为无异源的，或是通过不使用任何非人、动物产品或动物来源的组分的方法或培养所获得。
在另一个实施方式中，涂层包括人重组肽或蛋白，例如rh-胶原蛋白、rh-纤连蛋白、rh-玻连蛋白、rh-层粘连蛋白或其任意组合。
在一个实施方式中，近似球状或微珠的微载体的平均直径为50至500μm。微载体可为大小均匀的。
珠形式或近似球状的特别适合的微载体为具有约90至400μm的体积中值直径(d50)的微载体。术语体积中值直径或d50是指50％体积的微载体样品的直径。在其他优选的实施方式中，该微载体可具有分别为100至300μm或100至250μm的体积中值直径。
在其他实施方式中，珠形式或近似球状的微载体可具有以d5值和/或d95值表示的直径，其是指第5个百分位和第95个百分位的微载体样品的直径。例如，d5值可分别为约50至约250μm或约80至约200μm；和/或d95值可分别为约100至约400μm或从约150至约300μm。
一般而言，微载体可分类为实体(无孔隙)或多孔隙微载体。多孔隙微载体可为大孔或微孔，或大孔和微孔的组合。大孔载体包括50nm以上的孔，而微孔的微载体通常包括10至35μm的孔。
相比于常规的单层培养基质，微载体可提供更大的表面积供细胞粘附。在一个实施方式中，用于扩增的步骤(c)中肝祖细胞接种在其上的微载体具有300-6,000cm2/g的表面积。在一个具体实施方式中，该微载体具有300至600cm2/g的表面积。在其他实施方式中，微载体的表面积分别为约1,000至约6,000cm2/g或约2,000至约5,000cm2/g。在一个具体实施方式中，该微载体包括基于可酶促消化的生物聚合物的多孔微珠，其中所述微珠具有约100μm至约250μm的d50值和约2,000至约5,000cm2/g的表面积。
与多孔和实心微载体无关，微载体的平均密度通常是大于1g/cm3。优选地，在细胞培养基中微载体的密度调节至适合均匀和一致的悬浮液及适合在生物反应器中搅拌或移动。在本发明的一个实施方式中，该微载体以1.02和1.12g/cm3的平均密度来使用。特别地，平均密度可以为约1.01、1.02、1.03、1.04或1.05g/cm3。在一些情况中，平均密度为约1.10、1.11或1.12g/cm3。
在根据本发明方法的一个实施方式中，该微载体是平均直径为90至400μm，密度为1.02至1.12g/cm3且表面积为300至600cm2/g的珠。
在另一个实施方式中，该微载体是平均直径为约250μm，密度为约1.02-1.03g/cm3且表面积为约5000cm2/g的可消化微载体(例如，交联的聚半乳糖醛酸聚合物(PGA)微载体)。
当传代培养时，将培养细胞与培养基质彼此相互分离和解离。细胞的分离和解离可如本领域中公知的来进行，例如通过以蛋白水解酶的酶处理(例如选自胰蛋白酶、胶原蛋白酶，例如第I、II、III或IV型，分散酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等)，以二价的离子螯合剂处理(例如EDTA或EGTA)或机械处理(例如，经由小口径移液管或移液管管尖重复吸取)或这些处理的任意组合。优选地，细胞是通过用水解蛋白酶促处理来分离。
当保留培养基中大多数的细胞时，适合分离和分散细胞的方法应确保所需的细胞分离和分散程度。优选地，培养细胞的分离和解离应有很大的细胞比例为单个活细胞，例如至少50％、70％、90％的细胞或更多。剩余的细胞可以以细胞簇存在，各簇含有相对少数的细胞，例如平均为1至100个细胞。
然后所述经分离和解离的细胞可依步骤(d)收获，或另外如果在步骤(c)下进行进一步的扩增和传代培养，则如上所述再铺板或再接种于使细胞粘附其上的基质并随后于培养基中培养，维持HALPCs和HALPC后代的进一步增殖。
在另一个实施方式中，步骤(c)中于微载体上培养的细胞的接种密度，即步骤(c)中第一传代或后续传代，密度为1000-8000个细胞/cm2。在另一个实施方式中，接种密度为约5000个细胞/cm2，或不大于5000个细胞/cm2。
细胞也可以通过约1/16至1/2，优选地约1/8至1/2，更优选约1/4至1/2的分流比(splitting ratio)再铺板来培养。分流比是指接种至与获得所述细胞的容器表面积相同的空的(通常，新的)培养容器的传代细胞的分数。
培养容器的类型以及使细胞粘附至培养容器的表面和细胞培养基可与最初使用或与上述相同，或可以不同。如前面所提及的，细胞可在任何适合的支持体上培养，所述支持体可以可选地涂覆有例如胞外基质蛋白(例如胶原蛋白，并且优选地第I型胶原蛋白)或临床等级细胞培养上可接受和可用的GMP等级的合成肽。
针对上述步骤(d)的方法，关于最终收获和分离HALPC群，术语“细胞群”一般是指一组细胞。除非另有指出，否则此术语是指基本上由如本文所定义的细胞组成的细胞组或包括的细胞组。细胞群基本上可由具有共同表型的细胞所组成，或可包括至少部分具有共同表型的细胞。当细胞在一个或多个可验证的特征上为基本上相似或相同，则其称为具有共同表型，其包括但不限于形态外观、特定细胞组分或产物(例如RNA或蛋白)的表达程度、特定生化路径的活性、增殖能力和/或动力学、分化潜能/或对分化信号的反应或体外培养期间的行为(例如粘附或单层生长)。这些可验证的特征因此可定义一细胞群或其部分。如果基本上大多数的细胞具有共同的表型，则细胞群可以为“基本上同源的”。“基本上同源的”细胞群可包括至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，或甚至至少99％的具有共同表型的细胞，例如特别指出的表型(例如本发明的肝祖细胞或干细胞，或本发明的肝祖细胞或干细胞后代的表型)。此外，细胞群基本上可由具有共同表型(例如本发明的肝祖细胞或干细胞的表型)的细胞所组成(即，本发明的肝祖细胞或干细胞的后代)，如果存在此群中的任何其他细胞没有变异或不具有影响细胞群的整体性质的物质，且因此其可定义为细胞系。
无论所施用的方法为何，可在细胞悬浮液上于最后收获时，在方法步骤(b)之后，或步骤(c)的任一种传代培养，以及在配制HALPCs期间内或在质量控制测试期间可以进行细胞计数和细胞存活力。可使用本领域中已知的任何方法，例如使用Burker Chamber的手动计数法，或自动计数器，例如NucleoCounter。这些方法的目标为测定细胞的总量以及活细胞的量。
使用Burker Chamber的手动计数法是基于台盼蓝排除测试(Trypan Blueexclusion test)。根据用于进行此分析的方法，是将细胞悬浮液以PBS或任何其他适合的重构介质稀释，计数每室100至200个活细胞。使用1:1比率将台盼蓝加到细胞悬浮液中。通过显微术和细胞计数器计算细胞。白色细胞为活细胞；蓝色细胞为死细胞。然后计算活细胞和死细胞的百分比。进行两次细胞计数。如果两次计数之间的差异＞15％，则进行第三次计数。本领域技术人员应理解，也可使用类似的方法和材料并可产生基本上等效的结果。
作为另一选择，可使用基于图像细胞仪的自动细胞计数器，例如NucleocounterNC-200 1-step或类似仪器。此种图像细胞仪提供基于荧光显微镜和先进图像分析的高精确自动细胞计数器，以进行死细胞和总细胞的图像细胞计数排除。在Nucleocounter NC-200 1-step的情况下，可使用含有固定化荧光染料的Via1-CassetteTM，即分别自动染色总细胞和死细胞群的吖啶橙和DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)进行一步法。再次，本领域技术人员应理解，可以类似地使用其他仪器、策略和材料。将细胞悬浮液稀释，以计数7x105至2x106个总细胞/ml。吸取校准体积的Via1-CassetteTM，并且NC-200将自动测定总细胞和死细胞浓度及存活力百分比。所有的计数一式三份进行。报告的数值为三个独立抽取样品的有效结果的平均。就总细胞浓度和活力，总细胞计数必须介于之间并且变异系数(CV)必须不超过15.0％，则才是有效的。
根据本发明用于制造HALPC群的方法的步骤(e)是确定：步骤(c)中获得的扩增细胞群的细胞确实是所需的人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)。例如，这可包括确定：这些细胞表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且可选地表达至少一种肝标志物和/或展现肝-特异性活性。作为另一选择，其可包括确定：这些细胞共表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物与一种或多种选自甲胎蛋白(AFP)、α-1-抗胰蛋白酶、HNF-4和MRP2转运蛋白的肝标志物以及可选地肝标志物白蛋白。作为另一选择，其可包括确定：这些细胞共表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物与肝细胞生长因子(HGF)以及可选的前列腺素E2(PGE2)。
在另一个优选的实施方式中，步骤(e)包括确定：步骤(c)或(d)中获得的HALPCs为CD90、CD73、波形蛋白和ASMA阳性。可在步骤(e)中确定的另外替代标志物和/或活性样貌已于上本文描述。
如本文所用的，术语“确定”应广义并在控制医药制造方法的背景之下解释。当必须验证以分批式法所制造的细胞的身分特征时，其可以不需要或就每个批次实行测试整体细胞特征范围，例如细胞的整体标志物或活性样貌。可以仅检查已选出作为特定细胞类型或亚型的指征的关键标志物或细胞性质便已足够。
例如出于质量控制的目的，所述例如通过验证标志物表达来确定细胞的身分特征的步骤，可以在任何步骤(c)的传代培养之后，例如第一传代(P1)、第二传代(P2)等之后进行。
例如通过验证特定标志物的表达来确定细胞的身分特征的步骤，也可在步骤(c)的最终传代培养之后进行，例如在收获依照方法步骤(d)获得的细胞群时。换言之，步骤(e)可在步骤(d)之前或之后进行，或与步骤(c)并行。
此外，例如通过检查所选标志物的表达来确定细胞的身分特征，也可以可选地在从培养步骤(b)所获得的所产生细胞群组样品上进行。然而，此种在早期方法步骤(b)所获得的细胞的额外测试不能替代步骤(e)。
再次，用于确定细胞的身分特征的潜在有用标志物可选自本文所公开的优选的或可选的标志物，并且本领域技术人员应理解，常规的身分特征检查可以并非必要或对检查细胞的整体标志物样貌为有用的。一般而言，确认是否存在一些标志物应已足够，而所述标志物是特定选为确定分批式法中所生产的细胞身分特征的关键。
在另一个实施方式中，根据本发明制备的HALPCs
a.对于α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)、CD140b和可选的白蛋白(ALB)为阳性；并且
b.对于细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。
在一个特别优选的实施方式中，根据本发明制备的HALPCs对于CD90、CD73、波形蛋白和ASMA为阳性，并且对于CK-19为阴性。
在另一个实施方式中，根据本发明制备的HALPCs
a.对于α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)、CD140b和可选的白蛋白(ALB)及含有SuShi结构域(Sushi domain)的蛋白2(SUSD2)为阳性；并且
b.对于细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。
在另一个实施方式中，这些细胞在表型测定上也可
a.对于α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)、CD140b和可选的白蛋白(ALB)为阳性；
b.对于含有SuShi结构域的蛋白2(SUSD2)及细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。
在另一个实施方式中，这些细胞也可在以下的表型测定上或测量上对于以下为阳性：
a.至少一种选自HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的肝标志物和可选的白蛋白；
b.至少一种选自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的间充质标志物；
c.至少一种选自尿素分泌、胆红素缀合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝特异性活性；
d.至少一种选自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81的标志物；以及
e.至少一种选自MMP1、ITGA11、FMOD、KCND2、CCL11、ASPN、KCNK2和HMCN1的标志物。
在另一可选地的实施方式中，所述细胞对于HLA-DR为阴性。
在另一个实施方式中，进一步测试HALPCs并确定成对于标志物CD133、CD45、CK19和/或CD31为阴性。
也可以以任何功能和技术组合测定上述实施方式的HALPCs的其他特征，例如通过测量对至少另一种选自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81的标志物为阳性来进行。在一些这样的实施方式中，HALPCs可针对至少一种选自由ITGAM、ITGAX、IL1R2、CDH5和NCAM1组成的组中的其他标志物测量为阴性。在一些这样的实施方式中，HALPCs可针对HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM1、CD24、CPM和APOC1中的至少一种测量为阴性。
如本文所用的种源细胞库(master stock cell)(MCS)可定义为从培养步骤(b)所获得的所产生细胞群，其已根据步骤(c)扩增至给定数量的细胞，其可分装并储存以供作为制造另外但有限批次的最终细胞产物的起始物，即本发明内容中的HALPCs。
由根据本发明方法的步骤(b)可获得的原代肝细胞群，即根据任一种本文所述的实施方式，在无异源无血清培养基中培养来自肝细胞悬浮液的原代肝细胞，或作为另一选择，由任何步骤(c)的传代培养物收获的细胞群可无菌调配制，填入小瓶中并低温储存作为种源细胞库。所述种源细胞库可在之后解冻，并接种至适当的培养容器或生物反应器中，以便继续进行该方法，所述方法可以包括另外的步骤(c)、(d)和(e)。
在一个实施方式中，根据本发明的方法可进一步包括以下步骤：
(c1)收获在步骤(b)中或在步骤(c)的任何传代培养之后获得的细胞群；
(c2)在步骤(c1)收获的细胞群中加入防冻保护剂，以获得防冻保护的细胞制剂；
(c3)将所述防冻保护的细胞制剂冷冻；并且
(c4)将所述冷冻的防冻保护的细胞制剂解冻；
其中步骤(c1)至(c4)作为步骤(c)的子步骤进行。
在一个实施方式中，步骤(c1)至(c4)作为步骤(c)的一系列子步骤，在步骤(c)开始时立即进行。因此，在步骤(c1)中，收获步骤(b)中获得的细胞群。后续的步骤仍相同：(c2)在步骤(c1)收获的细胞群中加入防冻保护剂，以获得防冻保护的细胞制剂；(c3)将所述防冻保护的细胞制剂冷冻；并且(c4)将所述冷冻的防冻保护的细胞制剂解冻。
在另一个实施方式中，步骤(c1)至(c4)作为步骤(c)的子步骤，根据步骤(c)在细胞群的一个(即，第一或P1)传代之后进行。换言之，可进行步骤(c)为P1，然后产生MCS(即步骤(c1)至(c4))，然后是P2(可选地然后是P3，其可选地然后是P4)。作为另一选择，可进行步骤(c)为P1，然后是P2，然后产生MCS(即步骤(c1)至(c4))，然后是P3(可选地然后是P4)。
当需要或计划进一步生产HALPCs群时，可进行包括解冻所述冷冻的防冻保护的细胞制剂的步骤(c4)。步骤(c3)和步骤(c4)之间所经历的时间可以分别高达12个月，或高达24个月，或甚至更长。
在另一方面，本发明涉及在所述方法的步骤(c2)或步骤(c3)中获得的防冻保护的细胞制剂。
如本文所用的，防冻保护剂为一种能保护活细胞免于冷冻伤害的试剂。可以有用的防冻保护剂的实例包括二甲基亚砜(DMSO)、甘醇类例如甘油、糖和糖醇。
在一个实施方式中，防冻保护剂为DMSO。在此情况下，优选地，防冻保护的细胞制剂中DMSO的含量不高于约5％。在其他实施方式中，防冻保护的细胞制剂包括不大于2％的DMSO。在一个备选的实施方式中，所述防冻保护剂不包括DMSO。
在另一个实施方式中，防冻保护的细胞制剂中的细胞浓度为每小瓶约10x106个细胞或每小瓶2百万至2千万个细胞(例如，就体积6ml的小瓶而言)。所述细胞数量可通过上文所定义的方法或本领域已知的用于细胞计数的方法来测定。
在另一方面，本发明涉及包括纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基在培养从人肝脏获得或可获得的原代肝细胞以用于制造人同种异体肝源性细胞(HALPC)的用途。特别地，本发明提供包括纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基的用途，其特征还在于其含有小于30ng/mL的表皮生长因子，以用于制造人同种异体肝源性细胞。在相关的实施方式中，所述无异源无血清培养基展现如上所述方法步骤(b)和/或(c)的公开内容中的一个或多个其他特征。在另一方面，本发明涉及人同种异体肝源性祖细胞，例如通过本发明方法可获得的分离的HALPC，以及通过本文所述的方法，和根据任一种本文所述的相关实施方式或其组合可获得的分离的人同种异体肝源性祖细胞群。
发明人已发现，根据本发明制备的HALPCs与先前通过依赖包括胎牛血清的培养基的方法获得的细胞相比，显示一些轻微但可能有利的差异。在一方面，根据本发明制备的HALPCs具有相同的形态，但是尺寸稍小。例如，相比于其他以胎牛血清制备的类似细胞，根据本发明制备的细胞，平均细胞直径通常小约5至20％，例如10至15％。例如，在一个比较中，如使用基于图像细胞计数的自动细胞计数器(例如NucleoCounter NC-200)所测定的，根据本发明制备的HALPCs的平均细胞直径为大约14μm，而以血清制备的类似HALPCs为大约16μm。一般而言，较小的细胞尺寸对于处理和施用细胞是潜在有利的，因为较小的直径可解释为沉降较慢及可注射性更好。
此外，如实施例5中所述和图4中所示，相比于以胎牛血清制备的HALPCs，根据本发明制备的HALPCs展现下降的每分裂中期克隆异常和以及非克隆异常的平均水平。一般而言，在细胞治疗的情况下，期望较低的异常发生率。
在又一方面，本发明提供人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)，其对于CD90、CD73、波形蛋白和ASMA为阳性，并且展现平均每分裂中期小于约2.5％克隆异常和/或分裂每中期小于约15％非克隆异常。
本发明还涉及所述分离的人同种异体肝源性祖细胞群，其用于治疗肝疾病，或所述分离的人同种异体肝源性祖细胞群在制造用于治疗肝疾病的药物中的用途。此外，本发明也可包括治疗肝疾病的方法，所述方法包括将所述分离的人同种异体肝源性祖细胞群施用于有需要的患者的步骤。例如，这些细胞可用于治疗慢加急性肝衰竭(ACLF)，或用于治疗非酒精性脂肪肝疾病，例如非酒精性脂肪肝炎(NASH)。
以下实施例是用来说明本发明，然而，不应理解为限制本发明的范围。
实施例
实施例1-在无异源无血清培养基中制造HALPC细胞
根据以下一般程序制备HALPCs。
肝细胞悬浮液(LCS)制剂
由捐赠的肝脏制造肝细胞悬浮液。在37℃使用多步骤胶原蛋白酶灌流的技术获得肝细胞。将全肝或片段称重。将套管插入可进入的脉管系统并连接灌流泵送。制造LCS的主要步骤包括桥粒松散，肝消化，肝破坏、过滤，以离心分离肝细胞并低温保存最终的LCS。
以含有Ca2+螯合剂以及抗生素的钙络合介质灌流肝组织，以便通过络合Ca2+来移除残余的血液并松散细胞连结(桥粒)。然后将含有胶原蛋白酶+/-蛋白酶的消化介质灌入肝脏，快速破坏胶原蛋白基质。当其变脆弱时，将肝置于在筛子上。在停止胶原蛋白酶缓冲液流之后，移除套管并将肝组织机械破坏及撕裂。通过缓和的震动使细胞从消化的组织释出，并且然后通过肝包膜金属筛或通过尼龙网过滤并洗涤，以便移除未消化的肝碎块(例如，Glisson肝包膜、结缔组织、血管树和未灌流/未消化肝组织部分)。然后收集悬浮液进行离心。以离心将肝细胞以冷的洗涤介质浓缩一次，洗涤两次，总计旋转三次，并且然后浓缩，之后冷冻并储存。冷冻之前，将上清液丢弃并将肝细胞团块再悬浮于有或无初步添加缓冲液的冷冻培养基及针对细胞活力采样，并于≤130℃储存在袋中或小瓶中(细胞浓度为7.5-20x106个细胞/mL)。可选地，可使用新鲜制备的LCS并直接进行HALPCs的制造。
产出(P0)
为了制备HALPCs，是将一袋低温保存的肝细胞悬浮液(±650M个细胞)在重建培养基(碳酸氢钠、肝素、葡萄糖、人白蛋白)中解冻并离心两次，历时10分钟((+4℃)以224g)。离心后，将细胞团再悬浮在适当体积的选择培养基中并使用NucleoCounter NC-200(Chemometec)计数。
以66,666/cm2或者20,000/cm2并以0.20mL/cm2或0.16mL/cm2的表面-体积比接种无菌培养烧瓶(具有CellBIND表面的T-烧瓶)。
培养维持在+37℃，含有5％CO2的湿化气氛中。培养基一周更换两次(例如，每3至4天)。当培养接近汇合时(≥80％)，以DPBS(杜尔贝科磷酸缓冲盐水)，以0.20mL/cm2或0.16mL/cm2的表面-体积比洗涤细胞一次，并且然后通过以TrypLETM选择酶以0.04mL/cm2的表面-体积比处理来分离。随后以培养基(DMEM(杜尔贝科改性伊格尔培养基)/2％HSA)以0.12mL/cm2或0.08mL/cm2的表面-体积比进行淬火。以锥形无菌试管收获细胞悬浮液并以224g离心10分钟(+15-25℃)。然后丢弃上清液，并以培养基将细胞团再悬浮。采集样品，经由NucleoCounter NC-200装置(Chemometec)计算细胞数。
扩增(P1至P5)
P1(传代1)-将来自P0的细胞以5000个细胞/cm2密度再铺板或再接种在无菌培养容器内的选择培养基中。培养维持在+37℃，含有5％CO2的湿化气氛中。培养基一周更换两次(例如，每3至4天)，直到接近汇合(≥80％)。如上文产出(P0)章节，重复后续的处理步骤以从基质/容器收获以及分离细胞供进一步传代培养，即传代培养(subcultivation)。如本文所理解的，传代数(P1至P5)仅仅是指细胞在培养中传代培养的次数。
P2(传代2)至P5(传代5)-重复上述如P1的步骤，直到最后P5(传代5)，直到最终的P5(传代5)，此时进行最终的收获HALPC细胞(P5/H)。合并所有细胞以形成最终收获物。
收获之后(且可以可选地在任一种P1至P5传代或其组合中完成)，对细胞采样并例如就细胞存活力、纯度和身分特征(例如，针对CD90、CD73、波形蛋白和/或α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的表达)进行分析。
收获时，将HALPC细胞再悬浮在低温保存溶液中(CryoStore CS5)并低温保存。
用于产生HALPC(P0)和用于扩增步骤(P1至P5)的培养基是选自无血清无异源的培养基(分别为培养基A、培养基B和培养基C)。所有无血清无异源的培养基包括无机金属盐的碱性混合物、营养素例如氨基酸和维生素，并具有pH 7.0至7.4的pH，例如已知来自杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)或DMEM/F-12的组合物。培养基也含有谷氨酰胺或谷氨酸，或其前体，例如L-丙酰胺基-L-谷氨酰胺，和不大于2重量％的量的葡萄糖，以及一种或多种脂肪酸。
培养基A进一步包括纯化的天然人蛋白以及重组人蛋白组分，包括纯化的人血浆衍生的血清白蛋白和转铁蛋白，以及重组人胰岛素。培养基还包括人生长因子，但并不含EGF。此类型的市售产品为
Figure BDA0003369122690000331
MSC Expansion XSFM(FUJIFILM IrvineScientific)，其用于此实施例1中。
培养基B还包括天然纯化的人血清白蛋白和重组人胰岛素。在此实施例中，使用市售产品
Figure BDA0003369122690000332
MSC Expansion kit XF(Miltenyi Biotech)作为培养基B。
培养基C为特制的培养基组合物，其主要特征在于其含有源自水稻植物的重组人血清白蛋白(例如
Figure BDA0003369122690000333
和/或
Figure BDA0003369122690000334
皆购自InVitria)，其中至少一些可以与脂质结合，特别是类似这些通常与人血清中的白蛋白结合的脂肪酸或脂肪酸化合物。其也含有重组人转铁蛋白(可用的有
Figure BDA0003369122690000335
InVitria)。不存在生长因子EGF。
出于比较，也使用含有源自动物的血清的培养基作为制造HALPC细胞的参照：补充有9.1％FBS(胎牛血清)的DMEM；补充有9.1％FBS(胎牛血清)、胰岛素和地塞米松的William’s E。在P0用于Williams E参照的铺板密度仅处在66666/cm2。
结果
相比于包括FBS的参照培养基，在以无异源无血清培养基进行的方法中，观察到产生HALPC细胞(P0)的时间明显较短(表1)。
表1产出时间
Figure BDA0003369122690000341
此外，扩增步骤中培养的持续时间，即从传代P1到完成P5/收获的时间也明显较短(表2)。
表2培养时间(实现P5收获的时间)
Figure BDA0003369122690000342
还确定了，对于在无异源无血清培养基中进行的培养达到每传代较高的群倍增频率，或换言之，较高的细胞产量。这由较高的累积群倍水平(cPDL)的数值反映出，其是指在其初次体外分离之后，从第一次扩增(从P1)起，在群中细胞倍增的次数，并且也为特定培养的“年龄”的测量值(表3)。
表3培养性能(从P1开始的cPDL)
Figure BDA0003369122690000351
测试功能性例如免疫调节活性和分泌蛋白组分析(例如，肝细胞生长因子或HGF分泌量)以及细胞活力，并发现在获自无血清和含血清培养的肝祖细胞之间为大致相当的。测试由无异源无血清培养基所产生的HALPC细胞的身分特征和纯度，也发现为大致相当的，并且符合HALPCs所确定的接受标准。此外，安全性样貌，包括获自无异源无血清培养基培养的细胞样品的核型稳定性以及衰老和致肿瘤性，发现完全符合标准要求和接受标准，并且与基于参照培养基的培养获得的数值相当或更佳。
有趣的是，在过程比较中也观察到在20,000个细胞/cm2的较低细胞铺板密度的无异源无血清培养基所生产的细胞产量与66,666个细胞/cm2的较高密度的大约类似。出乎意料地，观察到在全部的无异源无血清培养基方法中以较低密度铺板时在P0都成功产生肝细胞，而相比之下在该铺板密度下对于对照DMEM/9.1％FBS培养基则失败了(表4)。
由无异源无血清培养基支持的较低细胞密度在制造期间有利地提供更有效的使用肝细胞悬浮储液。
表4-产出
Figure BDA0003369122690000352
Figure BDA0003369122690000361
如图2所示，其为以其中一种试验的无异源无血清培养基A所进行的生产运行从产生P0至扩增传代5的整体培养时间(数据点以空心圆绘出)与含有FCS的血清培养基(数据点以实心圆绘出)的图形比较，血清培养基法的达到P5的整体培养时间在所有的传代中皆较高。以含有血清的参照培养基所进行的生产运行，观察到48天的总培养时间，相比之下，以无血清无异源培养基A的制造总计29天的时间。这产生了每次接种的理论产量，其相比于参照培养基，在无异源无血清培养基中所进行的方法经计算高出几乎50倍(图3)。
实施例2-制备HALPCs的种源细胞库
种源细胞库是在实施例1的传代1(P1)之后由一种基于无异源无血清培养基的培养来制备。在P1时，当约80％汇合度时收获细胞，并将所得的细胞团再悬浮于低温保存培养基中(Cryostor-5)。通过将每瓶填入约1千万-5千万个活细胞的小瓶冷冻，制造储备液。小瓶在无菌条件下充填。
相对于直接从肝细胞悬浮液的仅单一次的制造，所述储备液可用于进一步的制造回合(例如，至多25回合)，以提供HALPC细胞。如在实施例1中所见，更快且也更有效率生产(P0)，其使得细胞的产量增加且制造时间更快，如在提供制造种源细胞库机会的无异源无血清培养基中所观察到的。
实施例3–由MCS在微载体上的生物反应器扩增HALPC
以下为用于由根据实施例2的方案制备的种源细胞库(MCS)扩增HALPC的代表性一般程序。
将来自MCS的一个或多个小瓶解冻并将细胞接种至在小型生物反应器内(例如100mL或3L生物反应器，例如PBS直立轮式生物反应)的培养基内的微载体上，所述培养基例如实施例1中所用的无异源无血清培养基(例如培养基A)。在细胞粘附(静置或半静置)至微载体之后，搅拌微载体并调节生物反应器中培养基的体积。将微载体接种充足的细胞，以便获得平均每粒微载体至少一个细胞。
调节生物反应器中的搅动速度以控制和最小化剪切力，但处于足够的速率以避免微载体沉降在容器底部并避免结块。通过测量代谢参数，例如葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨，监测生长。培养基在±第4天更新，在±第6天收获。
在典型的方法中，微载体的浓度以每升15g的微载体来提供。例如，具有大约360cm2/g表面积的微载体可提供约5400cm2的培养表面。大约15g的微载体可提供±45M微载体，使得每粒微载体接种大约1个细胞，培养物中的细胞量应为每升至少约45-50M个细胞。
在优化时，在6-7天内预期可扩增20倍，产生每升高达±1B个细胞。
在培养结束时，排出培养基并以缓冲液洗涤微载体，之后将其在低搅动下以TryplE培养。使用袋内筛系统(sieve-in-a-bag system)从微载体分离细胞，即将细胞通过筛子(通常70μm)并保留较大的微载体。作为另一选择，在可消化微载体的情况下，与消化剂(例如，用于交联右旋糖酐微载体的果胶酶)一起培养微载体并洗涤所产生的混合物以显露细胞。在这两种情况下，可随后将细胞悬浮液通过离心系统
Figure BDA0003369122690000375
以进行洗涤和浓缩。在下游处理期间的细胞损失预计大约15％。
发现此扩增步骤可在尺寸高达50L的生物反应器中再制造和/或重复一或两次(传代P2，传代P3)。在该情况中，整个生产运行通常花费大约14天。
实施例4-接种HALPC-的微载体的生物反应器扩增
以下研究评估使用微载体和生物反应器的HALPC扩增。该研究是根据实施例3中所述的通用培养和收获程序来进行，但是细胞是由不同的传代所获得并用作新鲜细胞或解冻细胞来使用。
特别地，扩增是在作为卧式搅拌槽生物反应器的实例的旋转容器中于直立轮式搅拌生物反应器系统(PBS Biotech)中对微载体进行测试。使用T-烧瓶(T175
Figure BDA0003369122690000371
Figure BDA0003369122690000372
)做为对照。所测试的微载体基质包括涂覆胶原蛋白的微载体(Solohill Eng.)，以及可溶性
Figure BDA0003369122690000373
II微载体
Figure BDA0003369122690000374
使用前，根据说明将微载体水合及重建。将细胞以5000个细胞/cm2接种在所选的微载体培养容器。所用的培养基为DMEM/9％FBS培养基。
在使用涂覆胶原蛋白的微载体(以15cm2/mL和5000个细胞/cm2接种密度来提供)和DMEM/9％FBS培养基的试验中，相比于对照，观察到在生物反应器/微载体系统(直立轮式和搅拌器)中都在第7天提供较高数目的活细胞数/cm2(图1)。在使用经可溶性
Figure BDA0003369122690000381
肽表面处理过的微载体(以5cm2/mL和5000个细胞/cm2接种密度来提供)和DMEM/9％FBS培养基的试验中，观察到类似结果(图2)。
实施例5-核型分析：根据本发明制备的HALPCs与常规制备的HALPCs的比较
根据本发明，遵循实施例1的程序并且使用培养基A制备一系列批次的HALPCs，并与以基本上相同方法制造但在比较性批次中用于步骤(b)和(c)(即在产生和扩增期间)的培养基为包括胎牛血清的常规培养基的批次相比较。
核型分析是在如下所获得的这些批次的细胞样品上进行：
将新鲜收集的细胞以3x T175 CellBind以5,000个活细胞/cm2接种在常用的培养基中。然后持续培养细胞直到约70％的汇合度(汇合度必须为30至80％)。
阻断有丝分裂的分裂中期：然后将细胞以0.1ug/ml的N-去乙酰基-N-甲基-秋水仙素溶液的培养基于+37℃培养18小时(+/-2小时)，以停止存在细胞微管中的微管蛋白的聚合并就此防止有丝分裂纺锤体形成，在分裂中期阶段阻断细胞。
收集细胞：接着，使用胰蛋白酶消化收集细胞，然后在1,200rpm和室温下离心。
低渗休克：将+37℃的稀氯化钾溶液逐滴加到细胞，使细胞团缓慢崩解并达到均匀悬浮液。随后，将细胞于+37℃培养25分钟，使KCl引发细胞的低渗休克，使其经由渗透压差膨胀。此膨胀使细胞展开并得以分析染色体。
固定细胞：随后，使用缓慢加到细胞中的乙酸和甲醇(3:1)混合物，，在室温固定细胞，然后于室温温育并于室温以1,200rpm离心。再进行数次循环，即将团块再悬浮于固定混合物中，温育并在室温下以1,200rpm进行离心。
展开和染色：将固定的样品铺开在载玻片上。干燥后，用NaH2PO4H2O溶液将样品变性，用水洗涤并以4％Giemsa溶液(G-banding)染色。染色后，再次用水洗涤载玻片并风干。
染色体分析：计数、拍照和分析分裂中期，以确定核型样貌。最少分析20个分裂中期。
结果：发现了相比于常规制造的HALPCs，对于根据本发明处理的批次中所制造的HALPCs，其克隆和非克隆染色体异常的数目明显较低，如图4所示。更特别地，根据本发明制造的HALPCs的克隆异常的平均发生率为0.71％，相比之下，常规制备的HALPCs为2.86％；根据本发明制备的HALPCs的非克隆异常的发生率为7.14％，相比之下，常规制造的HALPCs为18.09％。这些数值是通过各方法的7个批次和超过20个分裂中期所获得。
结论是，本发明不仅能提高HALPCs的生产效率，而且能使得细胞改善，其显示出比常规制造的HALPCs更高的染色体稳定性。
实施例6-HGF和PGE2分泌
根据本发明，遵循实施例1的程序并且使用培养基A制备一系列批次的HALPCs，并与以基本上相同方法制造但在比较性批次中用于步骤(b)和(c)(即在产生和扩增期间)的培养基为包括胎牛血清的常规培养基的批次相比较。随后，测定细胞分泌的HGF和PGE2。
如下测量由HALPC所分泌的抗纤维因子HGF。将HALPC以30.000个活细胞/cm2接种至T75或T25烧瓶，最初48小时以DMEM/9％FBS培养，最后24小时以DMEM/0.5％FBS培养。最后24小时将FBS浓度降至0.5％以避免任何以ELISA测量的该组分的干扰。温育后，收获培养基，离心，分装并于-80℃冷冻。并行地，将细胞以胰蛋白酶消化并计数以便针对所述细胞数报告培养基中由细胞所分泌的HGF量(pg HGF/106个细胞)。使用特定的Quantikine ELISA(Bio-Techne,R&D Systems brand,#DHG00)评估细胞培养基中的HGF浓度。如图5A中所示，在培养基A(无血清无异源)制备的批次中，HGF分泌增加。
Figure BDA0003369122690000391
在促炎细胞因子IL-1β、IFN-γ和TNF-α的混合物的存在下(其是指在促炎的条件下)，使用ELISA测量由HALPCs所分泌的PGE2。将HALPC以30,000个活细胞/cm2接种至T75或T25烧瓶的DMEM/9％FBS中。最后24小时将FBS浓度降至0.5％以避免任何以ELISA测量的该组分的干扰。温育24小时后，将细胞培养基换成促炎培养基(DMEM/9.1％FBS+TNFα、IL-1β和IFNγ)。温育24小时后，移除促炎培养基并在新鲜的DMEM/0.5％FBS中温育细胞。温育24小时后，收获培养基，离心，分装并于-80℃冷冻。使用特定的竞争性ELISA试剂盒(Prostaglandin E2 ELISA kit,Abcam,#ab133021)评估细胞培养基中的PGE2浓度。并行地，将细胞以胰蛋白酶消化并使用NC-200一步法计数以便针对所述细胞数报告培养基中由总细胞所分泌的PGE2量(pg HGF/106个细胞)。如图5B中所示，相比于常规制备的批次，在培养基A(无血清无异源)制备的批次中于促炎情况下PGE2的分泌增加。
Figure BDA0003369122690000401

Claims (25)

1.一种制造人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)群的方法，其包括以下步骤：
(a)提供获自人肝脏的原代肝细胞的悬浮液；
(b)在导致产生具有伸长形状和间充质形态的细胞群的条件下培养包含在所述悬浮液中的原代肝细胞；
(c)在导致步骤(b)中产生的细胞群扩增的条件下培养步骤(b)中产生的细胞群；
(d)收获步骤(c)中获得的扩增细胞群；
其中在步骤(c)中获得的所述扩增细胞群的细胞为人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)，所述细胞表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且可选地表达至少一种肝标志物物和/或展现肝特异性活性；并且
其中步骤(b)的培养条件包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述无异源无血清培养基的特征还在于其含有小于30ng/mL的表皮生长因子(EGF)。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其还包括以下步骤：
(e)确定步骤(c)中获得的所述扩增细胞群的细胞为人同种异体肝源性祖细胞(HALPC)，所述细胞表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物，并且可选地表达至少一种肝标志物和/或展现肝特异性活性。
4.如权利要求1至3所述的方法，其中步骤(c)或(d)中获得的所述人同种异体肝源性祖细胞表达至少一种选自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的间充质标志物；并分泌HGF。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)或(d)中获得的所述人同种异体肝源性祖细胞进一步分泌PGE2。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)或(d)中获得的所述人同种异体肝源性祖细胞
(i)对于α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)、CD140b以及可选地白蛋白(ALB)为阳性；
(ii)对于细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)或(d)中获得的所述人同种异体肝源性祖细胞对于CD90、CD73、波形蛋白和ASMA为阳性。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无异源无血清培养基包括脂质，优选地选自一种或多种脂肪酸，并且其中所述脂质与纯化的天然或重组人血清白蛋白缔合或结合。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无异源无血清培养基包括：
(i)纯化的天然或重组人转铁蛋白，并且其中所述人转铁蛋白可选地经铁化合物预处理过；
(ii)重组人胰岛素；以及
(iii)硒化合物，例如亚硒酸钠。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无异源无血清培养基包括30pg/mL以上的水平的碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)，以及可选的5pg/mL以上的水平的酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无异源无血清培养基包括人纤连蛋白和/或人玻连蛋白，例如重组人纤连蛋白和/或重组人玻连蛋白。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无异源无血清培养基包括葡萄糖，并且其中所述葡萄糖的含量不高于约2.5重量％，并且可选地不高于约1重量％。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无异源无血清培养基包括谷氨酰胺或其盐，或能够释放谷氨酰胺或其盐的化合物。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述无异源无血清培养基包括：
(iv)无机盐，包括钙、铁(II)、铁(III)、钾、铜(II)、镁、钠和锌的盐；
(v)氨基酸，包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸；
(vi)维生素，包括D(+)-生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟碱酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素和维生素B12；以及可选的
(vii)DL-硫辛酸、次黄嘌呤、亚油酸、酚红钠、腐胺、丙酮酸盐和/或胸苷；并且
其中所述培养基的pH调节至pH 6.9-7.5。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(c)的培养条件包括使用包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基，并且其中所述步骤(c)中所用的无异源无血清培养基的特征还在于其不包括EGF。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(c)中所用的无异源无血清培养基的特征还在于其展现出权利要求8至15中所述的一个或多个特征。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括将步骤(b)中所产生的细胞群传代培养至少两次。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
(c1)收获在步骤(b)中或在步骤(c)的任一传代之后获得的细胞群；
(c2)在步骤(c1)中收获的细胞群中加入防冻保护剂，以获得防冻保护的细胞制剂；
(c3)将所述防冻保护的细胞制剂冷冻；和
(c4)将所述冷冻的防冻保护的细胞制剂解冻；
其中步骤(c1)至(c4)作为步骤(c)的子步骤进行。
19.包含纯化的天然或重组人血清白蛋白的无异源无血清培养基用于培养获自人肝脏的原代肝细胞以便产生人同种异体肝源性细胞的用途。
20.如权利要求19所述的无异源无血清培养基的用途，其中所述培养基的特征还在于其含有小于30ng/mL的表皮生长因子(EGF)。
21.如权利要求19或20所述的无异源无血清培养基的用途，其中所述培养基的特征还在于其展现出权利要求8至15中所述的一个或多个特征。
22.一种分离的人同种异体肝源性祖细胞群，其对于CD90、CD73、波形蛋白和ASMA为阳性；并且表现出平均每个分裂中期小于2.5％的克隆异常和/或每个分裂中期小于15％的非克隆异常。
23.一种分离的人同种异体肝源性祖细胞群，其能够通过权利要求1至18中任一项所述的方法获得。
24.如权利要求22或23所述的分离的人同种异体肝源性祖细胞群，其用于治疗肝病。
25.一种防冻保护的细胞制剂，其在权利要求18所述的方法的步骤(c2)或步骤(c3)中获得。
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