TW202106875A

TW202106875A - 人類同種異體肝衍生前驅細胞的製備(二)

Info

Publication number: TW202106875A
Application number: TW109114557A
Authority: TW
Inventors: 派翠克史特拉吉耶; 約瑟夫品斯特倫; 伊洛迪德爾圖爾; 蒂埃里波維
Original assignee: 比利時商普羅米修亞生物科技股份有限公司
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2021-02-16
Also published as: PL3963050T3; CA3137785A1; LT3963050T; KR20220002495A; FI3963050T3; DK3963050T3; US20220213442A1; EP3963050A1; PT3963050T; CN113939585A; EP3963050B1; JP2022530620A; WO2020221843A1; ES2966620T3; AU2020266266A1

Abstract

本發明係關於用於製造人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)族群的方法。該方法係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源(xeno-)和無血清培養基。

Description

人類同種異體肝衍生前驅細胞的製備(二)

本發明係關於人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC或HALPCs)及其製造。這些細胞有時候亦稱為人類成年肝衍生前驅細胞或異源性人類成年肝衍生前驅細胞(HHALPC或HHALPs)。

肝臟為調節體內平衡的關鍵器官且為許多重要代謝路徑之所在。在複雜的代謝路徑中只要有一種蛋白減損可能為高度有害的。大量的重要肝臟酵素存在實質上增加發生各種肝臟疾病的風險。整體上，有200種不同的肝臟代謝之先天型缺陷存在，在2500個活產嬰兒中有1位孩童受影響。目前的治療和長期的管理效率不足。正位肝臟移植(OLT)具高度侵入性，不可逆性，受限於供體移植物短缺和需要先進技術的手術。由於肝細胞製備物的品質，肝細胞移植(LCT)可能僅發揮短期至中期的效用。

幹細胞或前驅細胞，尤其是肝前驅細胞之用途已在使用來自不同生物體之肝組織，以及在胎兒或成年肝組織的文獻中經確認(Schmelzer E et al., 2007; Sahin MB et al., 2008; Azuma H et al., 2003; Herrera MB et al., 2006; Najimi M et al., 2007; Darwiche H and Petersen BE, 2010; Shiojiri N and Nitou M, 2012; Tanaka M and Miyajima A, 2012)。此等細胞，在活體外暴露於肝原性刺激後及/或在活體內投予後，咸信可能提供具有形態和功能特質，典型地與肝分化，例如第I/II階段酵素活性有關的細胞。

這些從其產生的肝前驅細胞或類肝細胞可用於細胞移植以及在開發新藥上用於檢測藥物，因為其代表在藥物代謝上和藥理學或毒物學活體外篩選上之初代(primary)人類肝細胞的替代物(Dan YY, 2012; Hook LA, 2012)。

WO 2016/030525和WO 2017/149059揭示了獲得具有特定表現圖譜和改良生物特質之人類成年肝衍生前驅細胞(HALPC)的細胞培養條件。例如，WO2016/030525描述了在培養該細胞的方法中使用基礎培養基調配物，例如威氏培養基E(William’s medium E)、杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)，較佳地中添加補乳動物血漿或血清，尤其是胎牛血清(亦即FCS或FBS)。在WO 2016/030525中亦描述，除了提供營養素及/或生長促進劑之外，液體培養基中添加了牛、人類或其他動物血清亦可能提升特定細胞類型的生長/黏附或消除/分離。

因此本發明之目的係提供一製造人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)的有效方法。另一目的係提供用於製造具高生產力之人類同種異體肝衍生前驅細胞的方法，且其能進行具商業價值的批式處理次數。又另一目的係提供用於製造人類同種異體肝衍生前驅細胞之穩定方法，其中該方法係確保具有一致性品質，符合GMP標準之高產率細胞。

本發明係關於人類肝衍生前驅細胞，尤其是人類同種異體肝前驅細胞(HALPC)，亦稱為異源性人類成年肝衍生前驅細胞(HHALPC)或人類成年肝衍生前驅細胞(HALPC)，以及其製造。

在一方面，本發明係關於製造一人類同種異體肝衍生前驅細胞 (HALPC)族群之方法，其係包括下列步驟： (a) 提供一得自人類肝臟之初代肝細胞的懸浮液； (b) 於能產生具有拉長形狀和間質形態之細胞族群的條件下，培養包括在該懸浮液中的初代肝細胞； (c) 於能使其擴增的條件下培養步驟(b)中所產出的細胞族群； (d) 收取於步驟(c)中所得到的擴增細胞族群；其中於步驟(c)中得到的該擴增細胞族群之細胞為人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)，該細胞係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白(vimentin)和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，及視情況表現至少一種肝標記及/或展現一肝-特異性活性；其中步驟(b)的培養條件係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基。

在另一方面，該無異體來源和無血清培養基進一步的特徵為其係含有低於30 ng/mL的上皮生長因子(EGF)。

又在另一方面，此方法之步驟(c)亦包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基。

在另外方面，本發明係關於藉由該方法得來之分離的人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPCs)族群。再者，本發明係關於該HALPCs供用於治療肝臟疾病。

在一方面，本發明係關於用於製造一人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)族群之方法，其係包括下列步驟： (a)提供一得自人類肝臟之初代肝細胞的懸浮液； (b)於能產生具有拉長形狀和間質形態之細胞族群的條件下，培養包括在該懸浮液中的初代肝細胞； (c)於能使其擴增的條件下培養步驟(b)中所產出的細胞族群； (d)收取於步驟(c)中所得到的擴增細胞族群；其中於步驟(c)中得到的該擴增細胞族群之細胞為人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)，該細胞係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，及視情況表現至少一種肝標記及/或展現肝-特異性活性；其中步驟(b)的培養條件係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基。

在另一方面，本發明係關於用於製造一人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)族群之方法，其係包括下列步驟： (a) 提供一得自人類肝臟之初代肝細胞的懸浮液； (b) 於能產生具有拉長形狀和間質形態之細胞族群的條件下，培養包括在該懸浮液中的初代肝細胞； (c)於能使其擴增的條件下培養步驟(b)中所產出的細胞族群； (d) 收取於步驟(c)中所得到的擴增細胞族群；其中於步驟(c)中得到的該擴增細胞族群之細胞為人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)，該細胞係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，及視情況表現至少一種肝標記及/或展現肝-特異性活性；其中步驟(b)的培養條件係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基，且其中該無異體來源和無血清培養基進一步的特徵為其係含有低於30 ng/mL的上皮生長因子(EGF)。

步驟(c)或(d)中所得到的人類同種異體肝衍生前驅細胞之特徵為其係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，及其係分泌HGF，此外其亦分泌PGE2。

在其中一個較佳的具體實例中，本發明之方法係進一步包括步驟(e)，該步驟係建立步驟(c)中所得到的擴增細胞族群之細胞為人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)，該細胞係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，及視情況表現至少一種肝標記及/或展現肝-特異性活性。

在另一具體實例中，步驟(c)或(d)中所得到的人類同種異體肝衍生前驅細胞為α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、CD140b陽性，且視情況為白蛋白(ALB)陽性；及細胞角質蛋白-19(CK-19)陰性。

在另一方面，本發明係關於用於製造人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)族群之方法，其係包括下列步驟： (a)提供一得自人類肝臟之初代肝細胞的懸浮液； (b)於能產生具有拉長形狀和間質形態之細胞族群的條件下，培養包括在該懸浮液中的初代肝細胞； (c)於能使其擴增的條件下培養步驟(b)中所產出的細胞族群； (d)收取於步驟(c)中所得到的擴增細胞族群；及 (e)建立步驟(c)中所得到的擴增細胞族群之細胞係共表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記與一或多個選自α-胎兒蛋白(AFP)、α-1-抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin)、HNF-4和MRP2轉運體之肝標記及視情況肝標記白蛋白；其中步驟(b)的培養條件係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基。

在另一方面，本發明係關於用於製造人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)之族群的方法，其係包括下列步驟： (a)提供一得自人類肝臟之初代肝細胞的懸浮液； (b)於能產生具有拉長形狀和間質形態之細胞族群的條件下，培養包括在該懸浮液中的初代肝細胞； (c)於能使其擴增的條件下培養步驟(b)中所產出的細胞族群； (d)收取於步驟(c)中所得到的擴增細胞族群；及 (e)建立步驟(c)中所得到的擴增細胞族群之細胞係共表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記與一或多個選自α-胎兒蛋白(AFP)、α-1-抗胰蛋白酶)、HNF-4和MRP2轉運體之肝標記及視情況肝標記白蛋白；其中步驟(b)的培養條件係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基，且其中該無異體來源和無血清培養基進一步的特徵為其係含有低於30 ng/mL的上皮生長因子(EGF)。

根據本發明方法之步驟(a)係包括提供一得自人類肝臟之初代肝細胞的懸浮液。

涉及從人類肝臟獲得初代肝細胞懸浮液(其在本文亦可稱為肝細胞懸浮液，或縮寫為LCS)的子步驟可包括下列：鬆弛細胞間緊密連結，肝臟消化，肝臟破壞，過濾，以離心分離肝細胞，及視情況冷凍保存最終的肝細胞懸浮液。

解離人類(成年)肝臟或其一部分，形成初代肝細胞族群的步驟係包括，獲得肝臟或其一部分，其係共同包括完全分化的肝細胞以及一定量之可用於製造肝前驅細胞的初代細胞或幹細胞。

如文中所用，術語「肝前驅細胞」係指無特化和增生-勝任細胞，其係藉由培養分離自肝臟的細胞所產生，且該等細胞或其後代可產生至少一種相對更特化的細胞類型。肝前驅細胞產生的子代可沿著一或多個譜系分化，漸增地產生更特化的細胞(但較佳地肝細胞或肝-活化細胞)，其中此等子代本身仍可能為前驅細胞，或甚至最終產生分化的肝細胞(例如，完全特化的細胞，尤其是呈現類似於該等初代人類肝細胞之形態學和功能特質的細胞)。術語「幹細胞」係指能自我更新的前驅細胞，亦即可在無分化下增生，由此肝細胞的後代或至少其部分實質上仍保留母幹細胞之未特化或相當低特化表型、分化潛在性和增生勝任性。此術語係涵蓋能實質上無限制自我更新的幹細胞，亦即其中後代或其部分之進一步增生的能力，相較於母細胞，實質上不會降低，以及展現有限的自我更新之幹細胞，亦即其中後代或其部分之進一步增生的能力，相較於母細胞，係明顯下降。

如所提及的，術語「成年人類肝衍生前驅細胞」與「人類成年肝衍生前驅細胞」、「異源性人類成年肝衍生前驅細胞」或「人類同種異體肝前驅細胞」使用上為同義的，係縮寫為「HHALPC」或「HHALPCs」或「HALPC」或「HALPCs」。這些細胞係代表可如文中所述取得之特定類型的人類肝衍生前驅細胞。目前本發明者認為較佳的為術語「人類同種異體肝前驅細胞」。

以產生多樣細胞類型的能力為基準，前驅細胞或幹細胞通常可描述為全能(totipotent)、多功能(pluripotent)、多潛能(multipotent)或單能(unipotent)。單一的「全能」細胞係定義為能成長，亦即發育成一整個生物體。「多功能」細胞不能生長成一整個生物體，但能產生源自於所有三胚層，亦即中胚層、內胚層和外胚層之細胞類型，並可能產生一生物體的所有細胞類型。「多潛能」細胞為能產生至少一種來自一生物體之各二或多種不同器官或組織的細胞類型，其中該細胞類型可源自相同或不同的胚胎層，但不能產生一生物體的所有細胞類型。「單能」細胞僅能分化成一種細胞譜系之細胞。

肝臟或其部分係得自「對象」、「供體對象」或「供體」，其可交換使用，係指脊椎動物，較佳地哺乳動物，更佳地人類。一部分的肝臟可為衍生自肝臟任何部分的組織樣本並且可包括存在肝臟中的不同細胞類型。術語「肝臟」係指肝臟器官。術語「部分的肝臟」一般而言係指衍生自肝臟器官之任何部分的組織樣本，不限於該部分的量或其係源自於肝臟器官的哪一個區域。較佳地，存在肝臟器官中的所有細胞類型亦可代表該部分的肝臟。部分肝臟的量可至少部分係由實際考量得到足夠初代肝細胞用於合理施行本發明方法之需求來推斷。因此，一部分的肝臟可代表肝臟器官的百分比(例如，至少1%、10%、20%、50%、70%、90% 或更高，典型地w/w)。在其他的非限定實例中，一部分的肝臟可以重量來定義(例如，至少 1 g、10 g、100 g、250 g、500 g或更多)。例如，一部分的肝臟可為一肝葉，例如右葉或左葉，或在劈離(resect)肝手術期間或肝活體組織切片檢查(biopsy)期間所切除之包括大量細胞的任何片段或組織樣本。

根據本發明所使用的細胞係分離自人類肝臟或部分人類肝臟。更佳地，肝前驅細胞或幹細胞係分離自成年人類肝臟或其一部分。術語「成年肝臟」係指產後，亦即出生後任何時間，較佳地足月之對象的肝臟，且可為，例如，出生後至少1天、1週、1個月或1個月以上年齡，或至少1歲、5歲、10歲或更大。因此，「成年肝臟」或成熟肝臟可在另外以習用的術語「新生兒」、「嬰兒」、「兒童」或「成人」所描述的人類對象中發現。熟習技術者應了解，肝臟可能在不同時間出生後區間內達到實質發育成熟。在一較佳的具體實例中，此細胞係分離自新生人類肝臟或部分肝臟(例如，肝葉)。

供體對象可為活體或死亡，由技術-接受的標準來決定，例如，舉例而言，「心-肺」標準(通常涉及不可逆的循環和呼吸功能停止)或「腦死」標準(通常涉及不可逆的整個腦部，包括腦幹之全部功能停止)。收取可能涉及本項技術中已知的程序，例如，舉例而言，活體組織切片檢查、大部切除或局部切除。

熟習技術者應了解，至少某些方面從供體對象收取肝臟或其部分，可依照相關法律和倫理規範。舉例來說，但不限於此，從活體人類供體收取肝臟組織可能必需與維持供體進一步的生命並容。

因此，典型地僅可能從活體人類供體移除一部分肝臟，例如使用活體組織切片檢查或切除，使得在供體中維持足夠程度的生理肝功能。

肝臟或其部份可得自具有持續循環，例如心跳，及持續呼吸功能，例如肺呼吸或人工呼吸器之人類供體。受制於倫理和法律規範，供體可能需要或不需要腦死(例如移除全肝或其部分，不需與人類供體之進一步存活並容，其可能在腦死的人中為允許)。從此等供體收取肝臟或其部分為有利的，因為組織尚未遭受實質缺氧(缺乏氧化作用)，其通常係因缺血所導致(循環中止)。

另一種選擇，肝臟或其部分可得自人類供體，其在收取此組織時，已停止循環，例如無心跳，及/或呼吸功能停止，例如無肺呼吸或無人工呼吸器。當這些供體的肝臟或其部分可能已遭受至少某些程度的缺氧時，亦可從此等組織分離活的前驅細胞或幹細胞。肝臟或其部分可在供體循環(例如心跳)停止後約24小時內收取，例如約20小時內，例如約16小時內，更佳地約12小時內，例如約8小時內，甚佳地約6小時內，例如約5小時內，約4小時內或約3小時內，又更佳地約2小時內，及最佳地約1小時內，例如在供體循環(例如心跳)停止後約45、30或15分鐘內。

收取的組織可冷卻至約室溫，或低於室溫的溫度，但通常避免冷凍組織或其部分，尤其是當冷凍可能導致晶核形成或冰晶生長時。例如，組織可保持在介於約1°C和室溫之間，介於約2°C和室溫之間，介於約3°C和室溫之間或介於約4°C和室溫之間的任何溫度，且有利地可保持在約4°C。如本項技術中所知，組織亦可放置「在冰上」。組織可全程冷卻或就部份缺血時間進行冷卻，亦即供體循環停止之後的時間。亦即，組織可進行溫缺血，冷缺血，或溫缺血和冷缺血之組合。收取的組織在處理之前可如此保持，例如，至高48小時，較佳地低於24小時，例如低於16小時，更佳地低於12小時，例如10小時，低於6小時，低於3小時，低於2小時或低於1小時。

在進一步處理此組織之前，所收取的組織有利地可，例如完全或至少部份浸入適合的媒劑中及/或可以適合的媒劑灌流。熟習技術者能選擇在處理之前的時間內可支援細胞存活之適合的媒劑。

從肝臟或部分肝臟分離初代肝細胞可根據本項技術中已知的方法來進行，例如，如EP1969118、EP3039123、EP3140393或WO2017149059(參見實例1)中所述。

首先從解離的肝臟或其部分取得初代肝細胞之懸浮液。術語「解離」如文中所用係指部分或完全破壞組織或器官的細胞組織，亦即部分或完全破壞組織或器官之細胞和細胞組份之間的連結，得到該組織或器官之細胞懸浮液。此懸浮液可包括單獨或單一細胞，以及自然黏附一起形成二或多種細胞之集叢或團塊的細胞。解離較佳地不會造成(或造成的可能性小)細胞存活力降低。用於解離肝臟或其部分從其得到初代細胞族群(懸浮液)的適合方法可為任何本項技術中熟知的方法，包括，但不限於，酵素消化、機械分離、過濾、離心及其組合。特言之，用於解離肝臟或其部分的方法可包括酵素消化肝組織，釋放肝細胞，及/或機械破壞或分離肝組織，釋放肝細胞。藉由肝活體組織切片檢查獲得的肝組織小薄片可根據下列步驟(c)直接用來進行細胞培養，無需酵素或機械破壞。

如上述用於解離肝臟或其部分的方法係記載於文獻中，例如廣泛使用的二或多步驟之膠原蛋白酶灌流技術，其已用全肝或肝臟片段進行各種調整及修正。將肝組織以無二價陽離子，於37°C預熱，含有陽離子螯合劑(例如EDTA或EGTA)之緩衝溶液灌流。緩衝溶液可包括鹽溶液(例如HEPES，Williams E培養基)或其中亦可包括例如NaCl和KCl鹽類之任何其他平衡鹽溶液。其能破壞將細胞結合一起的橋粒結構。

然後以含有二價陽離子，例如Ca²⁺ 和Mg²⁺ 之緩衝溶液和用於消化組織的基質降解酵素灌流。通常係藉由緩和的機械破壞及/或經由過濾器壓榨來釋放初代肝細胞，以機械性完成細胞解離步驟。此過濾器可具有能讓細胞通過大約0.1mm、0.25mm、0.50mm、1mm或更大的篩子尺寸。帶有逐漸變小之篩子尺寸的連續過濾器可用於逐步解離組織及釋放細胞。以含有蛋白酶抑制劑、血清及/或血漿的緩衝液沖洗解的細胞使用於灌流程序中的膠原蛋白酶和其他酵素失活，及然後藉由低速離心(例如介於10 x g和500 x g之間)使其成團，分離混合物。若非全部，則大部分的活細胞可成團，而大體上消除死細胞和細胞碎片及隨後以冰冷的緩衝溶液清洗，淨化細胞懸浮液。初代肝細胞的數量和品質依照組織的品質、所使用不同溶液的組成物及酵素的類型和濃度，可能不同。酵素通常為膠原蛋白酶，但亦可使用鏈黴蛋白酶(pronase)、胰蛋白酶(trypsin)、玻尿酸酶(hyaluronidase)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)，以及其組合。膠原蛋白酶可能由純化差的酵素組合物所組成及/或具有蛋白酶活性，其可能造成不欲的反應影響活細胞之品質和數量，其進而可藉由選擇足夠純度和品質之酵素製備物來避免。收取初代肝細胞的其他方法可排除酵素消化技術且可包括以含有蔗糖的溶液灌流肝臟，接著機械破壞。

如文中所定義和藉由解離肝臟或其部分所取得的初代細胞族群典型地可為異源性，亦即，其可包括屬於一或多種屬於任何肝構成細胞類型之細胞類型，包括已存在肝實質(liver parenchyma)及/或在肝非實質部分的前驅細胞或幹細胞。如文中所用，術語「初代細胞」包括存在一細胞懸浮液中的細胞，其係來自一對象之組織或器官，例如肝臟，藉由以適當的技術解離存在此移除組織或器官中的細胞所獲得。

示例的肝構成細胞類型包括(但不限於)肝細胞、膽管細胞、庫佛氏細胞(Kupffer cells)、肝星狀細胞[伊東細胞(Ito cells)]、卵圓細胞和肝內皮細胞。上述術語具有技術上已建立的意義且在文中係廣義理解為包括如此分類的任何細胞類型。

術語「肝細胞」係涵蓋上皮肝細胞和實質肝細胞，其係包括(但不限於)不同大小或倍數體(例如二倍體、四倍體、八倍體)的肝細胞。根據解離肝臟的方法及/或任何用於分數化或充實最初的肝細胞製備物及/或其他細胞類型之方法，以物理性質(尺寸、形態學)、存活力、細胞培養條件或藉由應用任何適合技術之細胞表面標記表現為基準，初代細胞族群可包括不同比例的肝細胞(總細胞的0.1%、1%、10%或更高)。

如文中所定義及藉由解離肝臟(或其部分)所得到的初代細胞族群可立即用於建立新鮮初代肝細胞之懸浮液的細胞培養。人類肝細胞懸浮液(LCS)係由從人類捐贈的肝臟分離出之分散的人類初代肝細胞所組成。

另一種選擇，所得到的初代人類肝細胞可以低溫保存的製備物使用常用的技術儲存供長期保存。在一具體實例中，用於根據本發明之製造方法中的初代人類肝細胞懸浮液可以低溫保存的產品(儲存於≤-130°C)來取得和使用，在使用前將其解凍(例如在37°C水浴中)並以解凍的溶液沖洗。

在某些具體實例中，用於本發明方法中之肝細胞懸浮液中的肝細胞濃度可大於7.5x10⁶ 個細胞/mL，例如10x10⁶ 個細胞/mL或20x10⁶ 個細胞/mL。

根據本發明方法之步驟(b)係包括於能產生細胞族群，亦即具有拉長形狀和間質形態之人類同種異體肝衍生前驅細胞或HALPC的條件下培養包括在所提供的人類初代肝細胞懸浮液中的人類初代肝細胞。

初代肝細胞可於全合成的撐體上(例如塑膠或任何多聚物)或預先塗覆滋養細胞、蛋白萃取物或任何其他生物來源之物質的合成撐體上直接培養，讓類似的初代細胞黏附和增生以及產生具有所欲標記和形態之同種異體肝前驅細胞族群。

初代肝細胞係於維持其黏附和增生及/或產生同質細胞族群之細胞培養基中培養。根據一較佳的本發明之具體實例，步驟(b)中係使用包括純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基，其中該培養基進一步的特徵為其係含有低於30 ng/mL的表皮生長因子，或另一種選擇，無表皮生長因子(EGF)。又較佳的具體實例為其中培養基係包括濃度分別不大於25 ng/mL或不大於約10 ng/mL，或不大於5 ng/mL的表皮生長因子。

如文中所了解的，細胞培養基為一支撐分離的肝前驅細胞存活及/或生長之液體培養基。液體培養基可在細胞導入其中之前，同時或之後加入培養環境或系統中。術語「細胞培養基」或「培養基」一般可指包括可用於細胞維護和生長的養營養素之水性液體或膠狀物質。在本發明內容中，係使用液體培養基。

根據本發明，用於步驟(b)及/或後續步驟例如步驟(c)之細胞培養基為無血清的。按照其習知的定義，「血清」係從一全血樣本，藉由先讓樣本發生凝結及後續藉由適當的技術，典型地藉由離心從液體組份(血清)分離所形成的凝塊和血液樣本的細胞組份所得來。用於培養步驟(b)以及較佳地在任一或所有後續的方法步驟，例如步驟(c)中的培養基可為無衍生自任何來源，無論是動物及/或人類之血清。換言之，因此係缺乏血清的。然而，此定義並非排除從血清所分離出之個別組份的存在，例如高純化血清白蛋白。

可用於步驟(b)及/或後續方法步驟例如步驟(c)之細胞培養基，亦為無異體來源。術語「無異體來源」，如文中所用，可理解為「無動物組份」(ACF)，且係指培養基(或基質)其不含有非人類動物衍生或來源之組份。換言之，細胞培養基不含有任何動物來源的成份，或可能已使用動物宿主細胞或動物表現培養所製造的成份。術語「動物」如文中所用，係理解為任何非人類動物，例如非人類哺乳動物，例如非人類靈長類、胎牛、小牛或成年牛、馬、豬、羔羊、山羊、狗、兔、小鼠或大鼠。

在一特定的具體實例中，此培養基為化學成份確定的培養基，係指該培養基不包括衍生自人類血清之人類純化組份，但僅有重組的組份，其亦較佳地係從非動物表現培養來製造。

如所述，雖然其本身無血清，但用於根據本發明方法之步驟(b)及/或本方法之後續步驟，例如步驟(c)的細胞培養基可包括純化的天然或重組人類血清白蛋白，作為一個別組份。在一特定的具體實例中，根據本發明方法步驟(b)及/或後續方法步驟例如步驟(c)中所用的細胞培養基係包括一重組的人類血清白蛋白。

在另一具體實例中，培養基中純化的天然或重組人類血清白蛋白之量係不超過0.2 重量%，或介於0.01%和2重量%之間。

又在另一具體實例中，此培養基係包括一植物(例如稻米)表現的重組人類血清白蛋白。

若重組的人類血清白蛋白或任一重組蛋白或其組合或生物因子係用於或添加於本方法之步驟(b)(或步驟(c))中所用的培養基中，則較佳地該蛋白或因子亦無異體來源，亦即無使用任何動物宿主細胞或培養條件或無使用動物組份來製造或生產。

脂質和脂質載劑亦可用於添加細胞培養基。此等脂質和載劑可包括(但不限於)固醇類，例如膽固醇、脂肪酸(或衍生物，例如脂肪酸之酯類)，例如亞麻油酸、ω-3或ω-6脂肪酸。如文中所用，此等脂肪酸衍生物係包括在詞語「脂肪酸」的範圍內。在其中一個較佳具體實例中，至少某些脂質係與作為培養基特徵之純化的天然或重組人類血清白蛋白相鍵結或相結合。

在一具體實例中，此培養基係包括膽固醇和一或多種脂肪酸衍生物。

在一具體實例中，如上所定義和用於根據本發明方法中的無異體來源和無血清培養基，係包括脂質，較佳地選自一或多種脂肪酸之脂質，其中該等脂質係與純化的天然或重組人類血清白蛋白相結合。

在一具體實例中，包括在培養基中以及與人類血清白蛋白結合的一或多種脂質可為脂肪酸，例如飽和或不飽和C13至C22脂肪酸，或其衍生物，例如酯類或鹽類。在另外的具體實例中，與人類血清白蛋白結合的脂肪酸係選自任一肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞麻油酸、異油酸、γ-次亞麻油酸、α-次亞麻油酸、雙同γ-次亞麻油酸、花生油酸、11-二十碳烯酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山俞酸(behenic acid)、芥酸(erucic acid)、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、蜜胺酸(meads’ acid)和神經酸(nervonic acid)或其組合。在另外的具體實例中，包括在培養基中並與天然或重組的人類血清白蛋白相結合的脂肪酸係選自任一肉豆蔻酸、亞麻油酸，一或多種次亞麻油酸和二十碳五烯酸或其組合。又在另一具體實例中，包括在培養基中並與重組的人類血清白蛋白相結合的脂肪酸係選自至少一種二十碳五烯酸、山俞酸、芥酸、二十二碳四烯酸和二十二碳五烯酸或其任何組合。又在另外的具體實例中，包括在培養基中並與重組的人類血清白蛋白相結合的脂肪酸係選自蜜胺酸和神經酸其中之一或其組合。

術語「與人類血清白蛋白相結合或相鍵結」(天然形式或重組分子)，係指一脂質或脂肪酸，其係與一或多個白蛋白的結合位置相鍵結，例如經由疏水性鍵結，或靜電或氫鍵作用。視情況，該脂質可與人類血清白蛋白共價連接或接合。

在另一具體實例中，作為本發明無異體來源和無血清培養基特徵之人類天然或重組人類血清白蛋白與脂質相結合，可藉由將人類血清白蛋白以任一上文所定義之脂肪酸或其混合物預處理來製得。

根據本發明用於培養肝前驅細胞的細胞培養基可包括生長因子的混合物，供其適當生長、增生、維持所欲的標記及/或生物活性或長期儲存。

根據本發明方法之步驟(b)及/或後續方法步驟例如步驟(c)中所用的細胞培養基可包括一或多種生長因子，但其特徵可為其係含有低於30 ng/mL的EGF，和視情況無EGF。據此又較佳的具體實例為此培養基係包括濃度分別不大於25 ng/mL，或不大於約10 ng/mL，或不大於5 ng/mL之表皮生長因子。

術語「生長因子」如文中所用係指影響各種細胞類型之增生、生長、分化、存活及/或遷移之生物活性物質，且單獨或當藉由其他物質調節時，可能影響生物體之發育、形態學和功能變化。生長因子典型地可藉由，作為一配體，與存在細胞內的受體(例如表面或細胞內受體)結合來作用。文中生長因子可為尤其是包括一或多條胜肽鏈的蛋白類實體。術語「生長因子」係涵蓋纖維母細胞生長因子(FGF)家族、骨塑型蛋白(BMP)家族、血小板衍生生長因子(PDGF)家族、轉化生長因子β(TGF-β)家族、神經生長因子(NGF)家族、表皮生長因子(EGF)家族、胰島素相關生長因子(IGF)家族、肝細胞生長因子(HGF)家族、介白素-6 (IL-6)家族(例如，抑癌蛋白M(oncostatin M))、造血生長因子(HeGFs)、血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血管生成素(angiopoietin)、血管內皮生長因子(VEGF)家族或醣皮脂激素的成員。

在另外的具體實例中，根據本發明之無異體來源和無血清培養基係包括低於30 ng/mL的EGF，或較佳地低於10 ng/mL的EGF，或視情況無EGF，但包括至少三種其他的生長因子，其係由任一上文所列的生長因子中選出。

在一具體實例中，根據本發明此培養基可包括低於30 ng/mL的EGF，或視情況無EGF，但可包括至少一種由轉化生長因子β(TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)組成之群中選出的生長因子或其組合。

在一具體實例中，本發明方法中所用的生長因子可為人類或人類重組的生長因子。

在另外的具體實例中，該細胞培養基之特徵為其係含有低於25 ng/mL或低於10 ng/mL或低於5 ng/mL之任一人類生長因子

在另外的具體實例中，該細胞培養基係無表皮生長因子，亦即不包括任何表皮生長因子(EGF)。

在另外的具體實例中，該培養基之特徵為其係含有低於25 ng/mL，或低於10 ng/mL或低於5 ng/mL的EGF。較佳地，此細胞培養基係含有低於10 ng/mL的表皮生長因子。

如文中所用，術語「表皮生長因子」或「EGF」係指與受體EGFR結合的生長因子，及視情況不僅可包括胜肽EGF本身亦可括在本項技術中被視為屬於EGF-蛋白家族之任一胜肽或其組合。該術語可包括天然(人類)以及重組的人類EGF。

在本文內容中，及為了避免疑問，就培養基而言，生長因子，例如EGF的含量應了解係指在與任何細胞混合之前，個別培養基之組成物。明確的，培養的細胞，就HALPCs的情況，本身可能分泌生長因子。換言之，在本發明一具體實例中，此培養基在與細胞混合之前並無EGF。

用於本發明內容中的培養基可包括無機鹽類(尤其是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P、Cu、Fe、Se和Zn之鹽類)、生理緩衝液(例如，HEPES、碳酸氫鹽)、核苷酸、核苷及/或核酸鹼基、核糖、去氧核糖、胺基酸、維生素、抗氧化劑(例如，麩胱甘肽)和碳來源(例如，葡萄糖，丙酮酸鹽如丙酮酸鈉，乙酸鹽如乙酸鈉)等。

培養基亦可進一步供應一或多種另外的組份。例如，可使用另外的補充物供應細胞必需的微量元素和物質，供最佳生長和擴增。此等補充物包括胰島素、運鐵蛋白(transferrin)、硒鹽及其組合。可加入另外的抗氧化劑補充物，例如β-巰基乙醇。在本發明一具體實例中，用於本發明內容中的培養基係添加選自抗壞血酸或其鹽類的抗氧化劑。在另一具體實例中，培養基可添加胺基酸，例如L-麩醯胺酸，其已知當在溶液中時較為不穩定。

亦可添加荷爾蒙並可包括(但不限於)D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松(dexamethasone)、雌二醇(estradiol)、氫羥腎上腺皮質素(hydrocortisone)、胰島素、泌乳素(prolactin)、黃體素(progesterone)、體抑素(somatostatin)/人類生長荷爾蒙(HGH)、促甲狀腺素(thyrotropin)、甲狀腺素(thyroxine)和L-甲狀腺素。以三碘甲狀腺胺酸(triiodithyronine)、α-生育酚乙酸酯和升糖素培養對於肝細胞亦為有利的。

在一具體實例中，根據本發明方法中(例如步驟(b)及/或步驟(c)中)所用的無異體來源和無血清培養基係包括： (i) 純化的天然或重組人類運體蛋白，且其中該人類運鐵蛋白視情況係經鐵化合物預處理過； (ii) 重組的人類胰島素；及 (iii) 硒化合物，例如亞硒酸鈉。

無異體來源和無血清培養基中的人類運鐵蛋白(天然或重組)之量較佳地係不超過約0.1重量%。在一具體實例中，培養基中的特色人類運鐵蛋白之量係介於0.0001%和 0.1重量%，例如介於0.001重量%和0.1重量%之間。

無異體來源和無血清培養基中重組的人類胰島素之量較佳地係不超過約0.05重量%。在一具體實例中，人類重組的胰島素之量係介於0.001重量%和0.05重量%之間。

在另一具體實例中，根據本發明方法中(亦即步驟(b)及/或步驟(c)中)所用的無異體來源和無血清培養基係包括： (i) 重組的人類運鐵蛋白，其中該人運鐵蛋白視情況係經鐵化合物預處理過，且進一步視情況其中該重組的人類運鐵蛋白為植物-表現的重組人類運鐵蛋白，例如稻米-表現的重組人類運鐵蛋白； (ii) 重組的人類胰島素；及 (iii) 硒化合物，例如亞硒酸鈉。

在另外的具體實例中，根據本發明方法中(例如步驟(b)及/或步驟(c)中)所用的無異體來源和無血清培養基係包括：約0.01-2重量%的純化天然或重組人類血清白蛋白，不大於30 ng/mL或較佳地不大於10 ng/mL的表皮生長因子；且其中該無異體來源和無血清培養基進一步係包括： (i) 約0.0001-0.1重量%的純化天然或重組人類運鐵蛋白，且其中該人類運鐵蛋白視情況係經鐵化合物預處理過； (ii) 約0.001至0.05 重量%的重組人類胰島素；及 (iii) 硒化合物，例如亞硒酸鈉。

在本方法之另外的具體實例中，此無異體來源和無血清培養基係包括人類纖連蛋白(fibronectin)及/或人類玻連蛋白(vitronectin)，例如重組的人類纖連蛋白及/或重組的人類玻連蛋白。

在另外較佳的具體實例中，此培養基係包括鹼性纖維母細胞生長因子(FGF2)，亦稱為BFGF、FGF-2、FGFB、HBGF-2、纖維母細胞生長因子2。其若存在的話，較佳地係以約30 pg/mL或更高之量來使用，例如在約30至約10,000 pg/mL的範圍內。其亦可以約100 pg/mL或更高之量來使用，例如在約100至約10,000 pg/mL的範圍內。

亦較佳的具體實例為其中該培養基係除了FGF2之外亦包括酸性纖維母細胞生長因子(FGF1)。FGF1若存在的話，可例如以約5 pg/mL或更高之量來使用，例如在約5至約500 pg/mL的範圍內。特別有用的亦在約5至約100 pg/mL的範圍內。

另外較佳的具體實例為其中該培養基進一步係包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，視情況約1至約100 pg/mL之量。在一具體實例中，無異體來源和無血清培養基係包括約100至約10,000 pg/mL之量的FGF2，約5至約100 pg/mL之量的FGF1，及約1至約100 pg/mL之量的G-CSF。

又在另外的具體實例中，無異體來源和無血清培養基係包括葡萄糖，且其中該葡萄糖含量係不高於約2.5 重量%，且視情況不高於約1重量%。在另一具體實例中，無異體來源和無血清培養基係包括葡萄糖，其中該葡萄糖含量為約0.001 – 2.5 重量%，或視情況約0.001-1 重量%。

如文中所了解的，術語重量%或重量百分比為一組成物中一組份重量，其係以組成物總重量之百分比來表示。

又在另一具體實例中，無異體來源和無血清培養基係包括麩醯胺酸或其鹽，或能釋放麩醯胺酸或其鹽的化合物。能釋放麩醯胺酸或其鹽的化合物可為麩醯胺酸的前藥。

又在另一具體實例中，用於根據本發明方法之培養步驟中的無異體來源和無血清培養基係包括： (iv)無機鹽類，包括鈣、鐵(II)、鐵(III)、鉀、銅(II)、鎂、鈉和鋅之鹽類； (v)胺基酸，包括L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天門冬醯胺酸、L-天門冬胺酸、L-半胱胺酸、L-胱胺酸、L-麩醯胺酸、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸和L-纈胺酸； (vi)維生素，包括D(+)-生物素、D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素和維生素B12；及視情況 (vii)DL-硫辛酸、次黃嘌呤、亞麻油酸、酚紅鈉、腐胺(putrescine)、丙酮酸及/或胸苷；及其中培養基的pH係調整至pH 6.9-7.5。

無異體來源和無血清培養基可藉由將個別的組份組合來製備，或其可以文中所提供的指南為基準，從市售產品來選擇。例如，可能使用的市售無異體來源和無血清培養基，視情況根據文中所揭示的視情況特性及/或偏好調整後，目前包括(不限於)PRIME-XV® MSC Expansion XSFM(FUJIFILM Irvine Scientific)和StemMACS® MSC Expansion kit XF (Miltenyi Biotech)，包括任何GMP等級的或其同等物，例如MSC-Brew GMP培養基(Miltenyi Biotech)。這些培養基目前亦為無EGF或含有濃度低於30 ng/mL之EGF。

用於步驟(b)之培養的接種密度可視情況分別在從約5,000至約100,000個細胞/cm²，從約10,000至約80,000個細胞/cm²，或從約20,000至約66,666個細胞/cm² 的範圍內。

如步驟(b)中所定義之初代肝細胞培養係在培養中使肝前驅細胞產生和增生，且可持續直到肝前驅細胞或幹細胞充分增生。

根據本發明，細胞係培養一段時間直到細胞族群產生，亦即觀察到具有拉長形狀和間質形態之人類同種異體肝衍生前驅細胞或HALPC。

在一具體實例中，培養係持續直到細胞族群達到特定程度的聚滿度。術語「聚滿度」如文中所用係指培養細胞的密度，其中細胞相互接觸，實質上覆蓋所有可供生長的表面(亦即，完全聚滿)。聚滿的程度可藉由標準造影(例如顯微鏡術)和本項技術中常用的分析方法來測定。

在一具體實例中，步驟(b)的持續時間可經選擇，使得達到至少40%的聚滿度(confluence)。在其他的具體實例中，步驟(b)係進行至達到約至少50%、70%，或至少90%或更高的聚滿度。在其他的具體實例中，步驟(b)係進行至達到至少80%聚滿度。

又在另外的具體實例中，細胞可在步驟(b)中培養至少7天，至少10天或至少12天。較佳地，從步驟(b)的初代細胞族群產生前驅細胞，其中達到至少80%聚滿度係在平均(均值)6至12天內，較佳地平均7至10天內發生。

發明者們已發現，使用包括純化天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基，且其中該無異體來源和無血清培養基之特徵為其係含有低於30 ng/mL的表皮生長因子，明顯地降低步驟(b)以及從肝細胞懸浮液產生HALPCs的時間。此時間優勢可造成整體製造時間縮短和實質上降低製備HALPCs的相關成本。

在步驟(b)期間產生的HALPC具有拉長形狀和間質形態。例如，使用相位差顯微鏡可觀察到這些細胞的形狀為類纖維母細胞，其支持一類間質樣貌。人類間質幹細胞的拉長形狀和間質樣貌係描述在本項技術和綜合文獻中。HALPC之拉長形狀和間質形係顯示在參照圖1中，其係描繪以相位差顯微鏡術所觀看的培養HALPC(100-倍放大率)。該細胞可以集叢及/或集落的形式以層狀產生和增生在支持培養基上。

HALPC為衍生自人類成年肝臟及表現間質和肝標記二者之人類間質肝前驅細胞。除了型態學評估，從步驟(b)產生的肝前驅細胞可視情況進一步藉由能偵測在此階段已有的相關標記，進一步定性，例如，如EP3140393或WO2017149059中所述。在用於鑑別此等標記並測量其為陽性或陰性之技術中，西方墨點、流式細胞免疫細胞化學和ELISA為較佳的，因為這些技術能以蛋白量偵測標記，即使在此步驟僅可得到低量的肝前驅細胞。

肝前驅細胞的確切標記樣貌可能在某種程度上係依照所欲的細胞亞型和其他因子，例如細胞的微環境或其年齡而定。一般而言，根據本發明所製備的HALPCs(例如，在步驟(c)或步驟(d)中所得到的細胞)係具有表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波型蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，及其視情況表現至少一肝標記及/或展現一肝特異性活性之共通點。

在其中一個較佳的具體實例中，HALPCs之特徵為其係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波型蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，且其係分泌肝細胞生長因子(HGF)，和視情況以及前列腺素E2 (PGE2)。在一相關的具體實例中，HALPCs為α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、CD140b和視情況白蛋白(ALB)陽性，及細胞角質蛋白-19(CK-19)陰性。

在另外的較佳的具體實例中，如根據本發明方法之步驟(c)或(d)所得到的HALPCs之特徵為其係表現CD90、CD73、波型蛋白和ASMA，或為CD90、CD73、波型蛋白和ASMA陽性。

如所述的，肝前驅細胞為至少一肝標記及至少一間質標記陽性。其可具有至少一肝特異性活性。例如，肝標記包括(但不限於)HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和α-1-抗胰蛋白酶並亦可包括白蛋白(ALB)。間質標記包括(但不限於)波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)和CD140-b。肝特異性活性包括(但不限於)分泌尿素、膽紅素接合、分泌α-1-抗胰蛋白酶和CYP3A4活性。

在一視情況的具體實例中，此方法在步驟(b)之後，例如一旦達到至少40%的定義聚滿度，可直接包括另一建立步驟(b)中所得到的新興細胞族群係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，且其視情況表現至少一種肝標記及/或展現一肝特異性活性之步驟。

在另外的視情況具體實例中，此方法在步驟(b)之後，例如一旦達到至少40%的定義聚滿度，可直接包括另一建立步驟(b)中所得到的新興細胞族群係共表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記與一或多種選自α-胎兒蛋白(AFP)、分泌α-1-抗胰蛋白酶、HNF-4和MRP2轉運體之肝標記及視情況肝標記白蛋白。

此方法之步驟(c)係在能使其擴增的條件下培養步驟(b)中所產出的細胞族群，而步驟(d)係包括收取該擴增的細胞族群。

在步驟(c)中，初代細胞係在維持其黏附和同質細胞族群增生之細胞培養基中培養，其在至少一繼代後，越來越富含肝前驅細胞或幹細胞。這些肝前驅細胞可快速擴增供產生更充足的細胞，而得到具有所欲性質之後代達至少2、3、4、5或更多繼代。

術語「繼代」或「繼代培養」係指可藉由收取和再接種一細胞培養或藉由置換培養基，例如就延長細胞生命或擴增其數量之目的所進行的細胞繼代培養(subculture)。在本發明方法中，在擴增步驟(c)中於黏附培養條件下第一次細胞生長後所進行的繼代培養在文中稱為「第一繼代」(或繼代1，P1)。細胞可繼代培養至少一次且較佳地二或三次。在第1繼代之後的各繼代在文中係以加1的數字來指稱，例如繼代2、3、4、5或P1、P2、P3、P4、P5等。繼代培養可包括下列步驟：(i)將得自步驟(b)的細胞或更早期的繼代接種或植入一適合細胞生長和擴增的基質上，於能使其擴增的條件下培養該等細胞，及(ii)將培養基質與培養的細胞彼此相互分離和解離。

在一具體實例中，根據本發明方法之步驟(c)係包括將步驟(b)中產生的細胞族群繼代培養至少二次。在另一具體實例中，此方法的步驟(c)係包括將步驟(b)中產生的細胞族群繼代培養至高四次或五次。最終收取擴增的HALPC族群可在P5之後，或視情況在P4之後進行。在另外的具體實例中，此方法的步驟(c)係包括將步驟(b)中產生的細胞族群繼代培養三至四次。在一具體實例中，當達到至少40%聚滿度時進行細胞在步驟(c)期間的繼代培養。在其他的具體實例中，當達到約至少50%、70%或至少90%或更高的聚滿度時進行步驟(c)中的單一繼代培養。在另一具體實例中，當達到至少大於或等於80%聚滿度時進行步驟(c)中的繼代培養。

又在另外的具體實例中，步驟(c)的持續時間，其中步驟(c)係包括5次繼代培養，係介於25至45天，或介於25至30天。當步驟(c)係包括2或3次繼代培養時，步驟(c)的持續時間係介於10至24天，或介於12至21天。又在本發明之另一具體實例中，步驟(c)的各繼代培養係具有介於5至8天，較佳地6-7天的時間。

在一較佳的具體實例中，步驟(c)的培養條件亦包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基。在另外的具體實例中，步驟(c)係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白及低於約30 ng/mL的EGF或低於約10 ng/mL的EGF，或其中該培養基不含有EGF之無異體來源和無血清培養基。較佳地，無異體來源和無血清培養基其進一步的特徵為其係具有一和多項如上述具體實例中就用於步驟(b)中的培養基所描述之特性。

再者，此等無異體來源和無血清培養基可用於一或多個步驟(c)的繼代培養。在另一較佳的具體實例中，整個步驟(c)係僅使用如步驟(b)所描述的無異體來源和無血清培養基來進行。

步驟(c)中，分離的肝前驅細胞可植入或接種至讓細胞黏附其上的基質，並於如文中所定義的液體培養基中培養及持續其進一步的增生。

初代肝前驅細胞可，例如在步驟(c)中於習用的單層培養系統中，例如以視情況包括表面處理或增進或讓細胞黏附和增生的塗層之堆疊箱室形式培養和增生。另一種選擇及較佳地，步驟(c)係在一生物反應器中進行。

生物反應器為細胞培養系統，其係提供一控制環境和以可複製、標準化方式調整適於細胞增生和擴增之合適條件。相較於靜置或傳統的單層培養，例如「2D」平面培養系統(例如T-燒瓶)，生物反應器為可擴展且可用於較大規模或甚至工業規模的細胞製造。

較佳地，生物反應器係與微載體組合使用，該微載體係作為基質並提供步驟(b)所產生的肝細胞或步驟(c)正在經歷繼代的細胞作為黏附之表面積。微載體可選自任一文中所述的具體實例。

在一具體實例中，此生物反應器為攪拌槽生物反應器。攪拌槽生物反應器可包括葉輪系統供均勻攪拌及在培養和擴增期間攪動細胞懸浮液。

在較佳的具體實例中，此生物反應器分別為臥式攪拌槽生物反應器或直立式攪拌槽反應器。臥式攪拌槽生物反應器通常具有配置用來旋轉大約一垂直軸之葉輪系統，例如藉由鑲嵌在垂直方向軸承或軸桿的葉片，一般係以向上或向下的方向移動液體，亦即培養基。臥式攪拌槽類型的生物反應器之一實例為攪拌燒瓶(spinner flask)或攪拌反應器(spinner reactor)，有時候只稱為「攪拌瓶(spinner)」。

直立式攪拌槽反應器，在另一方面，係配置有一攪伴器或葉輪系統，該攪伴器或葉輪系統可鑲嵌在水平方向軸承或軸桿上以便沿著水平軸旋轉。在一具體實例中，直立式攪拌槽反應器為一直立輪反應器，其中葉輪系統為一混拌輪之形式。直立式攪拌槽反應器的實例為PBS直立輪反應器(PBS Biotech, Inc)。

可用於本發明內容中或做為例示的其他市售生物反應器之實例包括PADReactor®或PADReactor® Mini、Allegro STR (Pall Corp.)、ambr® 250、UniVessel®、Biostat STR®(Sartorius-Stedim)和Mobius® STR (Merck-Millipore)。

在一替代的具體實例中，此生物反應器並非攪拌槽反應器，而是包括一替代葉輪之攪動工具的反應器，例如搖擺移動或搖動式生物反應器，其為一整合或適用於搖動平台之生物反應器，該搖動平台在運轉時係提供細胞培養波動或渦流。

可用於本發明之生物反應器可包括至少一個適用於容納或裝盛細胞培養物之容器；一攪拌或攪動工具；及一或多個端口，其可視情況為整體或部分的容器，且適用於，例如導入或補充液流，例如培養基或氣體的進及/或出，或用於導入微載體、細胞、營養素組份或適用於收取或清洗細胞。較佳地，生物反應器和導入生物器的所有的裝置或組件皆為無菌的，並在無菌條件下作業。

在一具體實例中，此生物反應器為一次性使用的生物反應器，其中該生物反應器係經調整而適用於適合裝盛培養組成物(例如培養基、微載體、細胞等)之一次性使用的容器(例如包袋)。

可同時(in parallel)使用一或多種生物反應器進行步驟(c)中的細胞擴增。生物反應器可視情況亦為一同時包括一或多個，亦即多個適合裝盛細胞培養物之容器的系統。

生物反應器的體積(亦即適合裝盛細胞培養物及在其中發生細胞擴增之容器的體積)可視情況分別在分從約0.1至約1,000公升，或從約0.2至約500公升，或從約0.5公升(亦即500 ml)至約200公升，或從約100公升至約500公升的範圍內。在其他的具體實例中，生物反應器的體積係包括介於0.1至5公升之間，例如3公升，或5公升，10公升或50公升。

在其中一個較佳的具體實例中，方法步驟(c)係包括使用二或更多個不同的生物反應器，尤其是連續使用二個(或更多個)具有實質上不同內體積的生物反應器。例如，步驟(b)中所產生的細胞族群可先在具有體積約0.5 L至約10 L的生物反應器中擴增，及隨後轉置於或在具有內體積約10 L至約100 L之不同生物反應器中繼代培養。

步驟(c)的繼代培養可進一步包括下列步驟：(i)將得自步驟(b)的細胞或更早期的步驟(c)之繼代接種至微載體上，在一根據任一文中所述的具體實例之生物反應器中，於能使其擴增的條件下培養該等細胞，及(ii)將培養基質與培養的細胞彼此相互分離和解離。

如文中所了解的，術語「微載體」(或另一種選擇「微珠」)為在培養期間可黏附或錨定細胞之顆粒狀基質。微載體一般為小的、球狀顆粒或小珠，通常具有介於90至400 µm之平均直徑。詞語「微載體」，如文中所用，可指單一小珠或多數個小珠。

微載體係加到細胞培養基作為黏附-依賴細胞的生長表面。特言之，相較於單層細胞培養，微載體提供較高的表面與體積比率並可得到較佳的製程控制。

可能適合的微載體可以合成的聚合物為基底，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸、聚甘醇酸、聚己內酯，或聚乳酸、聚甘醇酸、聚己內酯之共聚物，例如聚乳酸-甘醇酸(PLGA)。在一具體實例中，係使用以合成聚合物為基礎，其實質上無孔洞的微載體。

在另外的具體實例中，該微載體係以天然的聚合物為基礎，或視情況修飾的生物聚合物，例如包括多肽或多糖的聚合物。適合的實例包括(不限於)以明膠、海藻酸鹽、膠原蛋白、交聯聚半乳糖醛酸(PGA)、交聯右旋糖酐、醣胺聚醣、纖維素或纖維素的衍生物(例如醚類或酯類)為基底的微載體。視情況，以視情況修飾的生物聚合物為基底的微載體為多孔的。

在另外的具體實例中，微載體可為可消化或生物可降解的微載體。可消化的微載體可例如藉由使用適合的酵素及/或藉由化學試劑，例如溶劑或鉗合劑進一步消化、降解(或溶解)。在細胞存活上將損傷最小化或減少的同時，可消化微載體對於細胞擴增方法為有利的，並可增加收取的活細胞。

若使用可消化微載體，微載體的消化係作為根據本發明方法之步驟(c)的子步驟或中間步驟來進行，例如在另一步驟的擴增和繼代之前，作為從微載體分離擴增細胞之部分。微載體之消化亦可作為根據本發明步驟(d)之方法的部分來進行，以便於收取步驟(c)中所得到的擴增細胞。

在一具體實例中，根據本發明方法所使用的微載體為可消化微載體，例如Ca² ₊ 交聯聚半乳糖醛酸(PGA)聚合物微載體，其可在收取階段之後藉由以EDTA和果膠酶處理，加以消化。

在根據本發明方法之一較佳的具體實例中，微載體係選自聚苯乙烯、明膠、交聯右旋糖酐、交聯纖維素、帶有氧化矽的聚乙烯、聚乙烯醇(PVA)和可消化的微載體。

微載體，亦即組成微載體的微珠表面，可塗覆上幫助細胞黏附之生物相容的物質。特言之，在本發明方法的內容中，以合成聚合物為基底的微載體較佳地係具有一塗層，而且對於以特定生物聚合物為基底的微載體，塗層可能對於進一步提升微珠屬性為有用。

在一具體實例中，此微載體係塗覆上幫助細胞黏附之生物相容的物質，視情況其中該塗層為合成的塗層、合成的聚合物、生物聚合物或微載體之化學表面修飾。

如文中所用，術語「塗層」或「塗覆」係指施予微載體基質核心的處理，其係改變微載體顆粒或基質核心的性質，包括(但不限於)，例如表面電荷、細胞黏附或結合親和力、多孔性、密度、微載體直徑和其他物化性質。術語「塗覆」如文中所用不僅可包括施予微載體基質「核心」的物理層，亦包括「化學塗層」，亦即任何化學修飾或表面修飾部分與微載體基質表面的共價接合。

較佳地該塗層為蛋白或多肽塗層。此塗層特言之可包括一或多種的胞外基質(ECM)或ECM-結合蛋白或胜肽。適合的塗層包括(但不限於)膠原蛋白，較佳地人類膠原蛋白；明膠或其他胜肽塗層，例如包括纖連蛋白或纖連蛋白胜肽；玻連蛋白或玻連蛋白胜肽；層粘連蛋白(laminin)或層粘連蛋白胜肽或任何其他胞外基質(ECM)蛋白或胜肽衍生物，以及其組合。此等塗層較佳地係經調整適用於，及適合提升細胞對基質的黏附。

某些微載體可利用專屬之塗層。專屬的無異體來源塗層之實例包括Corning公司的CellBind®或Synthemax II®，或SoloHill Eng公司的Nunclon^TM 。

在其他的具體實例中，此微載體塗層不含有多肽。取而代之的，此塗層可為合成或人工塗層，例如玻璃塗層，尤其是高氧化矽玻璃。在其他的具體實例中，此塗層為化學塗層或微載體基質表面的化學修飾。在一具體實例中，此表面修飾係包括導入陽離子三甲基銨基團。在其他的具體實例中，此表面可經二乙胺基乙基(DEAE)基團修飾，例如就DEAE-纖維素或經DEAE-修飾的交聯右旋糖酐(例如Cytodex 1)的情況。

依照所選的微載體基質之物質及/或塗層(若有塗覆的話)，該微載體顆粒或微珠可具有表面電荷。在某些具體實例中，該微載體具有不帶電或中性的表面。在其他的具體實例中，此微載體具有帶正電荷表面。在其他的具體實例中，此微載體具有些微帶負電荷表面。帶電的表面可藉由以帶電的塗層，以物理上或經由化學修飾或表面核心基質之處理，塗覆微載體來取得。

能使微載體基質表面為中性或不帶電的包括膠原蛋白、聚苯乙烯、右旋糖酐、高氧化矽玻璃或聚乙烯醇。帶正電荷表面在另一方面可藉由利用一經塗層或處理過的微載體來取得，例如塗覆陽離子膠原蛋白、陽離子三甲基銨或二乙胺基乙基的微載體。

依照所選的物質，微載體可視情況分類為包括玻璃或塑膠之硬式微載體(例如聚苯乙烯微載體)，或軟式膨脹型微載體(例如，明膠、海藻酸或右旋糖酐微載體)。

在本發明之一具體實例中，此微載體係以由下列選出的表面處理塗覆：胜肽塗層，例如膠原蛋白、明膠或纖連蛋白；玻璃塗層，例如高氧化矽玻璃；以及表面帶電塗層，例如陽離子三甲基銨或二乙胺基乙基。

在一較佳的具體實例中，本發明內容中所用的微載體及/或其塗層為無異體來源，亦即無任何非人類、動物組份。特言之，較佳的任何多肽基質微載體或經修飾或經多肽或蛋白塗覆的微載體為無異體來源的，或係經由無使用任何非人類、動物產品或動物來源之組份的方法或培養所取得。

在另外的具體實例中，此塗層係包括一人類重組胜肽或蛋白，例如rh-膠原蛋白、rh-纖連蛋白、rh-玻連蛋白、rh-層粘連蛋白或其任何組合。

在一具體實例中，大約為球狀或微珠之微載體的平均直徑係從50至500 µm。微載體可為大小均勻的。

微珠形式或大約為球狀之特別適合的微載體為具有範圍約90至400 µm之體積中數直徑(d50)的微載體。術語體積中數直徑或d50係指50%微載體樣本之體積的直徑。在其他較佳的具體實例中，此微載體可具有範圍分別為100至300 µm，或100至250 µm之體積中數直徑。

在其他的具體實例中，微珠形式或大約為球狀之微載體可具有以d5值及/或d95值表示之直徑，其係指第5個百分位和第95個百分位的微載體樣本之直徑。例如，d5值可在分別約50至約250 µm，或從約80至約200 µm的範圍內；及/或d95值可在分別約100至約400 µm，或從約150至約300 µm的範圍內。

一般而言，微載體可分類為實體(無孔隙)或多孔隙微載體。多孔隙微載體可為大孔或微孔，或大孔和微孔之組合。大孔載體係包括50 nm及更大的孔洞，而微孔的微載體典型地係包括10至35 µm的孔洞。

相較於習用的單層培養基質，微載體可提供更大的表面積供細胞黏附。在一具體實例中，擴增步驟(c)中肝前驅細胞接種在其上的微載體係具有300-6,000 cm² /g範圍內的表面積。在一特定的具體實例中，此微載體係具有介於300至600 cm² /g的表面積。在其他的具體實例中，微載體的表面積係分別在1,000至約6,000 cm² /g範圍內，或在約2,000至約5,000 cm² /g範圍內。在一特定的具體實例中，此微載體係包括以酵素可消化生物聚合物為基底的多孔微珠，其中該微珠係具有在100 µm至約250 µm範圍內的d50值和從約2,000至約5,000 cm² /g範圍內的表面積。

與多孔和實體微載體無關，微載體的平均密度通常係大於1 g/cm³ 。較佳地，在細胞培養基中微載體的密度係調整至適合均勻和一致的懸浮液及適合在生物反應器中攪拌或移動。在本發明之一具體實例中，此微載體係以介於1.02和1.12 g/cm³ 的平均密度來使用。特言之，平均密度可為約1.01、1.02、1.03、1.04或1.05 g/cm³ 。在某些案例中，平均密度為約1.10、1.11或1.12 g/cm³ 。

在根據本發明方法之一具體實例中，此微載體為具有平均直徑介於90至400 µm，密度介於1.02至1.12 g/cm³ 及表面積介於300至600 cm² /g之微珠。

在另外的具體實例中，此微載體為具有平均直徑約250 µm，密度約1.02-1.03 g/cm³ 和表面積約5000 cm² /g之可消化微載體(例如，交聯聚半乳糖醛酸聚合物(PGA)微載體)。

當繼代培養時，係將培養細胞與培養基質彼此相互分離和解離。細胞的分離和解離可如一般本項技術中已知的來進行，例如藉由以蛋白水解酵素的酵素處理(例如選自胰蛋白酶、膠原蛋白酶，例如第I、II、III或IV型，分散酶、鏈黴蛋白酶、木瓜蛋白酶等)，以二價的離子螯合劑處理(例如EDTA或EGTA)或機械處理(例如，經由小口徑移液管或移液管管尖重複吸量)或這些處理的任何組合。較佳地，細胞係藉由以水解蛋白酵素處裡來分離。

當在保留培養基中大多數的細胞時，一適合分離和分散細胞的方法應確保所欲的細胞分離和分散程度。較佳地，分離和解離的培養細胞應有很大的細胞比例為單一活細胞，例如至少50%、70%、90%的細胞或更多。剩餘的細胞可以細胞集叢存在，各集叢係含有相當少數的細胞，例如平均，介於1至100個細胞之間。

然後該經分離和解離的細胞可依步驟(d)收取，或另外若於步驟(c)下進行進一步的擴增和繼代培養，則如上所述再植入或再接種於讓細胞黏附其上的基質並隨後於培養基中培養，維持HALPCs和HALPC後代的進一步增生。

在另一具體實例中，步驟(c)中於微載體上培養的細胞之接種密度，亦即步驟(c)中第一繼代或後續繼代，密度為介於1000-8000個細胞/cm² 。在另外的具體實例中，接種密度為約5000個細胞/cm² ，或不大於5000個細胞/cm² 。

細胞亦可以介於約1/16至1/2，較佳地介於約1/8至1/2，更佳的介於約1/4至1/2的分流比再植入來培養。分流率係指接種至與取得該細胞的容器表面積相同之空的(典型地，新的)培養容器之一部分繼代細胞。

培養容器的類型以及讓細胞黏附至培養容器之表面和細胞培養基可與最初使用或與上述者相同，或可能不相同。如前面所提及的，細胞可在任何適合的撐體上培養，而該撐體可視情況塗覆，例如胞外基質蛋白(例如膠原蛋白，及較佳地第I型膠原蛋白)或臨床等級細胞培養上可接受和可用的GMP等級之合成胜肽。

有關上文步驟(d)之方法，關於最終收取和分離HALPC族群，術語「細胞族群」一般係指一群細胞。除非另有指出，否則此術語係指基本上包括或由如文中所定義的細胞所組成之細胞群。一細胞族群基本上可由具有共通表型之細胞所組成，或可包括至少一部分具有共通表型之細胞。當細胞在一或多個可驗證特徵上為實質上相似或相同，則稱為具有共通表型，其係包括(但不限於)形態外觀、特定細胞組份或產物的表現程度(例如RNA或蛋白)、特定生化路徑的活性、增生能力及/或動力學、分化潛在性/或對分化訊號之反應或活體外培養期間的行為(例如黏附或單層生長)。此等可驗證的特徵因此可定義一細胞族群或其一部分。若實質上大多數的細胞具有共通的表型，則一細胞族群可能為「實質上同源的」。「實質上同源的」細胞族群可包括至少60%，例如至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或甚至至少99%的細胞具有共通的表型，例如特別指出的表型(例如本發明之肝前驅細胞或幹細胞，或本發明之肝前驅細胞或幹細胞後代的表型)。再者，一細胞族群基本上可由具有共通表型，例如本發明之肝前驅細胞或幹細胞表型的細胞所組成，若存在此族群中的任何其他細胞沒有變異或不具有影響整體細胞族群之屬性的物質且因此其可定義為一細胞株。

細胞計數和細胞存活力，無論所施用的方法為何，可在細胞懸浮液上於最後收取時，在方法步驟(b)之後，或步驟(c)的任一繼代培養，以及在調配HALPCs期間內或在品質控制檢測期間進行。本項技術中已知的任何方法皆可使用，例如使用Burker Chamber的手動計數法，或自動計數器，例如NucleoCounter。這些方法的目標為測定細胞的總量以及活細胞的量。

使用Burker Chamber的手動計數法係以台盼藍排除檢測(Trypan Blue exclusion test)為基礎。根據一用於進行此分析的方法，係將細胞懸浮液以PBS或任何其他適合的重建媒劑稀釋，計算每箱室介於100至200個活細胞。將台盼藍使用1:1比率加到細胞懸浮液中。藉由顯微鏡術和細胞計數器計算細胞。白色細胞為活性胞；藍色細胞為死細胞。然後計算活細胞和死細胞的百分比。進行二次細胞計數。若二次計數之間的差異＞15%，則進行第三次計數。熟習本項技術者應了解，亦可使用類似的方法和材料並可產生基本上同等的結果。

另一種選擇，可使用以影像細胞儀為基礎的自動細胞計數器，例如Nucleocounter NC-200 1-step或類似儀器。此影像細胞儀係提供以螢光顯微鏡和先進影像分析為基礎的高精確自動細胞計數器，用以進行死細胞和總細胞之影像細胞計數排除。就Nucleocounter NC-200 1-step的情況，可使用含有固定化螢光染劑之Via1-Cassette™，亦即分別自動染色總細胞和死細胞族群的吖啶橙和DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)，進行一步驟法。又，熟習本項技術者應了解，同樣地可使用的其他儀器、方法和材料。

將細胞懸浮液稀釋，用以計算介於7x10⁵ 至2x10⁶ 個總細胞/ml。吸量一校準體積的Via1-Cassette™而NC-200將自動測定總細胞和死細胞濃度及存活力百分比。將細胞懸浮液稀釋，用以計算介於7x10⁵ 至2x10⁶ 個總細胞/ml。吸量一校準體積的Via1-Cassette™及NC-200將自動測定總細胞和死細胞濃度及存活力百分比。所有的計數係以三重複進行。提報的數值為三個獨立抽取樣本之有效結果的平均。就總細胞濃度和存活性，總細胞計數必須介於之間且變異係數(CV)必須不超過15.0%，才為有效的。

根據本發明用於製造HALPC族群之方法步驟(e)係建立：步驟(c)中所得到的擴增細胞族群之細胞為真正所欲的人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)。例如，此項可包括建立：此等細胞係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)的間質標記，及視情況表現至少一種肝標記及/或展現一肝-特異性活性。另一種選擇，其可包括建立：此等細胞係共表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)的間質標記與一或多種選自α-胎兒蛋白(AFP)、α-1-抗胰蛋白酶、HNF-4和MRP2轉運體之肝標記及視情況肝標記白蛋白。另一種選擇，其可包括建立：此等細胞係共表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)的間質標記與肝細胞生長因子(HGF)以及視情況前列腺素E2 (PGE2)。

在另一較佳的具體實例中，步驟(e)係包括建立：步驟(c)或(d)中所得到的HALPCs為CD90、CD73、波形蛋白和ASMA陽性。可於步驟(e)中建立的另外替代標記及/或活性樣貌已於上文中描述。

如文中所用，術語「建立」應廣義及在控制醫藥製造方法的背景之下解釋。當必須確認以批式法所製造的細胞之身分特質時，其可能不需要或就每個批次實行檢測整體細胞特徵範圍，例如細胞的整體標記或活性樣貌。可能僅檢查已選出作為特定細胞類型或亞型之指標的關鍵標記或細胞性質便已足夠。

該例如藉由確認標記表現來建立細胞之身分特質(identity)的步驟，可能在任何步驟(c)的繼代培養之後，例如第一繼代(P1)，第二繼代(P2)等之後進行，例如就品質控制之目的。

例如藉由確認特定標記的表現來建立細胞之身分特質的步驟，亦可在步驟(c)的最終繼代培養之後進行，例如在收取依方法步驟(d)所得到的細胞族群時。換言之，步驟(e)可在步驟(d)之前或之後進行，或與步驟(c)並行。

此外，例如藉由檢查所選標記的表現來建立細胞之身分特質，亦可視情況在從培養步驟(b)所得來的新興細胞群組樣本上進行。然而，此另外的在早期方法步驟(b)所得來的細胞之檢測不能替代步驟(e)。

又，用於建立細胞之身分特質的潛在有用標記可選自文中所揭示之較佳的或視情況標記，且熟習技術者應了解，常規性的身分特質檢查可能並非必要或對檢查細胞的整體標記樣貌為有用的。一般而言，確認有及/或無一些標記存在應已足夠，而該標記係特定選為建立批式法中所生產之細胞身分特質的關鍵。

在另一具體實例中，根據本發明所製備的HALPCs為 a.α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、CD140b及視情況白蛋白(ALB)陽性；和 b.角質蛋白-19(CK-19)陰性。

在一特佳的具體實例中，根據本發明所製備的HALPCs為CD90、CD73、波形蛋白和ASMA陽性，及CK-19陰性。

在另一具體實例中，根據本發明所製備的HALPCs為 a.α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、CD140b及視情況白蛋白(ALB)及含有壽司區域(Sushi domain)的蛋白2 (SUSD2)陽性；和 b.角質蛋白-19(CK-19)陰性。

在另一具體實例中，此等細胞在表型上亦可為 a. α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、CD140b及視情況白蛋白(ALB)陽性； b.含有壽司區域的蛋白2 (SUSD2)及角質蛋白-19(CK-19)陰性。

在另一具體實例中，此等細胞亦可在下列的表型測定上或測量上為陽性的 a.至少一種選自HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4之肝標記及視情況白蛋白； b.至少一種選自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29之間質標記； c.至少一種選自分泌尿素、膽紅素接合、分泌α-1-抗胰蛋白酶和CYP3A4活性之肝特異性活性； d. 至少一種選自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81之標記；及 e. 至少一種選自MMP1、ITGA11、FMOD、KCND2、CCL11、ASPN、KCNK2和HMCN1之標記。

在另一視情況的具體實例中，在另一視情況的具體實例中，該細胞為HLA-DR陰性。

在另一具體實例中，係進一步檢測HALPCs並建立標記CD133、CD45、CK19及/或CD31為陰性。

亦可以任何功能和技術組合測定上述具體實例之HALPCs的進一步特質，例如藉由測量對至少另一種選自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81之標記為陽性。在某些此等具體實例中，HALPCs可經測量就至少一種由ITGAM、ITGAX、IL1R2、CDH5和NCAM1組成之群中選出的另外標記為陰性。在某些此等具體實例中，HALPCs可經測量就至少其中一種HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM1、CD24、CPM和APOC1為陰性。

種源細胞庫(master stock cell)(MCS)如文中所用可定義為從培養步驟(b)所得來的新興細胞族群，其已根據步驟(c)擴增至一給定的細胞數，其可分裝並儲存供作為製造另外(但有限)批次的最終細胞產物之起始物，亦即在本發明內容中，HALPCs。

由根據本發明方法之步驟(b)可得到的初代肝細胞族群，亦即依照任一文中所述的具體實例，在無異體來源和無血清培養基中培養來自肝細胞懸浮液的初代肝細胞，或另一種選擇，將由任何步驟(c)之繼代培養所收取的細胞族群可無菌調配，填入小瓶中並低溫儲存作為種源細胞庫。該種源細胞庫可在後續解凍，並接種至適當的培養容器或生物反應器中，持續進行此方法，該方法可能包括另外的步驟(c)、(d)和(e)。

在一具體實例中，根據本發明之方法可進一步包括下列步驟： (c1)收取在步驟(b)或任何步驟(c)之繼代培養之後所得到的細胞族群； (c2)於步驟(c1)所收取的細胞族群中加入防凍劑，得到一防凍保護的細胞調配物； (c3)將該防凍保護的細胞調配物冷凍；及 (c4)解凍該冷凍的防凍保護之細胞調配物；其中步驟(c1)至(c4)係以步驟(c)之子步驟來進行。

在一具體實例中，步驟(c1)至(c4)係以一連串的步驟(c)之子步驟在步驟(c)開始時立即進行。因此，在步驟(c1)中，係收取步驟(b)中所得到的細胞族群，後續的步驟仍相同：(c2)於步驟(c1)所收取的細胞族群中加入防凍劑，得到一防凍保護的細胞調配物；(c3)將該防凍保護的細胞調配物冷凍；及(c4)解凍該冷凍的防凍保護之細胞調配物。

在另外的具體實例中，步驟(c1)至(c4)係以步驟(c)之子步驟來進行，依照步驟(c)在細胞族群之一(亦即，第一或P1)繼代之後進行。換言之，可進行步驟(c)為P1，接著產生MCS(亦即步驟(c1)至(c4))，接著P2(視情況接著P3，其視情況接著P4)。另一種選擇，可進行步驟(c)為P1，接著P2，接著產生MCS(亦即步驟(c1)至(c4))，接著P3(視情況接著P4)。

當需要或計畫進一步生產HALPCs族群時，可進行包括解凍該冷凍的防凍保護之細胞調配物的步驟(c4)。步驟(c3)和步驟(c4)之間所經歷的時間可能分別高達12個月，或高達24個月，或甚至更長。

在另一方面，本發明係關於在該方法之步驟(c2)或步驟(c3)中所得到的防凍保護之細胞調配物。

如文中所用，防凍劑為一種能保護活細胞免於冷凍傷害之試劑。可能有用的防凍劑之實例包括二甲基亞碸(DMSO)、甘醇類例如甘油，糖和糖醇。

在一具體實例中，此防凍劑為DMSO。在該情況下，較佳地，防凍保護的細胞調配物中DMSO的含量不高於約5%。在其他的具體實例中，防凍保護的細胞調配物係包括不大於2%的DMSO。在一替代的具體實例中，該防凍劑不包括DMSO。

在另外的具體實例中，防凍保護的細胞調配物中的細胞濃度為每小瓶約10x10⁶ 個細胞或每小瓶介於2百萬至2千萬個細胞(例如，就體積6 ml的小瓶而言)。該細胞數量可藉由上文所定義或本項技術已知之用於細胞計數的方法加以測定。

在另一方面，本發明係關於使用包括純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基供培養從人類肝臟得到或可得到的初代肝細胞，以用於製造人類同種異體肝衍生細胞(HALPC)。特言之，本發明係提供使用包括純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基其進一步的特徵為其係含有低於30 ng/mL的表皮生長因子，供製造人類同種異體肝衍生細胞。在相關的具體實例中，該無異體來源和無血清培養基係展現如上述方法步驟(b)及/或(c)之揭示內容中的一或多項進一步特質。在另一方面，本發明係關於人類同種異體肝衍生前驅細胞，例如藉由本發明方法可得到之分離的HALPC，以及藉由文中所述的方法，和根據任一文中所述之相關具體實例或其組合可得到之分離的人類同種異體肝衍生前驅細胞。

發明人已發現，根據本發明所製備的HALPCs與先前藉由倚靠包括胎牛血清之培養基的方法所得到的細胞，顯示輕微但可能有利的差異。在一方面，根據本發明所製備的HALPCs具有相同的形態，但是尺寸稍小。例如，相較於其他以胎牛血清所製備的類似細胞，根據本發明所製備的細胞，平均細胞直徑通常小約5至20%，例如10至15%。例如，在一比較中，如使用以影像細胞計數為基準的自動細胞計數器(例如NucleoCounter NC-200)所測，根據本發明所製備的HALPCs之平均細胞直徑細在大約14 µm的範圍內，而以血清製備的類似HALPCs係具有大約16 µm。一般而言，愈小的細胞對於處理和投予細胞可能較有利，因為較小的直徑可解釋為較慢沉降及較佳的可注射性。

再者，如實例5中所述和圖4中所示，相較於以胎牛血清所製備的HALPCs，根據本發明所製備的HALPCs顯現下降的每中期選殖異常和以及非選殖異常之平均量。一般而言，就細胞治療的情況，係希望低的異常發生率。

又在另一方面，本發明係提供其為CD90、CD73、波形蛋白和ASMA陽性，以及具有平均每中期低於約2.5%選殖異常及/或每中期低於約15%非選殖異常之人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)。

本發明進一步係關於該分離的人類同種異體肝衍生前驅細胞族群用於治療肝疾病，或該分離的人類同種異體肝衍生前驅細胞族群用於製造醫藥品供治療肝疾病之用途。再者，本發明亦可包括治療肝疾病之方法，該方法係包括將該分離的人類同種異體肝衍生前驅細胞族群投予一有此需要的病患之步驟。例如，此等細胞可用於治療慢性肝衰竭之急性發作(ACLF)，或治療非酒精性脂肪肝疾病，例如非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

下列實例係用來說明本發明，而不應理解為限制本發明之範圍。實例實例1–於無異體來源和無血清培養基中製造HALPC細胞及製備種源細胞庫(MSC)

根據下列通用製程製備HALPCs。肝細胞懸浮液 (LCS) 製備物

由捐贈的肝臟製造肝細胞懸浮液。於37°C使用多步驟膠原蛋白酶灌流之技術得到肝細胞。將全肝或肝片稱重。將套管插入可進入的脈管系統並連接灌流泵浦。製造LCS的主要步驟包括鬆開橋粒，肝消化，肝破壞、過濾，以離心分離肝細胞及低溫保存最終的LCS。

以含有Ca²⁺ 螯合劑以及抗生素之鈣錯合媒劑灌流肝組織，以便藉由錯合Ca²⁺ 移除殘餘的血並鬆開細胞連結(橋粒)。然後將含有膠原蛋白酶+/-蛋白酶的消化媒劑灌入肝臟，快速破壞膠原蛋白基質。當其變脆弱時，將肝放置在篩子上。在停止膠原蛋白緩衝液流之後，移除套管並以機械破壞及撕裂肝組織。藉由緩和的震動讓細胞從消化的組織釋出，及然後過濾並沖洗通過金屬篩或通過尼龍網，以便移除未消化的肝碎塊(例如，肝被膜(Glisson’s liver capsule)、結締組織、血管樹和未灌流/未消化肝組織部分)。然後收集懸浮液進行離心。以離心將肝細胞以冷的清洗媒劑濃縮一次及沖洗2次總計旋轉3次，及然後濃縮，之後冷凍並儲存。冷凍之前，將上清液丟棄並將肝細胞團塊再懸浮於有或無初步添加緩衝液之冷凍培養基及採樣細胞存活力，並於≤130°C儲存於袋中或小瓶中(細胞濃度介於7.5- 20x10⁶ 個細胞/mL)。視情況，可使用新鮮製備的LCS並直接進行HALPCs之製造。產出(P0)

就製備HALPCs，係將一袋低溫保存的肝細胞懸浮液(± 650M個細胞)以重建培養基(碳酸氫鈉、肝素、葡萄糖、人類白蛋白)解凍並離心二次歷時10分鐘((+4°C)以224g)。離心後，將細胞團再懸浮於適當體積的選擇培養基中並使用NucleoCounter NC-200 (Chemometec)計數。

以66,666/cm² 或另一種選擇20,000/cm² 、0.20 mL/cm² 或0.16 mL/cm² 的表面-與-體積比率，接種無菌培養燒瓶(具CellBIND表面之T-燒瓶)。

培養係維持在+37°C，含有5% CO₂ 的濕化氣壓中。培養基一周更換二次(例如，每3至4天)。當培養接近聚滿時(≥80%)，以DPB(杜爾貝科磷酸緩衝食鹽水)，以0.20 mL/cm² 或0.16 mL/cm² 之表面-與-體積比率沖洗細胞一次，及然後藉由以TrypLE™選擇酵素以0.04 mL/cm² 之表面-與-體積比率處理加以分離。隨後以培養基(DMEM(杜爾貝科改良伊格爾培養基)/2% HSA)以0.12 mL/cm² 或0.08 mL/cm² 之表面-與-體積比率，進行驟冷。以錐形無菌試管收取細胞懸浮液並以224g離心10分鐘(+15-25°C)。然後丟棄上清液，並以培養基將細胞團再懸浮。採集樣本，經由NucleoCounter NC-200裝置(Chemometec)計算細胞數。擴增 (P1 至 P5)

P1(繼代1)-將來自P0的細胞以5000個細胞/cm² 密度再植入或再接種於無菌培養容器內的選擇培養基中。培養係維持在+37°C，含有5% CO₂ 的濕化氣壓中。培養基一周更換二次(例如，每3至4天)，直到接近聚滿(≥ 80%)。如上文產出(P0)段落，重複後續的處理步驟從基質/容器收取以及分離細胞供進一步繼代培養，亦即傳代培養。如文所理解的，繼代數目(P1至P5)單單係指細胞在培養中傳代培養(subculture)的次數。

P2(繼代2)至P5(繼代5)-重複上述如P1之步驟，直到最後P5(繼代5)，之後進行最終的收取HALPC細胞(P5/H)。

收取之後(且可視情況在任一P1至P5繼代或其組合中完成)，採取細胞樣本並例如就細胞存活力、純度和身分特質(例如，就CD90、CD73、波形蛋白及/或α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之表現)進行分析。

收取時，將HALPC細胞再懸浮於低溫保存溶液中(CryoStore CS5)並低溫保存。

用於產生HALPC(P0)和用於擴增步驟(P1至P5)的培養基係選自無血清和無異體來源的培養基(分別為培養基A、培養基B和培養基C)。所有無血清和無異體來源的培養基係包括無機金屬鹽之鹼性混合物、營養素例如胺基酸和維生素，並具有範圍從pH 7.0至7.4之pH，例如已知來自杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)或DMEM/F-12之組成物。培養基亦含有麩醯胺酸或麩胺酸，或其前驅物，例如L-丙醯胺基-L-麩醯胺酸，和不大於2重量%之量的葡萄糖，以及一或多種脂肪酸。

培養基A進一步係含有純化的天然人類蛋白以及重組的人類蛋白組份，包括純化的人類血漿衍生的血清白蛋白和運鐵蛋白，以及重組的人類胰島素。此培養基亦包括人類生長因子，但並無EGF。此類型之市售產品有PRIME-XV® MSC Expansion XSFM (FUJIFILM Irvine Scientific)，其係用於此實例1中。

培養基B亦包括天然純化的人類血清白蛋白和重組的人類胰島素。在此實例中，係使用市售產品StemMACS® MSC Expansion kit XF (Miltenyi Biotech)作為培養基B。

培養基C為一特製的培養基組成物，其主要特徵為其係含有一衍生自稻株的重組人類血清白蛋白(例如Optibumin®及/或Cellastim®，二者可購自InVitria)，其中某些可能與脂質結合，尤其是類似該等典型與人類血清中的白蛋白結合之脂肪酸或脂肪酸化合物。其亦含有重組的人類運鐵蛋白(可取得的有Optiferrin®, InVitria)。並無生長因子EGF。

供比較用，亦使用含有動物衍生血清的培養基作為製造HALPC細胞之參照組：添加9.1% FBS(胎牛血清)之DMEM；添加9.1 % FBS (胎牛血清)、胰島素和地塞米松(dexamethasone)之William’s E。在P0用於Williams E參照組之植入密度僅為66666/cm² 。結果

相較於包括FBS的參照培養基，在以無異體來源和無血清培養基進行的方法中，觀察到產生HALPC細胞(P0)的時間明顯較短(表1)。表1產出時間

	Williams-E	DMEM/9.1% FBS	培養基B	培養基A	培養基C
天數	66k (n= 17)	66K (n=7)	20K (n=7)	66K (n=6)	20K (n=12)	66K (n = 3)	20K (n= 3)	66K (n=5)
最小	15	9	7	6	8	7	11	8
中位數	19	22	8	7	11	8	16	11
最大	23	34	14	10	21	11	17	14
平均	19.29	20.14	8.714	7.667	8.667	8.667	14.67	10.8
標準差	2.085	9.856	2.563	1.506	3.742	2.082	3.215	2.387
變異係數(%)	10.80	48.93	29.42	19.64	31.18	24.02	21.92	22.11

再者，擴增步驟的培養時間，亦即，從繼代P1到完成P5/收取的時間亦明顯較短(表2)。表2 培養時間(達成P5收取的時間)

	Williams-E	DMEM/9.1% FBS	培養基B	培養基A	培養基C
天數	66k (n= 17)	66K (n=7)	20K (n=7)	66K (n=6)	20K (n=12)	66K (n = 3)	20K (n= 3)	66K (n=5)
最小	46	39	24	24	25	24	35	26
中位數	54	53	25	25	29.5	29	36	28
最大	64	94	30	27	38	29	55	42
平均	54.88	53.29	25.86	25.33	29.92	27.33	42	30.8
標準差	6.48	19.55	2.116	1.366	4.358	2.887	11.27	6.535
變異係數(%)	11.81	34.74	8.18	5.39	14.57	10.56	26.83	21.22

亦測定出，以無異體來源和無血清培養基進行的培養達到每繼代較高的族群倍增頻率，或換言之，較高的細胞產率。此項係由較高的累積群組倍增量(cPDL)之數值反映出，其係指在其初次活體外分離之後，從第一次擴增(從P1)算起，在族群中細胞倍增之次數，且亦為特定培養之「年齡」的測量值(表3)。表3培養效能(從P1開始之cPDL)

	Williams-E	DMEM/9.1% FBS	培養基B	培養基A	培養基C
cPDL	66k (n= 16)	66K (n=6)	20K (n=7)	66K (n=6)	20K (n=11)	66K (n = 3)	20K (n= 3)	66K (n=5)
最小	7	7	14	15	12.96	16	9	12
中位數	11	12	17	16	15	16	13	14.53
最大	15	15	19	19	18	17	16	18
平均	10.85	11.33	16.57	16.17	15.65	16.33	12.67	14.77
標準差	2.494	2.944	1.988	1.472	1.733	0.5774	3.512	2.69

檢測功能性例如免疫調節活性和分泌蛋白體分析(例如，肝細胞生長因子或HGF分泌量)以及細胞存活力，並發現在得自無血清和含血清培養的肝前驅細胞之間一般而言為相當的。檢測由無異體來源和無血清培養基所產生的HALPC細胞之身分特質和純度，一般亦發現為相當的，且符合HALPCs所建立的接受標準。再者，安全性樣貌，包括得自無異體來源和無血清培養基培養的細胞樣本之核型穩定性以及衰老和致腫瘤性，發現完全符合標準要求和接受標準，且和以參照培養基為基準的培養所得到數值相當或更佳。

有趣地，在方法比較中亦觀察到從無異體來源和無血清培養基所生產的細胞產率，就20,000個細胞/cm² 的較低細胞植入密度與66,666個細胞/cm² 的較高密度大約為相類似。令人意外的，觀察到在全部的無異體來源和無血清培養基方法中以較低密度植入的一般在P0皆成功產生肝細胞，而相較之下在該植入密度下對照的DMEM/9.1% FBS培養基則無細胞產生(表4)。

由無異體來源和無血清培養基所支持的較低細胞密度在製造期間有利地提供更有效的使用肝細胞懸浮儲液。

如圖2所示，其為以其中一種試驗的無異體來源和無血清培養基A所進行之生產運轉從產生P0至擴增繼代5的整體培養時間(數據點以空心圓繪出)與含有FCS之血清培養基(數據點以實心圓繪出)之圖解比較，就血清培養基法，到P5的整體培養時間在所有的繼代皆為較高的。以含有血清之參照培養基所進行的生產運轉，觀察到48天的總培養時間，相較之下，以無血清和無異體來源培養基A的製造總計29天的時間。由此得到一每次接種之理論產量，其相較於參照培養基，在無異體來源和無血清培養基中所進行的方法經計算係高出50倍(圖3)。實例2–製備HALPCs之種源細胞庫

種源細胞庫係在實例1的繼代1(P1)之後由其中一種以無異體來源和無血清培養基為基底的培養來製備。在P1時，當約80%聚滿度時收取細胞，並將生成的細胞團再懸浮於低溫保存培養基中(Cryostor-5)。藉由將每瓶填入約1千萬-5千萬個活細胞的小瓶冷凍，製造儲備液。小瓶係於無菌條件下充填。

相對於直接從肝細胞懸浮液的僅單一次之製造，該儲備液可用於進一步的製造回合(例如，至高25回合)，提供HALPC細胞。如在實例1中所見，更快且亦更有效率生產(P0)，其使得細胞的產率增加及製造時間更快，如在提供製造種源細胞庫機會之無異體來源和無血清培養基中所觀察到的。實例3–從MCS於微載體上的生物反應器擴增HALPC

下列為一用於從根據實例2之方法所製備的種源細胞庫(MCS)擴增HALPC之代表性通用製程。

將來自MCS的一或多個小瓶解凍並將細胞接種至在小型生物反應器內(例如100 mL或3L生物反應器，例如PBS直立輪式生物反應)的培養基，例如實例1中所用之無異體來源和無血清培養基(例如培養基A)內的微載體上。在細胞黏附(靜置或半靜置)至微載體之後，攪拌微載體並調整生物反應器中培養基的體積。將微載體接種充足的細胞，以便得到平均每粒微載體至少一個細胞。

調整生物反應器中的攪動速度用以控制和最小化剪切力，但為足夠的速率用以避免微載體沉降在容器底部及避免結塊。藉由測量代謝參數，例如葡萄糖、乳酸、麩醯胺酸和氨，監測生長。培養基係於±第4天更新，於±第6天收取。

在一典型的方法中，微載體的濃度係以每公升15g的微載體來提供。例如，帶有大約360 cm² /g表面積的微載體可提供約5400 cm² 的培養表面。大約15g的微載體可提供±45M微載體，以每粒微載體接種大約1個細胞，培養物中的細胞量應在每公升至少約45-50M個細胞的範圍內。

在優化時，在6-7天內預期可擴增20-倍，產生每公升高達±1B個細胞。

在培養結束時，排出培養基並以緩衝液沖洗微載體，之後將其在低攪動下以TryplE培養。使用袋內篩子系統(sieve-in-a-bag system)從微載體分離細胞，亦即將細胞通過篩子(通常70µm)並保留較大的微載體。另一種選擇，在可消化微載體的情況下，以消化劑培養微載體(例如，果膠酶用於交聯右旋糖酐微載體)並清洗所產生的混合物以顯露細胞。在這二種情況下，然後可將細胞懸浮液通過離心系統(kSep®)進行清洗和濃縮。在下游處理期間流失的細胞預計大約15%。

發現此擴增步驟可在尺寸高達50 L的生物反應器中再製及/或重複一或二次(繼代P2，繼代P3)。在本案例中，整個生產運轉典型地係花費大約14天。實例4-接種HALPC-之微載體的生物反應器擴增

下列研究係評估使用微載體和生物反應器之HALPC擴增。此研究係根據實例3中所述的通用培養和收取製程來進行，但是細胞係由不同的繼代所取得並以新鮮細胞或解凍細胞來使用。

特言之，擴增係於直立輪式攪拌生物反應器系統(PBS Biotech)中，於攪拌器容器做為臥式攪拌槽生物反應器之實例中，於微載體上試驗。使用T-燒瓶(T175 CellBIND®, Corning®)做為對照。所檢測的微載體基質包括塗覆膠原蛋白的微載體(Solohill Eng.)，以及可溶解Synthemax® II微載體(Corning®)。

使用前，依照說明將微載體水合及重建。將細胞以5000個細胞/cm² 接種在所選的微載體培養容器。所用的培養基為DMEM/9% FBS培養基。

在使用塗覆膠原蛋白的微載體(以15 cm² /mL及5000個細胞/cm² 接種密度來提供)和DMEM/9% FBS培養基之試驗中，觀察到在二種生物反應器/微載體系統(直立輪式和攪拌器)，相較於對照組，在第7天提供較高數目的每平方公分(cm² )活細胞數(圖1)。在使用經可溶性Synthemax®胜肽表面處理過的微載體(以15 cm² /mL及5000個細胞/cm² 接種密度來提供)和DMEM/9% FBS培養基之試驗中，觀察到類似結果(圖2)。實例5–核型分析：根據本發明所製備的HALPCs與傳統製備的HALPCs之比較

根據本發明，依照實例1之製程及使用培養基A製備一系列批次的HALPCs，並與以基本上相同方法所製造但在比較的批次中用於步驟(b)和(c)的培養基不同的批次相比較，亦即在步驟(b)和(c)的細胞產生和擴增期間為包括胎牛血清之習用培養基。亦即在步驟(b)和(c)之產生和擴增期間為一包括胎牛血清之習用培養基。

核型分析係在如下所取得的這些批次之細胞樣本上進行：

將新鮮收集的細胞以3x T175 CellBind以5,000個活細胞/cm² 接種在尋常的培養基中。然後持續培養細胞直到約70%之聚滿度(聚滿度必須介於30至80%)。

阻斷有絲分裂的中期：然後將細胞以0.1 ug/ml之N-去乙醯基-N-甲基-秋水仙素溶液的培養基於+37°C培養18小時(+/-2小時)，停止存在細胞微管中的微管蛋白之聚合作用並就此防止有絲分裂紡錘體形成，在中期階段阻斷細胞。

收集細胞：接著，使用胰蛋白酶消化收集細胞，接著以1,200 rpm和室溫離心。

低滲性休克：將+37°C的稀氯化鉀溶液逐滴加到細胞，使細胞團緩慢崩解並達到一均勻懸浮液。隨後，將細胞於+37°C培養25分鐘，讓KCl引發細胞之低滲性休克，使其經由滲透壓差膨脹。此膨脹讓細胞展開並得以分析染色體。

固定細胞：隨後，於室溫使用乙酸和甲醇(3:1)混合物，將其緩慢加到細胞中，固定細胞，接著於室溫培養並於室溫以1,200 rpm離心。進行數個將團塊再懸浮於固定混合物中、培養以及於室溫以1,200 rpm離心之循環。

展開和染色：將固定的樣本鋪開在載玻片上。乾燥後，將樣本以NaH₂ PO₄ H₂ O溶液使其變性，以水清洗並以4% Giemsa溶液(G-banding)染色。染色後，再次以水清洗載玻片並風乾。

染色體分析：計數、攝影和分析中期，建立核型樣貌。最少分析20個中期。

結果：發現，相較於傳統製造的HALPCs，根據本發明處理之批次中所製造的HALPCs其選殖和非選殖染色體異常的數目實質上較低，如圖4所示。更特言之，選殖異常的平均發生率就根據本發明所製備的HALPCs為0.71%，相較之下，傳統製備的HALPCs為2.86%；非選殖異常的發生率就根據本發明所製備的HALPCs為7.14%，相較之下，傳統製造的HALPCs為18.09%。這些數值係從各方法的7個批次和超過20個中期(metaphase)所得來。

結論，本發明不僅能增加HALPCs的生產效率，亦能改良細胞，展現比傳統製造之HALPCs更高的染色體穩定性。實例6 – HGF和PGE2分泌

根據本發明，依照實例1的製程及使用培養基A，製備一系列批次的HALPCs，並與以基本上相同方法所製造但在比較的批次中用於步驟(b)和(c)的培養基不同的批次相比較，亦即在步驟(b)和(c)的細胞產生和擴增期間為包括胎牛血清之習用培養基。隨後，測定細胞所分泌的HGF和PGE2。

如下測量由HALPC所分泌的抗纖維因子HGF。將HALPC以30.000個活細胞/cm² 接種至T75或T25燒瓶，最初48h以DMEM/9%FBS培養及最後24h以DMEM/0.5% FBS培養。最後的24小時將FBS濃度降至0.5%用以避免任何以ELISA測量之該組分的干擾。培養後，收取培養基，離心，分裝並於-80°C冷凍。並行地，將細胞以胰蛋白酶消化並計數以便對該細胞數提報培養基中由細胞所分泌的HGF量(pg HGF/10⁶ 個細胞)。使用一特定的Quantikine ELISA(Bio-Techne, R&D Systems brand, #DHG00)評估細胞培養基中的HGF濃度。如圖5A中所示，在培養基A(無血清和無異體來源)所製備的批次中，HGF分泌增加。

在前發炎細胞激素IL-1β、IFN-γ和TNF-α之混合物的存在下，其係指在前發炎的情況下，使用ELISA測量由HALPCs所分泌的PGE2。將HALPC以30.000個活細胞/cm² 接種至T75或T25燒瓶之DMEM/9%FBS中。最後的24小時將FBS濃度降至0.5%用以避免任何以ELISA測量之該組分的干擾。培養24小時後，將細胞培養基換成前發炎培養基(DMEM/9.1% FBS + TNFα、IL-1β和IFNγ)。培養24小時後，移除前發炎培養基並以新鮮的DMEM/0.5% FBS培養細胞。培養24小時後，收取培養基，離心，分裝並於-80°C冷凍。使用特定的競爭性ELISA套組(Prostaglandin E2 ELISA kit, Abcam, #ab133021)評估細胞培養基中的PGE2濃度。並行地，將細胞以胰蛋白酶消化並使用NC-200一步法計數以便對該細胞數提報培養基中由總細胞所分泌的PGE2量(pg HGF/10⁶ 個細胞)。如圖5B中所示，相較於傳統製備的批次，在培養基A(無血清和無異體來源)所製備的批次中於前發炎情況下PGE2的分泌增加。

無

圖1描繪以相位差顯微鏡術所觀看到(100-倍放大率)，在無血清和無異體來源培養基A中所培養的新興HALPCs(P0)之形態(接種密度66,666個細胞/cm² )。

圖2為以無異體來源和無血清培養基A進行生產運轉從產生P0和後續擴增繼代培養1至5的整體培養時間(圖中以空心圓繪出)，相較於含有胎牛血清(FCS)之參照含血清培養基(圖中以實心或實體圓繪出)之圖解比較。就血清培養基方法終結到P5的整體培養時間在所有的繼代中為較高，以48天的整體培養時間終結，相較之下，以無異體來源和無血清培養基A製造係觀察到總計29天的時間。

圖3為含血清之參照培養基中製造HALPCs的每次接種理論產量，相較於使用無異體來源和無血清培養基A製造的每次接種理論產量之圖示比較。可測定出在無異體來源和無血清培養基中進行的方法，與參照的培養基相比，高出幾乎50倍的理論產量之差異。

圖4係顯示發生在根據本發明使用無異體來源和無血清培養基或以習用的方法使用包含牛血清的培養基所製備之另外可相比的HALPCs中，選殖(左)和非選殖(右)染色體異常的量。

圖5係顯示在根據本發明使用無異體來源和無血清培養基或以習用的方法使用包含牛血清的培養基所製備之另外可相比的HALPCs中，HGF和PGE2的分泌。

無

Claims

一種製造人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)族群之方法，其係包括下列步驟： (a) 提供一得自人類肝臟之初代肝細胞的懸浮液； (b)於能產生具有拉長形狀和間質形態之細胞族群的條件下，培養包括在該懸浮液中的初代肝細胞； (c)於能使其擴增的條件下培養步驟(b)中所產出的細胞族群； (d)收取步驟(c)中所得到的擴增細胞族群；其中於步驟(c)中所得到的該擴增細胞族群之細胞為人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)，該細胞係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白(vimentin)和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，及視情況表現至少一種肝標記及/或展現肝-特異性活性；及其中步驟(b)的培養條件係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基。
如請求項1之方法，其中該無異體來源和無血清培養基之進一步的特徵為其係含有低於30 ng/mL的上皮生長因子(EGF)。
如請求項1或2之方法，進一步係包括下列步驟： (e)建立步驟(c)中所得到的該擴增細胞族群之細胞為人類同種異體肝衍生前驅細胞(HALPC)，該細胞係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記，及視情況表現至少一種肝標記及/或展現肝-特異性活性。
如請求項1至3之方法，其中步驟(c)或(d)中所得到的該人類同種異體肝衍生前驅細胞係表現至少一種選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)之間質標記；並分泌HGF。
如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(c)或(d)中所得到的該人類同種異體肝衍生前驅細胞進一步係分泌PGE2。
如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(c)或(d)中所得到的該人類同種異體肝衍生前驅細胞為 (i)α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、CD140b陽性，及視情況為白蛋白(ALB)陽性； (ii)細胞角質蛋白-19(CK-19)陰性。
如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(c)或(d)中所得到的該人類同種異體肝衍生前驅細胞為CD90、CD73、波形蛋白和ASMA陽性。
如前述請求項中任一項之方法，其中該無異體來源和無血清培養基係包括脂質，較佳地選自一或多種脂肪酸，且其中該脂質係與純化的天然或重組人類血清白蛋白結合或鍵結。
如前述請求項中任一項之方法，其中該無異體來源和無血清培養基係包括： (i) 純化的天然或重組人類運鐵蛋白(transferrin)且其中該人類運鐵蛋白係視情況經一鐵化合物預處理過； (ii) 重組的人類胰島素；及 (iii) 一硒化合物，例如亞硒酸鈉。
如前述請求項中任一項之方法，其中該無異體來源和無血清培養基係包括30 pg/mL或更高量之鹼性纖維母細胞生長因子(FGF2)，及視情況5 pg/mL或更高量之酸性纖維母細胞生長因子(FGF1)。
如前述請求項中任一項之方法，其中該無異體來源和無血清培養基係包括人類纖連蛋白(fibronectin)及/或人類玻連蛋白(vitronectin)，例如重組的人類纖連蛋白及/或重組的人類玻連蛋白。
如前述請求項中任一項之方法，其中該無異體來源和無血清培養基係包括葡萄糖，且其中該葡萄糖含量係不高於約2.5 重量%，及視情況不高於約1重量%。
如前述請求項中任一項之方法，其中該無異體來源和無血清培養基係包括麩醯胺酸或其鹽，或能釋放麩醯胺酸或其鹽的化合物。
如前述請求項中任一項之方法，其中該無異體來源和無血清培養基係包括： (iv)無機鹽類，包括鈣、鐵(II)、鐵(III)、鉀、銅(II)、鎂、鈉和鋅之鹽類； (v)胺基酸，包括L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天門冬醯胺酸、L-天門冬胺酸、L-半胱胺酸、L-胱胺酸、L-麩醯胺酸、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸和L-纈胺酸； (vi)維生素，包括D(+)-生物素、D-泛酸鈣、氯化膽鹼、葉酸、肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫胺素和維生素B12；及視情況 (vii)DL-硫辛酸、次黃嘌呤、亞麻油酸、酚紅鈉、腐胺(putrescine)、丙酮酸及/或胸苷；及其中培養基的pH係調整至pH 6.9-7.5。
如前述請求項中任一項之方法，其中該步驟(c)的培養條件係包括使用包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基，且其中該步驟(c)中所用的無異體來源和無血清培養基進一步的特徵為其係不包括EGF。
如前述請求項中任一項之方法，其中該步驟(c)中所用的無異體來源和無血清培養基進一步的特徵為其係展現一或多項如請求項8至15之特質。
如前述請求項中任一項之方法，其中步驟(c)係包括繼代培養步驟(b)中所產生的細胞群組至少二次。
如前述請求項中任一項之方法，進一步係包括下列步驟： (c1)收取在步驟(b)或任何步驟(c)之繼代培養之後所得到的細胞族群； (c2)於步驟(c1)所收取的細胞族群中加入防凍劑，得到一防凍保護的細胞調配物； (c3)將該防凍保護的細胞調配物冷凍；及 (c4)解凍該冷凍的防凍保護之細胞調配物；其中步驟(c1)至(c4)係以步驟(c)之子步驟來進行。
一種包含純化的天然或重組人類血清白蛋白之無異體來源和無血清培養基的用途，其係用於培養得自人類肝臟之初代肝細胞，使其產生人類同種異體肝衍生前驅細胞。
根據請求項19之無異體來源和無血清培養基的用途，其中該培養基進一步的特徵為其係含有低於30 ng/mL的表皮生長因子(EGF)。
根據請求項19或20之無異體來源和無血清培養基的用途，其中該培養基進一步的特徵為其係展現一或多項如請求項8至15之特質。
一種分離的人類同種異體肝衍生前驅細胞族群，其為CD90、CD73、波形蛋白和ASMA陽性；且具有平均低於2.5%每中期之選殖異常及/或低於15%每中期之非選殖異常。
一種分離的人類同種異體肝衍生前驅細胞族群，其係藉由如請求項1至18中任一項之方法所獲得。
根據請求項22或23之分離的人類同種異體肝衍生前驅細胞族群，係用於治療肝臟疾病。
一種低溫保護的細胞調配物，其係以根據請求項18之方法的步驟(c2)或步驟(c3)所獲得。