WO2013109055A2

WO2013109055A2 - 개 유래의 자연살해세포 및 이의 대량 증식방법

Info

Publication number: WO2013109055A2
Application number: PCT/KR2013/000352
Authority: WO
Inventors: 김상기; 신동준; 박지윤; 조덕
Original assignee: 공주대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2013-07-25
Also published as: KR101384203B1; KR20130084465A; WO2013109055A3

Abstract

본 발명은 개 유래의 자연살해세포 및 이의 대량 증식방법에 관한 것으로，본 발명의 개 유래의 자연살해세포는 개의 암 또는 바이러스 질환， 질병 또는 증상의 예방 또는 치료제로서 사용가능하며, 본 발명에 따른 자연살해세포 대량 증식방법은 개 유래의 자연살해세포의 살해능을 현저히 증가시키면서 최대 증식이 가능한 획기적인 방법이므로， 적은 양의 채혈로 많은 수의 자연살해세포를 수득할 수 있게 됨으로써 세포치료제로의 상용화에 크게 기여할 것이다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

개 유래의 자연살해세포 및 이의 대량 증식방법

【기술분야】

<1> 본 발명은 개 유래의 자연살해세포 및 이의 대량 증식방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개 유래의 자연살해세포， 개로부터 유래된 단핵구세포로부터 자연 살해세포를 시험관 내에서 대량 증폭할 수 있는 자연살해세포 증식 /분화용 배지 조 성물 및 이를 이용한 분화 및 /또는 증폭방법에 관한 것이다.

【배경기술】

<2> 성체 줄기세포 중 하나인 조혈즐기세포 (hematopoietic stem cell)는 혈액을 구성하는 모든 세포 (적혈구， 백혈구， 혈소판 및 림프구)로 분화할 수 있는 세포로 서, 주로 골수에 있는 조혈줄기세포로부터 생체의 면역체계를 구성하는 세포가 지 속적으로 자가 재생된다. 이들 면역체계를 구성하는 세포들 중 특히， 자연살해세포 (natural killer cell, 이하 'NK 세포'라 약칭함)는 비특이적으로 암세포 및 바이 러스 감염세포를 살상할 수 있는 능력이 밝혀지면서 많은 연구가 진행되었으며, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암 (Konjevic G, et al. , Breast Cancer Res. Treat., 66： 255-263, 2001), 혹색종암 (Ryuke Y, et al . , Melanoma Res. , 13： 349- 356, 2003)， 폐암 (Villegas FR, et al . , Lung Cancer , 35： 23-28, 2002) 등 다양한 질병들과 관련 되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 연구들을 바탕으로 암과 같은 난치성 질환 치료에 NK 세포를 이용하는 NK 세포 치료법이 대두되고 있다. NK 세포를 이용 한 세포 치료를 위해서는 생체 외 (ex vivo) 상에서 NK 세포를 배양하는 것이 필요 하고， NK 세포의 생체외 분화 조건을 최적화하는 것은 필수적이며, 생체외 상에서 조혈줄기세포로부터 성숙한 NK세포를 분화시키는 방법은 이미 보고되어 있다.

<3> 그동안 사용되어온 공통 유전형의 마우스 모델 (syngenic mouse model)이나 제노그래프트 마우스 모델 (xenograft mouse model) 등 실험동물에서의 실험은 개나 영장류를 이용한 실험에 비해 실제 임상적 효능을 예측하기 어려운 것으로 잘 알려 져 있고, 실험용 쥐에서 R 세포의 체외 증폭기술이 확립되지 않아 대부분 NK 세포 를 순수 분리한 다음 사이토카인으로 활성화시켜 사용하여 왔다.

<4> 한편， 개는 개의 게놈 (genome) 관독 결과 인간과 개의 게놈이 매우 유사하다 고 입증되었으며, 특히 개에서 자연적으로 발생된 암의 유전적， 분자 생물학적, 병 리조직학적 양상 및 일반적으로 사용되고 있는 암치료법에 대한 반응이 사람에서 발생되는 암과 거의 비슷하다는 사실이 밝혀졌으며 (Lindblad-Toh K et al, 2005； Hoffman 匪 & Birney E, 2007), 인간의 면역질환 및 감영성질환과 유사한 질병이 자연발생적으로 유발되기 때문에 아주 흥미 있는 실험모델이다. 아울러 개에서 암 이나 바이러스 질환 등과 같은 난치성 질환의 발생이 현저히 증가하고 있어 이들 난치성 질환에 대한 새로운 치료제 개발 역시 매우 필요하다.

<5> 이와 같은 생물학적 유사성 때문에 개에서 암에 관한 연구는 사람 또는 실험 동물만을 대상으로 한 암 연구와 차별화되는 귀중한 정보를 제공하며, 이와 같은 가치에 대한 인식은 암 -관련 유전자 확인 연구를 비롯하여 환경성 위험요소 , 암의 생물학적 특성 이해, 그리고 특히 새로운 암치료법 개발 및 효능 평가 등의 연구 분야에서 현저히 높아지고 있다 (Paokmi M & Khanna C, 2008) . 그러나 아직까지 개 에서 세계적으로 NK세포의 확인， 이의 증폭 및 이를 이용한 암치료에 관련된 보고 가 없다. 、

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

<6> 이에, 본 발명자들은 사람에서 암을 극복하기 위한 연구에 귀중한 실질적 자 료를 제공할 수 있는 개와 같은 효과적인 동물 실험 모델이 필요한 시점에서, 개 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)에 발현하는 특이 표지인자조차도 밝 혀져 있지 않는 개 유래의 자연살해세포의 연구를 진행하던 중， 시험관내에서 강력 한 항암 및 항바이러스 효과를 갖는 개 유래 자연살해세포， 및 고순도의 자연살해 세포 대량 증폭방법을 발견하고， 본 발명을 완성하였다.

<7> 본 발명의 목적은 개 유래의 자연살해세포를 제공하는 것이다.

<8> 본 발명의 다른 목적은 개 유래의 자연살해세포를 포함하는 세포치료제 또는 항암제 및 항바이러스제를 제공하는 것이다.

<9> 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 대량 증폭할 수 있는, 자연살해세포 분화 및 /또는 증폭용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

<10> 본 발명의 목적은 개 유래의 자연살해세포를 시험관 내에서 대량 증폭할 수 있는, 자연살해세포 분화 및 /또는 증폭용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

<11> 본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 개로부터 유래된 단핵구 세포로부터 고효율로 강력한 항암 및 항바이러스 효과를 갖는 개 유래의 자연살해 세포의 대량 증폭방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

<12> 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개 유래의 자연살해세포를 제공 한다. <13> 본 발명의 개 유래의 자연살해세포는 개의 암 또는 바이러스 질환， 질병 또 는 증상의 치료 및 예방을 위한 세포치료제 또는 항암제로 사용할 수 있다.

<14> 본 발명은 또한 IL-2, IL-15 또는 이들의 흔합물을 유효성분으로 함유하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell) 분화 및 /또는 증폭 용 배지 조성물을 제공한다. '

<15> 본 발명에 따른 조성물에 있어서, 유효성분으로 IL-2 10 내지 500 U/ 및

IL-150.1 내지 100 U/i 를 함유하는 것이 바람직하다.

<16> 본 발명은 또한 정상개의 말초혈액에서 밀도 구배 원심방법 (density gradient centrifugation)을 이용하여 분리한 단핵구세포 (PBMCs)를 상기 조성물이 첨가된 배지에서 피더 세포 (Feeder cell)와 함께 공조배양하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)의 분화 및 /또는 증폭방법을 제공한 다.

<17> 본 발명에 따른 분화 및 /또는 증폭방법은 개 유래의 단핵구세포를 75% (비중

1.057) 내지 80% (비중 1.063)농도의 Lymphoprep, 100% (비중 1.077) 농도의 Lymphoprep 및 100% Histopaque (비중 1.119)의 불연속 밀도구배 (discont inuous density gradients) 원심분리를 이용하여 정제하는 것이 바람직하다.

<18> 본 발명의 바람직한 일 구체예에서， 본 발명에 따른 분화 및 /또는 증폭방법 은 개 유래의 단핵구세포를 76% (비중 1.058) 내지 77% (비중 1.059) 농도의 Lymphoprep, 100% (비중 1.077) 농도의 Lymphoprep 및 100% HistopaQue (비중 1.119) 의 불연속 밀도구배 (discontinuous density gradients) 원심분리를 이용하여 정제 할 수 있다.

<19> 본 발명에 따른 분화 및 /또는 증폭방법은 개로부터 유래된 단핵구세포로부터 순도가 95% 이상의 개 유래의 자연살해세포만을 최대 200배 이상 대량 증폭시킬 수 있다.

【유리한 효과】

<20> 본 발명에 따른 개로부터 유래된 자연살해세포는 개의 암 또는 바이러스 질 환, 질병 또는 증상의 치료 또는 예방제로서 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 자연 살해세포의 증식 및 /또는 분화용 배지 조성물은 개 유래의 단핵구세포 및 피더 세 포와 함께 배지에 첨가하여 추가 배양함으로써 강력한 항암 효과를 갖는 고순도의 자연살해세포를 단기간에 폭발적으로 증식시킬 수 있는 장점이 있다.

<21> 본 발명에 따른 자연살해세포 분화 및 /또는 증폭방법은 개 유래의 자연살해 세포의 살해능을 강력히 증가시키면서 최대 증식이 가능한 획기적인 방법이므로， 적은 양의 채혈로 많은 수의 강력한 자연살해세포를 수득할 수 있게 됨으로써 세포 치료제로의 상용화에 크게 기여할 것이다.

【도면의 간단한 설명】

<22> 도 1은 본 발명의 분화 및 증폭방법으로 체외 증폭된 개 유래의 자연살해세 포의 형태적 특징을 확인한 결과이고 (A: 0일， B: 18일， C: 13일 (배지 내))，

<23> 도 2는 본 발명의 분화 및 증폭방법으로 체외 증폭된 개 유래의 자연살해세 포에 대한 표현형 분석 결과이며，

<24> 도 3은 본 발명의 방법분화 및 증폭방법으로 체외 증폭된 개 유래의 자연살 해세포에 대한 자연살해세포 관련 유전자의 발현 결과이며，

<25> 도 4는 본 발명의 분화 및 증폭방법으로 체외 증폭된 개 유래의 자연살해세 포에 대한 iTCRa chain의 발현 결과이고，

<26> 도 5는 본 발명의 분화 및 증폭방법으로 체외 증폭된 개 유래의 자연살해세 포에 대한 IFN-ga讓 a 생산능을 분석한 결과이며，

<27> 도 6은 본 발명의 분화 및 증폭방법으로 체외 증폭된 개 유래의 자연살해세 포에 대한 개 갑상샘암 세포 살상능올 분석한 결과이고,

<28> 도 7은 본 발명의 분화 및 증폭방법으로 체의 증폭된 개 유래의 자연살해세 포로 개 갑상샘암을 공격시킨 후 세포를 염색하여 현미경으로 관찰한 결과이며 <29> 도 8은 본 발명의 방법분화 및 증폭방법으로 체외 증폭된 개 유래의 자연살 해세포에 대한 종양 살상능을 확인한 결과이다. —

<30> (A: 개 유선종양세포, B: 방광이행상피종)

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

<31> 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

<32> 본 발명은 개유래의 자연살해세포를 제공한다.

<33> 본 발명의 개유래 자연살해세포의 표현형은 CD5 low positive, CD3 positive, CD4 negative, CD8 positive, TCR α β negative 및 /또는 TCRy δ negative이거나， 단핵구세포와 비교하여 CDllc와 CDlld의 발현이 증가된 것일 수 있다.

<34> 본 발명에 있어서， 개유래 자연살해세포는 사람의 자연살해세포에 대한 특이 표지인자인 CD56가 발현되지 않고， 개유래 자연살해세포는 Ly49가 발현된다는 것을 처음으로 규명하였다.

<35> 이와 같이， 본 발명의 개유래 자연살해세포는 사람의 자연살해세포에 대한 특이 표지인자인 CD56를 발현되지 않는 특성을 가질 수 있다. 또한 본 발명의 개유 래 자연살해세포는 Ly49가 발현된 특성을 가질 수 있다.

<36> 본 발명은 또한 상기 개 유래 자연살해세포를 포함하는 개의 암 또는 바이러 스 질환， 질병 또는 증상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

<37> 본 발명은 또한 개의 암 또는 바이러스 질환， 질병 또는 증상의 예방 또는 치료를 위한 상기 개 유래 자연살해세포의 용도를 제공한다.

<38> 본 발명은 또한 상기 개 유래 자연살해세포를 사용하는 개의 암 또는 바이러 스 질환， 질병 또는 증상의 예방또는 치료방법을 제공한다.

<39> 본 발명은 또한 상기 개 유래 자연살해세포를 포함하는 세포치료제를 제공한 다.

<40> 본 발명은 또한 상기 개 유래 자연살해세포를 포함하는 개의 항암제를 제공 한다.

<4i> 본 발명에 있어서， "자연살해세포"란 세포독성 대형 과립 림프구 (cytotoxic large granular lymphocyte: CLGL)를 의미하며, 자연살해세포의 특성 및 /또는 효과 를 갖는 대형 과립 림프구를 포함한다.

<42> 본 발명에 있어서, "Feeder cell (피더 세포) "란， 분열증식하지 못하게 하였 으나 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 세포의 증식을 돕는 세포로서， 최초에 이식한 세포를 '피더 세포'라고 한다.

<43> 본 발명에 있어서, 상기 'Lymphoprep'나 'Histopaque'이라는 이름은 실험실 에서 널리 사용되는 이름으로서, 그 물건을 용이하게 입수할 수 있고 그로써 물건 자체가 명확히 특정되기도 한다.

<44> 본 발명은 또한 IL-2, IL-15 또는 이들의 흔합물을 유효성분으로 함유하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell) 분화 및 /또는 증폭 용 배지 조성물을 제공한다.

<45> 본 발명에 있어서， 상기 유효성분은 보다 바람직하게는 IL-2 및 IL-15의 흔 합물일 수 있다.

<46> 본 발명에 있어서， 상기 유효성분은 IL-2 10 내지 500 U/ 및 IL-150.1 내 지 100 U/ 를 함유하며， 바람직하게는 IL-2 50 내지 200 U/m£ 및 IL-15 10 내지 100 U/n , 더욱 바람직하게는 IL-270 내지 150 U/ra^ 및 IL-1550 내지 100 U/n^를 함유한다.

<47> 본 발명은 또한 1) 개로부터 채취된 혈액을 농도밀도구배， 바람직하게는 피 콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) 농도밀도구배에 중첩하고 원심분리하여 단핵구세포를 분리하는 단계; 2) 임의로 상기 분리된 단핵구세포를 바람직하게는 피콜 (Ficoll)로 정제하는 단계; 및 3) 피더 세포 (Feeder cell) 존재 하에， 상기 IL-2, IL-15 또는 이들의 흔합물을 유효성분으로 함유하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell) 증식 및 /또는 분화용 배지 조성물을 상기 2)에서 정제된 단 핵구 세포 (mononuclear eel Is)와 공조 배양하는 단계 :를 포함하는 것을 특징으로 하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)의 분화 및 /또 는 증폭방법을 제공한다.

<48> 또한, 보다 상세하게는 본 발명은 1) 개로부터 채취된 혈액을 1.077 내지

1.119 g/ni 비중의 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque)에 증첩하고 원심분리하여 단핵 구세포를 분리하는 단계; 2) 상기 분리된 단핵구세포를 75% (비중 1.057) 내지 80¾( 비중 1.063)농도의 Lymphoprep, 100% (비중 1.077) 농도의 Lymphoprep 및 100% Histopaque (비중 1.119)의 불연속 밀도구배 (discontinuous density gradients) 원 심분리를 이용하여 정제하는 단계; 및 3) K562 피더 세포 (Feeder cell) 존재 하에， 상기 2)의 정제된 단핵 구세포를 IL-2 10 내지 500 \J/ i 및 IL-15 0.1 내지 100 U/ 를 포함하는 배지에서 10 내지 25일 동안 공조 배양하는 단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)의 분화 및 /또는 증폭방법을 제공한다.

<49> 또한， 본 발명은 1) 개로부터 채취된 혈액을 1.077 내지 1.119 g/ i 비중의 피콜-하이파크 (FicoU-Hypaque)에 중첩하고 원심분리하여 단핵구세포를 분리하는 단계; 2) 상기 분리된 단핵구세포를 76% (비중 1.058) 내지 77% (비중 1.059) 농도의 Lymphoprep, 100% (비중 1.077) 농도의 Lymphoprep 및 100% Histopaque (비중 1.119) 의 불연속 밀도구배 (discontinuous density gradients) 원심분리를 이용하여 정제 하는 단계; 및 3) K562 피더 세포 (Feeder cell) 존재 하에, 상기 2)의 정제된 단핵 구세포를 IL-2 10 내지 500 ]/\\ύ 및 IL-15 0.1 내지 100 U/m를 포함하는 배지에서 10 내지 25일 동안 공조 배양하는 단계:를 포함하는 것을 특징으로 하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)의 분화 및 /또는 증폭방법을 제공한다.

<50> 본 발명에 따른 분화 및 /또는 증폭방법은 상기 1) 단계의 1.077 내지 1.119 g/mi 비중으로 조절된 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) 용액에서의 부유밀도 구배 원심분리 방법을 이용함으로써 단핵구세포를 과립구 (granulocytes)의 오염 없는 고 농도의 전체 살아있는 단핵구세포군을 수득할 수 있다.

<5i> 본 발명에 있어서, 2) 단계는 단핵구세포를 75¾ (비중 1.057) 내지 80% (비중

1.063)농도 농도의 Lymphoprep, 100% (비중 1.077) 농도의 Lymphoprep 및 100% Hi st opaque (비중 1.119)의 불연속 밀도구배 (discontinuous density gradients) 원 심분리를 이용하여 정제할 수 있으며， 보다 바람직하게는 분리된 단핵구세포를 76% (비중 1.058) 내지 77% (비중 1.059) 농도의 Lymphoprep, 100% (비중 1.077) 농도 의 Lymphoprep 및 100% Histopaque (비중 1.119)의 불연속 밀도구배 (discont inuous density gradients) 원심분리를 이용할 수 있다.

<52> 본 발명에 있어서， 상기 불연속 밀도구배에 사용되는 Lymphoprep의 농도는 본 발명의 목적을 달성에 중요한 의미를 가진다. 즉， 사람에서와는 달리 개의 과립 구 특히， 호산구 (eosinophil)의 밀도는 단핵구세포의 밀도와 매우 유사하여 일반적 인 단핵구세포의 분리방법으로 호산구의 오염을 줄이기 매우 어렵다. 뿐만 아니라 개체의 차이는 있지만 개의 말초혈액 내에는 사람에 비해 매우 적은 수의 자연살해 세포가 존재하기 때문에 과립구의 오염이 많을수록 분리된 단핵구세포 내에 존재하 는 자연살해세포의 비율이 작아짐으로써 증폭의 효과를 저하시키는 원인이 된다. <53> 이에， 상기 본 발명에 따른 75% (비중 1.057) 내지 80% (비중 1.063) 농도의

Lymphoprep, 보다 바람직하게는 76% (비중 1.058) 내지 77% (비중 1.059) 농도의 Lymphoprep은 적은 양의 채혈로 호산구의 오염을 현저히 줄이고， 많은 수의 자연살 해세포를 수득에 중요한 의미를 가진다. 만약 Lymphoprep을 75% (비중 1.058) 농도 미만으로 사용하여 단핵구세포를 정제할 경우, 호산구의 오염은 현저히 줄일 수 있 었지만 회수할 수 있는 단핵구세포의 총 개수가 매우 적을 뿐만 아니라 회수된 단 핵구세포 내 림프구의 수가 현저히 감소하고, 단핵세포 (monocytes)의 수가 많아 자 연살해세포의 증폭 효과는 급격히 감소하는 문제점이 있으며, Lymphoprep을 80¾> (비 중 1.063) 농도를 초과하여 사용할 경우에는 호산구의 오염을 줄이기 어려운 문제 점이 있다.

<54> 본 발명에 있어서， 상기 2) 단계 후 정제된 단핵구세포는 1X10⁴내지 1X10⁸ eel ls/well의 농도로 접종되는 것이 좋고， 더욱 바람직하게는 IX K)⁵ 내지 3X10⁷ eel Is/well의 농도가 좋다. 특히, 3X10⁶ cells/well의 농도로 접종한 경우， 배양 후 14일에 약 200배의 증식율을 보이는 것을 실험을 통해 확인하였다.

<55> 본 발명에 따른 분화 및 /또는 증폭방법은 상기 1) 및 2) 단계로부터 분리 정 제된 단핵구세포와 함께 IL-2 10 내지 500 U/ra^ 및 IL-15 0.1 내지 100 U/ ^을 동 시에 처리 배양함으로써 강력한 항암 효과를 갖는 고순도의 자연살해세포를 단기간 에 더욱 폭발적으로 증식시킬 수 있다.

<56> 또한， 본 발명에 따른 분화 및 /또는 증폭방법은 순차적으로 상기 1) 단계 후 ， 상기 2) 단계의 불연속 밀도구배 원심분리에 의해 정제된 단핵구세포를 상기 3) 단계의 조성물 및 배양조건을 이용하여 자연살해세포로 분화 유도시킴으로써 형태， 표현형， 기능적인 면에서 전형적인 개 유래의 자연살해세포로 분화됨을 확인할 수 있었다.

<57> 본 발명에서 사용되는 피더 세포는 유전자가 도입된 동물 세포주 (cell line) 나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포 (PBL), Tcell, B- cell, 또는 단핵구 등을 사용할 수 있으나， 가장 바람직하게는 K562 세포로 자연살 해세포를 순수 자연살해세포만선택적으로 증식하게 할 수 있는 장점이 있다.

<58> 본 발명에 따른 분화 및 /또는 증폭방법은 개의 단핵구세포로부터 자연살해세 포를 선택적으로 증폭시킬 수 있으며， 적은 양의 채혈로 많은 수의 자연살해세포를 수득할 수 있는 장점이 있다.

<59> . 보다 상세하게 상기 방법으로 분화된 개 유래의 자연살해세포에 대하여， 전 형적인 자연살해세포로의 분화가 이루어졌음을 확인하기 위해， 세포 표면의 자연살 해세포 관련 유전자 (服 cell-related gene)의 발현 변화를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다.

<60> 그 결과, 상기 분화 및 /또는 증폭방법에 따른 개 유래의 자연살해세포는

CD16, NKG2D, NKp30, NKp44, 및 Ly49로 이루어진 활성 수용체의 발현이 증가가 되 었고, 상기 활성 수용체가 증가된 자연살해세포를 비교적 단기간에 200배 이상 증 식시킬 수 있으며， 궁극적으로 95% 이상의 고순도의 강력한 항암 효과를 갖는 개 유래의 자연살해세포를 다량 얻을 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

<6i> 보다 상세하게는 정상개의 말초혈액에서 밀도 구배 원심방법 (density gradient centrifugation)을 이용하여 단핵구세포 (PBMCs)를 분리한 다음, 10% FBS 와 IL-2 100 U/ml)와 ILᅳ 15(10 U/ml)가 첨가된 RPMI-1640 media에서 단핵구 세포를 피더 세포 (Feeder cell)와 함께 14일간 공조배양하여 개로부터 유래된 자연살해세 포의 증폭률을 확인한 결과, 최대 200배 이상 증폭됨을 확인하였으며， 14일 후 자 연살해세포의 순도는 최대 9 이상인 것을 확인할 수 있었다. 도 1을 참조한다.

<62> 상기 분화 및 /또는 증폭방법에 따른 개 유래의 자연살해세포는 임상 적용이 가능한, 다량의 활성화된 자연살해세포를 이용하여 종양치료나 종양의 발생원이되 는 것으로 상정되고 있는 바이러스 감염세포의 제거에 유효한 세포치료제를 제조할 수 있다.

【발명의 실시를 위한 형태】 ,

<63> 본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. <64> 그러나， 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐， 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<65> 이때， 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며， 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 블필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

<66>

<67> [실시예 1] 개 유래의 말초혈액으로부터 단핵구세포의 정제

<68> (1) 농도밀도구배 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque)를 이용한 단핵구세포의 분 리

<69> 개의 말초혈액 (perpheral blood)은 공주대학교 특수동물학과의 실험동물사육 시설에서 사육하는 개 중에서 혈액검사와 정기적인 건강검진을 통해 건강하다고 인 정되는 8세의 성견의 경정맥에서 15 내지 30 의 말초혈액을 무균적으로 채혈하였 으며， 채혈된 말초혈액은 헤파린튜브 (heparin tube; BD vacutainer)에 보관하여 2 시간 내에 사용하였다.

<70> (2) 단핵구세포의 정제

<7i> 상기 채취한 말초혈액을 PBS 버퍼 (phosphate-buffered saline buffer)로 1:2 비율로 희석하였다. 또한， 불연속 밀도구배 (discontinuous density gradients) 용 액은 76% 농도의 Lymphoprep (비중 1.058), 77% 농도의 Lymphoprep (비중 1.059)， 용 액은 78% 농도의 Lymphoprep (비중 1.060), 용액은 79% 농도의 Lymphoprep (비중 1.062), 용액은 80% 농도의 Lymphoprep (비중 1.063) 10 각각을 100% 농도의 Lymphoprep (비중 1.077) 5 ι 와 100% 농도의 Histopaque (비중 1.119) 용액 위에 조 심스럽게 을린 후, 상온에서 25분 동안 400 X g로 원심분리 하여 단핵구세포를 정 제한 후, 과립구의 오염 (호산구의 오염) 정도 및 단핵구세포의 수를 조사하여 하기 표 1에 나타내었다. <72> 【표 1】

SG: specific gravity

<73> PB: peripheral blood

<74>

<75> 상기 표 1에서도 확인할 수 있듯이， Lymphoprep을 76% (비중 1.058) 농도 미 만으로 사용하여 단핵구세포를 정제하였을 때， 호산구의 오염은 현저히 줄일 수 있 었지만 회수할 수 있는 단핵구세포의 총 개수가 매우 적을 뿐만 아니라 회수된 단 핵구세포 내 림프구의 수가 현저히 감소하고， 단핵세포 (monocytes)의 수가 많아 자 연살해세포의 증폭 효과는 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었고， Lymphoprep을 80% (비중 1.063) 농도를 초과하여 사용하였을 때， 호산구의 오염도가 높은 것을 확 인할 수 있었다.

<76> 상기의 결과로부터 개의 말초혈액으로부터 분리된 단핵구세포의 정제시에는

Lymphoprep는 76% (비중 1.058) 내지 77% (비중 1.059) 농도를 이용함으로써 적은 양 의 채혈로부터 호산구의 오염을 현저히 줄일 수 있음을 확인한 결과이고， 나아가 실험관 내에서 많은 수의 자연살해세포를 증폭할 수 있음을 확인한 결과이기도 하 다.

<77>

<78> [실시예 2] 개 유래의 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)의 증폭

<79> 상기 실시예 1의 76% 농도의 Lymphoprep (비중 1.058) 10 ml, 100% 농도의

Lymphoprep (비중 1.077) 5 mi 및 100% 농도의 Histopaque (비중 1.119)를 이용한 불 연속 밀도구배 (discontinuous density gradients) 방법으로 정제한 단핵구 세포를 이용하였다.

<80> 24 well plate에 상기 정제한 단핵구세포 (1X1C⁾⁶ cells/well)를 넣은 후，

K562 또는 K562-mbl5-41BBL 세포주 (kindly provided by Dr. Campana, St. Jude Children s Research Hospital, USA) 0.5X10 eel ls/well을 추가하여 37^°C， 5% C0₂ 배양기에서 14일 동안 배양하여， 체외에서 개 유래의 자연살해세포를 증폭시켰 다.

<8i> 상기 배양은 RPMI1640 배지에 10% fetal bovine serum(FBS)을 첨가하고 100

IU/ml human IL-2(PeproTec , USA) 및 10 IU/ml human IL-15(PeproTec, USA)를 첨가 한 배지를 이용하였고. 배양액은 매 2일에 한 번씩 교체하였다.

<82>

<83> [실시예 3] 개 유래의 자연살해세포의 표현형 확인

<84> 상기 실시예 2로부터 증폭된 개 유래의 자연살해세포의 형태적 특징을 확인 하기 위하여， 체외 증폭된 자연살해세포를 May-Grunwald-Giemsa(MGG)염색하여 현미 경으로 관찰하였다.

<85> 그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이， 배양 시작일 (0일)에는 다양한 종류의 세포로 구성된 단핵구세포의 분포가 많았으나 배양 8일째 다수 세포의 세포질에 자 연살해세포 특이적인 퍼포린 (perforin)/그랜자임 (granzyme)을 함유한 단일 종류 세 포의 증폭을 확인할 수 있었으며, 배양 14일째는 대부분의 세포가 세포질에 perforin/granzyme granule들을 함유한 자연살해세포임을 확인할 수 있었다.

<86> 또한, 상기 증폭된 개 유래의 자연살해세포의 표현형 (phenotype)을 확인하기 위하여 세포 표면에 발현된 단백질 인자를 APC, RPE 또는 FTTC가 결합된 단클론 항 체 (mAbs)를 이용하여 유세포 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

<87> 【표 2】

SD: standard deviation

<89> 그 결과 상기 표 2， 도 2 및 도 3에서도 확인할 수 있듯이， 증폭된 개 유래 의 자연살해세포는 대부분 CD5 low positive, CD3 positive, CD4 negative, CD8 positive였으며， 배양 시작일 (0일)의 단핵구세포와 비교하여 CDllc와 CDlld의 발현 이 증가됨을 확인할 수 있었으며， 배양 14일 후 CD21+ 세포는 거의 포함되어 있지 않음을 확인할 수 있었다.

<90>

<91> [실시예 4] 자연살해세포 관련 유전자의 발현 조사

<92> 자연살해세포는 분화되면서 세포 표면에 특정 수용체를 발현시키는데, 이들 수용체를 통해서 NK세포가 분화되는 단계를 확인할 수 있게 된다.

<93> 상기 실시예 2로부터 분리된 배양 시작일 (0일)의 단핵구세포와 체외 증폭된 자연살해세포에서 자연살해세포 관련 유전자 (NK cell-related gene)의 발현에 대한 RT-PCR을 수행하였다. ¹

<94> 개 유래의 자연살해세포에 대한 특이 표지자가 아직 밝혀져 있지 않기 때문 에 공지된 다른 포유동물에서 자연살해세포와 관련된 여러 분자들 (CD56, CD16, NKG2D, NKp30, N _P44, Ly49)에 대한 발현 양상을 확인하였다. 상기 분자들에 대한 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.

<95> 【표 3】

a Gene bank accession number

<96> ^b Positions as counted from the first nucleotide of the canine genes reported.

<97>

<98> 도 3의 A에서도 확인할 수 있듯이， NK세포와 관련된 수용체들에 대한 유전자 즉， CD56, CD16, NKG2D, NKp30, NKp44, Ly49에서의 mRNA발현 양상은 배양 시작일 (0 일)의 단핵구세포와 비교하였을 경우， 14일간 배양하여 체외 증폭된 자연살해세포 에서 CD56을 제외한 모든 유전자들의 발현이 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었 으며 특히， Ly49는 배양 전 단핵구세포에서는 전혀 발현되지 않고 증폭된 자연살해 세포에서만 발현되는 것을 확인할 수 있어， Ly49가 개 유래의 자연살해세포를 구분 하는 특이 표지인자로 사용될 수 있음 역시 확인할 수 있었다.

<99> 또한， 자연살해세포의 세포독성 능력과 관련이 깊은 퍼포린 (perforin)과 그 랜자임 (granzyme) B의 발현 양상을 분석한 결과도 자극하기 전 배양 시작일 (0일)의 단핵구세포와 비교하여 14일간 시험관에서 증폭된 자연살해세포에서 발현이 현저히 증가됨을 확인할 수 있었다.

<ιοο> 반면, 사람의 자연살해세포에 대한 특이 표지인자인 CD56의 경우는 개 자연 살해세포에는 전혀 발현되지 않음을 확인하였고， 상기 사용한 프라이머와 RT-PCR의 결과의 정확성을 재확인하기^' 위하여 개 뇌세포 (positive control)와 개의 간세포 (negative control)에서 CD56에 대한 발현을 동일한 프라이머로 분석하였다.

<ιοι> 그 결과 도 3의 B에서도 확인할 수 있듯이， 뇌세포에서 CD56 발현이 확인되 었고 반면， 간에서는 전혀 발현이 되지 않음을 확인한 바， 상기 분석 결과가 정확 하였음을 확인할 수 있었다.

<102> 상기 결과는 상기 실시예 2의 방법으로 분화된 개 유래의 자연살해세포가 T 세포의 특성을 갖는 것을 확인한 결과로서， 이를 세포가 자연살해 T 세포 (NKT cell)인지를 확인하기 위하여， NKT 세포에만 발현되는 iTCRa의 발현 여부를 RT- PCR로 확인하였다.

<103> 상기 NKT세포는 내재면역의 한 수행원으로서 비교적 근래에 그 기능들이 밝 혀지고 있는 T세포의 한 종류이다.

<104> 그 결과 도 4에서 확인할 수 있듯이， iTCRa를 발현하는 세포는 소수로 대부 분의 증폭된 세포는 NKT세포와 상관이 없는 것을 확인할 수 있었다.

<105>

<106> [실시예 5] 개 유래의 자연살해세포의 IFN-gamma생산 능력 비교

<107> 상기 실시예 2의 체외에서 증폭된 개 유래의 자연살해세포가 효과적으로

TM

IFN-gamma를 생산하는지를 ELISA법 (BD OptEIA SetCanineKit , BD Bioscience)을 통 하여 확인하였다.

<108> 그 결과 도 5에서 확인할 수 있듯이, 단핵구세포와 IL-2로 자극한 림포카인 활성화 세포 (LAC cell)에 비해 현저히 많은 양의 IFN-gamma를 생산하는 것으로 확 인할 수 있었다.

<109>

<ιιο>^' [실시예 6] 개 유래의 자연살해세포의 표적 종양세포에 대한 세포독성 평가

<πι> 상기 실시예 2의 체외에서 증폭된 개 유래의 자연살해세포의 세포살상능을 조사하기 위해， 상기 실시예 2의 체외에서 증폭된 개 유래의 자연살해세포를 세척 후 효과세포 (Effector cell) ： 표적세포 (Target cell) 비을 (20:1， 10:1， 5:1, 2.5:1, 1,25:1)에 따라 표적세포인 ⁵¹Cr-표지된 CTAC 세포 (lx lo wel 1 )와 함께 96 웰 등근 바닥 플레이트 (well round bottom plate, Falcon, USA)에 넣고 37^°C, 5% C02 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후， 상층액을 취하여 감마 -카운 터 ( γ-counter)로 Cr 방출분석 (release assay)을 수행하였다.

<Π2> 상기 표적세포는 canine thyroid adenoc ar c i noma ( CTAC ) 세포，

CF41.Mg(canine mammary gland tumor cell line) 세포， K9TCC—pu—AXC( canine transitional eel 1 carcinoma eel 1 line) 세포를 이용하였다.

<113> [식 1]

(Experirnentarrelease-Spontane us release)

Specific re{ease(%)=—

{maxtimaE release - Spontaneous retease}

<U4>

<115>

<ii6> 배양 4시간 후， 개 NK— sensitive cell인 CTAC 세포에 대한 세포독성을 확인 한 결과， 도 6에서도 확인할 수 있듯이 상기 실시예 2의 체외에서 증폭된 개 유래 의 자연살해세포의 순도에 따라 60 내지 85%의 매우 높은 세포독성을 보였으며， 16 시간 후， 효과세포 ： 표적세포 비율이 20:1 비율일 때 세포독성은 80% 이상의 결과 를 보여 체외에서 증폭된 개 유래의 자연살해세포가 매우 강력한 기능을 갖은 세포 임을 확인할 수 있었다.

<ιΐ7> 또한， 상기 체외에서 증폭된 개 유래의 자연살해세포로 CTAC를 공격시킨 후 세포를 염색하여 현미경으로 관찰한 결과， 도 7에서 확인할 수 있듯이 세포질 내 퍼포린 (perforin)과 그랜자임 (granzyme) B 과립을 함유한 개 유래의 자연살해세포 가표적 종양세포에 붙어 살상효과를 보이고 있음을 확인할 수 있었다.

<Π8> 자연살해세포는 CD8+ cytotoxic T cell(CTL)과 달리 종양의 특이 항원에 대 한 사전 인식 없이 종양세포를 공격하여 사멸시킬 수 있기 때문에 상기 실시예 1의 체외에서 증폭된 개 유래의 자연살해세포가 완전한 자연살해세포임을 확인하기 위 하여 CTAC 세포와 완전히 다른 개 유선종양세포 (CF41-Mg)와 방광이행상피종 (K9TCC-pu-AXC)에 대한 세포독성을 동시에 확인하였다.

<Π9> 그 결과 도 8에서 확인할 수 있듯이， CF41.Mg 세포 및 K9TCC-pu-AXC 세포에 대한 세포독성을 확인한 결과， 도 8에서 확인할 수 있듯이 4시간 후， 효과세포 ： 표적세포 비율이 20:1 비율일 때 세포독성은 CF41.Mg 세포의 경우 73.6±2.3¾ᅳ K9TCC-pu-AXC 세포의 경우 66.6士 2.0%의 세포독성을 나타내었고 반면， 배양시작일 (0일)의 단핵구세포의 경우 0.5 내지 30%의 독성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. <120> 이는 상기 종양에 대한 항원 인식 없이 매우 높은 살상효과를 보임을 통해 실시예 1의 체외에서 증폭된 개 유래의 자연살해세포가 강력한 자연살해세포로서의 특성을 갖가지고 있음을 확인한 결과이다.

<i2i> 상기의 결과로부터 본 발명의 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)의 분화 및 /또는 증폭방법은 그 형태， 표현형 및 기능적인 측면을 볼 때 체외 (In vitro)에서 자연살해세포로 성공적으로 배양할 수 있고， 나이가 임 상단계에서 자연살해세포를 안전하고， 효율적으로 배양할 수 있는 closed system에 도 적용이 가능할 것으로 기대된다.

【산업상 이용가능성】

<122> 본 발명에 따른 개로부터 유래된 자연살해세포를 제공하고， 또한 이의 증식 / 분화용 배지 조성물은 개 유래의 단핵구세포 및 피더 세포와 함께 배지에 첨가하여 추가 배양함으로써 강력한 항암 효과를 갖는 고순도의 자연살해세포를 단기간에 폭 발적으로 증식시킬 수 있는 장점이 있다.

<123> 본 발명은 또한 상기 자연살해세에 따른 자연살해세포 분화 및 /또는 증폭방 법은 개 유래의 자연살해세포의 살해능을 강력히 증가시키면서 최대 증식이 가능한 획기적인 방법이므로， 적은 양의 채혈로 많은 수의 강력한 자연살해세포를 수득할 수 있게 됨으로써 세포 치료제로의 상용화에 크게 기여할 수 있다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 11

IL-2, IL-15또는 이들의 흔합물을 유효성분으로 함유하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell) 증식 및 /또는 분화용 배지 조성물.

【청구항 2]

제 1항에 있어서， 상기 유효성분은 IL-2 10 내지 500 U/i 및 IL-150.1 내 지 100 U/m£를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.

【청구항 3]

1) 개로부터 채취된 혈액을 농도밀도구배에 중첩하고 원심분리하여 단핵구세 포를 분리하는 단계 ;

2) 임의로 상기 분리된 단핵구세포를 정제하는 단계;

3) 피더 세포 (Feeder cell) 존재 하에， 제 1항 또는 제 2항에 따른 배지 조 성물을 상기 2)에서 정제된 단핵구세포 (mononuclear eel Is)와 공조 배양하는 단계 : 를 포함하는 것올 특징으로 하는， 개로부터 유래된 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)의 분화 및 /또는 증폭방법.

【청구항 4】

제 3항에 있어서, 상기 1) 단계의 농도밀도구배가 피콜-하이파크 (Ficoll- Hypaque) 농도밀도구배인 분화 및 /또는 증폭방법.

【청구항 5】

제 4항에 있어서, 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque) 비중은 1.077 내지 1.119 g/n^인 것을 특징으로 하는 분화 및 /또는 증폭방법.

【청구항 6】

제 3항에 있어서, 상기 2) 단계의 정제는 75% (비중 1.057) 내지 80% (비중 1.063)농도의 Lymphoprep, 100¾> (비중 1.077) 농도의 Lymphoprep 및 100% Hi st opaque (비중 1.119)의 불연속 밀도구배 (discontinuous density gradients) 원 심분리를 이용하는 것을 특징으로 하는 분화 및 /또는 증폭방법.

【청구항 7】

제 6항에 있어서， 상기 2) 단계의 정제는 76% (비중 1.058) 내지 77% (비중 1.059) 농도의 Lymphoprep, 100% (비중 1.077) 농도의 Lymphoprep 및 100% Hi st opaque (비중 1.119)의 불연속 밀도구배 (discontinuous density gradients) 원 심분리를 이용하는 것을 특징으로 하는 분화 및 /또는 증폭방법.

【청구항 8】 제 3항에 있어서， 상기 3) 단계는 K562 피더 세포 (Feeder cell) 존재 하에， 상기 2)의 정제된 단핵구세포를 ILᅳ 2 10 내지 500 U/i 및 IL-15 0.1 내지 100 U/ 를 포함하는 배지에서 10 내지 25일 동안 공조 배양하는 것을 특징으로 하는 분 화 및 /또는 증폭방법 .

【청구항 9】

제 3항 내지 제 8항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서， 상기 방법은 CD16, NKG2D, NKp30, N p44, 및 Ly49로 이루어진 활성 수용체의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 분화 및 /또는 증폭방법.

【청구항 10】

제 9항에 있어서， 상기 방법은 자연살해세포는 순도가 95% 이상인 것을 특징 으로 하는 분화 및 /또는 증폭방법 .

【청구항 11】

표현형이 CD5 low positive, CD3 positive, CD4 negative, 또는 CD8 positive, TCRa β negative또는 TCRy δ negative인 개유래의 자연살해세포.

【청구항 12】

단핵구세포와 비교하여 CDllc와 CDlld의 발현이 증가된 개유래의 자연살해세 포.

【청구항 13】

사람의 자연살해세포에 대한 특이 표지인자인 CD56가 발현되지 않은 개유래 의 자연살해세포.

【청구항 14】

Ly49가 발현된 개유래의 자연살해세포.

【청구항 15]

제 11항、내지 제 14항 중 어느 한 항의 개 유래 자연살해세포를 포함하는 개의 암또는 바이러스 질환， 질병 또는 증상의 예방 또는 치료용 조성물.

【청구항 16]

제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 개 유래 자연살해세포를 포함하는 개의 항암 또는 항바이러스용 세포치료제 .

【청구항 17】

제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 개 유래 자연살해세포를 포함하는 개의 항암제 .

【청구항 18】 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 개 유래 자연살해세포를 포함하는 개의 항바이러스제.