CN109453198A

CN109453198A - 移植物抗宿主疾病的治疗或预防方法

Info

Publication number: CN109453198A
Application number: CN201811266179.XA
Authority: CN
Inventors: 道格拉斯·格兰特·麦克法登; 埃里克·卡特·巴提; 克里斯多弗·R·考格
Original assignee: University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2019-03-12
Also published as: EP2717887B1; PT2717887T; JP6513729B2; CA2873713A1; PL2717887T3; JP2017141273A; CA2873713C; US20180064760A1; EP2717887A4; US9730960B2; US20140328804A1; JP2014520115A; US10322149B2; WO2012171007A3; CN104039333B; DK2717887T3; EP2717887A2; ES2663844T3; WO2012171007A2; CN104039333A

Abstract

提供了一种用于治疗或预防接受了移植(包括造血细胞移植)的主体出现移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法。该方法包含在体外令移植物接触有效数量的粘膜瘤病毒，以抑制移植物内T淋巴细胞的增殖或预防受试体移植该移植物后出现移植物抗宿主疾病(GVHD)。在移植物接触粘液瘤病毒后，该方法包含将经过病毒处理的移植物植入到受试体内。

Description

移植物抗宿主疾病的治疗或预防方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年6月9日提交的美国专利申请第61/495,342号的优先权，该美国专利申请在这里被全文引用。

有关联邦赞助开发的声明

本发明是在美国国家卫生研究所(合同号R01 CA138541)和美国国家癌症研究所(合同号R21 CA149869)的支持下开发完成的。因此，美国政府对本发明拥有一定权利。

发明领域

本发明与移植物抗宿主疾病(GVHD)的治疗或预防方法及生物试样内T淋巴细胞增殖的抑制方法有关，例如同种异体细胞的移植。

背景技术

移植物抗宿主疾病(GVHD)是将同种反应性T淋巴细胞移植至免疫功能不健全的患者体内时，可能发生的一种潜在的可致死性临床并发症，具体来说，移植物抗宿主疾病(GVHD)的一个重要组成包括移植物中的成熟供体CD3⁺T淋巴细胞被移植到免疫功能不健全的受体体内。供体T细胞一经被输注至受体体内，就会识别宿主细胞抗原，导致影响肝脏、胃肠道和皮肤(1、2)的免疫级联反应。

目前，移植物抗宿主疾病(GVHD)的治疗和预防方法包括移植后进行常规免疫抑制、低强度预处理及在输注前耗竭或抑制同种反应性供体的T淋巴细胞(2、3)。不过，这些方法的临床效果受多种副作用的限制。例如，常规免疫抑制与增加再次感染病毒及机会性病毒感染的风险有关联，而低强度预处理方案则与复发率增加有关联(3)。目前，耗竭或抑制供体T淋巴细胞是最具前景的移植物抗宿主疾病(GVHD)预防性治疗方法，通过淋巴细胞毒性剂、专用的T淋巴抑制剂及专门针对CD34⁺造血干细胞和祖细胞(HSPC)选择的T细胞耗竭剂等多种方法，可实现该目的。尽管人们已经证实，这些方法可有效地降低移植物抗宿主疾病(GVHD)发病率，但是，它们会降低受体重构免疫系统的速度，增加患者出现致命感染的危险并可能具有限制移植物抗白血病的效果(4、5)。

附图说明

图1：粘液瘤病毒(MYXV)治疗可防止致死性移植物抗宿主疾病(GVHD)。对NSG小鼠进行亚致死量照射，然后移植PBS(阴性对照组，n＝5)、1×10⁷的人体原体骨髓(BM)(n＝36)或使用粘液瘤病毒(MYXV)预处理过的1×10⁷人体原代骨髓(n＝36)，小鼠每两周称重一次，以监测小鼠身体状况(A)，并在移植六周后或小鼠身体状况评分达到2时，将小鼠处死(B)。然后，采用对数秩检验(P＜0.05)法，判断存活率是否存在显著差异。N.S.＝不显著。小鼠尸体解剖后，将各器官取出并使用福尔马林固化，然后切片和标记，以确定是否存在人体CD3⁺淋巴细胞(C)。所示的免疫组织化学图片为在五只小鼠中观测到的具有代表性的结果。

图2：粘液瘤病毒(MYXV)处理可防止供体T淋巴细胞在移植后出现体内扩张，同时使得正常造血干细胞和祖细胞(HSPC)能够成功移植。首先对NSG小鼠进行亚致死量照射，然后移植1×10⁷的全骨髓细胞。移植六周后，取出小鼠骨髓，并通过流式细胞仪分析人体造血细胞植入情况(人体CD45⁺/HLA-A、B、C⁺双阳性细胞)，采用粘液瘤病毒(MYXV)处理后，人体造血细胞的成功植入(A)并未改变动物细胞的比例或是此类植入物在小鼠骨髓(B)中的水平。试验显示，经过照射的小鼠在移植了1×10⁷的CD34耗竭了的骨髓细胞后，可降低整体植入水平，体外粘液瘤病毒(MYXV)处理可显著降低此植入水平(C)。试验显示，经过照射的小鼠在移植1×10⁵CD34⁺选定细胞后，人体细胞植入水平与移植了全骨髓细胞的小鼠中的水平类似。体外粘液瘤病毒(MYXV)处理对植入水平无影响。试验中采用了Student T检验法对显著性进行了判断(P＜0.05)。N.S.＝不显著。首先对NSG小鼠进行亚致死量照射，然后移植5×10⁶的聚蔗糖浓缩外围血单核细胞(PBMC)。小鼠每两周称重一次，以监测小鼠身体状况(E)，并在移植六周后或小鼠身体状况评分达到2后，将小鼠处死(F)。然后，采用对数秩检验(P＜0.05)法，判断存活率是否存在显著差异。

图3：粘液瘤病毒(MYXV)感染了一部分人体原代CD3⁺T淋巴细胞。为了测定粘液瘤病毒(MYXV)是否会感染骨髓细胞中存在的CD3⁺T淋巴细胞，采用了vMYX-GFP对1×10⁶的全骨髓细胞进行了处理，感染复数(MOI)＝10。细胞接触MYXV24小时后，采用了CD3或CD34抗原对细胞进行了标记，然后采用了流式细胞仪测定了各族群中GFP+细胞的水平(A)。为了测定不同骨髓细胞供体之间CD3⁺淋巴细胞感染的不同，共对21份不同的骨髓试样进行了感染处理和分析。GFP+呈显性的CD3⁺细胞所占比例在1％-47％(B)之间。为了测定粘液瘤病毒(MYXV)能否在同种刺激后抑制T淋巴细胞的扩张，采用了经过照射的人体白细胞抗原(HLA)不匹配的饲养层细胞，将通过粘液瘤病毒(MYXV)处理过的骨髓细胞的阴性对照处理细胞培养了10天。经对照组处理过的骨髓细胞在经照射过的饲养层细胞刺激后，显示出活细胞数量显著增加，而经粘液瘤病毒(MYXV)处理过的骨髓细胞未见该显著增加(C)，所示数据为三次独立试验的平均值。

图4：在骨髓赠体之间，对移植物抗宿主疾病(GVHD)的形成情况进行了统一的观察。首先对NSG小鼠进行亚致死量照射，然后移植1×10⁷的来自三个不同供体的骨髓细胞(A)。小鼠每两周称重一次，以监测小鼠身体状况，并在注入六周后或小鼠身体状况评分达到2时，将小鼠处死(B)。然后，采用对数秩检验(P＜0.05)法，判断存活率是否存在显著差异小鼠尸体解剖后，将各器官取出并使用福尔马林固定，然后切片和标记，以确定是否存在人体CD3⁺淋巴细胞(B)。所示的免疫组织化学图片为在五只小鼠中观测到的具有代表性的结果。

图5：注入了CD34⁺细胞或CD34⁺耗竭的骨髓细胞的小鼠出现了不同淋巴细胞谱系的植入。首先对NSG小鼠进行亚致死量照射，然后植入1×10⁷的CD34⁺耗竭骨髓细胞或1×10⁵的CD34⁺选定的造血干细胞和祖细胞(HSPC)。注入六周后将小鼠处死，并通过对提取出的鼠科骨髓细胞和HLA-APC、CD3-PE、CD19-FitC和CD15-PERCP抗原进行共同标记，测定骨髓中是否存在人体细胞谱系。在注入了CD34⁺耗竭骨髓细胞的小鼠体内，人体细胞主要是HLA⁺/CD3⁺/CD15^-/CD19^-细胞(A)，而在注入了CD34+选定细胞的小鼠体内，人体细胞主要是HLA⁺/CD3^-/CD15^-/CD19⁺细胞(B)。

图6：粘液瘤病毒(MYXV)处理可抑制T淋巴细胞的扩张。为了测定粘液瘤病毒(MYXV)能否在同种刺激后抑制T淋巴细胞的扩张，采用经过照射的人体白细胞抗原(HLA)不匹配的饲养层细胞，将通过粘液瘤病毒(MYXV)处理过的骨髓细胞的阴性对照处理细胞培养了10天。采用对照组处理方法处理过的骨髓细胞在经照射过的饲养层细胞刺激后，显示出活细胞数量显著增加，而经粘液瘤病毒(MYXV)处理过的骨髓细胞未见该显著增加(C)。三组独立的骨髓供体均见此效果。

图7：GFP表这粘液瘤病毒选择性地感染正常骨髓细胞中的一部分原代T细胞，但不会感染CD19⁺B细胞或CD34⁺干细胞。

具体描述

本发明的发明人发现，可通过粘液瘤病清除生物试样(如同种异体细胞)中的T淋巴细胞或抑制其扩张，对生物试样进行处理。以这种方式经过粘液瘤病毒处理过的同种异体移植物可有效防止移植物抗宿主疾病(GVHD)。若不采用本发明中所述的粘液瘤病毒处理，移植体内的同种反应性T淋巴细胞可导致受体肝脏、皮肤和肺部等几种重要器官损伤。这种损伤可表现为轻度发炎、肠道粘膜破坏及靶细胞死亡脱落不等。发炎一般会表现为发热、腹部疼痛、恶心、呕吐、腹泻、肠出血和黄疸等症状。

在本发明中，“生物试样”或“试样”是指与其自然环境相分离的生物材料。试样可包含组织试样、生物体液试样(如血液、血浆)或细胞试样，如造血细胞试样，试样可采用当前适用的技术，通过供体、组织库或其他来源获取，然后会被移植到受体宿主中。

在本发明中，“接触”包含令生物试样与粘液瘤病毒相接触的任何方法。

在本发明中，“有效量”是指要达到所需结果，所需的有效剂量或时间。

在本发明中，“移植物抗宿主疾病”或“GVHD”是指移植组织与宿主受体之间发生的病理反应。移植物抗宿主疾病(GVHD)常见于造血干细胞和实体器官移植后。发生移植物抗宿主疾病时，同种反应性T淋巴细胞会将受体组织视为异物。因此，会攻击受体，导致受体发炎或发生有害反应。移植物抗宿主疾病(GVHD)易于攻击上皮组织，尤其是皮肤、肝脏和胃肠道黏膜。鉴于免疫系统参与了大规模的同种免疫反应，因此，移植物抗宿主疾病(GVHD)属于一种深度的免疫系统受损状态。此外，出现移植物抗宿主疾病的患者一般要服用强性免疫抑制剂，使得此类主体更易于受到机会性感染源的侵害。

在本发明中，“移植物”是指按照本发明中所述方法，被移植到受试体中的试样，如造血细胞试样。移植物可为同种异体移植物或自体移植物。

在本发明中，“造血细胞”是指造血系统中各种类型的细胞，其中包括但不仅限于造血干细胞和祖细胞(HSPC)等未分化细胞及巨核细胞、血小板、红细胞、白细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞等分化细胞。

在本发明中，“造血细胞移植”包含和指代血液和骨髓移植、外周血液干细胞移植、供体细胞输注、脐带血移植或多能造血干细胞的其他任何来源途径。

在本发明中，“宿主受试体”或“受试体”是指动物世界中包括人在内的各种受试体，在其中一种实施方案中，受试体指按照本发明中所述方法，正在接受、将要接受或已经接受了移植物的任何哺乳动物。哺乳动物受试体可能包含但不仅限于人类、猴类、马、猪、牛、狗、猫、大鼠及小鼠等，在某一具体实施方法中，采用了本发明中所述的方法，对人类受试者进行了治疗。

在本发明中，“免疫受损”、“免疫受损的受试体”或“免疫受损的个体”是指由于免疫系统无法在最佳状态下工作，而存在罹患感染性疾病风险的个体。在其中一种实施方案中，受试体由于接受了用于治疗其潜在疾病及(或)用于防止移植物排异现象的治疗方案，而出现免疫系统受损。

在本发明中，“抑制T淋巴细胞增殖”是指清除或耗竭受试体生物试样中的T淋巴细胞或抑制生物试样中T淋巴细胞的增殖。

在本发明中，“非致病性病毒”是指对所关注的受试体而言不具致病性的病毒，如粘液瘤病毒。换言之，粘液瘤病毒不会导致受试体患病。

在本发明中，“预防”是指阻止和推迟与移植物抗宿主疾病(GVHD)相关的症状或是降低此类症状的严重性。

在本发明中，“治疗”或“处理”是指为达到有益或期望的结果，包括临床效果，而采取的方法。所谓有益或期望的结果可包含但不仅限于减轻或改善一种或多种症状或状况；缩小疾病(如移植物抗宿主疾病(GVHD))的发病范围、稳定病况、防止疾病发生、防止疾病扩散、延缓或减慢疾病发展速度、延缓或减慢疾病发作速度、改善或减轻病况及可见或不可见地减慢扩散速度(无论是局部还是整体)，“治疗”还可能指延长患者的寿命，以超出放弃治疗时的预期寿命。此外，“治疗”还指抑制疾病的发展，暂时性地减缓疾病的发病速度，在更理想的情况下，治疗还包含永久地阻止疾病的发展。如本领域技术人员所知，若在改善特定病况的同时，治疗方法在被治疗主体上产生的有害效果超过了治疗产生的有益效果，可能会产生有害效果或非理想效果。

在本发明中，“移植体/移植”是指从源体部位移植至受体部位的各种器官或器官组织，或是代指该移植过程。“移植”包括但不仅限于通过输液、局部应用及(或)充填方式，而进行的移植。

在本发明中，提供了一种移植物抗宿主疾病(GVHD)治疗或预防方法，以防止移植了含造血细胞移植物的受试体，出现该疾病或对其进行治疗。该方法包含在体外令移植物接触有效数量的粘液瘤病毒，以抑制移植物内T淋巴细胞的增殖或预防受试体移植该移植物后出现移植物抗宿主疾病(GVHD)。此外，该方法还包含在移植物接触粘液瘤病毒后，将该经过病毒处理的移植物移植到受试体中。移植可包含本领域内的各种通用技术，如同种异体造血细胞移植、供体细胞输液和支持性血液产品输液等。在其中一种实施方案中，采用了输注法作为单倍体相合移植方法。

在本发明中，提供了一种用于抑制T淋巴细胞在生物试样内增殖的方法。该方法包含令生物试样接触有效数量的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴细胞在生物试样中的增殖，在其中一种实施方案中，粘液瘤病毒被用于抑制T淋巴细胞在生物试样或移植物中的增殖。

含有造血细胞的生物试样可通过行业内已知的各种标准方法，从受试体中提取，其中包括但不仅限于活组织检查法和穿刺法，例如，我们可通过穿刺患者(进行或不进行细胞因子动员)，收集造血细胞。通常，该生物试样需在大约35℃至38℃温度下保持30-120分钟，最佳宜保持60分钟，以在确保试样达到稳定状态后，再将痘病毒引入试样。待造血细胞经过本发明中所述的非致病性痘病毒处理后，可采用行内已知技术，将处理好的造血细胞重复输回或注入到患者体内。例如，我们可通过血管内输入的方法重新输入这些细胞，或是直接将其输回患者的系统循环中。

在本发明中，提供了一种细胞族群，该族群由多种经过一定数量的粘液瘤病毒处理过的造血细胞组成。

本发明所使用的粘液瘤病毒可能为任何属于兔痘病毒属的病毒，这些粘液瘤病毒可为野生菌株的粘液瘤病毒，或是经过基因改良的粘液瘤病毒。此类粘液瘤病毒可采用行业内已知的任何方法和配方制备和配制，其中包括已公布的编号为2006/026333的美国专利中所述的方法，本发明通过引用，将该专利纳为本发明申请的整体组成部分。例如，我们可能如下方法制备粘液瘤病毒：首先令培养好的兔子细胞感染所要使用的粘液瘤细胞菌株，直至该病毒开始在所培养的细胞中复制及可通过行内已知的标准方法释放该病毒，以破坏细胞表面，释放和收集病毒颗粒，待病毒收集后，可通过令该病毒感染兔子细胞试样及执行菌班计数试验的方法，确定病毒的滴定量(见Mossman等人于1996年在《病毒学》上发表的论文215：17-30)。值得一提的是，粘液瘤病毒的宿主嗜性高度地限于欧洲兔种，试验显示，该病毒对包括人在内的其他各种脊椎动物均不具有致病性(麦克法登(McFadden)，2005)。该病毒的基因组不具分段性，含有一个单独的线性双链DNA分子，其长度上包含16万个核苷酸，该基因组的G-C含量约为40％，两端具有重复排列的末端冗余序列。

当生物试样与粘液瘤病毒接触时，本领域技术人员可轻松确定要达到期望结果，所需的处理剂量和时间。在其中一种实施方案中，生物试样为同种异体移植物，该试样采用粘液瘤病毒处理了至少一个小时(例如可为三个小时)。此外，还可采用有效数量的粘液瘤病毒处理生物试样，该数量可通过测量试样中的感染复数确定。感染复数是指传染性病原体(如噬菌体或病毒)与感染目标(如细胞)的比例。例如，对于接种了感染性病毒颗粒的一组细胞而言，感染复数(MOI)是指孔内沉积的感染性病毒颗粒的数量除以孔内靶细胞数量，得到的比值。在其中一种实施方案中，在令试样(如同种异体移植物)与粘液瘤病毒相接触时，所采用的感染复数(MOI)值为10。

在其中一种实施方案中，要采用粘液瘤病毒处理的移植物中，可能包含含有多种造血细胞的骨髓细胞或人体外周血液细胞，在其中一种具体实施方案中，该移植物为同种异体移植物。

作为进一步的理解，可结合化疗、放疗或其他抗病毒疗法等治疗方法，对要引入到患者体内的移植物进行体外处理。在其中一种实施方案中，经过粘液瘤病毒处理过年移植物可同其他溶瘤病毒(对于不同肿瘤细胞类型，可能会表现出不同的特异性)一起或先后移植到受试体内。

在本发明中，提供了一种用于治疗受试体癌症的方法。该方法包括令含有多种造血细胞的移植体在体外接触数量有效的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴细胞在生物试样内的增殖。此外，该方法包含在化疗、生物治疗、基因抑制和放疗中至少选择一种方法，对宿主个体进行治疗。然后，按照该方法将经过病毒处理过的移植体植入到受试体内。在其中一种实施方案中，该移植物由骨髓细胞或人体外周血液细胞组成。

可通过本发明中所述方法进行治疗的癌症及(或)癌症细胞的典例包括但不仅限于从患有造血系统恶性肿瘤的患者体中提取出的细胞，例如患有淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、骨髓增长异常综合症、成神经细胞瘤、肉瘤、肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、细胞癌、大肠癌、胰腺癌、脑癌、卵巢癌或胃癌的患者，在其中一种实施方案中，本发明中所述的方法被用于患有恶性血液肿瘤的受试体中。此类恶性血液肿瘤可为白血病、骨髓增生异常综合症、淋巴瘤或骨髓瘤。在一种具体实施方案中，所针对的癌症是一种急性骨髓性白血病(AML)或多发性骨髓瘤(MM)。在其中一种实施方案中，所针对的癌症为难治性疾病，如对治疗无反应或产生耐药性的癌症。

在本文所述的方法中，可能会用到任何适用的放疗、生物治疗、免疫抑制和化疗方法，例如，化疗剂可为任何对癌症细胞或受试者的肿瘤细胞具有溶瘤作用的任何试剂。例如，化疗剂可为但不仅限于蒽环类化合物、烷化剂、烷基磺酸酯、氮丙啶、氮丙啶、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素、含铂类试剂或细胞因子。此类化疗剂宜为已知的能够有效对抗特定类型的癌症或肿瘤细胞的试剂。在其中一种实施方案中，化疗剂可有效治疗造血系统恶性肿瘤，例如此类化疗剂可为塞替派、顺铂系化合物和环磷酰胺。细胞因子包括干扰素、G-CSF、红细胞生成素、GM-CSF、白细胞介素、甲状旁腺激素等类似因子。生物疗法包括利妥昔单抗、贝伐单抗、血管破坏剂、来那度胺及类似物。放射增敏剂包括烟酰胺等类似物

尽管本发明包含对移植物等生物试样进行体外处理，不过，该发明还可被理解为按照申请编号为20090317362的美国公开专利(麦克法登(McFadden)等人申请)中所述方法，在受试体的体内进行粘液瘤病毒治疗，同时，本文通过引用的方法，已将该专利纳为本文的整体组成部分。在体内使用时，可将粘液瘤病毒作为一种成份，配制在药品之中。根据理解，该药品一般可含有浓度为药品可接受水平的盐、缓冲剂、防腐剂及各种相容载体。对于各种输送形式而言，我们还可将粘液瘤病毒配制到生理盐溶液中，该药液还可包含抗癌剂等其他治疗剂。在各种实施方案中，此类药液可包含化疗剂、细胞因子、生物治疗剂和放疗剂。

作为进一步理解，本发明中所述的方法还可用于治疗以致病性及(或)自身反应性T淋巴细胞为特征的非恶性疾病，例如自身免疫失调症。因此，从本发明的另一个层面上说，本发明还提供了一种用于治疗T淋巴细胞介导自身免疫失调症的方法。该方法包括令含有多种造血细胞的移植体在体外接触数量有效的粘液瘤病毒，以抑制T淋巴细胞在生物试样内的增殖。此外，该方法还包含将经过病毒处理过的移植体植入到受试体内。在此方面，本方法还有可能用于清除及(或)抑制可导致自身免疫失调症的致病性、自身反应性T淋巴细胞，如多发性硬化症。

以下各例仅用于描述本发明。但是，本发明的范围应为下面所附权利声明中所定义的范围，以下各例不应被理解为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

下面实施例中采用了以下材料和方法。

正常人体细胞：由Lonza公司提供的新鲜人体骨髓穿刺细胞及外周血液单核细胞。试验时，会按照厂家建议的方式，采用临床Sepax装置(Biosafe公司生产)在Ficoll梯度内对骨髓单核细胞进行富集化处理。

粘液瘤病毒和病毒感染物：通过使用vMyx-GFP培养细胞，完成各种病毒感染处理，vMyx-GFP是具有粘液瘤病毒(MYXV)结构，可从合成病毒早期/后期启动于(21)处，在病毒基因中的基因间位置表达eGFP。通过这种结构，可根据试验细胞内的GFP表达情况，监测病毒复制的早期阶段。在感染复数(MOI)为10的条件下，在温度为37℃及CO₂浓度为5％的加湿舱内，在PBS+10％FBS溶液中，令人体骨髓细胞接触vMyx-GFP3小时。阴性对照组细胞则在PBS+10％FBS的环境中进行培养，该环境中不含病毒，其他条件与上面所述相同。

干细胞移植瘤：在移植物抗宿主疾病(GVHD)研究中，采用了Cs¹³⁷作为辐射源，按照200cGy的亚致死性总辐射剂量，对(NSG)小鼠进行了照射处理。照射后24小时内，通过尾巴静脉为小鼠注入了1×10⁶-10×10⁶的细胞，此类细胞已按照对照组进行了处理或者采用了vMyx-GFP进行了处理或接触了vMyx-GFP。为防止机会性细胞感染，注射后两周内，小鼠通过饮用水摄入了预防性抗生素。移植后周后，小鼠被处以安乐死，并提取了小鼠的骨髓。然后采用流式细胞液(BD FACSCaliber公司生产)，针对人体CD45⁺和HLA-A、B、C⁺细胞，定量测定了人体干细胞植入量，若流式细胞仪确证，骨髓细胞群体中人体CD45⁺/HLA-A、B、C⁺细胞呈双阳性，则将小鼠评定为成功植入。同时，将各骨髓细胞中CD45⁺/HLA-A、B、C⁺细胞的数量，均采用了植入水平予以表示。通过采用HLA-APC、CD3-PE、CD19-FitC、CD15-PERCP抗体对提取的小鼠骨髓进行共同标记，测定了植入细胞的谱系分析值。

免疫组织化学分析：组织验尸后，手术摘取肺、肝、肾、胰腺、皮肤和肠道六种组织，对人体细胞在小鼠外周组织中的渗透情况进行分析。组织被放入10％的福尔马林缓冲液中固化24小时，然后采用了70％的EtOH溶液冲洗24小时。组织处理后，按照5微米的大小，切取了被福尔马林固化且浸有石蜡的组织块，然后将切片置于了带电载片上(FisherScientific公司产品)。通过一系列二甲苯和分级酒精对载片进行了脱石蜡和再水化处理，然后在浓度为3％的过氧化氢/甲醇溶液中，室温下阻断10分钟。此后，在pH6.0的斯特拉缓冲液中，进行25分钟的热介导抗原修复处理。紧接着使用市面上有售的试剂盒(VectorLabs公司产品)，采用普通山羊血清和抗生物素蛋白/生物素阻断。在4℃的温度下，按照1∶100的比例，在切片上涂敷兔子的抗CD 3。接着，采用ABC-Elite试剂组(VectorLaboratories公司产品)完成标记。最后，可通过与DAB(Vector Labs公司产品)反应，观测抗原-抗体复合物，并在盖片前，采用苏木素对载片进行复染标记。

磁场激活细胞分选法，采用Miltenyi Biotec公司生产的CD3⁺(产品目录号130-050-101)和CD34⁺(产品目录号130-046-702)微珠分离试剂盒，按照厂家建议从SEPAX纯化正常骨髓细胞穿刺提取物中，分离出CD3⁺和CD34⁺细胞。然后采用Miltenyi Biotec公司生产的autoMACS专业分离器，按照厂家建议，对细胞进行分离。分离完成后，采用流式细胞仪测定各种分离族群的相对纯度。分离后，采用血球计测定各种细胞的总数目。

淋巴细胞混合反应分析：将1×10⁶的SEPAX纯化nBM细胞分成三份，分别加入到96孔的孔板中。然后，采用Cs¹³⁷作为辐射源，按照1000cGy的剂量对细胞进行辐照，以形成无法进行复制的饲养层细胞。然后，对从第二个HLA-不合供体中取出的SEPAX纯化nBM细胞进行阴性对照组处理或使用粘液瘤病毒(MYXV)予以处理，并将1×10⁶个细胞分三份置入空孔或含有经过照射处理的饲养层细胞的孔中。在指定的时间点，采用市面上有售的MTT分析仪器(Pierce公司产品)，按照厂家建议方式，测定各孔内活细胞的总数量。

统计分析：采用对数秩禾Student T检验法，测定各试验组之间的统计差异，报告值为中数值加上或减去中数值标准误差后，得到的值。若P值小于0.05，则认为存在统计显著性。

如上文所述，移植物抗宿主疾病(GVHD)是将同种T淋巴细胞移植至免疫功能不健全的患者体内时，可能发生的一种潜在的可致死性临床并发症。尽管有一些传统的T细胞耗竭方法，不过，移植物抗宿主疾病(GVHD)仍是同种异体造血细胞移植中遇到的重大难题之一。在下面几个例子中，发明人会展示几种通过在体外采用粘液瘤病毒(MYXV)处理原代人体造血细胞，来预防移植物抗宿主疾病(GVHD)的方法，众所周知，粘液瘤病毒(MYXV)的宿主特异性较窄，仅对欧洲兔种具有该特异性，对小鼠和人类等其他物种不具特异性。本发明的发明者发现，采用粘液瘤病毒(MYXV)处理人体骨髓和外周血液单核细胞等，在免疫受损的小鼠体内，不会抑制人体造血细胞的植入；同时，人体移植物通过体外接触粘液瘤病毒，可通过根除移植物抗宿主疾病，提高人体造血细胞的移植成功率及移植后存活率，各大器官的检查结果显示，该方法能够避免人体T淋巴细胞的增殖，粘液瘤病毒(MYXV)还可通过消除同种反应性T细胞，平息淋巴细胞混合反应，此外值得一提的是，未见免疫系统深度受损的小鼠出现粘液瘤病毒(MYXV)感染现象，以下数据显示，粘液瘤病毒(MYXV)体外病毒治疗是一种简单、有效的移植物抗宿主疾病(GVHD)预防方法，可有效地预防患者在输注可能含有同种反应性淋巴细胞的造血产品(如同种异体造血干细胞和祖细胞HSPC、供体白细胞注入物及输血)后，出现移植物抗宿主疾病(GVHD)症状。

本发明的发明者之前已经证实，粘液瘤病毒(MYXV)这种新型病毒可作为溶瘤剂，在不损伤正常人体组织的同时，治疗多种人体癌症(6-8)。粘液瘤病毒(MYXV)在人体内用作病毒治疗时，具有多个优点。首先，粘液瘤病毒(MYXV)的自然宿舍仅限为兔子，目前尚无任何非兔类物种感染粘液瘤病毒(MYXV)的实例记录，即使是将活性病毒输入人体受试者和免疫受损的小鼠体内，也未见感染情况(9，10)。第二，粘液瘤病毒(MYXV)的溶瘤作用不依赖于特定的细胞表面受体，同时，而是依赖于独特的细胞内途径，如用于允许进入的蛋白激酶。这种特性使得粘液瘤病毒(MYXV)能够有效地键合和清除多种人体癌症。最后，粘液瘤病毒(MYXV)在治疗中使用起来较为简单和便捷，因此，可对于临床用药而言，具有很大的吸引力。

最近，本发明的发明人证实，通过体外处理被急性髓细胞性白细胞(AML)污染的原代人体造血细胞，可在保留正常人体造血干细胞和祖细胞(HSPC)的同时，产生消除白血病克隆的效果(11)。这种有选择性的清除不依赖于任何转基因的表达和任何化疗剂的添加，仅需要使用粘液瘤病毒(MYXV)在体外对移植物试样进行短时间培养，然后将其植入到免疫受损NOD/scid/IL2R(伽玛)(NSG)小鼠体内即可(11)。

在使用粘液瘤病毒(MYXV)作为临床剂清除其他各种人体恶性血液肿瘤污染的HSPC移植物的跟进试验中，发现经过亚致死量辐射的NSG小鼠在注入健康人体(BM)骨髓后，有50-70％小鼠在移植后4-6周内地出现可致死消耗性疾病(图1A和1B)。在经过照射且注入阴性对照物的小鼠中及注入了已确定的癌症细胞系的小鼠中均未见发生此病症，但在注入取自三个独立健康供体的骨髓后，均出现了该病症。Barnes和Loutit在60年代[PMID13517181]最早将此类病症称为是“二次疾病”，此后又被称为是移植物抗宿主疾病(GVHD)。与移植物抗宿主疾病(GVHD)相符，患病小鼠的组织学验尸报告显示，小鼠外周组织出现显著水肿，同时人体CD3⁺T淋巴细胞渗透至小鼠的肝脏、肠道、皮肤、肺、肾和胰腺等多个器官(图1C)(图4)。

但是，出乎意料的是，本发明的发明者发现输注了经过体外粘液瘤病毒(MYXV)处理的健康骨髓的小鼠，大多存活下来，未见患有消耗性疾病的迹象(图1A和1B)。此外，组织学验尸报告显示，小鼠在输注经过粘液瘤病毒(MYXV)处理的骨髓后，几乎未见人体CD3⁺T淋巴细胞渗透至小鼠任何重要器官，这其中包括肝脏、肺、肾和胰腺等器官(图1C和图4)，该数据支持了最新观测结果，即使用粘液瘤病毒(MYXV)体外处理同种异体人体造血细胞移植物可预防移植物抗宿主疾病(GVHD)，并可实现正常人体造血干细胞和祖细胞(HSPC)的有效移植。

原代人体骨髓含有CD3⁺T淋巴细胞和CD34⁺HSPC。为了测定粘液瘤病毒(MYXV)能否通过影响供体T淋巴细胞的扩张预防移植物抗宿主疾病(GVHD)病症的发生或改变造血干细胞的长期移植成功率，我们对原代人体骨髓中的CD3⁺T淋巴细胞或CD34⁺ HSPC进行了免疫磁性富集或耗竭处理。与我们对移植物抗宿主疾病(GVHD)病症的诊断结果一致，异体移植了主动选择的CD3⁺淋巴细胞或CD34⁺耗竭骨髓的小鼠均死于移植物抗宿主疾病(GVHD)，其发病机制与移植了未分化骨髓的小鼠类似。与之相反，小鼠标在移植CD3⁺淋巴细胞耗竭的骨髓或主动选择的CD34⁺HSPC后，未见GVHD病症(表1)。在所有同类试验中，移植了经过粘液瘤病毒(MYXV)预处理的人体造血细胞的NSG小鼠大多成活下来，未见移植物抗宿主疾病(GVHD)病症迹象。

在有了粘液瘤病毒(MYXV)能够预防供体T淋巴细胞同种异体反应性的证据后，我们通过试验检测了体外粘液瘤病毒(MYXV)是否会影响造血干细胞和祖细胞(HSPC)植入物。具体来说，我们采用了异体移植模型，试验中采用了全骨髓、主动选择的CD34⁺HSPC和CD34⁺耗竭的移植物。与之前的观测结果一致(11)，通过使用粘液瘤病毒(MYXV)对人体造血移植物预处理，小鼠在移植六周后，人体造血移植物在小鼠体内比例未见显著变化。对于移植了经过体外处理的全骨髓的小鼠，观测结果显示，人体造血移植物在小鼠骨髓内所占比例有下降趋势。不过，该趋势未能达到统计显著水平(图2B)。对于移植了经过体外处理的CD34+HSPC的小鼠，人体造血移植物所占百分比无显著差异(图2D)，血统分析发现了存在B淋巴细胞扭曲的多向移植物，此为免疫系统受损的小鼠进行异种移植后的常见现象(图5)。移植了CD34⁺耗竭骨髓的小鼠也显示，小鼠在移植6周后，骨髓内存在人体造血细胞移植物。不过，就像我们所预期的，与接受了全骨髓和CD34⁺HSPC的试验相比，CD34⁺耗竭试验组的植入水平要更低(图2C)。血统分析发现了T淋巴细胞出现扭曲的多向移植(图6)。这些数据表明，使用粘液瘤病毒(MYXV)体外处理人体造血移植物，不会在免疫受损的受体内损害人类造血干细胞和祖细胞(HSPC)植入物。

NSG小鼠在异种植入人体骨髓后出现移植物抗宿主疾病(GVHD)的结果，进一步证实了最近一份有关NSGi上鼠异植入人体外周血液单核细胞(PBMC)后出现移植物抗宿主疾病(GVHD)的报告(15)。未动员的外周血液单核细胞(PBMC)移植物含有高水平的CD3⁺T淋巴细胞，并在半合移植试验和供体白细胞输注中，用作T细胞反向添加物。在临床上，输注外周血液单核细胞(PBMC)的目的是产生移植物抗白血病效应(GVL)及提供有于防止感染的免疫能力，不过，同种异体外周血液单核细胞(PBMC)输注可带来高度的移植物抗宿主疾病(GVHD)风险。考虑到我们的试验结果显示，粘液瘤病毒可防止免疫受损的小鼠输注人体骨髓后出现移植物抗宿主疾病(GVHD)，因此，我们下一步试验了粘液瘤病毒能否防止与外周血液单核细胞(PBMC)输注相关的移植物抗宿主疾病(GVHD)。与之前有发表的研究结果一致(15)，移植了人体外周血液单核细胞(PBMC)的NSG小鼠出现显著体重下降(图2E)，并在移植后40天左右，因移植物抗宿主疾病(GVHD)死亡。与之相反，移植了经过粘液瘤病毒(MYXV)体外处理的人体外周血液单核细胞(PBMC)的小鼠大多存活了下来。这些小鼠出现少量但仍具有统计意义的体重减轻，这表明这种病毒治疗方法在此模型中，可能仅能部分减轻根除同种反应性T淋巴细胞。

随着体内试验显示，粘液瘤病毒(MYXV)能够防止骨髓移植后出现移植物抗宿主疾病(GVHD)及减少外周血液单核细胞(PBMC)输注后移植物抗宿主疾病(GVHD)的发病率，我们通过使用粘液瘤病毒(MYXV)处理人类骨髓或令人类骨髓接触粘液瘤病毒(MYXV)(通过合成早期/晚期病毒启动因子表达GFP)，探索了该机制的定义(21)。根据观测，一小部分CD3⁺T淋巴细胞出现GFP表达(即指示出现粘液瘤病毒(MYXV)感染)，但所有CD19⁺B细胞或CD34⁺HSPC均未见GFP表达(图3A和图7)。由于已经证实，粘液瘤病毒(MYXV)治疗效果与其能够在体内防止移植物抗宿主疾病(GVHD)的能力显著一致(图4)，我们很惊奇地发现，用于显示粘液瘤病毒(MYXV)感染迹象的CD3⁺淋巴细胞所占的比例，在不同患者骨髓试样之间，存在显著的差异性(图3B)。为此，试验了粘液瘤病毒(MYXV)治疗能否以单向混合淋巴细胞反应的方式，通过同种抗原刺激，对T淋巴细胞产生更加一致的效应。结果发现，若添加至经过致死量照射的HLA不合人体饲养层细胞，按照阴性对照组处理过的人类骨髓的活细胞数量会出现显著增加。与之相关，经过粘液瘤病毒(MYXV)预处理过的骨髓细胞也可防止这种MLR增殖现象(图3C)。三组独立的患者骨髓试样均见此观测结果(图6)。这些数据表明，对于来自多个原代供体的同种反应性T淋巴细胞而言，粘液瘤病毒(MYXV)都会抑制此类细胞的扩张，即使在这些试样中，CD3⁺淋巴细胞的粘液瘤病毒(MYXV)感染率看起来存在高度的可变性。

此前，人们已经验证，粘液瘤病毒(MYXV)治疗能够在保留正常人体HSPC的同时，防止原代人体AML干细胞和祖细胞植入(11)。这些数据表明，粘液瘤病毒(MYXV)有一种全新的用途，具有在同种异体造血细胞输注(如异基因造血干细胞移植)、外周血液单核细胞(PBMC)输注和支持性血液产品输入后，予以使用潜力。用于证实粘液瘤病毒治疗能够预防移植物抗宿主疾病(GVHD)的这些数据是有关此类治疗策略的首例报告，其利用了完整复制的溶瘤性病毒来防止一种自身性免疫疾病的发展。值得的一提的是，将同种反应性T淋巴细胞从异基因造血干细胞移植试样中清除，这一过程与从自体造血细胞移植物中清除癌细胞大体类似。这两种流程都是基于清除剂(粘液瘤病毒)能够区分污染细胞(自体移植物中的癌细胞或同种异体移植物中的供体T淋巴细胞)和功能务必保留的干细胞(这里指造血干细胞)的能力。目前，人们正在对多种能够用作溶瘤剂的病毒进行研究，并开发了多种方法以区分不同的细胞类型。本文所示的数据表明，某些溶瘤性病毒(如粘液瘤病毒(MYXV))的潜在治疗用途可扩展至非恶性疾病的治疗，例如T淋巴细胞或B淋巴细胞介导的自身免疫失调。为了改进用于治疗造血系统恶性肿瘤的异基因造血干细胞移植(allo HCT)疗法，此前已尝试了多种淋巴细胞清除方法，其中包括阳性或阴性细胞分离及采用特定的溶瘤剂进行处理的方法。不过，这些方法会延缓免疫系统恢复可为患者带来高度的致命性感染的风险及移植失败风险(4，5)。本文数据显示，粘液瘤病毒(MYXV)治疗看起来对正常HSPC移植无不良影响，由于部分同种反应性CD3⁺淋巴细胞的感染，还可有选择性地传输功能性淋巴细胞子集，以能够在患者体内立即实现抗感染和抗癌的效果。此外，粘液瘤病毒(MYXV)治疗仅需在移植物输注前，添加一个快速的病毒吸收步骤，该过程可在当前已有的GTP(良好组织规范)临床条件下完成(11)。因此，要将粘液瘤病毒(MYXV)的移植物抗宿主疾病(GVHD)预防和治疗效果转化为临床应用，无需对现有的异基因造血干细胞移植、外周血液单核细胞(PBMC)输注和输注护理标准做显著调整。

尽管我们不希望被理论所束缚，不过，我们认为粘液瘤病毒(MYXV)能够从其他T淋巴细胞子集和造血干细胞和祖细胞(HSPC)中，区分同体反应性T淋巴细胞的机制及粘液瘤病毒(MYXV)在人体造血细胞移植中所具有的安全性，可能是基于粘液瘤病毒(MYXV)无法与正常的人体CD34⁺HSPC相结合。由于痘细胞结合对于大部分的哺乳动物细胞而盲具有极为广泛的特性(18)，这表明粘液瘤病毒(MYXV)可能是一种有效的治疗剂，能够从功能上包括供体T淋巴细胞在内的多种非干细胞类细胞从造血移植物中清除，及清除多种造血系统恶性肿瘤中的污染性癌细胞。有趣的是，在当前研究中，我们发现尽管仅少量CD3+T淋巴细胞被粘液瘤病毒(MYXV)感染，但这种病毒在每一例异体移植中，都能够完全地根除移植物抗宿主疾病(GVHD)。通过这种具有选择性的感染，粘液瘤病毒(MYXV)能够在抑制移植物抗宿主疾病(GVHD)同时，有选择性地将部分功能性T淋巴细胞传输给异基因造血干细胞移植受体(alloHCT)，因此，可提供有益的防菌和抗癌免疫(19)。考虑到粘液瘤病毒(MYXV)仅通过结合而不需要感染癌症细胞来促发溶瘤活动(20)，因此，粘液瘤病毒(MYXV)还可通过简单地抑制特定的CD3⁺淋巴细胞子集出现移植性扩张来防止移植物抗宿主疾病(GVHD)，而不会出现全面产毒性病毒感染。在任何情况下，在输注同种异体造血细胞前，使用粘液瘤病毒(MYXV)进行体外病毒治疗不仅具有防止移植物抗宿主疾病(GVHD)发病和降低出现重症风险的潜力，还为人体白细胞抗原(HLA)不合度更大的同种异体移植提供了空间，例如，来自不匹配的无关供体和单倍同一性供体的移植物，因此，可为更多患者提供接受异基因造血干细胞移植的机会。

尽管本文已经介绍和描述了本发明的多种实施方案，不过，所述的这些实施方案仅用举例说明。我们可对所述方案进行多种变化、改变和替代，而均不会背离本申请所述的发明。相应的，所述权利声明项意图是仅在精神和范围上限制本发明的范围。

参考资料

1.S.W.Choi，J.E.Levine，J.L.Ferrara，Immunol Allergy Clin North Am 30，75(Feb).

2.B.R.Blazar，R.Korngold，D.A.Vallera，Immunol Rev 157，79(Jun，1997).

3.S.Paczesny，S.W.Choi，J.L.Ferrara，Curr Opin Hematol 16，427(Nov，2009).

4.P.J.Martin et al.，Bone Marrow Transplant 3，445(Sep，1988).

5.M.Delain et al.，Leuk Lymphoma 11，359(Nov，1993).

6.M.M.Stanford et al.，Mol Ther 16，52(Jan，2008).

7.Y.Woo et al.，Ann Surg Oncol 15，2329(Aug，2008).

8.X.Q.Lun et al.，Cancer Res 67，8818(Sep 15，2007).

9.F.Fenner，F.N.Ratcliffe，Myxomatosis.(Cambridge University Press，Cambridge，UK，1965).

10.M.M.Stanford，G.McFadden，Expert Opin Biol Ther 7，1415(Sep，2007).

11.M.Kim et al.，Leukemia 23，2313(Dec，2009).

12.A.Gratwohl et al.，Bone Marrow Transplant 41，687(Apr，2008).

13.D.Gallardo et al.，Haematologica 94，1282(Sep，2009).

14.J.Tanaka，Rinsho Ketsueki 43，442(Jun，2002).

15.R.Ito et al.，Transplantation 87，1654(Jun 15，2009).

16.R.K.Burt et al.，J Autoimmun 30，116(May，2008).

17.C.Annaloro，F.Onida，G.Lambertenghi Deliliers，Expert Rev Hematol 2，699(Dec，2009).

18.B.Moss，in Fields Virology，D.M.K.a.P.M.Howley，Ed.(Lippincott，Williams&Wilkins，New York 2007)，vol.2，pp.p.2849-2855.

19.J.W.Hiemenz，Semin Hematol 46，289(Jul，2009).

20.G.Madlambayan et al.，Cancer Res Submitted，(2011).

21.J.B.Johnston et al.，J Virol 77，5877(May，2003).

应当理解的是，为了确保更加全面地描述与本发明相关的当前发展水平，本申请所引用的各种专利、专利申请书、专利出版物、技术出版物、科学出版物及其他参考文件，均应视为本文的组成部分。

本文中所指出的特定缓冲液、介质、试剂、细胞、培养条件等等及其此类材料的细分材料，均非用于限制目的，在阅读时，应将其视为包含专业人员在特定讨论环境中，能够意识到的其他有兴趣或重要的所有此类材料。例如，一般缓冲液系统或培养介质都多种选择，可以相互替代，因此，专业人员可通过其他已知方法，达到与本文所述方法、材料或成份所能达到的相同目标。

对本发明的理解应着重注意，本发明中所采用的所有技术和科学术语，除非特别定义，其含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。除非特别说明，本发明中所使用的技术与本领域的技术人员所知晓的技术相同。同时为了更加清楚地帮助理解本发明揭示的内容和权利要求而提供下列定义。

虽然本发明内容中显示和描述了数个实施例，但该些实施例仅作为示范例，并不具有限制性。在不实质性地偏离本发明为基础上，本领域的技术人员可以进行多种变异、变化和替代。例如，本发明无需局限于所揭示的最佳方式，因为其他申请可以从本发明所教授的内容同等获益。同样，在权利要求中，“方法+功能”和“步骤+功能”的权利要求形式旨在于分别涵盖为实施所述功能而在本发明中进行描述的结构和行为，并且不仅指结构的等同物或行为的等同物，而且分别指等同的结构或等同的行为。据此，根据对相关法律的理解，所有这样的调整均应包括在本发明在权利要求中所限定的范围内。

表1

Claims

1.一种用于治疗或预防T淋巴细胞介导自身免疫失调的移植物，包含造血细胞，并且在体外被用有效数量的粘液瘤病毒处理，以抑制自身反应性T淋巴细胞在移植物内的增殖。

2.如权利要求1所述的移植物，其中所述移植物包含骨髓。

3.如权利要求1所述的移植物，其中所述移植物包含人体外周血液细胞。

4.如权利要求1所述的移植物，其中所述移植物包含数量减少的T淋巴细胞。

5.一种在体外用来抑制CD3+T淋巴细胞在人体生物试样内增殖的方法，包括将人体生物试样接触有效数量的粘液瘤病毒，以抑制CD3+T淋巴细胞在所述人体生物试样内的增殖。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述CD3+T淋巴细胞是同种异体或自身反应性的。