CN110484504B - 一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群，其为CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群。本发明还提供了上述细胞亚群的制备方法，先利用特异性标记物标记肿瘤组织中的T细胞亚群，然后经流式分选CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群，再进行体外扩增培养，获得用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群。本发明的细胞亚群具有更强的肿瘤杀伤效果、抗凋亡能力和增殖能力，能够在体内长期存活，旨在为肝癌的免疫治疗尤其是肿瘤浸润的T细胞免疫疗法提供有效候选细胞群，并为其他肿瘤的治疗提供新思路。

Description

一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备 方法

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及一种免疫细胞，具体来说是一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群及其制备方法。

背景技术

免疫疗法是指通过激活免疫系统来治疗疾病。在肿瘤治疗中，CAR-T疗法是使用较为广泛的免疫疗法。传统CAR-T疗法通过嵌合抗原受体改造PBMC细胞，提高T细胞对目的细胞的识别能力，经过体外大量扩增CAR-T细胞后回输到病人体内。此方法在实体肿瘤和血液肿瘤治疗中都取得过显著的疗效，但是治疗效果受个体差异影响大，仅在部分患者人群中有明显效果，整体治疗响应率不高。其原因主要有两点：若CAR-T的肿瘤特异性识别能力不高，容易发生脱靶效应；另外，第一代CAR-T方法改造的T细胞在回输到体内后，增殖和生存能力减弱，导致T细胞凋亡。随后的第二代CAR-T增加了共刺激信号，如CD28、4-1BB等，旨在增强T细胞分泌细胞因子、抗凋亡和增殖的能力。但目前为止，如何增强并保持T细胞的上述功能依然是CAR-T治疗的重点问题。

除了PBMC细胞，肿瘤浸润的淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL)也是免疫治疗的研究热点。近年来，许多研究证明，肿瘤组织周围特异性的TIL的存在和病人良好的预后相关。目前的TIL治疗步骤包括了分离，筛选，扩增，回输4个阶段，从病人肿瘤组织中提取出的淋巴细胞加入高浓度的IL-2进行培养，筛选肿瘤特异性TIL，再进行扩增，大大提高了TIL治疗肿瘤疾病的有效性。TIL治疗方法也存在局限性：第一，TIL制备技术复杂，需要进行大量筛选；第二，目前的TIL治疗方法采用的是效应T细胞(effector T cell),细胞寿命短，在体内无法维持长期生存。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于免疫治疗的细胞及其制备方法，所述的这种用于免疫治疗的细胞及其制备方法要解决现有技术中采用免疫技术治疗肿瘤疾病的效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群，其为 CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群。

本发明还提供了上述用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群的制备方法，先利用特异性标记物标记肿瘤组织中的T细胞亚群，经流式分选CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群，再进行体外扩增培养，获得用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群。

进一步的，所述特异性标志物为CD137、CD3、CD8和CD45RO。

本发明还提供了CD8⁺T细胞的CD137作为原发性肝细胞肝癌肿瘤反应性T细胞标记物的用途。

本发明先利用特异性标记物标记肿瘤组织中的T细胞亚群，所述特异性标志物包括 CD137(TNFRSF9/4-1BB)，CD3,CD8,CD45RO，然后经流式分选CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群，并进行体外扩增，作为肿瘤浸润的T细胞免疫疗法的新方案。

本发明的用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群具有更强的肿瘤杀伤效果、抗凋亡能力和增殖能力，能够在体内长期存活，旨在为肝癌的免疫治疗尤其是肿瘤浸润的T细胞免疫疗法提供有效候选细胞群，并为其他肿瘤的治疗提供新思路。同时肿瘤组织中CD8⁺T细胞 CD137表达可作为HCC患者原发性肝细胞肝癌肿瘤反应性T细胞标记物，临床中可通过流式检测或者病理染色进行评估并指导预后。

本发明和已有技术相比，其具有如下的优点：

1)相对于其他肿瘤浸润的耗竭性T细胞，CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺细胞群的肿瘤杀伤性能更强；

2)相对于其他肿瘤浸润的耗竭性T细胞，CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺细胞群的增殖和抗凋亡能力更强；

3)相对于传统的PBMC改造扩增的CAR-T细胞，CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞能够更好地特异性靶标癌细胞，效果更好。

附图说明

图1显示了肿瘤、腹水、外周血PBMC中CD137⁺细胞的比例，(A)代表性流式图，肿瘤、腹水、外周血PBMC中CD3⁺CD137⁺的比例；(B)统计分析结果，比较肿瘤、腹水、外周血PBMC中CD137⁺细胞的比例；(C)比较肿瘤、腹水中CD3⁺CD137⁺，CD8⁺CD137⁺，CD4⁺CD137⁺的比例。数据提示肿瘤内天然富集了一群CD137⁺T细胞。

图2显示了肿瘤组织中CD137⁺和CD137^-两群细胞的CD27,IFNγ，T-bet，IRF4，Blimp，NFAT1,Bcl2和Ki67的表达量检测，其中左边图为CD137^-，右边图为CD137⁺。

图3显示了CD137-CART剂量依赖性抑制肿瘤进展。(对照组为PBS组，其它为5x10⁵，1x10⁶，2x10⁶细胞级别)

具体实施方式

实施例1

CD8⁺T细胞是抗肿瘤免疫反应中的关键细胞，能够分泌细胞因子如干扰素γ(IFN-γ)，攻击表面上具有主要组织相容性I类复合物(MHCI)的肿瘤细胞。浸润在肿瘤微环境中的CD8⁺T细胞易受到抑制因素的影响，最终造成功能耗竭及肿瘤的免疫逃逸。2016年Speiser等人提出，肿瘤中的耗竭性T细胞是存在异质性的。找到其中功能具有可塑性的T细胞将对免疫治疗很有帮助。

我们将从原发性肝细胞肝癌(HCC)病人肿瘤中分离的CD3⁺CD45RO⁺细胞进行单细胞测序，发现肿瘤病人的CD8⁺T细胞大部分为耗竭状态。

实验操作流程：将HCC病人的肿瘤组织和癌旁组织剪碎、研磨，70μM滤网过滤，经红细胞裂解液处理后，得到单细胞悬液。细胞重悬在1％胎牛血清的PBS溶液中，按抗体：体系＝1：200的体积比，加入anti-CD3和anti-CD45RO抗体，4℃标记30分钟。随后用PBS 清洗细胞，并用PBS重悬细胞，按照染料：体系＝0.35：1000的体积比加入活细胞染料 Calcein AM，室温孵育15分钟，用1％胎牛血清的PBS溶液清洗细胞并重悬，经流式过滤管过滤，进行流式分选，目的细胞为活性良好的CD3⁺CD45RO⁺细胞。分选过程按照说明书指示操作。收集的细胞经镜检，活性率≥90％，即可上机进行10XGenomics单细胞检测。另外将 HCC病人的外周血提取外周血单核细胞，以及肿瘤组织和癌旁组织剪碎、研磨，70μM滤网过滤，经红细胞裂解液处理后，得到单细胞悬液。细胞重悬在1％胎牛血清的PBS溶液中，按抗体：体系＝1：200的体积比，加入anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8、anti-CD137抗体， 4℃标记30分钟。随后用PBS清洗细胞，并用1％胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，进行流式检测(附图1)。

分析发现肿瘤组织的耗竭性CD8⁺T细胞可分为CD137阳性和阴性表达两个亚群，这两群细胞的免疫应答相关基因表达存在大量差异，CD137阳性表达的T细胞群的IFNγ，CD27， HLA等基因的表达增强，表明其效应增强，而CD137阴性表达群的效应相对较弱。

随后，在蛋白水平上对肿瘤中CD137^+/-两群CD8⁺T细胞进行验证，包括CD27,IFNγ，T- bet，IRF4，Blimp，NFAT1,Bcl2和Ki67的表达量检测。其中：CD27即肿瘤坏死因子超家族成员，是T细胞早期活化的标志；IFNγ即干扰素，由活化的T细胞产生，具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性；T-bet是T-box基因家族的新型转录因子，在抗肿瘤免疫应答中具有重要的调节作用；IRF4是指干扰素调节因子4，参与T细胞的分化；Blimp-1，B淋巴细胞诱导成熟蛋白，一种转录因子，能够维持T细胞的稳态及功能；NFAT1，活化T细胞核因子，调节T细胞的活化，在机体免疫应答中诱导细胞因子及其他基因的转录；Bcl2是 B淋巴细胞瘤-2基因，能够抑制细胞凋亡；Ki67在细胞分裂的各个周期表达，细胞结束分裂后不表达，用于判断细胞增殖能力。

结果说明，CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群的生存增殖能力、杀伤性明显较高(附图 2)。

实验操作流程：1)将肝癌患者肿瘤组织的单细胞悬液培养在T细胞培养基中，加入100U/ml IL-2,需标记IFNγ的组按1：2000体积比加入cell activation cocktail，培养5h，收集细胞，离心清洗；2)将细胞重悬在含1％胎牛血清的PBS溶液中，标记表面抗体CD137，CD3,CD8,CD45RO,CD27，按照1：200的体积比加入抗体，4℃标记30min；3)清洗细胞，加入fixation buffer固定细胞15min，Intracellular staining perm wash buffer清洗细胞两次，将细胞重悬在Intracellular staining perm wash buffer中；4) 加入胞内抗体，IFNγ，T-bet，IRF4，Blimp，NFAT1，Bcl2，Ki67。Bcl2按照1：100比例加入，Ki67按照1：200比例加入，4℃标记2h，其他抗体1：200比例加入，4℃标记 30min；5)Intracellularstaining perm wash buffer清洗细胞，重悬在含1％胎牛血清的 PBS溶液中，加入Bcl2和Ki67抗体的荧光二抗，4℃标记30min；6)含1％胎牛血清的PBS 溶液清洗并重悬，流式上机检测。

检测过程按照说明书指示操作，检测结果通过flowjo7.6.1软件分析，分析 CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺CD137⁺和CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺CD137^-两群细胞的上述marker表达情况。

综上，将CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群视为效应性强，不易凋亡，增殖功能强的一群肿瘤特异性CD8⁺T细胞，在CAR-T疗法中具有极高的应用价值。

实施例2

1)将手术切除的HCC肿瘤组织处理成单细胞悬液。用无菌的手术剪将组织块剪切成浆状，加入20ml浓度为1mg/ml的IV型胶原酶，置于37℃恒温摇床消化45分钟。随后取出，用40um的滤网过滤消化产物至50ml离心管，滤液置于离心机中1100rpm离心10分钟。随后去掉上清液，加入2ml红细胞裂解液(含150mMNH₄Cl，10mMKHCO₃,

100uMEDTA)，室温下裂解5分钟，加入10％FBS的RPMI1640培养基至10ml，1100rpm离心 10分钟。弃掉上清，加入10ml生理盐水，1100rpm离心10分钟，弃掉上清。

2)进行流式抗体标记。

几种待测标志物的标记方法如下：

a)在1％FBS的PBS溶液中以1：200比例加入表面流式抗体PerCP/cy5.5-CD3,APC/Cy7- CD8,APC-CD45RO,CD137混匀后将细胞重悬，体积500ul。随后置于4℃标记30分钟；

b)用1％FBS-PBS清洗细胞，1500rpm，离心5min，弃上清；

c)500ul的1％FBS-PBS重悬细胞，以1：200比例加入PE-anti CD137,4℃标记30分钟；

d)用PBS清洗细胞，1500rpm，离心5min，弃上清；

e)以0.35ul/ml比例在PBS中加入活细胞染料Calcein AM，用500ul重悬细胞，室温避光标记15min；

f)用1％FBS-PBS清洗细胞，1500rpm，离心5min，弃上清；

g)用1ml的1％FBS-PBS重悬细胞；

h)流式分选活细胞染色阳性的CD137^highCD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞群。high代表高表达，+代表阳性表达。

实施例3 CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T淋巴细胞亚群的制备方法

将实施例2流式分选得到的细胞群进行体外培养，扩增肿瘤特异性的TIL，用于HCC的免疫治疗。扩增方法如下所述。

初步培养(酶促肿瘤消化液和机械研磨产生的肿瘤碎片(1-8mm³))：

1.将肿瘤置于酶消化液(RPMI 1640,2mM谷氨酰胺，10mg/mL庆大霉素，30U/mLDNase, 1.0mg/mL胶原酶)中后，立即机械分离约1分钟；

2.将溶液在37℃的体积百分比为5％二氧化碳中孵育30分钟，然后再次机械分离1分钟；

3.再次以37℃的浓度在体积百分比为5％的二氧化碳中孵育30分钟后，第三次机械干扰肿瘤1分钟；

4.如果在第三次机械破坏后，仍有大块组织，则对样本进行1或2次额外的机械分离，视情况是否再孵育30分钟；

5.在最后孵育结束时，如果细胞悬液中含有大量的红细胞或死亡细胞，则使用Ficoll进行密度梯度分离以去除这些细胞；

6.使用40mL容量G-REX10的透气瓶，需要5-10×10^6个肿瘤细胞，加10-40ml含IL-2 的CM。

G-Rex10在体积百分比为5％CO₂的37℃加湿培养箱中培养；

CM:RPMI 1640加谷氨酰胺，10％人AB血清，25mM Hepes,10mg/mL庆大霉素；

7.培养开始后5天，取出一半培养基，用新鲜CM和IL-2换液，第5天后，每隔2-3天更换一半培养基，培养1-4周。

第二阶段：

8.肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)的第二阶段扩增使用Rex100进行。将5×10^6细胞与辐照同种异体PBMC以1：100比例培养在400ml的50/50培养基中,加入3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗cd3。37℃，5％CO₂中孵育；

50/50培养基：一半是CM，另一半是AIM-V培养基；

9.第5天，取上清250mL，放入离心管中，1500rpm(491g)离心10分钟。TIL颗粒用150mL含3000IU/mL IL-2的新鲜50/50培养基分散，添加回原来的G-Rex100瓶再培养两天；

10.第七天将细胞吹打开，300ml液体分成3份传代，加到3个REX100瓶中，每瓶再加150mlAIM-V,含5％人AB血清和3000IU/ml IL-2；

11.一传三，在瓶中加入150mL AIM-V,5％的人AB血清和3000IU/mL的IL-2；

12.培养4天后，加150ml AIM-V,含3000IU/ml IL-2；

13.再培养3天收获细胞，即为CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群。

实施例4动物实验

体外培养H226肿瘤细胞系(购自中科院细胞库)，给予6-8周NOD SCID小鼠每只小鼠皮下注射5x10⁶数量的H226细胞(100ul PBS重悬)；游标卡尺每周测量3次，肿瘤大小计算公式为(长×宽×深)/2。

结束造模时间点：肿瘤＞20mm³即为造模成功。给予成功造模的小鼠瘤内注射CD137- CART(5x10⁵，1x10⁶，2x10⁶)细胞(实施例3获得的CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T淋巴细胞亚群)治疗,并以PBS注射作为对照组，观察两组肿瘤动态变化。观察时间为3个月，1个月的时候开始测量，每周一次测量肿瘤大小，描绘肿瘤生长曲线。

如图3所示，疗效观察：CD137-CART剂量依赖性抑制肿瘤进展。(对照组为PBS组，其它为5x10⁵，1x10⁶，2x10⁶细胞级别) 。

Claims (3)

1.一种用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群在制备治疗原发性肝细胞肝癌肿瘤的药物中的用途，其特征在于：其为CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：先利用特异性标记物标记肿瘤组织中的T细胞亚群，然后经流式分选CD137⁺CD3⁺CD8⁺CD45RO⁺T细胞亚群，再进行体外扩增培养，获得用于免疫治疗原发性肝细胞肝癌的细胞亚群。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述特异性标记物为CD137、CD3、CD8和CD45RO。

Images