CN111337681A - 评估肝细胞癌预后的标志物、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种评估肝细胞癌预后的标志物、试剂盒及方法。评估肝细胞癌预后的标志物为肿瘤组织与非肿瘤组织之间的交界组织的DPT细胞。评估肝细胞癌预后的试剂盒含有DPT细胞的检测相关试剂。评估肝细胞癌预后的方法包括以下步骤：1)获取HCC患者肿瘤组织与非肿瘤组织之间的交界组织；2)检测出所述交界组织中所有CD4和CD8阳性T细胞并计算DPT细胞在其中的占比；3)将步骤2)得到的结果与设定的占比临界值进行对比，对比结果用于评估患者的预后情况。DPT细胞的占比越高，评估患者的预后情况越好，预测生存期和无复发生存期越长。

Description

评估肝细胞癌预后的标志物、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及评估预后的标志物、试剂盒及方法。
背景技术
癌症是全球最致命的疾病之一。近年来，免疫治疗被认为是一种非常有前途的癌症治疗策略，其重点是重新激活癌细胞诱导的免疫抑制环境并改善抗肿瘤免疫反应。但是，免疫疗法仍然面临许多挑战。
肿瘤中免疫微环境的空间异质性是癌症免疫治疗的主要挑战，并引起了广泛关注。免疫微环境在不同癌症中具有高度异质性，在不同个体中具有高度多样性。对于肿瘤免疫异质性的探索，加速了促肿瘤和抗肿瘤免疫特征的鉴定。对各种肿瘤的组织病理学分析已经证实，浸润的免疫细胞的分布在肿瘤及其周围非肿瘤区域显示出很大的差异。肿瘤细胞与相邻基质细胞之间的互作已被确定为肿瘤进展的重要驱动力。基质诱导的炎症和血管生成已被证明具有促进肿瘤的作用。然而，尚未有报道很好地描述了交界区域特征性的免疫微环境，即从肿瘤核心到相邻非肿瘤组织的过渡区域。
肝细胞癌(HCC)是肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝癌的90％，是全世界癌症相关死亡率的第三大常见原因。由于致癌过程中表观遗传学改变、病毒感染、酒精摄入和代谢紊乱的共同作用，HCC被认为是高度异质性的。与非肿瘤组织相比，HCC微环境表现出更为复杂和免疫抑制的表型，可诱导肿瘤逃逸并促进疾病进展。但是，免疫微环境从激活状态转变为抑制状态的过渡过程仍然不清楚。
DPT细胞，即CD4/CD8双阳性T细胞，现有研究认为DPT细胞是CD4和CD8单阳性T(SPT)细胞亚群的前体，一般认为在胸腺中，未成熟的DPT细胞经阳性选择和阴性选择发育成成熟的CD4+T或者CD8+T细胞，然后分泌到外周血中发挥效应功能。基于这种经典的免疫学理论，通常认为DPT细胞主要存在于胸腺组织中，外周血中也存在着少量的DPT细胞，但其功能并不十分清楚。
任广旭在《乙型肝炎病毒感染者外周CD4/CD8双阳性T(DPT)细胞的研究》中阐明，人类乙型肝炎病毒(HBV)感染显著上调外周血DPT细胞的比例，与单阳性T细胞相比，外周DPT细胞能分泌更强的效应细胞因子，提示DPT细胞可能是一种重要的T细胞亚群参与宿主针对HBV的免疫应答。
尽管血液和外周淋巴组织中的DPT细胞已被广泛研究，国外还有一些研究报道了成熟的DPT细胞会在某些疾病条件下(例如黑色素瘤和淋巴瘤)出现，但对其来源和潜在的生物学功能目前知之甚少，肿瘤相关的DPT细胞的分子特征和细胞功能的研究也很少。
发明内容
为了进一步探讨DPT细胞的潜在作用，本发明人系统性地研究了DPT细胞在肝细胞癌中的独特分布，并在此基础上提供了评估HCC预后的标志物、试剂盒及方法。
本发明所述DPT细胞是指CD4/CD8双阳性T(CD4+CD8+DPT)细胞。
本发明的第一个方面，提供了一种评估肝细胞癌预后的标志物，所述标志物为肿瘤组织与非肿瘤组织之间的交界组织的DPT细胞；优选地，所述交界组织为以肿瘤组织与非肿瘤组织分界线为基准向肿瘤组织和非肿瘤组织延伸0.1-0.8cm的组织，优选为延伸0.2-0.6cm，更优选为延伸0.4-0.6cm的组织。
可选地，所述DPT细胞为PD-1+DPT细胞。
优选地，所述预后包括检测、疗效评估、复发监控。
本发明第二个方面，提供了所述评估肝细胞癌预后的标志物在制备评估肝细胞癌预后的试剂或试剂盒中的应用。
进一步，本发明提供了一种评估肝细胞癌预后的试剂盒，所述试剂盒含有DPT细胞的检测相关试剂。
优选地，所述评估肝细胞癌预后的试剂盒以HCC患者肿瘤组织与非肿瘤组织之间的交界组织中DPT细胞或PD-1+DPT细胞在所有CD4和CD8阳性T细胞中的占比为评估标准。
优选地，所述评估肝细胞癌预后的试剂盒还包括DPT细胞在所有CD4和CD8阳性T细胞中的占比临界值。
优选地，所述试剂盒包括染色液、缓冲液。
优选地，所述试剂盒包括CD4抗体、CD8抗体以及染色剂；进一步优选地，所述试剂盒还包括PD-1抗体及染色剂。
本发明的第三个方面，提供了一种评估肝细胞癌预后的方法，包括以下步骤：
1)获取HCC患者肿瘤组织与非肿瘤组织之间的交界组织；
2)检测出所述交界组织中所有CD4和CD8阳性T细胞并计算DPT细胞在其中的占比；
3)将步骤2)得到的结果与设定的占比临界值进行对比，对比结果用于评估患者的预后情况。
优选地，所述交界组织为以肿瘤组织与非肿瘤组织分界线为基准向肿瘤组织和非肿瘤组织延伸0.1-0.8cm的组织，优选为延伸0.2-0.6cm，更优选为延伸0.4-0.6cm的组织。
进一步，DPT细胞的占比越高，评估患者的预后情况越好，预测生存期和无复发生存期越长；优选地，步骤3)中的临界值可设定为10-15％，高于临界值评估患者预后情况好，否则预后情况较差。在本发明的一种实施方式中，所述DPT细胞为PD-1+DPT细胞，此时步骤3)中的临界值可设定为4-6％。
在本发明的一种优选实施方式中，所述交界组织为以肿瘤组织与非肿瘤组织分界线为基准向肿瘤组织和非肿瘤组织延伸0.4-0.6cm的组织，所述DPT细胞的占比临界值设定为12.15％，当所述DPT细胞为PD-1+DPT细胞时，所述占比临界值设定为5.3％。
本发明首先发现了HCC患者的肿瘤与非肿瘤组织的交界区存在DPT细胞的特异性富集，并发现了该区域的DPT细胞占比与HCC预后情况成正相关性，从而提供了一种新的评估HCC预后的有效方法、试剂盒和标志物，对HCC及肿瘤的研究以及肿瘤病人的治疗具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是从样本中分离白细胞进行CyTOF分析的工作流程图：提取手术切除的样品中的免疫细胞，用金属标记的抗体处理，然后用飞行时间质谱细胞仪检测；降维后获得的数据可视化，通过手动门控策略和聚类算法识别细胞簇；其中T指肿瘤核心区域，L指前沿区域，N指非肿瘤区域。
图2是来自肿瘤浸润白细胞(TIL)、前沿区浸润白细胞(LIL)和非肿瘤区浸润白细胞(NIL)的CyTOF数据的tSNE图，确定了免疫谱系，并比较了其百分比(右)。
图3是总T细胞的tSNE图，左侧显示通过FlowSOM聚类方法在总T细胞中鉴定出的40个簇，右侧显示了已识别的经典T细胞亚群。
图4显示了以T/L/N表示的40个簇中每一个的簇频率；簇的顺序基于它们在L中的频率。
图5的热图显示了40个T细胞簇中所有35个标志物的平均表达水平，T/L/N富集簇标记在左侧。
图6显示了在13名患者中，各T细胞簇分别在T、L、N区T细胞中的百分比，其中每幅小图中三个数据点从左到右依次表示在T、L、N区中的百分比，深色小图示出了在L区富集(L区中占比最高)的T细胞的情况。
图7显示了每个HCC样本的DPT簇的频率；
图8是在总T细胞中鉴定出单阳性/双阳性/双阴性T细胞的tSNE图。
图9显示了所有13例患者中分别来自于TIL、LIL、NIL的总T细胞中双阳性T细胞的细胞百分比。
图10显示了所有13例患者中分别来自于TIL、LIL、NIL的总T细胞中CD45RO+PD-1+DPT细胞的细胞百分比。；
图11是DPT细胞和PD-1+DPT细胞之间的细胞密度相关性图。
图12是DPT细胞水平、PD-1+DPT细胞水平与总生存期(OS)/无复发生存期(RFS)之间相关性的Kaplan-Meier分析图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
实施例1样本处理和白细胞分离
1、样本的处理
肝脏和肿瘤组织取自东方肝胆外科医院的13例HCC患者，这些患者接受了HCC根治性手术切除。如图1所示，将每份肝癌样本分为三种：来自肿瘤核心区域的肿瘤组织(T，tumor core)、非肿瘤组织(N，non-tumor region)和从肿瘤前沿至其周围基质组织的交界组织(L，leading-edge area)，其中，交界组织(L)是指以肿瘤组织与非肿瘤组织分界线为基准向肿瘤组织和非肿瘤组织延伸0.4-0.6cm的区域。所有样本都按照当地的道德准则进行了匿名编码。
2、从组织中分离白细胞
从新鲜的上述三种样本中分离出白细胞从而获得13组肿瘤浸润白细胞(TIL)、非肿瘤区浸润白细胞(NIL)和前沿区浸润白细胞(LIL)。
具体步骤为：切碎用HBSS洗涤的组织，并用消化酶消化，在37℃振荡60分钟，然后通过300目滤网过滤，将过滤后的混合物收集在50mL离心管中，用450g离心8分钟，然后将沉淀物用HBSS重悬后用50g离心一分钟；将澄清的上清液小心地叠加在淋巴液的表面，然后用450g离心25分钟；离心后，白细胞浓缩在混合液的中间层。其中，消化酶由胶原酶IV、I型脱氧核糖核酸酶和V型透明质酸酶组成，溶于含10％血清的RPMI中。
实施例2肝细胞癌的免疫微环境空间异质性分析
对13组白细胞进行CyTOF分析，步骤概括如下：洗涤白细胞并染色，用10mM的顺铂染色2分钟以鉴定细胞的存活/死亡，用金属结合的表面膜抗体(由35个表面标记物组成的以免疫细胞为中心的抗体板)在37℃孵育30分钟；之后，用固定浸透缓冲液(fix permbuffer)固定；最后，加入细胞插层(固定浸透缓冲液和铱的混合物)以进行细胞固定和可视化，该过程持续一整夜，然后在Helios质谱仪(Fludigm，美国)上进行分析。
根据制造商的说明，使用了EQ四元素校准珠以对信号进行归一化。每个样品收集了250,000～500,000个细胞事件。文件(.fcs)已上传到Cytobank，手动设置了感兴趣的种群，并将感兴趣的事件以.fcs文件形式导出。为了进一步分析，使用R软件包上的CyTOFkit程序从每个fcs文件中随机抽取了6000个细胞样本。然后，在这些细胞上执行了基于tSNE的可视化和基于FlowSOM算法的聚类，CyTOF分析流程如图1所示。
本实施例从近20,000,000个白细胞(每个样品平均约450,000个细胞)中收集了高维度单细胞蛋白质组学概况。免疫谱系的分布可视化tSNE图如图2所示：HCC中，T细胞数量从N区到T区逐渐减少，而B细胞则相反，N区CD16+NK细胞数量与T区相比明显增加，L区较T区略有上调。N区单核细胞数量减少。对B细胞、NK细胞和单核细胞的更深入分析未发现具有统计学意义的区域特异性细胞亚簇。此外，在来自不同区域的不同免疫细胞谱系中观察到了表面标志物(PD-1、ICOS、HLA-DR、CXCR3、CD161、CD69、CD9)的多样化表达模式(图中未示出)。这些结果表明，HCC的免疫微环境在空间上是异质的。
实施例3T细胞簇的区域多样性及DPT细胞的分布特征
为了探索跨越这三个区域的独特的T细胞亚群组成，我们可视化并重新分析了T细胞亚群。通过应用FlowSOM算法，可以将T细胞划分为40个簇(cluster)(包括来自三个区域的所有T细胞)(图3)。然后，我们首先将40个簇按经典的T亚型分类，发现CD4效应记忆T细胞(Tem)从N区逐渐增加至L区(略微)至T区(显著)，而CD8 Tem显示相反的趋势。
在40个T细胞簇中，分别有11个、13个和16个簇分别主要分布在T区、L区和N区(图4和图5)。在13例HCC患者中，至少有8例的L区(>61％)发现DPT细胞(包括簇5、6、13、18)富集(图6)。对T细胞簇的频率研究结果显示HCC患者之间5个DPT簇(包括簇5、6、13、17、18)的组成差异很大(如图7所示)。在一些SPT簇中也可以观察到类似的模式，表明在HCC中患者体内的异质免疫环境很高。
为了进一步探讨DPT细胞的潜在作用，我们根据CD4和CD8的表达模式将T细胞分为CD4单阳性(CD4+SPT)、CD8单阳性(CD8+SPT)、双阴性(DNT)和双阳性(DPT)细胞(图8)。如图9所示，在多达70％的HCC患者中，L区的DPT细胞显著增加(9/13)。我们观察到L区的DPT细胞中PD-1明显上调。PD-1+CD45RO+T细胞(包括簇5、6、13、18)构成了DPT细胞的主要亚群，且在L区(8/13患者)中明显富集(图10)。
为了进一步证实PD-1+DPT细胞的空间分布，我们同时用CD4/CD8/PD-1抗体标记了肝癌组织，并检查了T细胞在T、L和N区的零星浸润。与先前的结果一致，CD8+SPT细胞主要位于N区，而CD4+SPT细胞则大部分位于T区。在T/N区几乎看不到的PD-1+DPT细胞在L区广泛存在，所有3种抗体均具有强烈的染色信号。用HALO软件计数PD-1+DPT细胞的数目，发现PD-1+DPT细胞的密度在不同的HCC患者的L区是可变的，并且与DPT细胞的数量高度相关(图11)。
实施例4L区DPT细胞的预后价值
为了检查DPT和PD-1+DPT(三重阳性)细胞的潜在预后价值，本实施例使用了由46例HCC患者的匹配的T、L和N标本组成的组织微阵列进行分析。生存率分析结果表明，DPT细胞较多和PD-1+DPT细胞较多，相应的总生存率和无复发生存率均较高，该差异在L区具有显著性，而T区和N区则无显著性的差异(图12)。该结果提示DPT细胞可以在L区特异性地发挥其功能。生存和与复发相关的临床病理变量的单因素分析显示，DPT细胞(HR＝0.35，P＝0.016)和PD-1+DPT细胞(HR＝0.32，P＝0.008)与OS和RFS(DPT细胞：HR＝0.25，P＝0.001；PD-1+DPT细胞：HR＝0.37，P＝0.012)显著相关。
本实施例使用了OpalTM7Immunology Discovery Kit试剂盒(Perkin-Elmer)对石蜡组织切片进行多标免疫荧光染色。具体步骤如下：
(1)去石蜡：在干燥的烤箱中于55-60℃加热载玻片加热四小时，其位置应允许排出熔化的石蜡。用二甲苯洗涤玻片10分钟，共3次。通过乙醇梯度水合，最后用蒸馏水洗涤。
(2)切片固定：在10％中性福尔马林缓冲液中固定组织20分钟，然后用蒸馏水洗涤。
(3)3种抗体标记的多重染色：
循环一：
C1.1：抗原修复/微波法。用AR9试剂冲洗切片。将切片放入Opal切片处理罐中浸满AR9试剂到顶部。在先前确定的最佳条件下执行微波处理，随后让切片在工作台上冷却至少15分钟至室温。
C1.2：封闭。用TBST冲洗幻灯片。用疏水性笔将要染色的组织区域圈起来。在室温(RT)下用抗体稀释液孵育组织10分钟。
C1.3：一抗孵育。除去封闭液，然后将最佳浓度的CD4抗体加入到组织中。用1XTBST冲洗切片3次，每次2分钟。
C1.4：二抗孵育。将Opal多聚物HRP二抗溶液加入组织并在室温下孵育10分钟。用1X TBST洗涤切片3次，每次2分钟。
C1.5：Opal荧光基团孵育。将Opal-520工作溶液涂到组织上并室温孵育10分钟。用TBST清洗切片3次，每次2分钟。
C1.6：微波处理。用AR9冲洗切片。将切片放入装有AR9的Opal切片处理罐中，溶液装到顶部。使用微波处理，然后让切片冷却15分钟以上至室温。
循环二：
C1.1：封闭。用TBST冲洗幻灯片。用疏水性笔将要染色的组织区域圈起来。在室温(RT)下用抗体稀释液孵育组织10分钟。
C1.2：一抗孵育。除去封闭液，然后将最佳浓度的CD8抗体加入到组织中。用1XTBST冲洗切片3次，每次2分钟。
C1.3：二抗孵育。将Opal多聚物HRP二抗溶液加入组织并在室温下孵育10分钟。用1X TBST洗涤切片3次，每次2分钟。
C1.4：Opal荧光基团孵育。将Opal-570工作溶液涂到组织上并室温孵育10分钟。用TBST清洗切片3次，每次2分钟。
C1.5：微波处理。用AR9冲洗切片。将切片放入装有AR9的Opal切片处理罐中，溶液装到顶部。使用微波处理，然后让切片冷却15分钟以上至室温。
循环三：
C1.2：封闭。用TBST冲洗幻灯片。用疏水性笔将要染色的组织区域圈起来。在室温(RT)下用抗体稀释液孵育组织10分钟。
C1.3：一抗孵育。除去封闭液，然后将最佳浓度的PD-1抗体加入到组织中。用1XTBST冲洗切片3次，每次2分钟。
C1.4：二抗孵育。将Opal多聚物HRP二抗溶液加入组织并在室温下孵育10分钟。用1X TBST洗涤切片3次，每次2分钟。
C1.5：Opal荧光基团孵育。将Opal-620工作溶液涂到组织上并室温孵育10分钟。用TBST清洗切片3次，每次2分钟。
C1.6：微波处理。用AR9冲洗切片。将切片放入装有AR9的Opal切片处理罐中，溶液装到顶部。使用微波处理，然后让切片冷却15分钟以上至室温。
(4)DAPI染色：先用蒸馏水冲洗玻片，再用TBST冲洗。在DAPI溶液中将切片室温孵育5分钟。用TBST将切片洗两分钟，然后用蒸馏水洗两分钟。
(5)封片：用中性树脂作为封片试剂
多重荧光标记过的切片使用Vectra 3.0Pathology Imaging System Microscope(Perkin-Elmer)进行了扫描，后续分析在HaloTMImage Analysis software(indica labs)平台上进行，使用了Highplex FL模块。DPT细胞占比计算：交界区域DPT细胞数/(SPT细胞数+DPT细胞数)。以12.15％作为临界值将患者分为DPT高组和DPT低组。PD-1+DPT细胞占比计算：交界区域PD-1+DPT细胞数/(SPT细胞数+DPT细胞数)。以5.3％作为临界值将患者分为PD-1+DPT高组和PD-1+DPT低组。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种评估肝细胞癌预后的标志物，其特征在于，所述的标志物为肿瘤组织与非肿瘤组织之间的交界组织的DPT细胞。
2.如权利要求1所述的评估肝细胞癌预后的标志物，其特征在于，所述交界组织为以肿瘤组织与非肿瘤组织分界线为基准向肿瘤组织和非肿瘤组织延伸0.1-0.8cm的组织。
3.如权利要求1或2所述的评估肝细胞癌预后的标志物，其特征在于，所述DPT细胞为PD-1+DPT细胞。
4.如权利要求1或2所述的评估肝细胞癌预后的标志物在制备评估肝细胞癌预后的试剂或试剂盒中的应用。
5.一种评估肝细胞癌预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有DPT细胞的检测相关试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，以HCC患者肿瘤组织与非肿瘤组织之间的交界组织中DPT细胞或PD-1+DPT细胞在所有CD4和CD8阳性T细胞中的占比为评估标准。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，包括CD4抗体、CD8抗体以及染色剂。
8.一种评估肝细胞癌预后的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取HCC患者肿瘤组织与非肿瘤组织之间的交界组织；
2)检测出所述交界组织中所有CD4和CD8阳性T细胞并计算DPT细胞在其中的占比；
3)将步骤2)得到的结果与设定的占比临界值进行对比，对比结果用于评估患者的预后情况。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述交界组织为以肿瘤组织与非肿瘤组织分界线为基准向肿瘤组织和非肿瘤组织延伸0.4-0.6cm的组织。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3)中的所述占比临界值为10-15％。
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