CN112795536A - 人t细胞的培养方法及无血清培养基组合 - Google Patents

人t细胞的培养方法及无血清培养基组合 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人T细胞无血清培养基及其配制方法，所述培养基的成分中含有：L‑Glutamine、F‑68、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷、IGF‑I、亚油酸、吡哆胺二盐酸盐。本发明人T细胞无血清培养基组合培养得到的人T细胞在细胞总数、增殖速度、扩增倍数和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术，满足临床治疗所需。本发明人T细胞无血清培养基组合的三种培养基中使用相同的基础培养基，便于人T细胞无血清培养基组合的大量配制；基础培养基及各组分均不含动物血清，有效规避了由动物血清对接受细胞治疗患者带来的风险以及动物血清中不确定的成分对细胞培养的结果造成影响。本发明在基础培养基中加入了刀豆蛋白A和补体调节蛋白以及白介素因子。配合分阶段进行细胞培养的方法，大大提高了T细胞得率，增加了T细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本。

Description

人T细胞的培养方法及无血清培养基组合
技术领域
本发明属于生物培养领域，具体涉及一种支持人T细胞的培养方法及无血清培养基组合。
背景技术
T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝)。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。
成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。
现有的细胞免疫治疗中的T细胞主要是通过分离血液中的淋巴细胞，经体外培养、各种细胞因子刺激诱导扩增培养，得到一定量的细胞后回输人体，进行肿瘤治疗。现有 T细胞的培养基主要是由基础培养基、自体血浆(或动物血清)和各种因子培养组成，培养得到的T细胞增殖倍数有限、数量不多，不能广泛的用于治疗，限制了T细胞在免疫细胞治疗中的应用。
所以，T细胞无血清培养基的研究成为免疫细胞治疗中一个重要的突破点，人们开始尝试用含有多种氨基酸、无机盐、维生素和细胞因子的培养基培养T细胞。
现有技术中虽然对T细胞的培养基进行了较大改进，但是使用现有培养基和培养方法获得的T细胞的细胞数量、细胞活率和杀伤活性等仍有待进一步提高，无法满足临床治疗对T细胞的应用要求。
因此急需提供一种化学成分明确，污染风险小，细胞培养效果好，适用于工业规模生产的支持人T细胞高密度悬浮培养的无血清培养基。
发明内容
本发明提供的人T细胞无血清培养基更适合高效培养T细胞，提高增值倍数。
本发明的第一个目的在于提供一种能更高效的扩增和活化T细胞的培养基组合，使获得的T细胞的数量更多、增殖倍数更高和杀伤效果更佳。
本发明的第二个目的在于提供一种人T细胞的培养方法。本发明的第一个目的通过以下技术方案予以实现：
一种人T细胞无血清培养基组合，包括基础培养基、增殖培养基和活化培养基，所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分，所述增殖培养基包括基础培养基和增殖组分，所述活化培养基包括基础培养基和活化组分。
所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸220-320mg/L，L-门冬酰胺30-60mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐50.15-80.15mg/L，L-谷氨酸15-35mg/L，甘氨酸8-12mg/L，L-组氨酸13-16mg/L，L-羟脯氨酸18-22mg/L，L-异亮氨酸35-50mg/L，L-亮氨酸 40-60mg/L，L-赖氨酸盐酸盐30-50mg/L，L-甲硫氨酸12-18mg/L，L-苯丙氨酸12-18mg/L， L-脯氨酸18-22mg/L，L-丝氨酸25-30mg/L，L-苏氨酸9-22mg/L，L-色氨酸2-16mg/L， L-酪氨酸20.5-25.5mg/L，L-缬氨酸18-22mg/L，神经细胞生长因子0.5-60ng/mL，L-门冬氨酸12-25mg/L，无水氯化钙28-32mg/L，氯化钾300-500mg/L，氯化钠4000-6000mg/L，葡萄糖1800-2200mg/L，还原谷胱甘肽0.7-1.2mg/L，维生素B12 0.003-0.08mg/L，L-谷氨酰胺200-400mg/L，生物素0.2-0.5mg/L，次黄嘌呤3-5mg/L，叶酸0.8-1mg/L，肌醇 32-36mg/L，烟酰胺0.8-1.4mg/L，氯化胆碱2.5-3.2mg/L，盐酸吡哆醇0.8-1.2mg/L，核黄素0.2-0.4mg/L，盐酸硫胺素0.8-1mg/L，表皮细胞生长因子0.5-50ng/mL，卵泡刺激因子 80-100ng/mL，刀豆蛋白10-30mg/L，补体调节蛋白1-10mg/L。
优选地，所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸260mg/L，L-门冬酰胺50mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L，L-谷氨酸25mg/L，甘氨酸10mg/L，L-组氨酸15mg/L，L-羟脯氨酸20mg/L，L-异亮氨酸50mg/L，L-亮氨酸50mg/L，L-赖氨酸盐酸盐40mg/L，L-甲硫氨酸15mg/L，L-苯丙氨酸15mg/L，L-脯氨酸20mg/L，L-丝氨酸 30mg/L，L-苏氨酸20mg/L，L-色氨酸5mg/L，L-酪氨酸23.19mg/L，L-缬氨酸20mg/L，神经细胞生长因子5ng/mL，L-门冬氨酸20mg/L，无水氯化钙30mg/L，氯化钾400mg/L，
氯化钠6000mg/L，葡萄糖2000mg/L，还原谷胱甘肽1mg/L，维生素B12 0.005mg/L，L-谷氨酰胺300mg/L，生物素0.2mg/L，次黄嘌呤4mg/L，叶酸1mg/L，i-肌醇35mg/L，烟酰胺1mg/L，氯化胆碱3mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，核黄素0.2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，表皮细胞生长因子5ng/mL，卵泡刺激因子60ng/mL，刀豆蛋白20mg/L，补体调节蛋白 5mg/L。
优选地，诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体10-90μg/L，白细胞介素 -2(IL-2)10-150μg/L，白细胞介素-12(IL-12)10-150μg/L，白细胞介素-15(IL-15)10-200μg/L，白细胞介素-18(IL-18)10-90μg/L，白细胞介素-21(IL-21)10-150μg/L。更优选地，所述诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体60μg/L，白细胞介素-2 50μg/L，白细胞介素-12 60μg/L，白细胞介素-1530μg/L，白细胞介素-1860μg/L，白细胞介素-2120μg/L。
优选地，增殖组分及含量为：白细胞介素-2 10-400μg/L，白细胞介素-15 10-400μg/L，白细胞介素-18 10-500μg/L，CD16单克隆抗体10-400μg/L。更优选地，所述增殖组分及含量为：白细胞介素-2 50μg/L，白细胞介素-15 30μg/L，白细胞介素-18 50μg/L，CD16 单克隆抗体30μg/L。
优选地，活化组分及含量为：白细胞介素-2 10-150μg/L，白细胞介素-15 10-150μg/L，INF-r10-120μg/L，TNF-α10-200μg/L，白细胞调节素(LR)10-90μg/L。
更优选地，所述活化组分及含量为：白细胞介素-2 30μg/L，白细胞介素-1 30μg/L， INF-r 30μ/L，TNF-α80μg/L，白细胞调节素80μg/L。
优选地，所述诱导培养基、增殖培养基和活化培养基用于T细胞不同培养阶段。
本发明的第二个目的通过以下技术方案予以实现：
一种人T细胞的培养方法，分阶段依次使用诱导培养基、增殖培养基和活化培养基进行细胞培养。优选地，所述T细胞的培养方法包括以下步骤：
S1、使用上述诱导培养基培养PBMC 3-4天；S2、更换为上述增殖培养基培养至第10-12天；S3、更换为上述活化培养基培养至第14天，得到成熟的T细胞。优选地，PB MC的接种密度为0.5×106-2×106cells/mL。
本发明的有益效果是：
本发明人T细胞无血清培养基组合培养得到的人T细胞在细胞总数、增殖速度、扩增倍数和对肿瘤细胞的杀伤活性等方面都优于现有技术，满足临床治疗所需。本发明人 T细胞无血清培养基组合的三种培养基中使用相同的基础培养基，便于人T细胞无血清培养基组合的大量配制；基础培养基及各组分均不含动物血清，有效规避了由动物血清对接受细胞治疗患者带来的风险以及动物血清中不确定的成分对细胞培养的结果造成影响。本发明在基础培养基中加入了刀豆蛋白A(和补体调节蛋白以及白介素因予。配合分阶段进行细胞培养的方法，大大提高了T细胞得率，增加了T细胞培养的终密度，从而降低了细胞培养的成本。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合实施例对本发明作进一步的说明。本发明中所用的试剂均为市售试剂，所用的培养基的配制方法、检测方法、培养方法等均为本领域人员所熟知。
实施例1、T细胞无血清培养基
为了更清楚的说明本实施例人T细胞无血清培养基组合的组分，下面结合实施例进一步阐述本发明。基础培养基的组分及其含量如下所述，分别按照下述含量将诱导组分、增殖组分和活化组分添加到基础培养基中，即可得到诱导培养基、增殖培养基和活化培养基。
基础培养基的组分及其含量为：
Figure RE-GSB0000186673970000051
Figure RE-GSB0000186673970000061
Figure RE-GSB0000186673970000071
实施例1中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量为：
诱导组分
Figure RE-GSB0000186673970000072
增值组分
Figure RE-GSB0000186673970000073
活化组分
Figure RE-GSB0000186673970000074
Figure RE-GSB0000186673970000081
实施例2、T细胞无血清培养基
基础培养基组分及含量
Figure RE-GSB0000186673970000082
Figure RE-GSB0000186673970000091
Figure RE-GSB0000186673970000101
实施例2中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量
诱导组分
Figure RE-GSB0000186673970000102
增值组分
Figure RE-GSB0000186673970000103
Figure RE-GSB0000186673970000111
活化组分
Figure RE-GSB0000186673970000112
实施例3、T细胞无血清培养基
基础培养基组分及含量
Figure RE-GSB0000186673970000113
Figure RE-GSB0000186673970000121
Figure RE-GSB0000186673970000131
实施例3中诱导组分、增殖组分和活化组分及含量为：
诱导组分
Figure RE-GSB0000186673970000132
增值组分
Figure RE-GSB0000186673970000141
活化组分
Figure RE-GSB0000186673970000142
实施例4、T细胞无血清培养基
本实施例中基础培养基的组分与实施例1相同，诱导组分、增殖组分和活化组分及含量如下所示。
诱导组分
Figure RE-GSB0000186673970000143
Figure RE-GSB0000186673970000151
增值组分
Figure RE-GSB0000186673970000152
活化组分
Figure RE-GSB0000186673970000153
对比例1、T细胞无血清培养基
本对比例中基础培养基、特异性组分及含量分别如下所示。
对比例1中的T细胞无血清培养基
基础培养基
Figure RE-GSB0000186673970000154
Figure RE-GSB0000186673970000161
Figure RE-GSB0000186673970000171
人T细胞特异性培养组分
Figure RE-GSB0000186673970000172
实施例5、T细胞的培养方法
采用常规方法自外周血中分离出单个核细胞(PBMC)，平均分成5组，每组初始细胞量为8×106，分别进行T细胞培养。其中，4组PBMC采用本发明T细胞的培养方法进行培养，分别为实验组1-4，培养方法如下：
S1、按1×106 cells/mL密度将PBMC接种于T75培养瓶，分别添加实施例1-4中的诱导培养基，培养4天；S2、第5天，更换为实施例1-4中的增殖培养基继续培养，培养至第10天；S3、第11天，更换为实施例1-4中的活化培养基继续培养至第14天，得到成熟的T细胞。另一组PBMC采用常规方法培养，作为对照组1，培养方法为：按 1×106 cells/mL密度将PBMC接种于T75培养瓶，添加对比例1中的培养基进行培养至第14天，收获成熟的T细胞。实验组和对照组中未说明的其他条件均相同，且采用现有技术中的常规条件。
效果实施例1、增殖效果检测
在实施例5所述的对照组1和实验组1-4的培养结束后再进行细胞总量、增殖倍数、细胞活率的测定和计算，结果如表1所示。
表1、对照组和各实验组的细胞总量、增殖倍数和活率
Figure RE-GSB0000186673970000181
由表1可知，在第1-6天，实验组和对照组的细胞数量基本相同，第6天开始至培养结束，实验组的增殖速度都明显快于对照组。实验组之间的增殖速度在第1至第10 天基本相同，第10天之后，实验组1的增殖速度要稍慢于实验组2-4，实验组3的增殖速度最快。实验组1的细胞总量为1.64×109个细胞，其增殖倍数为245倍，实验组2-4 的细胞总量为2.23×109-2.48×109个细胞，其增殖倍数为285-310倍，细胞总量和增殖倍数都远远大于对照组。实验组和对照组的细胞活率基本相当，都在90％以上，说明本发明方法获得的细胞活率良好。
效果实施例2、流式检测
采用常规方法对实施例5中所述的实验组1-4和对照组1培养得到的T细胞进行流式检测，考察其表面抗原CD3和CD56的表达情况。结果如表2所示。
表2、流式检测结果
Figure RE-GSB0000186673970000191
由表2可知，实验组T细胞中CD3-CD56+细胞的比例明显高于对照组1中CD3- CD56+细胞的比例，说明采用本发明培养基和方法获得的T细胞纯度更高。
效果实施例3、杀伤活性检测
采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法对实施例5中所述的实验组1-4和对照组1培养得到的T 细胞进行K562细胞(人白血病细胞)的杀伤活性检测。结果如表3所示。
表3、杀伤活性检测结果
Figure RE-GSB0000186673970000192
由表3可知，实验组T细胞的杀伤活性在效靶比10∶1时为0.8左右，在效靶比20∶1时为0.86-0.89，在效靶比40∶1时为0.9以上，均高于相同效靶比情况下的对照组T细胞的杀伤活性。说明采用本发明培养基和方法获得的人T细胞对肿瘤细胞的杀伤毒性更强。
本发明并不限于以上实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变通，这些变通也属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人T细胞无血清培养基组合，包括基础培养基、增殖培养基和活化培养基，所述诱导培养基包括基础培养基和诱导组分，所述增殖培养基包括基础培养基和增殖组分，所述活化培养基包括基础培养基和活化组分。
所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸220-320mg/L，L-门冬酰胺30-60mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐50.15-80.15mg/L，L-谷氨酸15-35mg/L，甘氨酸8-12mg/L，L-组氨酸13-16mg/L，L-羟脯氨酸18-22mg/L，L-异亮氨酸35-50mg/L，L-亮氨酸40-60mg/L，L-赖氨酸盐酸盐30-50mg/L，L-甲硫氨酸12-18mg/L，L-苯丙氨酸12-18mg/L，L-脯氨酸18-22mg/L，L-丝氨酸25-30mg/L，L-苏氨酸9-22mg/L，L-色氨酸2-16mg/L，L-酪氨酸20.5-25.5mg/L，L-缬氨酸18-22mg/L，神经细胞生长因子0.5-60ng/mL，L-门冬氨酸12-25mg/L，无水氯化钙28-32mg/L，氯化钾300-500mg/L，氯化钠4000-6000mg/L，葡萄糖1800-2200mg/L，还原谷胱甘肽0.7-1.2mg/L，维生素B12 0.003-0.08mg/L，L-谷氨酰胺200-400mg/L，生物素0.2-0.5mg/L，次黄嘌呤3-5mg/L，叶酸0.8-1mg/L，肌醇32-36mg/L，烟酰胺0.8-1.4mg/L，氯化胆碱2.5-3.2mg/L，盐酸吡哆醇0.8-1.2mg/L，核黄素0.2-0.4mg/L，盐酸硫胺素0.8-1mg/L，表皮细胞生长因子0.5-50ng/mL，卵泡刺激因子80-100ng/mL，刀豆蛋白10-30mg/L，补体调节蛋白1-10mg/L。
2.根据权利要求1所述的人T细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基包括下述含量的下述组分：L-精氨酸260mg/L，L-门冬酰胺50mg/L，L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L，L-谷氨酸25mg/L，甘氨酸10mg/L，L-组氨酸15mg/L，L-羟脯氨酸20mg/L，L-异亮氨酸50mg/L，L-亮氨酸50mg/L，L-赖氨酸盐酸盐40mg/L，L-甲硫氨酸15mg/L，L-苯丙氨酸15mg/L，L-脯氨酸20mg/L，L-丝氨酸30mg/L，L-苏氨酸20mg/L，L-色氨酸5mg/L，L-酪氨酸23.19mg/L，L-缬氨酸20mg/L，神经细胞生长因子5ng/mL，L-门冬氨酸20mg/L，无水氯化钙30mg/L，氯化钾400mg/L，氯化钠6000mg/L，葡萄糖2000mg/L，还原谷胱甘肽1mg/L，维生素B12 0.005mg/L，L-谷氨酰胺300mg/L，生物素0.2mg/L，次黄嘌呤4mg/L，叶酸1mg/L，i-肌醇35mg/L，烟酰胺1mg/L，氯化胆碱3mg/L，盐酸吡哆醇1mg/L，核黄素0.2mg/L，盐酸硫胺素1mg/L，表皮细胞生长因子5ng/mL，卵泡刺激因子60ng/mL，刀豆蛋白20mg/L，补体调节蛋白5mg/L。
3.根据权利要求1-2所述的人T细胞无血清培养基组合，其特征在于，诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体10-90μg/L，白细胞介素-2(IL-2)10-150μg/L，白细胞介素-12(IL-12)10-150μg/L，白细胞介素-15(IL-15)10-200μg/L，白细胞介素-18(IL-18)10-90μg/L，白细胞介素-21(IL-21)10-150μg/L。
增殖组分及含量为：白细胞介素-2 10-400μg/L，白细胞介素-15 10-400μg/L，白细胞介素-18 10-500μg/L，CD16单克隆抗体10-400μg/L。更优选地，所述增殖组分及含量为：白细胞介素-2 50μg/L，白细胞介素-15 30μg/L，白细胞介素-18 50μg/L，CD16单克隆抗体30μg/L。
活化组分及含量为：白细胞介素-2 10-150μg/L，白细胞介素-15 10-150μg/L，INF-r10-120μg/L，TNF-α 10-200μg/L，白细胞调节素(LR)10-90μg/L。更优选地，所述活化组分及含量为：白细胞介素-2 30μg/L，白细胞介素-1 30μg/L，INF-r 30μg/L，TNF-α 80μg/L，白细胞调节素80μg/L。
4.根据权利要求3所述的人T细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述诱导组分及含量为：OKT-3单克隆抗体60μg/L，白细胞介素-2 50μg/L，白细胞介素-12 60μg/L，白细胞介素-15 30μg/L，白细胞介素-18 60μg/L，白细胞介素-21 20μg/L。
5.根据权利要求3所述的人T细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述增殖组分及含量为：白细胞介素-2 50μg/L，白细胞介素-15 30μg/L，白细胞介素-18 50μg/L，CD16单克隆抗体30μg/L。
6.根据权利要求3所述的人T细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述活化组分及含量为：白细胞介素-2 30μg/L，白细胞介素-1 30μg/L，INF-r 30μg/L，TNF-α 80μg/L，白细胞调节素80μg/L。
7.根据权利要求1所述的人T细胞无血清培养基组合，其特征在于，所述诱导培养基、增殖培养基和活化培养基用于人T细胞不同培养阶段。
8.一种人T细胞的培养方法，其特征在于，分阶段依次使用权利要求1-6任一项所述的诱导培养基、增殖培养基和活化培养基进行细胞培养。
9.根据权利要求8所述的人T细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、使用上述诱导培养基培养PBMC 3-4天；
S2、更换为上述增殖培养基培养至第10-12天；
S3、更换为上述活化培养基培养至第14天，得到成熟的NK细胞。
10.根据权利要求9所述的人T细胞的培养方法，其特征在于，PBMC的接种密度为0.5×106-2×106cells/mL。
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