CN105039253A - 适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，属于细胞生物学与医学免疫学领域。所述无血清培养基以RPMI1640培养基为基础，还含有添加成分，所述添加成分为羟乙基哌嗪硫磺酸、酚红·钠、L-谷氨酸盐、碳酸氢钠，还可以添加胰岛素、转铁蛋白、硒、人血白蛋白、白介素-2。本发明所含成分均为化学限定成分，不含任何动物血清成分，适用于对所有免疫细胞进行大规模培养、临床安全性高，且增殖效果更好。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学与医学免疫学领域，具体涉及一种适用于所有免疫细胞培养的无血清培养基。
背景技术
随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。
体细胞免疫治疗，是向肿瘤患者输入具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫反应，从而达到治疗效果的生物疗法。体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、修饰、筛选及经药物或其他能改变细胞生物学行为的处理。经体外操作后的体细胞可用于肿瘤治疗，也可用于肿瘤预防。
自体细胞免疫疗法，主要包括树突状细胞疫苗(DC)、CIK、DC刺激的CIK细胞(DC-CIK)、自然杀伤细胞(NK)、NKT细胞等。具体方法是：通过提取患者体内不通过提取患者体内不成熟的免疫细胞(采血)，在实验室中进行活化培养使其具有高效识别和杀灭肿瘤细胞的能力后，再回输患者体内。患者只需配合做采血与回输血两个步骤。
目前，血清仍是免疫细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊椎动物细胞，以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。然而，由于动物血清中含有动物成分，且成分复杂，虽含很多对细胞有利的成分，也含有对细胞有害的成分，如多胺氧化酶等，若其用于临床细胞治疗体系中，可能会导致一些潜在的风险。而且在大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。在此背景下，急需一种安全有效的免疫细胞无血清培养基来提高临床免疫细胞培养的安全性及有效性。
目前，使用最广泛的无血清培养基主要是LONZA的XVIVO无血清培养基和GIBCO的AIM无血清培养基，但是上述两种培养基均需在细胞培养前期补充自体血浆，否则培养免疫细胞时，难以达到临床的回输标准，且培养时间均较长。
发明内容
针对上述现有的无血清培养基的缺陷，本发明提供了一种适用于培养免疫细胞大规模培养的无血清培养基。本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供了一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基。本发明制备的无血清培养基可应用于所有免疫细胞的培养，不需要肿瘤细胞的刺激，不需要补加胎牛血清，提高了临床安全性。且运用本发明的无血清培养基培养免疫细胞时，增殖效果更好，培养时间更短，同时也大大地降低了生产成本。
为达到上述目的，本发明采用了下述技术方案：
一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，以RPMI1640培养基为基础，还含有添加成分，所述添加成分为羟乙基哌嗪硫磺酸、酚红·钠、L-谷氨酸盐、碳酸氢钠。
优选的，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸3-9/L、酚红·钠0.0001-0.1g/L、L-谷氨酸盐0.1-1g/L、碳酸氢钠0.5-8g/L。
进一步优选的，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸5-7g/L、酚红·钠0.002-0.01g/L、L-谷氨酸盐0.2-0.6g/L、碳酸氢钠1-5g/L。
进一步优选的，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸5.958g/L、酚红·钠0.0053g/L、L-谷氨酸盐0.4g/L、碳酸氢钠3g/L。
优选的，所述添加成分还包括胰岛素、转铁蛋白、硒、人血白蛋白、白介素-2的一种或几种。
进一步优选的，所述添加成分的浓度为胰岛素0.001-0.1g/L、转铁蛋白0.001-0.01g/L、硒0.0001-0.1g/L、人血白蛋白2-60g/L、白介素-240-600IU/mL。
进一步优选的，所述添加成分的浓度为胰岛素0.005-0.02g/L、转铁蛋白0.002-0.005g/L、硒0.001-0.01g/L、人血白蛋白5-50g/L、白介素-250-500IU/mL。
进一步优选的，所述添加成分的浓度为胰岛素0.13g/L、转铁蛋白0.0035g/L、硒0.05g/L、人血白蛋白25g/L、白介素-2250IU/mL。
所述RPMI1640培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、糖。
优选的，所述无机盐包括四水二硝酸钙、无水硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、
磷酸氢二钠；所述氨基酸包括精氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸·二盐酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸·盐酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸·二钠·水合物；所述维生素包括氨基苯酸、生物素、氯化胆碱、叶酸、还原性谷胱甘肽、肌醇、烟酰胺、泛酸·1/2钙、吡哆醇·盐酸、核黄素、维生素、硫胺素·盐酸；所述糖包括葡萄糖。
优选的，所述氨基酸包括L-精氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸·二盐酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-羟脯氨酸、L-赖氨酸·盐酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸·二钠·水合物；所述维生素包括p-氨基苯酸、D-生物素、氯化胆碱、叶酸、还原性谷胱甘肽、肌醇、烟酰胺、D-泛酸·1/2钙、吡哆醇·盐酸、核黄素、维生素、硫胺素·盐酸；所述糖包括D-葡萄糖。
进一步优选的，所述无机盐的浓度为：四水二硝酸钙0.01-1g/L、无水硫酸镁0.04-0.4g/L、氯化钾0.04-2g/L、碳酸氢钠0.2-8g/L、氯化钠2-10g/L、磷酸氢二钠0.08-4g/L；所述氨基酸的浓度为：L-精氨酸0.02-2g/L、L-缬氨酸0.002-2g/L、L-天冬氨酸0.002-2g/L、L-天冬酰胺0.005-0.5g/L、L-半胱氨酸·二盐酸0.006-0.6g/L、L-谷氨酸0.002-0.2g/L、L-谷氨酰胺0.03-0.3g/L、L-组氨酸0.0015-0.15g/L、甘氨酸0.001-0.1g/L、L-异亮氨酸0.005-0.5g/L、L-羟脯氨酸0.002-0.2g/L、L-赖氨酸·盐酸0.004-0.4g/L、L-亮氨酸0.005-0.5g/L、L-脯氨酸0.002-0.2g/L、L-甲硫氨酸0.0015-0.15g/L、L-丝氨酸0.003-0.3g/L、L-苯丙氨酸0.0015-0.15g/L、L-苏氨酸0.002-0.2g/L、L-色氨酸0.0005-0.05g/L、L-酪氨酸·二钠·水合物0.002-0.2g/L；所述维生素的浓度为：p-氨基苯酸0.0001-0.01g/L、D-生物素0.00002-0.002g/L、氯化胆碱0.0003-0.03g/L、叶酸0.0001-0.01g/L、还原性谷胱甘肽0.0001-0.01g/L、肌醇0.0035-0.35g/L、烟酰胺0.0001-0.01g/L、D-泛酸·1/2钙0.000025-0.0025g/L、吡哆醇·盐酸0.0001-0.01g/L、核黄素0.00002-0.002g/L、维生素B120.0000005-0.00005g/L、硫胺素·盐酸0.01-1g/L；所述糖的浓度为：D-葡萄糖0.2-8g/L。
进一步优选的，所述无机盐的浓度为：四水二硝酸钙0.1g/L、无水硫酸镁0.04884g/L、氯化钾0.4g/L、碳酸氢钠2g/L、氯化钠6g/L、磷酸氢二钠0.8g/L；所述氨基酸的浓度为：L-精氨酸0.2g/L、L-缬氨酸0.02g/L、L-天冬氨酸0.02g/L、L-天冬酰胺0.05g/L、L-半胱氨酸·二盐酸0.0652g/L、L-谷氨酸0.02g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、L-组氨酸0.015g/L、甘氨酸0.01g/L、L-异亮氨酸0.05g/L、L-羟脯氨酸0.02g/L、L-赖氨酸·盐酸0.04g/L、L-亮氨酸0.05g/L、L-脯氨酸0.02g/L、L-甲硫氨酸0.015g/L、L-丝氨酸0.03g/L、L-苯丙氨酸0.015g/L、L-苏氨酸0.02g/L、L-色氨酸0.005g/L、L-酪氨酸·二钠·水合物0.02883g/L；所述维生素的浓度为：p-氨基苯酸0.001g/L、D-生物素0.0002g/L、氯化胆碱0.003g/L、叶酸0.001g/L、还原性谷胱甘肽0.001g/L、肌醇0.035g/L、烟酰胺0.001g/L、D-泛酸·1/2钙0.00025g/L、吡哆醇·盐酸0.001g/L、核黄素0.0002g/L、维生素B120.000005g/L、硫胺素·盐酸0.1g/L；所述糖的浓度为：D-葡萄糖2g/L。
本发明还提供了所述适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：
1、称取无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的含量；
2、将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分溶解在水中，优选二蒸水或三蒸水；
3、用水将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的溶解混合物定容到1L，即制得无血清培养基。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、适用于对所有免疫细胞进行大规模培养、临床安全性高。本发明提供的无血清培养基可用于CIK细胞、DC细胞、NK细胞、NKT细胞等所有各类免疫细胞的培养，不需要肿瘤细胞的刺激，不需要补加胎牛血清，提高了临床安全性。
2、增殖效果更好。与LONZA的XVIVO无血清培养基和GIBCO的AIM无血清培养相比较，本发明的无血清培养基培养的免疫细胞，增殖效果更好，缩短了培养时间，且大大地降低了生产成本。
3、安全。本发明提供的无血清培养基，所含成分均为化学限定成分，不含任何动物血清成分，从而避免了动物血清可能导致的安全性问题。
附图说明
图1三种无血清培养基培养第7天的NKT细胞的形态
图2三种无血清培养基培养14天后NKT细胞的流式检测结果
图3三种无血清培养基培养14天NKT细胞的增殖曲线
图4三种无血清培养基培养第7天的CIK细胞的形态
图5三种无血清培养基培养14天后CIK细胞的流式检测结果
图6三种无血清培养基培养14天CIK细胞的增殖曲线
图7三种无血清培养基培养第7天的NK细胞的细胞形态
图8三种无血清培养基培养14天后NK细胞的流式检测结果
图9三种无血清培养基培养14天NK细胞的增殖曲线
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表达的范围。
实施例1
一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，以RPMI1640培养基为基础，还含有添加成分，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸3/L、酚红·钠0.0001g/L、L-谷氨酸盐0.1g/L、碳酸氢钠0.5g/L。所述添加成分还包括胰岛素0.001g/L、转铁蛋白0.001g/L、硒0.0001g/L、人血白蛋白2g/L、白介素-240IU/mL。
所述RPMI1640培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、糖。
所述无机盐的浓度为：四水二硝酸钙0.01g/L、无水硫酸镁0.04g/L、氯化钾0.04g/L、碳酸氢钠0.2g/L、氯化钠2g/L、磷酸氢二钠0.08g/L；所述氨基酸的浓度为：L-精氨酸
0.02g/L、L-缬氨酸0.002g/L、L-天冬氨酸0.002g/L、L-天冬酰胺0.005g/L、L-半胱氨酸·二盐酸0.006g/L、L-谷氨酸0.002g/L、L-谷氨酰胺0.03g/L、L-组氨酸0.0015g/L、甘氨酸0.001g/L、L-异亮氨酸0.005g/L、L-羟脯氨酸0.002g/L、L-赖氨酸·盐酸0.004g/L、L-亮氨酸0.005g/L、L-脯氨酸0.002g/L、L-甲硫氨酸0.0015g/L、L-丝氨酸0.003g/L、L-苯丙氨酸0.0015g/L、L-苏氨酸0.002g/L、L-色氨酸0.0005g/L、L-酪氨酸·二钠·水合物0.002g/L；所述维生素的浓度为：p-氨基苯酸0.0001g/L、D-生物素0.00002g/L、氯化胆碱0.0003g/L、叶酸0.0001g/L、还原性谷胱甘肽0.0001g/L、肌醇0.0035g/L、烟酰胺0.0001g/L、D-泛酸·1/2钙0.000025g/L、吡哆醇·盐酸0.0001g/L、核黄素0.00002g/L、维生素B120.0000005g/L、硫胺素·盐酸0.01g/L；所述糖的浓度为：D-葡萄糖0.2g/L。
制备本发明所述适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基的方法，包括如下步骤：
1、称取无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的含量；
2、将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分溶解在水中，优选三蒸水；
3、用水将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的溶解混合物定容到1L，即制得无血清培养基。
实施例2
一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，以RPMI1640培养基为基础，还含有添加成分，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸9/L、酚红·钠0.1g/L、L-谷氨酸盐1g/L、碳酸氢钠8g/L。所述添加成分还包括胰岛素0.1g/L、转铁蛋白0.01g/L、硒0.1g/L、人血白蛋白60g/L、白介素-2600IU/mL。
所述RPMI1640培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、糖。
所述无机盐的浓度为：四水二硝酸钙1g/L、无水硫酸镁0.4g/L、氯化钾2g/L、碳酸氢钠8g/L、氯化钠10g/L、磷酸氢二钠4g/L；所述氨基酸的浓度为：L-精氨酸2g/L、L-缬氨酸2g/L、L-天冬氨酸2g/L、L-天冬酰胺0.5g/L、L-半胱氨酸·二盐酸0.6g/L、L-谷氨酸0.2g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、L-组氨酸0.15g/L、甘氨酸0.1g/L、L-异亮氨酸0.5g/L、L-羟脯氨酸0.2g/L、L-赖氨酸·盐酸0.4g/L、L-亮氨0.5g/L、L-脯氨酸0.2g/L、L-甲硫氨酸0.15g/L、L-丝氨酸0.3g/L、L-苯丙氨酸0.15g/L、L-苏氨酸0.2g/L、L-色氨酸0.05g/L、L-酪氨酸·二钠·水合物0.2g/L；所述维生素的浓度为：p-氨基苯酸0.01g/L、D-生物素0.002g/L、氯化胆碱0.03g/L、叶酸0.01g/L、还原性谷胱甘肽0.01g/L、肌醇0.35g/L、烟酰胺0.01g/L、D-泛酸·1/2钙0.0025g/L、吡哆醇·盐酸0.01g/L、核黄素0.002g/L、维生素B120.00005g/L、硫胺素·盐酸1g/L；所述糖的浓度为：D-葡萄糖8g/L。
制备本发明所述适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基的方法，包括如下步骤：
1、称取无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的含量；
2、将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分溶解在水中，优选二蒸水；
3、用水将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的溶解混合物定容到1L，即制得无血清培养基。
实施例3
一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，以RPMI1640培养基为基础，还含有添加成分，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸5g/L、酚红·钠0.002g/L、L-谷氨酸盐0.2g/L、碳酸氢钠1g/L、胰岛素0.005g/L、转铁蛋白0.002g/L、硒0.001g/L、人血白蛋白5g/L、白介素-250IU/mL。
所述RPMI1640培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、糖。
所述无机盐的浓度为：四水二硝酸钙0.1g/L、无水硫酸镁0.04884g/L、氯化钾0.4g/L、碳酸氢钠2g/L、氯化钠6g/L、磷酸氢二钠0.8g/L；所述氨基酸的浓度为：L-精氨酸0.2g/L、L-缬氨酸0.02g/L、L-天冬氨酸0.02g/L、L-天冬酰胺0.05g/L、L-半胱氨酸·二盐酸0.0652g/L、L-谷氨酸0.02g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、L-组氨酸0.015g/L、甘氨酸0.01g/L、L-异亮氨酸0.05g/L、L-羟脯氨酸0.02g/L、L-赖氨酸·盐酸0.04g/L、L-亮氨酸0.05g/L、L-脯氨酸0.02g/L、L-甲硫氨酸0.015g/L、L-丝氨酸0.03g/L、L-苯丙氨酸0.015g/L、L-苏氨酸0.02g/L、L-色氨酸0.005g/L、L-酪氨酸·二钠·水合物0.02883g/L；所述维生素的浓度为：p-氨基苯酸0.001g/L、D-生物素0.0002g/L、氯化胆碱0.003g/L、叶酸0.001g/L、还原性谷胱甘肽0.001g/L、肌醇0.035g/L、烟酰胺0.001g/L、D-泛酸·1/2钙0.00025g/L、吡哆醇·盐酸0.001g/L、核黄素0.0002g/L、维生素B120.000005g/L、硫胺素·盐酸0.1g/L；所述糖的浓度为：D-葡萄糖2g/L。
制备本发明所述适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基的方法，包括如下步骤：
1、称取无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的含量；
2、将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分溶解在水中，优选二蒸水；
3、用水将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的溶解混合物定容到1L，即制得无血清培养基。
实施例4
一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，以RPMI1640培养基为基础，还含有添加成分，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸7g/L、酚红·钠0.01g/L、L-谷氨酸0.2-0.6g/L、碳酸氢钠5g/L、胰岛素0.02g/L、转铁蛋0.002-0.005g/L、硒0.01g/L、人血白蛋白5-50g/L、白介素-250-500IU/mL。
所述RPMI1640培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、糖。所述无机盐的浓度为：四水二硝酸钙0.1g/L、无水硫酸镁0.04884g/L、氯化钾0.4g/L、碳酸氢钠2g/L、氯化钠6g/L、磷酸氢二钠0.8g/L；所述氨基酸的浓度为：L-精氨酸0.2g/L、L-缬氨酸0.02g/L、L-天冬氨酸0.02g/L、L-天冬酰胺0.05g/L、L-半胱氨酸·二盐酸0.0652g/L、L-谷氨酸0.02g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、L-组氨酸0.015g/L、甘氨酸0.01g/L、L-异亮氨酸0.05g/L、L-羟脯氨酸0.02g/L、L-赖氨酸·盐酸0.04g/L、L-亮氨酸0.05g/L、L-脯氨酸0.02g/L、L-甲硫氨酸0.015g/L、L-丝氨酸0.03g/L、L-苯丙氨酸0.015g/L、L-苏氨酸0.02g/L、L-色氨酸0.005g/L、L-酪氨酸·二钠·水合物0.02883g/L；所述维生素的浓度为：p-氨基苯酸0.001g/L、D-生物素0.0002g/L、氯化胆碱0.003g/L、叶酸0.001g/L、还原性谷胱甘肽0.001g/L、肌醇0.035g/L、烟酰胺0.001g/L、D-泛酸·1/2钙0.00025g/L、吡哆醇·盐酸0.001g/L、核黄素0.0002g/L、维生素B120.000005g/L、硫胺素·盐酸0.1g/L；所述糖的浓度为：D-葡萄糖2g/L。
制备本发明所述适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基的方法，包括如下步骤：
1、称取无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的含量；
2、将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分溶解在水中，优选二蒸水；
3、用水将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的溶解混合物定容到1L，制得无血清培养基。
实施例5
一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，以RPMI1640培养基为基础，还含有添加成分，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸5.958g/L、酚红·钠0.0053g/L、L-谷氨酸盐0.4g/L、碳酸氢钠3g/L、胰岛素0.13g/L、转铁蛋白0.0035g/L、硒0.05g/L、人血白蛋白25g/L、白介素-2250IU/mL。
所述RPMI1640培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、糖。所述无机盐的浓度为：四水二硝酸钙0.1g/L、无水硫酸镁0.04884g/L、氯化钾0.4g/L、碳酸氢钠2g/L、氯化钠6g/L、磷酸氢二钠0.8g/L；所述氨基酸的浓度为：L-精氨酸0.2g/L、L-缬氨酸0.02g/L、L-天冬氨酸0.02g/L、L-天冬酰胺0.05g/L、L-半胱氨酸·二盐酸0.0652g/L、L-谷氨酸0.02g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、L-组氨酸0.015g/L、甘氨酸0.01g/L、L-异亮氨酸0.05g/L、L-羟脯氨酸0.02g/L、L-赖氨酸·盐酸0.04g/L、L-亮氨酸0.05g/L、L-脯氨酸0.02g/L、L-甲硫氨酸0.015g/L、L-丝氨酸0.03g/L、L-苯丙氨酸0.015g/L、L-苏氨酸0.02g/L、L-色氨酸0.005g/L、L-酪氨酸·二钠·水合物0.02883g/L；所述维生素的浓度为：p-氨基苯酸0.001g/L、D-生物素0.0002g/L、氯化胆碱0.003g/L、叶酸0.001g/L、还原性谷胱甘肽0.001g/L、肌醇0.035g/L、烟酰胺0.001g/L、D-泛酸·1/2钙0.00025g/L、吡哆醇·盐酸0.001g/L、核黄素0.0002g/L、维生素B120.000005g/L、硫胺素·盐酸0.1g/L；所述糖的浓度为：D-葡萄糖2g/L。
制备本发明所述适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基的方法，包括如下步骤：
1、称取无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的含量；
2、将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分溶解在水中，优选二蒸水；
3、用水将无机盐、氨基酸、维生素、糖以及添加成分的溶解混合物定容到1L，即制得无血清培养基。
实施例6
NKT细胞培养：对比本发明实施例1制备的无血清培养基、LONZAXVIVO15培养基和GIBVOAIM无血清培养基
(1)采集健康人30ml全血，将外周血转移到50mL离心管中，450-550g离心，取血浆。
(2)将下层血细胞用生理盐水稀释，混合均匀后转移到已加有淋巴分离液的sepmate离心管(从STEMCELL公司采购)中，600-800g离心。
(3)将离心后的上层液体倒入另一干净的离心管中，采用普通的RPMI1640培养基(GIBCO)洗涤两次，即得到外周血单个核细胞(PBMC)悬液。
(4)将上述得到的细胞悬液分为三组(下表1)，Aa组、Ab组和Ac组，分别按照一定接种密度接种于培养瓶中，添加10-100IU/mLIL-2、10-100ng/mlIL-21和10-100ng/mlOKT-3，培养NKT细胞，其中Aa组采用本发明提供的无血清培养基进行培养，Ab组采用LONZAXVIVO15培养基进行培养，Ac组采用GIBVOAIM无血清培养基进行培养。
(8)定期对细胞进行计数，补液，补加细胞因子，并进行观察和拍照，NKT细胞形态见下图1，其中图1a、图1b、图1c分别为Aa组、Ab组和Ac组的NKT细胞形态图。
(9)培养14天后，将NKT细胞收集后，进行流式检测和杀伤活性检测。流式检测加过见下图2，其中图2a、图2b、图2c分别为Aa组、Ab组和Ac组的流式检测结果。
此外，杀伤活性结果见下表2。图3为三种无血清培养基培养14天NKT细胞的增殖曲线图。
(10)根据以上实验结果可知，采用本发明配制的无血清培养基培养的NKT细胞，其增殖能力更强，标志表示物表达率更高，杀伤活性更好。
表1对比实验的分组
表2三种无血清培养基培养14天后NKT细胞的杀伤活性检测结果
实施例7
CIK细胞培养：对比本发明实施例2制备的无血清培养基、LONZAXVIVO15培养基和GIBVOAIM无血清培养基
(1)采集健康人30ml全血，将外周血转移到50mL离心管中，450-550g离心，取血浆。
(2)将下层血细胞用生理盐水稀释，混合均匀后转移到已加有淋巴分离液的sepmate离心管(从STEMCELL公司采购)中，600-800g离心。
(3)将离心后的上层液体倒入另一干净的离心管中，采用普通的RPMI1640培养基(GIBCO)洗涤两次，即得到外周血单个核细胞(PBMC)悬液。
(4)将上述得到的细胞悬液分为三组(表1)，Ba组、Bb组和Bc组，分别按照一定接种密度接种于培养瓶中，添加10-100IU/mLIL-2、10-100ng/mlIL-21和10-100ng/mlOKT-3，培养CIK细胞，其中Ba组采用本发明提供的无血清培养基进行培养，Bb组采用LONZAXVIVO15培养基进行培养，Bc组采用GIBVOAIM无血清培养基进行培养。
(5)定期对细胞进行计数，补液，补加细胞因子，并进行观察和拍照，CIK细胞形态见下图4，其中图4a、图4b、图4c分别为Ba组、Bb组和Bc组的CIK细胞形态图。
(6)培养14天后，将CIK细胞收集后，进行流式检测和杀伤活性检测。流式检测加过见下图5，其中图5a、图5b、图5c分别为Ba组、Bb组和Bc组的流式检测结果。
此外，杀伤活性结果见下表3。图6为三种无血清培养基培养14天CIK细胞的增殖曲线图。
(7)根据以上实验结果可知，采用本发明配制的无血清培养培养培养的CIK细胞，其增殖能力更强，标志表示物表达率更高，杀伤活性更好。
表3三种无血清培养基培养14天后CIK细胞的杀伤活性检测结果
实施例8NK细胞培养：对比本发明实施例5制备的无血清培养基、LONZAXVIVO15培养基和GIBVOAIM无血清培养基
(1)采集健康人45ml全血，将外周血转移到50mL离心管中，450-550g离心，取血浆。
(2)将下层血细胞用生理盐水稀释，混合均匀后转移到已加有淋巴分离液的sepmate离心管(从STEMCELL公司采购)中，600-800g离心。
(3)将离心后的上层液体倒入另一干净的离心管中，采用普通的RPMI1640培养基(GIBCO)洗涤两次，即得到外周血单个核细胞(PBMC)悬液。
(4)采用NK分选试剂盒(购至STEMCELL公司)将NK细胞从上述PBMC悬液中分选出来。
(5)将上述分选得到的细胞悬液分为三组(表1)，Ca组、Cb组和Cc组，分别按照一定接种密度接种于培养瓶中，添加10-100IU/mLIL-2、10-100ng/mlIL-21和10-100ng/mlOKT-3，培养CIK细胞，其中Ca组采用本发明提供的无血清培养基进行培养，Cb组采用LONZAXVIVO15培养基进行培养，Cc组采用GIBVOAIM无血清培养基进行培养。
(6)定期对细胞进行计数，补液，补加细胞因子，并进行观察和拍照，NK细胞形态见下图7，其中图7a、图7b、图7c分别为Ca组、Cb组和Cc组的NK细胞形态图。
(7)培养14天后，将NK细胞收集后，进行流式检测和杀伤活性检测。流式检测加过见下图8，其中图8a、图8b、图8c分别为Ca组、Cb组和Cc组的流式检测结果。
此外，杀伤活性结果见下表4。图9为三种无血清培养基培养14天NK细胞的增殖曲线图。
(8)根据以上实验结果可知，采用采用本发明配制的无血清培养培养培养的NK细胞，其增殖能力更强，标志表示物表达率更高，杀伤活性更好。
表4三种无血清培养基培养14天后NK细胞的杀伤活性检测结果
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (10)
1.一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，以RPMI1640培养基为基础，还含有添加成分，所述添加成分为羟乙基哌嗪硫磺酸、酚红·钠、L-谷氨酸盐、碳酸氢钠。
2.根据权利要求1所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸3-9/L、酚红·钠0.0001-0.1g/L、L-谷氨酸盐0.1-1g/L、碳酸氢钠0.5-8g/L。
3.根据权利要求1所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸5-7g/L、酚红·钠0.002-0.01g/L、L-谷氨酸盐0.2-0.6g/L、碳酸氢钠1-5g/L。
4.根据权利要求3所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加成分的浓度为：羟乙基哌嗪硫磺酸5.958g/L、酚红·钠0.0053g/L、L-谷氨酸盐0.4g/L、碳酸氢钠3g/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加成分还包括胰岛素、转铁蛋白、硒、人血白蛋白、白介素-2的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加成分的浓度为胰岛素0.001-0.1g/L、转铁蛋白0.001-0.01g/L、硒0.0001-0.1g/L、人血白蛋白2-60g/L、白介素-240-600IU/mL。
7.根据权利要求6所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加成分的浓度为胰岛素0.005-0.02g/L、转铁蛋白0.002-0.005g/L、硒0.001-0.01g/L、人血白蛋白5-50g/L、白介素-250-500IU/mL。
8.根据权利要求7所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述添加成分的浓度为胰岛素0.13g/L、转铁蛋白0.0035g/L、硒0.05g/L、人血白蛋白25g/L、白介素-2250IU/mL。
9.根据权利要求1所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述RPMI1640培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、糖。
10.根据权利要求9所述的一种适用于免疫细胞大规模培养的无血清培养基，其特征在于，所述无机盐包括四水二硝酸钙、无水硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠；所述氨基酸包括L-精氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸·二盐酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-羟脯氨酸、L-赖氨酸·盐酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-丝氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸·二钠·水合物；所述维生素包括p-氨基苯酸、D-生物素、氯化胆碱、叶酸、还原性谷胱甘肽、肌醇、烟酰胺、D-泛酸·1/2钙、吡哆醇·盐酸、核黄素、维生素、硫胺素·盐酸；所述糖包括D-葡萄糖。
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