CN104017770B - 一种利用糖脂制备cik细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种人体细胞因子诱导的杀伤细胞(简称CIK细胞)的制备和激活方法，即通过两种糖脂对人体免疫细胞的刺激作用，提高CIK细胞的增殖速度和活性。本发明在单个核细胞向CIK细胞诱导培养的过程先后加入α1-Galactosylceramide糖脂(简称KRN8000)和α2-Galactosylceramide糖脂(简称KRN9000)，可以有效的刺激CIK细胞活化，且两者有协同作用。再加上游离添加的CD3单克隆抗体和重组人IL-2等因子的刺激，可以在14天的培养时间内，使CIK细胞数量得到超过1000倍的增殖，活性CIK的比例，即CD3-CD8-CD56-CIK细胞的比例超过80％。

Description

一种利用糖脂制备CIK细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域中细胞培养领域，具体涉及一种利用糖脂制备CIK细胞的方法。

技术背景

细胞免疫治疗是继手术、放疗、化疗之后，而且是最有希望完全杀死癌细胞的第四大肿瘤治疗技术。目前肿瘤治疗临床使用最多的手术、放疗、化疗，均有不同程度的毒副作用，除给患者带来巨大的生理痛苦和精神恐惧以外，它们在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞，尤其是杀伤人体中生长发育旺盛的血液、淋巴组织细胞等。而CIK细胞免疫治疗是一种无痛苦无副作用的“和谐”治疗、“绿色”治疗方法。CIK细胞免疫疗法适用于多种实体肿瘤，包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等实体瘤手术后防止复发治疗，也可以用于多发性骨髓瘤、B淋巴瘤和白血病等血液系统恶性肿瘤的复发治疗。

CIK细胞制备技术是细胞免疫治疗过程中最重要的技术环节，是指把患者外周血液中的提取的单个核细胞在体外通过特定操作步骤培养诱导为大量的可以直接杀死各种肿瘤细胞的CIK细胞。之后，得到的CIK细胞再被输入患者体内，从而达到治疗肿瘤的效果。CIK细胞是一种免疫活性细胞，增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MMC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

目前市场上已有的细胞诱导技术只使用IFN-γ、CD3单克隆抗体、IL-2和IL-1a作为细胞诱导剂来培养CIK细胞，培养周期较长、肿瘤细胞杀伤率较低。培养周期长，与肿瘤细胞混合后12小时杀伤率为75％。因此，有必要提供一种更有效的制备、激活CIK细胞的方法

发明内容

本发明的目的是提供一种CIK细胞的高效制备方法，即通过KRN8000糖脂和KRN9000糖脂联合刺激外周血单核细胞，获得大量的CIK细胞并提高CIK细胞的活性，从而弥补现有技术的不足。

申请人在长期的研究中发现，将KRN8000糖脂和KRN9000糖脂在CIK细胞的诱导培养过程先后适量添加后，可以刺激活化CIK细胞，使其快速增殖。由该方法制备得到的CIK细胞活化比例不低于80％，培养周期由三周缩短至两周，极大的提高了培养NK细胞的效率，使CIK细胞12小时杀伤百分率由75％提高至85％，从而促成了本发明。

本发明的方法，是在CIK细胞制备的过程中，首先在培养液中添加α1-Galactosylceramide糖脂(KRN8000)，然后再添加α2-Galactosylceramide糖脂(KRN9000)进行活化和增殖。

本发明的方法，具体可包括有如下的步骤：

1)首先把人体外周血单个核细胞按照1～2×10⁶个/ml的浓度悬浮于细胞培养液中；

2)在步骤1)的细胞培养液中加入1000U/ml的重组人IFN-γ及50ng/ml的KRN8000在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时；

3)然后在细胞培养液中加入50ng/ml的CD₃单克隆抗体，300U/ml的重组人IL-2和50ng/ml的KRN9000进行培养；

4)在培养至第8天再次补充添加重组人IL-2和KRN9000；再培养两周后收获CIK细胞。

其中步骤1)所使用的培养液，其配方组成如下:

无水氯化钙200mg/L、硝酸铁0.1mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400mg/L、无水磷酸二氢钠125mg/L、L-盐酸精氨酸84mg/L、L-盐酸胱氨酸63mg/L、L-谷氨酰胺584mg/L、甘氨酸30mg/L、L-盐酸组氨酸42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-盐酸赖氨酸146mg/L、L-甲硫氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-色氨酸16mg/L、L-酪氨酸钠盐104mg/L、L-缬氨酸94mg/L、D-泛酸钙4mg/L、氯化胆碱4mg/L、叶酸4mg/L、肌醇7.2mg/L、烟酰胺4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺4mg/L、盐酸吡哆辛4mg/L、葡萄糖1000mg/L、丙酮酸钠110mg/L、酚红15mg/L。

其中CD3激发型单抗优选用克隆号为OKT3的激发型单抗。

本发明在单个核细胞向CIK细胞诱导培养的过程先后加入α1-Galactosylceramide糖脂(简称KRN8000)和α2-Galactosylceramide糖脂(简称KRN9000)，KRN8000可以调节NK细胞的活化和增殖，而KRN9000作为CIK细胞表面主要的活化受体的配体，可以有效的刺激CIK细胞活化，且两者有协同作用。再加上游离添加的CD3单克隆抗体和重组人IL-2等因子的刺激，可以在14天的培养时间内，使CIK细胞数量得到超过1000倍的增殖，活性CIK的比例，即CD3-CD8-CD56-CIK细胞的比例超过80％。

具体实施方式

本发明使用两种糖脂(KRN8000和KRN9000)作为细胞诱导剂，把细胞培养周期由三周缩短为两周，并却把收获的CIK细胞的12小时杀伤率由75％提高至85％

对于本发明所使用的α1-Galactosylceramide(KRN8000糖脂)和α2-Galactosylceramide(KRN9000糖脂)，可以使用市售的产品，本发明具体实施例中使用的是购自济南天鸣生物科技有限公司的产品。

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

实施例1：

(1)细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，使用淋巴细胞分离液离心分离得到单个核细胞，生理盐水洗涤2次，用60毫升的培养基重悬，取样计数后，确定单个核细胞纯度在90％以上。接种到细胞培养瓶中，加入1000U/ml的重组人IFN-γ及50ng/ml的KRN8000；在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。

其中培养液的配方组成如下:

无水氯化钙200mg/L、硝酸铁0.1mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400mg/L、无水磷酸二氢钠125mg/L、L-盐酸精氨酸84mg/L、L-盐酸胱氨酸63mg/L、L-谷氨酰胺584mg/L、甘氨酸30mg/L、L-盐酸组氨酸42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-盐酸赖氨酸146mg/L、L-甲硫氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-色氨酸16mg/L、L-酪氨酸钠盐104mg/L、L-缬氨酸94mg/L、D-泛酸钙4mg/L、氯化胆碱4mg/L、叶酸4mg/L、肌醇7.2mg/L、烟酰胺4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺4mg/L、盐酸吡哆辛4mg/L、葡萄糖1000mg/L、丙酮酸钠110mg/L、酚红15mg/L。

上述的培养基是经过长期优化获得的，在同样的培养时间内，本发明的培养液对细胞的增殖效果要明显好于现有的细胞培养液，以现有的细胞培养方法及培养基进行平行比较的情况如下：

细胞接种：采集50毫升的静脉外周血，使用淋巴细胞分离液离心分离得到单个核细胞，生理盐水洗涤2次，用60毫升的培养基重悬，取样计数后，确定单个核细胞纯度在90％以上。接种到细胞培养瓶中，仅加入1000U/ml的重组人IFN-γ而不加入50ng/ml的KRN8000；在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。

其中市场上现有的MEM系列细胞培养液的配方组成如下:

氯化镁200mg/L、氯化钾400mg/L、氯化钠6500mg/L、无水磷酸二氢钠1154mg/L、L-门冬酰胺126mg/L、L-盐酸胱氨酸32.4mg/L、L-谷氨酰胺292mg/L、L-盐酸组氨酸42mg/L、L-异亮氨酸52mg/L、L-亮氨酸52mg/L、L-盐酸赖氨酸72.5mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸32mg/L、L-苏氨酸48mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-酪氨酸钠盐54.52mg/L、L-缬氨酸46mg/L、D-泛酸钙1mg/L、叶酸1mg/L、肌醇2mg/L、烟酰胺1mg/L、氯化胆碱1mg/L、盐酸吡哆辛1mg/L、核黄素0.1mg/L、盐酸硫胺1mg/L、葡萄糖2000mg/L、酚红10mg/L。

以倒置显微镜对上述两种平行方法培养得到的细胞进行计数，证明，以本发明中的细胞培养方法，细胞增殖速度比现有方法提高约30％。再使用ThermoScientific针对IFN-γ的单独的抗体试剂盒进行酶联免疫斑点检测(ELISPOT)，证明，以本发明中的细胞培养方法，细胞分泌量比现有方法提高10％。

(2)二次刺激：加入50ng/ml的CD3单克隆抗体，300U/ml的重组人IL-2和50ng/ml的KRN9000。

为了最大程度上配合KRN9000发挥效果，CD3激发型单抗选用克隆号为OKT-3激发型单抗，其可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其他克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。

(3)转移培养：接种后的细胞在培养4天后，将细胞由一瓶扩瓶为两瓶继续培养，添加培养基至300毫升。

(4)三次刺激：扩大培养至第8天时，取样计数，再次补充细胞培养基、300U/ml的重组人IL-2和50ng/ml的KRN9000。

(5)扩大培养：每隔2天，根据细胞浓度补充无血清培养基，并按500单位/毫升的浓度添加IL-2，按10纳克/毫升的浓度添加IL-21，在培养至第14天时完成培养。取样进行细胞计数和流式细胞仪分析。

(6)细胞收获及质控：使用苔盘蓝进行染色检测确定细胞活性，活细胞应在80％以上。

检测结果表明，实施例中利用糖脂诱导培养的CIK细胞经14天诱导后即可迅速增殖，且细胞活性已超过80％；而常规培养需培养三周后，才能使活细胞比例达到80％以上。同时对CIK细胞进行病原学检测为阴性，且内毒素检测小于0.7EU/ml。其CD3+、CD3+/CD56+表达较常规培养方法获得的CIK细胞有所增高，另外，其它活化表面标志如HLA-DR、CD25、CD69、CD28表达均增加，以及参与杀瘤机制的表面标志如CD54、CD11a、FasL也均有更高表达。

利用本发明方法诱导培养14天后获得的CIK细胞对不同肿瘤细胞均有杀伤作用，其12小时杀伤百分率均达85％，较常规培养获得的CIK细胞提高10％以上。

在本发明的方法中，对KRN8000和KRN9000加入的先后顺序与CIK细胞的活性密切相关。先加入KRN8000，培养24小时后再加入KRN9000，可明显提高CIK细胞的活性。

Claims (2)

1.一种CIK细胞的制备方法，其特征在于,所述的方法包括有如下的步骤：

1)首先把人体外周血单个核细胞按照1～2×10⁶个/ml的浓度悬浮于细胞培养液中；

2)在步骤1)的细胞培养液中加入1000U/ml的重组人IFN-γ及50ng/ml的KRN8000；在37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时；

3)然后在细胞培养液中加入50ng/ml的CD₃单克隆抗体，300U/ml的重组人IL-2和50ng/ml的KRN9000进行培养；

4)在培养至第8天再次补充添加重组人IL-2和α2-Galactosylceramide糖脂；再培养两周后收获CIK细胞；

其中使用的培养液，其配方组成如下：

无水氯化钙200mg/L、硝酸铁0.1mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400mg/L、无水磷酸二氢钠125mg/L、L-盐酸精氨酸84mg/L、L-盐酸胱氨酸63mg/L、L-谷氨酰胺584mg/L、甘氨酸30mg/L、L-盐酸组氨酸42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-盐酸赖氨酸146mg/L、L-甲硫氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-色氨酸16mg/L、L-酪氨酸钠盐104mg/L、L-缬氨酸94mg/L、D-泛酸钙4mg/L、氯化胆碱4mg/L、叶酸4mg/L、肌醇7.2mg/L、烟酰胺4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺4mg/L、盐酸吡哆辛4mg/L、葡萄糖1000mg/L、丙酮酸钠110mg/L、酚红15mg/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3)中CD₃单克隆抗体是克隆号为OKT 3的激发型单抗。