CN104928241B - 一种增强型nk细胞的活化方法及细胞制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于体外活化扩增培养NK细胞的培养基，利用该培养基体外活化扩增培养NK细胞的方法，以及含有所述方法制备的体外活化扩增的NK细胞的生物制剂。用本发明NK细胞专用培养基重悬单核细胞，添加人CD3抗体和TLR7/8激动剂。所述NK细胞专用培养基是在无血清培养基中含有人血白蛋白、IL‑2、IL‑15和离体人血浆的培养基。
Description
技术领域：
本发明涉及免疫细胞体外培养领域，具体地涉及一种增强型NK细胞(自然杀伤细胞)活化方法、使用该NK细胞的NK细胞增殖方法及细胞制备方法。
背景技术：
早在20世纪70年代，在肿瘤免疫研究中就发现来自正常机体的淋巴细胞可以杀伤某些肿瘤细胞，随后证实这些淋巴细胞的杀伤作用是天然的，无需有抗体存在或预先加以致敏，因此将其命名为自然杀伤(natural killer cell，NK)细胞。NK细胞是机体抵抗恶性肿瘤或病毒感染的重要免疫调节细胞，其通过表面受体与靶细胞表面配体的特异性结合来调控自身活化，直接杀伤肿瘤浸润或病毒感染的细胞，或分泌细胞因子诱导炎症反应和调控其他免疫细胞。随着对NK细胞识别人类肿瘤分子机制研究的不断深入，以NK细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗已经引起重视并取得了重大进展。目前有关NK细胞在肿瘤免疫治疗的研究主要集中在自体NK细胞过继免疫治疗、异体NK细胞过继免疫治疗及基因修饰NK细胞免疫治疗等，并取得了一定成效。但如何在保证临床安全性的前提下提高NK细胞体外增殖效率和杀伤活性，增强适用于临床应用的NK细胞的离体增殖和活化的改进后的、简化并具有成本有效的方法仍存有很大需求。
多年来，人们一直尝试能在体外实现NK细胞的大量扩增，传统NK细胞培养方法中需要使用PHA和/或肿瘤细胞株(例如K562、K562-MB15-41BBL、HFWT)作为刺激因子和滋养层细胞来培养NK细胞，除了具有繁琐的细胞培养步骤之外，使用PHA和肿瘤细胞株也带来临床应用的安全问题。目前常用的技术主要是在体外培养体系中加入IL-2、IL-12、IL-18、IL-7、TNF-α等多种细胞因子组合来促进NK细胞的扩增，但经过一段时间后仅可以使NK细胞扩增几倍或几十倍，纯度亦不够理想，且杀伤活性亦不理想，因此不能完全满足实际应用的需求；而且这些已知方法由于对细胞因子的需求量较大、成本较高，培养效果不稳定，不适合大规模的应用。
因此，通过离体培养后扩增NK细胞，并增强其功能性，对于采用其进行免疫疗法的临床适用性是至关重要的。
TLR7/8激动剂(GDQ)具有很强的诱导体内抗原递呈细胞DC细胞因子分泌的能力，尤其是促进I型干扰素和IL-12分泌的作用更为明显，这些细胞因子又可以进一步促进NK细胞的活化和T细胞的增殖。也就是说，TLR7/8激活后可作用于多种免疫细胞，激活机体的天然免疫和获得性免疫应答，从而放大了局部炎症性反应，诱导整个机体的Thl类反应，从而加速病原体的清除和肿瘤细胞的凋亡。NK细胞的肿瘤杀伤作用主要依赖于表达表面活化性受体传递的活化性信号和抑制性受体传递的抑制性信号的平衡。因此，我们选用Gardiquimod(GDQ)，通过改变NK细胞表面活化性受体和抑制性受体的平衡状态而增强NK细胞的肿瘤杀伤作用。
发明内容：
本发明提供一种NK细胞体外活化扩增的方法、其专用培养基、含有该专用培养基的产品、以及由本发明方法活化的细胞和包含该活化细胞的制剂。
采用本发明能够提供可在不与K562等肿瘤细胞混合的情况下安全且简单有效地使对于各种肿瘤细胞、病毒感染细胞等具有非特异性杀伤活性或ADCC活性的NK细胞活化而增殖的NK细胞活化方法以及使用该方法的NK细胞增殖方法及细胞制备方法。此外还提供本发明方法制备的能够含有大量NK细胞的单核细胞。
在本发明的NK细胞活化方法的优选示例中，通过所述GDQ刺激剂和CD3激动剂共同刺激单核细胞，使NK细胞的增殖优于T细胞的增殖。由于NK细胞不表达CD3分子，所以可认为是经基于CD3激动剂和GDQ刺激剂的T细胞活化而产生的二次效应。
根据本发明NK细胞活化方法，通过GDQ刺激剂刺激含T细胞和NK细胞的单核细胞，因此与T细胞相比可更多地活化NK细胞，可在不与K562等肿瘤细胞混合的情况下安全且简单有效地使NK细胞活化并增殖。
根据本发明的NK细胞活化方法，可制备大量的NK细胞，能够制备60％以上比例包含NK细胞的单核细胞，例如以70-90％的比例包含NK细胞的单核细胞。本发明的单核细胞是含T细胞和NK细胞的单核细胞，而60％以上的比例包含通过TLR7/8激动剂(GDQ)给予刺激而二次增殖得到的NK细胞。
本发明提供的NK细胞活化方法中，通过GDQ刺激含有T细胞和NK细胞的单核细胞群而使NK细胞活化。采用GDQ刺激剂的单核细胞的刺激可在细胞因子的存在下，优选是在含有细胞因子的体外扩增培养NK细胞的NK细胞专用培养基中进行。与常规NK细胞培养体系所使用的多种细胞因子组合相比较，本发明仅使用了IL-2和IL-15，达到了促进NK细胞大量增殖并提高细胞毒性的效果。本发明用于NK细胞的专用培养基是在无血清培养基中添加人血白蛋白、IL-2、IL-15和离体人血浆得到的液体培养基。
在一个方面，本发明提供了一种体外扩增培养NK细胞的NK细胞专用培养基，其在无血清培养基中含有如下含量范围的成分：浓度为1-20g/L的人血白蛋白；浓度为10-50ng/ml的IL-2；浓度为10-50ng/ml的IL-15；1-5％体积百分比的离体人血浆。所述无血清培养基优选包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素，优选硒。
在另一个方面，本发明提供了一种离体培养NK细胞的方法，所述方法包括：
1)从离体外周血、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤、胸水、腹水或脐带血采集单核细胞；
2)用本发明NK细胞专用培养基重悬上述细胞，并添加作为CD3激动剂的人CD3抗体；TLR7/8激动剂；所述NK细胞专用培养基是在无血清培养基中含有如下含量范围的成分的培养基：浓度为1-20g/L的人血白蛋白；浓度为10-50ng/ml的IL-2；浓度为10-50ng/ml的IL-15；1-5％体积百分比的离体人血浆。所述无血清培养基优选包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素，优选硒。
在本发明优选的实施方案中，提供了一种离体培养NK细胞的方法，所述方法包括：
1)对从离体外周血、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤、胸水、腹水或脐带血采集的单核细胞进行刺激，所述的单核细胞优选由外周血单核细胞组成；
2)向步骤1)得到的单核细胞加入生理盐水稀释后，将稀释后的样品缓慢加入离心管中，离心，取白膜层细胞并用生理盐水洗涤，再次离心后用生理盐水重悬，重复一次后，弃上清；
3)用本发明NK细胞专用培养基重悬上述细胞，并添加作为CD3激动剂的人CD3抗体；TLR7/8激动剂；所述NK细胞专用培养基是在无血清培养基中含有如下含量范围的成分的培养基：浓度为1-20g/L的人血白蛋白；浓度为10-50ng/ml的IL-2；浓度为10-50ng/ml的IL-15；1-5％体积百分比的离体人血浆。所述无血清培养基优选包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素，优选硒。
4)培养至3-8天之后，每1-3天更换一次新鲜NK细胞专用培养基(不含OKT-3与GDQ)，并添加IL-2和IL-15，维持培养，10-20天后即可收获大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。
在本发明更优选实施方案中，提供了一种离体培养NK细胞的方法，所述方法包括：
1)对从离体外周血或脐带血采集的单核细胞进行刺激，所述的单核细胞优选由外周血单核细胞组成。离体人血浆终浓度为1-5％(体积百分比)；
2)取离体外周血或脐带血(优选静脉血)按1∶1加入生理盐水稀释后，取稀释后的血液缓慢加入离心管中，800-2000rpm，离心10-30min，取白膜层细胞并用生理盐水洗涤后，800-2000rpm，离心10-30min后用生理盐水重悬，重复一次后，弃上清；
3)用本发明NK细胞专用培养基重悬上述细胞，并添加作为CD3激动剂的人CD3抗体(Orthoclone OKT-3；Ortho Biotech，Raritan，NJ)，抗体终浓度调至5-200ng/ml；TLR7/8激动剂(GDQ，Gardiquimod购于Invivo Gen公司，用无内毒素无菌水溶解，浓度为1-2.5mg/ml，保存于-20℃备用)的终浓度调至0.5-10ug/ml；所述NK细胞专用培养基是在无血清培养基中含有如下含量范围的成分的培养基：浓度为1-20g/L的人血白蛋白；浓度为10-50ng/ml的IL-2；浓度为10-50ng/ml的IL-15；1-5％体积百分比的离体人血浆；所述无血清培养基优选包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素硒。
4)培养至第3-8天后，每1-3天更换一次新鲜NK细胞专用培养基(不含OKT-3与GDQ)，并添加终浓度为10-50ng/ml的IL-2和10-50ng/ml的IL-15，维持细胞浓度在2X106/ml左右，14天后即可收获大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。
由本发明方法制备得到的含有活化并增殖的NK细胞的单核细胞群以及包含由本发明方法制备得到的含有活化并增殖的NK细胞的单核细胞群的制剂也属于本发明的保护范围。
附图简要说明：
附图1是实施例1培养的NK细胞与常规方法培养的NK细胞扩增倍数比较结果。附图2是实施例1的方法获得的NK细胞与常规方法获得的NK细胞纯度的比较结果。
附图3是实施例1的方法获得的NK细胞与常规方法获得的NK细胞对K562细胞杀伤活性的比较结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1离体培养自外周血采集的NK细胞
本实施例提供的离体培养NK细胞的方法包括以下步骤：
1)从离体外周血采集单核细胞。将离体静脉血20ml按1∶1加入生理盐水稀释后，取10ml稀释后的血液缓慢加入15ml离心管中，1500rpm，离心20min，取白膜层细胞并用生理盐水洗涤后，1200rpm，离心10min后用生理盐水重悬，重复一次后，弃上清。
2)用本发明NK细胞专用培养基重悬上述细胞，所述NK细胞专用培养基是在无血清培养基中含有如下含量范围的成分：浓度为10g/L的人血白蛋白；浓度为20ng/ml的IL-2；浓度为20ng/ml的IL-15；2％体积百分比的离体人血浆。并添加作为CD3激动剂的人CD3抗体(Orthoclone OKT-3；Ortho Biotech，Raritan，NJ)，抗体终浓度调至100ng/ml；TLR7/8激动剂(GDQ，Gardiquimod购于Invivo Gen公司，用无内毒素无菌水溶解，浓度为1-2.5mg/ml，保存于-20℃备用)的终浓度调至1ug/ml；所述无血清培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，其中添加浓度为5mM的L-谷氨酰胺，浓度为10mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为8g/L的重组人白蛋白，浓度为5mg/L的重组人胰岛素，浓度为50mg/L的维生素PP，浓度为30mg/L的维生素C，浓度为30ng/mL的氢化可的松，浓度为5mg/L微量元素(硒)。
3)培养至第5天后，每2天更换一次新鲜本发明NK细胞专用培养基(不含OKT-3与GDQ)，并添加终浓度为20ng/ml的IL-2和20ng/ml的IL-15，维持细胞浓度在2X106/ml左右，14天后即可收获大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。继续培养至第21天。
实施例2离体培养自腹水采集的NK细胞
本实施例提供的离体培养NK细胞的方法包括以下步骤：
1)从腹水采集单核细胞。
2)用本发明NK细胞专用培养基重悬上述细胞，所述NK细胞专用培养基是在无血清培养基中含有如下含量范围的成分：浓度为5g/L的人血白蛋白；浓度为30ng/ml的IL-2；浓度为30ng/ml的IL-15；1％体积百分比的离体人血浆。并添加作为CD3激动剂的人CD3抗体(Orthoclone OKT-3；Ortho Biotech，Raritan，NJ)，抗体终浓度调至150ng/ml；TLR7/8激动剂(GDQ，Gardiquimod购于Invivo Gen公司，用无内毒素无菌水溶解，浓度为1-2.5mg/ml，保存于-20℃备用)的终浓度调至5ug/ml；所述无血清培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，其中添加浓度为5mM的L-谷氨酰胺，浓度为10mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为8g/L的重组人白蛋白，浓度为5mg/L的重组人胰岛素，浓度为50mg/L的维生素PP，浓度为30mg/L的维生素C，浓度为30ng/mL的氢化可的松，浓度为5mg/L微量元素(硒)。
3)培养至第6天后，每2天更换一次本发明新鲜NK细胞专用培养基(不含OKT-3与GDQ)，并添加终浓度为30ng/ml的IL-2和30ng/ml的IL-15，维持细胞浓度在2X106/ml左右，14天后即可收获大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。继续培养至第21天。
实施例3常规方法培养NK细胞
从外周血采集单核细胞。将离体静脉血20ml按1∶1加入生理盐水稀释后，取10ml稀释后的血液缓慢加入15ml离心管中，1500rpm，离心20min，取白膜层细胞并用生理盐水洗涤后，1200rpm，离心10min后用生理盐水重悬，重复一次后，弃上清。
用NK细胞培养基重悬上述细胞，所述NK细胞培养基是在CellGro SCGM无血清培养基(CellGenix，Freiburg，Germany；产品编号：YS-SO-0001334)中含有如下含量范围的成分：浓度为50g/L的人血白蛋白；浓度为60ng/ml的IL-2；50ng/ml的IL-7；10ng/ml的IL-12；10ng/ml的IL-18；25ng/ml的TNF-α；8％体积百分比的离体人血浆。培养至第5天后，每2天更换一次新鲜NK细胞培养基，维持细胞浓度在2X106/ml左右，14天后即可收获大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。继续培养至第21天。
实施例4本发明实施例1培养的NK细胞与实施例3常规方法培养的NK细胞扩增倍数比较
分别在第0、7、14及21天从两组取培养后的细胞，用台盼蓝染色后计数，计算细胞的扩增倍数，以此动态比较两组细胞的扩增情况，结果如图1所示。
由图可以看出，在7、14及21天，本发明实施例1培养的NK细胞扩增倍数都比常规方法培养的NK细胞扩增倍数高。说明本发明方法有效刺激了NK细胞的扩增。
实施例5本发明实施例1的方法获得的NK细胞与实施例3常规方法获得的NK细胞纯度的比较
取培养第14天的细胞培养液，PBS洗涤两次后，洗涤后调整细胞浓度为1X106/ml，加入流式抗体，4℃避光孵育30min，洗掉多余抗体后，用PBS重悬后进行细胞表型检测。结果在图2中给出。结果显示：常规组的CD3-CD(16+56)+NK细胞占60.7±1.1％(图2A)，本方法CD3-CD(16+56)+NK细胞占92.3±2.1％，本方法获得细胞的纯度显著高于常规组(P＜0.05)(图2B)。
实施例5本发明实施例1的方法获得的NK细胞与实施例3常规方法获得的NK细胞对K562细胞杀伤活性的比较
以处于对数生长期的K562细胞作为靶细胞，将其浓度调整为1X105/ml，将两种方法培养14天NK细胞作为效应细胞，按1∶1、2∶1、5∶1和10∶1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合培养，同时设效应细胞孔、靶细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终体积均为200ul，置于37℃5％CO2培养箱孵育，12h后每孔加入20ulCCK-8(Cell Counting Kit，CCK-8，购自日本同仁CCK8试剂盒，产品型号：CK04)溶液，继续孵育4h后用酶标仪检测450nm时的OD值，按照以下公式计算杀伤率：
杀伤率(％)＝[1-(实验孔OD值-效应孔OD值/靶细胞孔OD值)]X100％
结果如表1和图3所示，可以看出，在不同效靶比作用下，本发明方法所得NK细胞对K562细胞的杀伤活性均显著高于常规组(P＜0.01)。
表1：
Claims (5)
1.一种离体培养NK细胞的方法，所述方法包括：
1)从外周血、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤、胸水、腹水或脐带血采集单核细胞；
2)用NK细胞培养基重悬上述细胞，并添加作为CD3激动剂的人CD3抗体和TLR7/8激动剂；
所述NK细胞培养基是在无血清培养基中含有如下含量的成分：浓度为1-20g/L的人血白蛋白；浓度为10-50ng/ml的IL-2；浓度为10-50ng/ml的IL-15；1-5％体积百分比的离体人血浆；
所述无血清培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素。
2.一种离体培养NK细胞的方法，所述方法包括：
1)对从外周血、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤、胸水、腹水或脐带血采集的单核细胞进行刺激，所述的单核细胞由外周血单核细胞组成；
2)向步骤1)得到的单核细胞加入生理盐水稀释后，将稀释后的样品缓慢加入离心管中，离心，取白膜层细胞并用生理盐水洗涤，再次离心后用生理盐水重悬，重复一次后，弃上清；
3)用NK细胞培养基重悬上述细胞，并添加作为CD3激动剂的人CD3抗体和TLR7/8激动剂；
4)培养至3－8天之后，每1－3天更换一次新鲜的NK细胞培养基，其中不含OKT-3与GDQ，并添加IL-2和IL-15，维持培养；
所述NK细胞培养基是在无血清培养基中含有如下含量的成分：浓度为1-20g/L的人血白蛋白；浓度为10-50ng/ml的IL-2；浓度为10-50ng/ml的IL-15；1-5％体积百分比的离体人血浆；
所述无血清培养基包括以下含量的成分：RPMI-1640培养基，其中添加浓度为1-10mM的L-谷氨酰胺，浓度为5-20mg/L的重组人转铁蛋白，浓度为1-10g/L的重组人白蛋白，浓度为1-10mg/L的重组人胰岛素，浓度为10-100mg/L的维生素PP，浓度为10-50mg/L的维生素C，浓度为1-50ng/mL的氢化可的松，浓度为1-10mg/L微量元素。
3.一种权利要求1或2离体培养NK细胞的方法，其中所述人CD3抗体的终浓度是5-200ng/ml；TLR7/8激动剂的终浓度是0.5-10ug/ml。
4.一种权利要求1-3任一所述方法制备的含有活化扩增的NK细胞的单核细胞群。
5.一种包含权利要求4的含有活化扩增的NK细胞的单核细胞群的生物制剂。
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| CN103249404A (zh) * | 2010-07-02 | 2013-08-14 | 北卡罗来纳-查佩尔山大学 | 生物基质支架 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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