CN115044548A - 一种无血清培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无血清培养基及其应用，涉及免疫细胞无血清培养基的生物领域，具体而言，本发明提供了的无血清培养基包括激素类、蛋白类、氨基酸类、维生素类、脂质类、无机盐类和添加剂，应用于培养多种免疫细胞，如脐带血、外周血和骨髓等多种免疫细胞，能降低培养基成本，从而也能大大降低免疫细胞治疗的成本；而且培养的免疫细胞比例、扩增倍数和杀伤活性都优于现有的无血清培养基。

Description

一种无血清培养基及其应用
技术领域
本发明涉及免疫细胞无血清培养基的生物领域，具体而言，涉及一种无血清培养基及其应用。
背景技术
免疫细胞治疗是一种新兴的、具有显著疗效的全新的抗肿瘤治疗方法，弥补了传统的手术、放疗、化疗的弊端，已经被认为是二十一世纪肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有发展前途的一种治疗手段。肿瘤免疫细胞治疗的程序大致是采集患者外周静脉血或者异体供者的外周血或者脐带血，在GMP实验室内分离免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。常用的免疫细胞治疗手段包括细胞因子诱导的杀伤细胞CIK、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、自然杀伤细胞NK和γδT细胞等。免疫细胞在治疗肿瘤上的作用已经得到证实，但其疗效和体外培养免疫细胞的数量和功能有密切正相关关系。
传统的免疫细胞的扩增体系，主要是基础培养基添加一定浓度的动物血清或者人AB血清。动物或者人血清中含有异种或者异体蛋白质，它本身也有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病的风险。另外，有研究表明免疫细胞在培养过程中可以吞噬培养基中的异种或者异体蛋白，可以使受者体内产生抗异种或者异体蛋白抗体引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注细胞治疗后治疗失效（Fetal Bovine Serum (FBS): Past - Present –Future. ALTEX. 2018;35(1):99-118. doi: 10.14573/altex.1705101）。因此异种或者异体血清在临床大规模培养免疫细胞中的不利因素已经逐渐暴露出来。国家药品监督管理局于2017年发布了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》，在文件中明确指出细胞培养过程中，应尽量避免使用动物或人来源的血清。2019年，中国医药生物技术协会发布的《免疫细胞制剂制备质量管理自律规范》中也对免疫细胞制备中使用的培养基提出行业规范要求：免疫细胞体外扩增培养应避免使用异种、异体血清或血浆。所有成分应明确并符合无菌、低内毒素的质量标准。
无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分，既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。成分明确的无血清培养基是免疫细胞体外扩增培养技术发展的方向。现有很多商业化无血清培养基只能做到高密度培养、扩增一种或少数几种免疫细胞，缺少通用性，也没办法实现大规模产业化培养免疫细胞。目前市场上已经有几种具有广泛适用性，适合培养多种免疫细胞的无血清培养基进口商品，其中美国LONZA公司开发X-VIVO免疫细胞无血清培养基和美国Thermo Fisher公司开发AIM-V免疫细胞无血清培养基的使用最为广泛，占据绝对市场垄断地位。这两种X-VIVO和AIM-V免疫细胞无血清培养基存在以下几种缺点：一、价格昂贵，尤其是治疗级AIM-V免疫细胞无血清培养基的价格达到2500元/L，这大大的增加了免疫细胞治疗的制备成本，不利于广泛应用的推广；二、 这两种进口培养基在美国生产，供货时间周期较长，尤其是当前疫情对全球物料供应的影响，更加加大了供货的时长；三、免疫细胞扩增倍数较低、培养的免疫细胞功能较低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无血清培养基及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种无血清培养基，其包括以下组分：激素类、蛋白类、氨基酸类、维生素类、脂质类、无机盐类和添加剂。其中，所述激素类包括以下组分：重组人胰岛素和皮质醇；所述蛋白类包括以下组分：重组人血白蛋白和重组人转铁蛋白；所述氨基酸类包括以下组分：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺和N-乙酰-半胱氨酸；所述维生素类包括以下组分：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、肌醇、维生素B12、生物素、维生素C和维生素E；所述脂质类包括以下组分：花生四烯酸、胆固醇、DL-α -生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸和硬脂酸；所述无机盐类包括以下组分：CaCl2、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、NaH2PO4、Na2SeO3•5H2O、CuSO4•5H2O、ZnSO4•7H2O、FeC6H5O7、MnSO4•H2O、Na2SiO3•9H2O、(NH4)6Mo7O24、NH4VO3、NiSO4•6H2O、SnCI2、AICI3•6H2O、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCI2、CoCI2•6H2O、CrCI3、NaF、GeO2、KI、RbCI和ZrOCI2•8H2O；所述添加剂包括以下组分：吐温80、2-巯基乙醇、D-葡萄糖、HEPES、丙酮酸钠和肝素。
第二方面，本发明实施例提供了组合物在制备用于培养免疫细胞的无血清培养基中的应用，所述组合物包括如前述任意实施例所述的无血清培养基的组分。
第三方面，本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的无血清培养基在培养免疫细胞中的应用。
本发明具有以下有益效果：
（1）形成免疫细胞无血清培养基配方，降低培养基成本，从而也能大大降低免疫细胞治疗的成本；
（2）可以培养脐带血、外周血和骨髓等多种免疫细胞，而且培养的免疫细胞比例、扩增倍数和杀伤活性都优于进口无血清培养基。
（3）丰富了免疫细胞无血清培养基产品的种类，避免了供应不足的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的技术路线示意图；
图2为三种不同无血清培养基培养CIK细胞的CD56+CD3+表型检测结果；
图3为三种不同无血清培养基培养NK细胞的CD56+CD3-表型检测结果；
图4为三种不同无血清培养基培养γδ细胞的CD3+TCRγδ+表型检测结果；
图5为三种不同无血清培养基培养CTL细胞的CD3+CD8+表型检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
体外培养、扩增免疫细胞使用最大的试剂是培养基，培养基为免疫细胞的生长扩增提供了基本的环境，包括适宜的渗透压，为淋巴细胞的扩增提供生长所必需的营养成分，包括氨基酸、无机盐、微量元素、维生素等，同时也保护免疫细胞免受代谢过程中产生的毒性物质的损害。针对现有的无血清培养只能做到高密度培养、扩增一种或少数几种免疫，缺少通用性的问题，本申请发明人经一系列创造性劳动后提出并验证了一种高效的免疫细胞培养基，这种培养基的化学成分明确，无动物源、无血清，能够解决现有技术中存在的上述问题。
具体地，本发明实施例提供了一种无血清培养基，其包括以下组分：激素类、蛋白类、氨基酸类、维生素类、脂质类、无机盐类和添加剂；所述激素类包括以下组分：重组人胰岛素和皮质醇；所述蛋白类包括以下组分：重组人血白蛋白和重组人转铁蛋白；所述氨基酸类包括以下组分：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺和N-乙酰-半胱氨酸；所述维生素类包括以下组分：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、肌醇、维生素B12、生物素、维生素C和维生素E；所述脂质类包括以下组分：花生四烯酸、胆固醇、DL-α -生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸和硬脂酸；所述无机盐类包括以下组分：CaCl2、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、NaH2PO4、Na2SeO3•5H2O、CuSO4•5H2O、ZnSO4•7H2O、FeC6H5O7、MnSO4•H2O、Na2SiO3•9H2O、(NH4)6Mo7O24、NH4VO3、NiSO4•6H2O、SnCI2、AICI3•6H2O、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCI2、CoCI2•6H2O、CrCI3、NaF、GeO2、KI、RbCI和ZrOCI2•8H2O；所述添加剂包括以下组分：吐温80、2-巯基乙醇、D-葡萄糖、HEPES、丙酮酸钠和肝素。
在一些实施例中，本申请对重组人胰岛素、重组人血白蛋白和重组人转铁蛋白没有特别的限制，可以选自现有市售的任意重组人胰岛素、重组人血白蛋白和重组人转铁蛋白，或者基于文献公开的内容进行重组人胰岛素、重组人血白蛋白和重组人转铁蛋白的制备获取，均可以相同或相似的技术效果。
具体地，重组人胰岛素可以包括但不限于：诺和诺德(中国)制药有限公司生产的重组人胰岛素注射液（国药准字S20191007）。重组人血白蛋白可以包括但不限于华北制药公司生产的药用辅料级基因重组人血白蛋白，重组人转铁蛋白可以包括但不限于ProSpec供应的PRO-747（水稻植物细胞中重组表达）。
在一些实施例中，所述激素类包括的组分及其作用浓度如下：1~20mg/L 重组人胰岛素和1~100 μg/L皮质醇。可选地，所述重组人胰岛素的作用浓度可以为1 mg/L、2 mg/L、4mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、12 mg/L、14 mg/L、16 mg/L、18 mg/L、20 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。皮质醇的作用浓度可以为1μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、60μg/L、70μg/L、80μg/L、90μg/L、100μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述蛋白类包括的组分及其作用浓度如下：1~20 g/L重组人血白蛋白和1~20 mg/L重组人转铁蛋白。可选地，重组人血白蛋白的作用浓度可以为1g/L、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L、20 g/L中的任意一种或任意两种之间的范围，重组人转铁蛋白的作用浓度可以为1mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、12mg/L、14 mg/L、16 mg/L、18 mg/L、20 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述氨基酸类包括的组分及其作用浓度如下：50~500 mg/L L-精氨酸、20~200mg/L L-胱氨酸、20~180 mg/L L-组氨酸、30~300 mg/L L-异亮氨酸、30~300 mg/L L-亮氨酸、100~300 mg/L L-赖氨酸、10~100 mg/L L-蛋氨酸、50~200 mg/L L-苯丙氨酸、30~300mg/L L-苏氨酸、5~50 mg/L L-色氨酸、100~1000 mg/L L-酪氨酸、100~1000 mg/L L-缬氨酸、10~100 mg/L甘氨酸、10~100 mg/L L-丙氨酸、10~100 mg/L L-天冬酰胺、10~100 mg/LL-天冬氨酸、20~200 mg/L L-谷氨酸、10~100 mg/L L-脯氨酸、10~100 mg/L L-丝氨酸、100~1000 mg/L L-谷氨酰胺和30~300 mg/L N-乙酰-半胱氨酸。
可选地，L-精氨酸的作用浓度可以为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250mg/L、300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L、500 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。L-胱氨酸、L-谷氨酸的作用浓度独立地为20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。L-组氨酸的作用浓度可以为20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、N-乙酰-半胱氨酸的作用浓度可以独立地为30 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。L-赖氨酸的作用浓度可以为100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200 mg/L、220 mg/L、240 mg/L、260 mg/L、280 mg/L、300 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。L-蛋氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸的作用浓度可以独立地为10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。L-苯丙氨酸的作用浓度可以为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。L-色氨酸的作用浓度可以为5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L、45 mg/L、50 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-谷氨酰胺的作用浓度可以独立地为100mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L、900 mg/L、1000 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述维生素类包括的组分及其作用浓度如下：1~10 mg/L D-泛酸钙、1~10 mg/L氯化胆碱、1~10 mg/L叶酸、1~10 mg/L烟酰胺、1~10 mg/L盐酸吡哆醛、0.1~1mg/L核黄素、1~10mg/L盐酸硫胺素、2~15mg/L肌醇、0.001~0.02 mg/L维生素B12、0.001~0.02 mg/L生物素、2~20mg/L维生素C和2~20 mg/L维生素E。
可选地，D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛和盐酸硫胺素作用浓度可以为1mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。核黄素的作用浓度可以为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6 mg/L、0.7 mg/L、0.8 mg/L、0.9 mg/L、1 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。肌醇的作用浓度可以为2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、12 mg/L、14 mg/L、15 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。维生素B12和生物素的作用浓度可以独立地为0.001 mg/L、0.002 mg/L、0.004 mg/L、0.006 mg/L、0.008 mg/L、0.010 mg/L、0.012 mg/L、0.014 mg/L、0.016 mg/L、0.018 mg/L、0.20 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。维生素C和维生素E的作用浓度可以独立地为2mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、12 mg/L、14 mg/L、16 mg/L、18 mg/L、20 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述脂质类包括的组分及其作用浓度如下：0.01~0.05 mg/L花生四烯酸、1~5mg/L胆固醇、0.1~1 mg/L DL-α -生育酚乙酸酯、0.05~0.2mg/L亚油酸、0.05~0.2mg/L亚麻酸、0.05~0.2mg/L肉豆蔻酸、0.05~0.2mg/L油酸、0.05~0.2mg/L棕榈油酸、0.05~0.2mg/L棕榈酸和0.05~0.2mg/L硬脂酸。
可选地，花生四烯酸的作用浓度可以为0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.03 mg/L、0.04mg/L、0.05 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。胆固醇的作用浓度可以为1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L、3 mg/L、3.5 mg/L、4 mg/L、4.5 mg/L、5 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。DL-α -生育酚乙酸酯的作用浓度可以为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.6 mg/L、0.7 mg/L、0.8 mg/L、0.9 mg/L、1 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸和硬脂酸的作用浓度可以独立地为0.05 mg/L、0.07 mg/L、0.09 mg/L、0.10 mg/L、0.12 mg/L、0.14 mg/L、0.16 mg/L、0.18 mg/L、0.20 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述无机盐类包括的组分及其作用浓度如下：50~300mg/L CaCl2、20~200mg/LMgSO4、50~500mg/L KCl、500~5000mg/L NaHCO3、1000~10000mg/L NaCl、50~200 mg/LNaH2PO4、0.01~0.05 mg/L Na2SeO3•5H2O、0.5~3 μg/L CuSO4•5H2O、200~2000 μg/L ZnSO4•7H2O、200~2000μg/L FeC6H5O7、0.1~0.5μg/L MnSO4•H2O、20~200μg/L Na2SiO3•9H2O、0.5~3μg/L (NH4)6Mo7O24、0.1~1 μg/L NH4VO3、0.05~0.2 μg/L NiSO4•6H2O、0.05~0.2 μg/L SnCI2、0.5~3 μg/L AICI3•6H2O、0.05~0.3μg/L AgNO3、0.5~5μg/L Ba(C2H3O2)2、0.05~0.2μg/LKBr、0.5~5μg/L CdCI2、0.5~5μg/L CoCI2•6H2O、0.1~0.5μg/L CrCI3、1~10μg/L NaF、0.1~1μg/L GeO2、0.1~0.5μg/L KI、0.2~2 μg/L RbCI和0.5~5μg/L ZrOCI2•8H2O。
可选地，CaCl2的作用浓度可以为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250mg/L、300 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。MgSO4的作用浓度可以为20 mg/L、50mg/L、100 mg/L、150 mg/L和200 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。KCl的作用浓度可以为50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L、500 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。NaHCO3的作用浓度可以为500mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L、2000 mg/L、2500 mg/L、3000 mg/L、3500 mg/L、4000 mg/L、4500 mg/L、5000 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。NaCl的作用浓度可以为1000mg/L、2000 mg/L、3000 mg/L、4000 mg/L、5000 mg/L、6000 mg/L、7000 mg/L、8000 mg/L、9000 mg/L、10000 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。NaH2PO4的作用浓度可以为50mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。Na2SeO3•5H2O的作用浓度可以为0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.03 mg/L、0.04 mg/L、0.05 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。CuSO4•5H2O、(NH4)6Mo7O24和AICI3•6H2O的作用浓度可以独立地为0.5μg/L、1μg/L、1.5μg/L、2μg/L、2.5μg/L、3μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。ZnSO4•7H2O和FeC6H5O7的作用浓度可以独立地为200μg/L、400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L、1200μg/L、1400μg/L、1600μg/L、1800μg/L、2000μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。MnSO4•H2O的作用浓度可以为0.01 μg/L、0.02 μg/L、0.03μg/L、0.04 μg/L、0.05 μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。Na2SiO3•9H2O的作用浓度可以为20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L、120μg/L、140μg/L、160μg/L、180μg/L、200μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。NH4VO3的作用浓度可以为0.1μg/L、0.2μg/L、0.3μg/L、0.4μg/L、0.5μg/L、0.6μg/L、0.7μg/L、0.8μg/L、0.9μg/L、1μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。NiSO4•6H2O、SnCI2、KBr的作用浓度可以独立地为0.05μg/L、0.10μg/L、0.15μg/L、0.2μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。AgNO3的作用浓度可以为0.05μg/L、0.1μg/L、0.15μg/L、0.2μg/L、0.25μg/L、0.3μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。Ba(C2H3O2)2、CdCI2、CoCI2•6H2O和ZrOCI2•8H2O的作用浓度可以为0.5μg/L、1μg/L、1.5μg/L、2μg/L、2.5μg/L、3μg/L、3.5μg/L、4μg/L、4.5μg/L、5μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。CrCI3和KI的作用浓度可以为0.1μg/L、0.2μg/L、0.3μg/L、0.4μg/L、0.5μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。NaF的作用浓度可以为1μg/L、2μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。GeO2的作用浓度可以为0.1μg/L、0.2μg/L、0.3μg/L、0.4μg/L、0.5μg/L、0.6μg/L、0.7μg/L、0.8μg/L、0.9μg/L、10μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。RbCI的作用浓度可以为0.2μg/L、0.4μg/L、0.6μg/L、0.8μg/L、1μg/L、1.2μg/L、1.4μg/L、1.6μg/L、1.8μg/L、2μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述添加剂包括的组分及其作用浓度如下：10~50 mg/L吐温80、2~10 mg/L 2-巯基乙醇、1000~10000 mg/L D-葡萄糖、1000~10000 mg/L HEPES、20~200 mg/L丙酮酸钠、500~10000 IU/L肝素。
可选地，吐温80的作用浓度可以为10mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L、35 mg/L、40 mg/L、45 mg/L、50 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。2-巯基乙醇的作用浓度可以为2mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。D-葡萄糖和HEPES的作用浓度可以独立地为1000 mg/L、2000 mg/L、3000 mg/L、4000mg/L、5000 mg/L、6000 mg/L、7000 mg/L、8000 mg/L、9000 mg/L和10000 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。丙酮酸钠的作用浓度可以为20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L、180 mg/L和200 mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。肝素的作用浓度可以为500IU/L、1000 IU/L、2000 IU/L、3000 IU/L、4000IU/L、5000 IU/L、6000 IU/L、7000 IU/L、8000 IU/L、9000 IU/L、10000 IU/L中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述添加剂还包括普朗尼克F68，普朗尼克F68是一种非离子表面活性剂，细胞保护剂，用于控制悬浮培养细胞的剪切力。所述普朗尼克F68的作用浓度为500~1500 mg/L，具体可以为500 mg/L、700 mg/L、900 mg/L、1100 mg/L、1300 mg/L、1500mg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。
前述实施例中所限定的组分和其对应的添加含量是发明人经一系列创造性劳动后提出并验证的，在限定范围内的使用能够达到本文所述的技术效果，优选实施例的效果更好，限定范围外的技术方案则可能导致效果的下降或缺失。可以理解的是，限定范围外是指替换了前述实施例所述的任意一种或多种组分或者使用了其中任意一种或多种组分的配比，在包含所有前述组分并使用对应浓度的情况下，额外添加一种或几种能够用于免疫细胞培养的组分也属于本申请的保护范围中，因为，这并不影响培养基能够实现本文所述的技术效果。
在一些实施例中，所述添加剂还包括：外消旋福多司坦盐酸、育亨宾、布替萘芬和萘替芬中的至少一种。
优选地，所述添加剂还包括：外消旋福多司坦盐酸和育亨宾，外消旋福多司坦盐酸的作用浓度为5~500μg/L，具体可以为5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L、250μg/L、300μg/L、350μg/L、400μg/L、450μg/L、500μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。育亨宾的作用浓度为15~1500μg/L，具体可以为15μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、300μg/L、400μg/L、500μg/L、600μg/L、700μg/L、800μg/L、900μg/L、1000μg/L、1100μg/L、1200μg/L、1300μg/L、1400μg/L、1500μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。优选为220μg/L外消旋福多司坦盐酸、500μg/L育亨宾。可增加免疫细胞的扩增倍数。
优选地，所述添加剂还包括：布替萘芬和萘替芬，布替萘芬的作用浓度为16~1600μg/L，具体可以为16μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L、1200μg/L、1400μg/L、1600μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。萘替芬的作用浓度为10~300μg/L，具体可以为10μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L、250μg/L、300μg/L中的任意一种或任意两种之间的范围。优选为800μg/L布替萘芬和80μg/L萘替芬。可更加有效地增加免疫细胞的杀伤活性。
本发明实施例还提供了组合物在制备用于培养免疫细胞的无血清培养基中的应用，所述组合物包括如前述任意实施例所述的无血清培养基的组分。
可以理解的是，应用中的无血清培养基同前述任意实施例所述的无血清培养基相对应。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的无血清培养基在培养免疫细胞中的应用。
免疫细胞的培养方法可参照现有的培养方法或步骤（不同类型的免疫细胞对应有各自的培养步骤），本发明的培养基对于培养方法没有特殊要求，本申请的发明点在于提供了一种新的免疫细胞的培养基，在相同培养方法的情况下，相对于现有的免疫细胞的培养基具有更好的技术效果。
在一些实施例中，所述免疫细胞来源于脐带血、外周血和骨髓中的至少一种。
在一些实施例中，所述免疫细胞选自淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞中的任意一种；其中，所述淋巴细胞包括αβT细胞、γδT细胞、天然杀伤（NK）细胞、天然杀伤T（NKT）细胞、B细胞、先天淋巴样细胞（ILC）、细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞和调控性T细胞中的至少一种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种无血清培养基，可应用于培养免疫细胞，其包括：包括以下成分：激素类、蛋白类、氨基酸类、维生素类、脂质类、无机盐类和添加剂。
所述激素类包括：10 mg/L重组人胰岛素和40 μg/L皮质醇。
所述蛋白类包括：5g/L重组人血白蛋白和10 mg/L重组人转铁蛋白。
所述氨基酸类包括：210.0 mg/L L-精氨酸、115.0 mg/L L-胱氨酸、84.0 mg/L L-组氨酸、157.4 mg/L L-异亮氨酸、157.4 mg/L L-亮氨酸、218.5 mg/L L-赖氨酸、45.0 mg/L L-蛋氨酸、100.0 mg/L L-苯丙氨酸、142.6 mg/L L-苏氨酸、26.0 mg/L L-色氨酸、460.0mg/L L-酪氨酸、564.0 mg/L L-缬氨酸、45.0 mg/L甘氨酸、43.0 mg/L L-丙氨酸、55.0 mg/L L-天冬酰胺、57.0 mg/L L-天冬氨酸、105.0 mg/L L-谷氨酸、63.0 mg/L L-脯氨酸、62.0mg/L L-丝氨酸、584 mg/L L-谷氨酰胺、160 mg/L N-乙酰-半胱氨酸。
所述维生素类包括：5mg/L D-泛酸钙、5mg/L氯化胆碱、5mg/L叶酸、5mg/L烟酰胺、5mg/L盐酸吡哆醛、0.5mg/L核黄素、5mg/L盐酸硫胺素、8.2mg/L肌醇、0.013mg/L维生素B12、0.013mg/L生物素、10 mg/L维生素C、10 mg/L维生素E。
所述脂质类包括：0.02mg/L花生四烯酸、2.20mg/L胆固醇、0.70 mg/L DL-α -生育酚乙酸酯、0.10mg/L亚油酸、0.10mg/L亚麻酸、0.10mg/L肉豆蔻酸、0.10mg/L油酸、0.10mg/L棕榈油酸、0.10mg/L棕榈酸、0.10mg/L硬脂酸。
所述无机盐类包括：165.3mg/L CaCl2、97.67mg/L MgSO4、330mg/L KCl、3024mg/LNaHCO3、4505mg/L NaCl、109mg/L NaH2PO4、0.017mg/L Na2SeO3•5H2O、1.60 μg/L CuSO4•5H2O、863.00 μg/L ZnSO4•7H2O、1155.10μg/L FeC6H5O7、0.17μg/L MnSO4•H2O、140.00μg/LNa2SiO3•9H2O、1.24μg/L (NH4)6Mo7O24、0.65μg/L NH4VO3、0.13μg/L NiSO4•6H2O、0.12μg/LSnCI2、1.20μg/L AICI3•6H2O、0.17μg/L AgNO3、2.55μg/L Ba(C2H3O2)2、0.12μg/L KBr、2.28μg/L CdCI2、2.38μg/L CoCI2•6H2O、0.32μg/L CrCI3、4.20μg/L NaF、0.53μg/L GeO2、0.17μg/L KI、1.21 μg/L RbCI、3.22μg/L ZrOCI2•8H2O。
所述其它成分包括：900.0 mg/L普朗尼克F68、22.0 mg/L吐温80、4.30 mg/L 2-巯基乙醇、4500 mg/L D-葡萄糖、5958 mg/L HEPES、110 mg/L丙酮酸钠、5000 IU/L肝素。
培养基配制完成后，用pH计调节培养基在7.2-7.4之间，渗透压在260-320 mOsm/kg之间，0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存。
需要说明的是，组分前限定的浓度为其对应的作用浓度，后续同此理解，不再赘述。
实施例2
一种无血清培养基，大致与实施例1相同，区别在于组分具有部分差异，差异如下：在实施例1配方的基础上添加220μg/L外消旋福多司坦盐酸、500μg/L育亨宾。
实施例3
一种无血清培养基，大致与实施例1相同，区别在于组分具有部分差异，差异如下：在实施例1配方的基础上添加800μg/L布替萘芬、80μg/L萘替芬。
实施例4
标本来源
人外周血标本来自健康供者。供者签署知情同意书，且应经过人源性特定病毒（包括 HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）、梅毒螺旋体、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的项目检查，具体要求见下表。血样采集应使用以肝素钠为抗凝剂的采血管。采集过程须符合医疗卫生规范，确保血样品的无菌。每支管采血量在8~9mL，总采血量约80~100mL。血样采集后，轻轻上下颠倒8次，使抗凝剂与血样充分混匀。血样在18-25℃下保存和运输，并在12小时内运输到实验室进行培养。
表1.供者要求
项目 要求
人源特定病毒（包括 HIV 、 HBV 、 HCV 、 HTLV 、 EBV 、 CMV 等）、梅毒螺旋体 不得检出
6- 磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶 合格
（1）自体血浆的制备及单个核细胞的分离：
取自体外周血置于无菌离心管中，1800rpm离心10min，取上层血浆在56℃温度下灭活30min后，转移至新的离心管中，3000rpm转速下离心30min，吸取上清，即为人自体血浆。置-80℃冰箱保存备用。
用移液管在50mL离心管底部加入20mL人淋巴细胞分离液。使用2倍体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀后，用移液管缓慢地在离心管内人淋巴细胞分离液上分别加 20mL血样。注意动作一定要轻柔。为了不破坏两种液体的交接面，可以适当倾斜离心管，并将移液管靠着管壁慢慢将血样加入。在水平转头离心机中离心（22℃，800g，15min，升速1，降速0）。将白膜层吸出，转移至另1支50mL离心管。加入40mL的PBS，吹打清洗，离心（22℃，400g，10min，升速9，降速7）。弃去上清后，此为外周血单个核细胞。用RPMI 1640培养基重悬，并吸取少量细胞计数。
（2）CIK细胞的培养
参照图1，实验分为三组，第一组：X-VIVOTM 15；第二组：CTS™ AIM V™ SFM；第三组：本发明实施例1的免疫细胞无血清培养基。收集外周血单个核细胞用无血清培养液调整细胞浓度至2×106/mL，加入1000U/mL的重组人IFN-γ，同时加入5%的自体血浆培养；24h后加入100ng/ml 的重组鼠抗人CD3 单克隆抗体和1000 U/mL 的重组人IL-2，同时加入100U/mL的重组人IL-1α。置于培养瓶内；37℃，5% CO2培养箱中孵育刺激CIK 细胞的生长和增殖；每3天半量换液或扩瓶一次，并补加1000 U/ml重组人IL-2；在培养的第14d，收获CIK细胞。需要说明的是，在其他实施例中，无血清培养基也可选用本发明其他实施例提供的培养基，这里是示例性展示实施例1的情况，后续免疫细胞的培养依此类推。
（3）NK细胞的培养
实验分为三组，第一组：X-VIVOTM 15；第二组：CTS™ AIM V™ SFM；第三组：本发明实施例1的免疫细胞无血清培养基。收集外周血单个核细胞用无血清培养液调整细胞浓度至2×106/mL，加入1000U/mL的重组人IL-2和0.01KE/mL的沙倍林注射液，同时加入5%的自体血浆；置于包被重组鼠抗人CD16抗体的培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱中孵育72h，更换至未包被重组鼠抗人CD16抗体的培养瓶中，加入新鲜培养基和1000 U/mL 的重组人IL-2，刺激NK 细胞的生长和增殖；每3天半量换液或扩瓶一次，并补加1000 U/mL重组人IL-2；在培养的第21d，收获NK细胞。
（4）γδ细胞的培养
实验分为三组，第一组：X-VIVOTM 15；第二组：CTS™ AIM V™ SFM；第三组：本发明实施例1的免疫细胞无血清培养基。收集外周血单个核细胞用无血清培养液调整细胞浓度至2×106/mL，加入1000U/mL 的重组人IL-2和5μM唑来膦酸，同时加入5%的自体血浆；置于培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱中孵育72h，加入新鲜培养基和1000 U/mL 的重组人IL-2，刺激γδ细胞的生长和增殖；每3天半量换液或扩瓶一次，并补加1000 U/mL重组人IL-2；在培养的第14d，收获γδ细胞。
（5）CTL细胞的培养
实验分为三组，第一组：X-VIVOTM 15；第二组：CTS™ AIM V™ SFM；第三组：本发明实施例1的免疫细胞无血清培养基。收集外周血单个核细胞用无血清培养液调整细胞浓度至2×106/mL，加入1000 U/mL的重组人IL-2，同时加入5%的自体血浆；置于包被重组鼠抗人CD3抗体的培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱中孵育72h，加入新鲜培养基和1000 U/mL 的重组人IL-2，刺激CTL细胞的生长和增殖；每3天半量换液或扩瓶一次，并补加1000 U/mL重组人IL-2；在培养的第14d，收获CTL细胞。
（6）免疫细胞的质量检测：
免疫细胞在培养完成后需要进行各项质量控制点的质量检测，对每组免疫细胞进行质量评价。一般包括细胞活率、纯度、扩增倍数、细胞杀伤功能等。质量检测如下：
细胞活率：取对数生长期的细胞悬液，加入0.4%台盼蓝溶液，在三分钟内按《全国临床检验操作规程》（第四版）白细胞计数方法分别计数活细胞和死细胞，计算细胞活率。
细胞扩增倍数：细胞计数后，计算总细胞扩增倍数和目的效应免疫细胞的扩增倍数。
细胞表面标志物：取对数生长期免疫细胞进行免疫表型分析，收集细胞，制成1×106/mL的单细胞悬液，分别向预先加入抗体CD3-PercP、CD4- FITC、CD8-APC、CD56-PE、TCR-γδ-FITC的Falcon管各加100μL细胞悬液，以大鼠IgG1-FITC、IgG1-APC、IgG1-PE、IgG1-PercP为阴性对照。4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，重悬后进行流式细胞仪检测。采用CellQuest Pro对数据进行分析。
LDH释放法检测免疫细胞的体外杀伤效应：采用LDH释放测定法(步骤按照CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒操作说明进行)：调整靶细胞（对数生长期K562细胞）密度为1×105/mL，接种于96孔板，每孔50μL。以对数生长期的效应细胞（NK细胞、CTL细胞、CIK细胞或者γδT细胞），调整细胞密度为5×105/mL，以50μL/孔接种于相应靶细胞孔中，设为实验孔。另设置靶细胞自发释放孔（10％RPMI 1640完全培养液稀释的靶细胞，1×104/(100μL•孔)），靶细胞最大释放孔(10％RPMI 1640完全培养液稀释的靶细胞，每孔1×104／100μL，孵育结束45min前加入10μL 裂解液)、培养液背景孔(100μL完全培养液)和体积校正孔(100μL完全培养液，孵育结束45 min前加人10μL裂解液)。培养4 h后250g离心4 min，取50μL上清，加入50μL／孔底物，室温避光培养30 min后加人50μL终止液，酶标仪记录490nm处吸光度值。以上各组均设3个复孔。按下列公式计算免疫细胞杀伤活性：免疫细胞杀伤活性(％)=[(A实验-A效应细胞自发-A靶细胞自发)／(A靶细胞最大-A靶细胞自发)]×100％。
（7）检测结果
①CIK细胞培养结果
细胞活率检测结果：
三种不同无血清培养基培养CIK免疫细胞进行细胞活率检测，结果显示三组之间的细胞活率无差异（表2）。
表2. 三个组CIK免疫细胞的细胞活率检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
细胞活率（ % ） 9 8.2 9 7.4 9 8.8
细胞表型分析结果
流式细胞仪检测结果显示，最初外周血单个核细胞中CD56+CD3+所占的比例为1.27%，而CIK免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时，CIK细胞中CD56+CD3+所占比例分别为：第一组：34.89％；第二组：30.63％；第三组：57.15％，本发明实施例1的免疫细胞无血清培养基诱导培养CIK的CD56+CD3+效应细胞效果明显优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™SFM（图2）。
细胞扩增检测结果
CIK免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时，CD56+CD3+细胞的扩增倍数分别为：第一组：582.6；第二组：439.4；第三组：778.2。本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3+细胞的扩增倍数明显优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（表3）。
表3 三种不同无血清培养基培养CIK细胞的扩增倍数检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
CD 56+ CD 3+ 细胞扩增倍数 5 82.6 4 39.4 7 78.2
免疫细胞杀伤活性检测结果
CIK免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时，CIK细胞对K562杀伤活性分别为：第一组：46.6％；第二组：50.3％；第三组：68.7％。本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养CIK细胞的杀伤活性优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（表4）。
表4 三种不同无血清培养基培养CIK细胞杀伤活性检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
效靶比： 1 0 ： 1 （％） 4 6.6 50.3 68.7
②NK细胞培养结果
细胞活率检测结果：
三种不同无血清培养基培养NK免疫细胞进行细胞活率检测，结果显示三组之间的细胞活率无差异（表5）。
表5 三个组NK免疫细胞的细胞活率检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
细胞活率（ % ） 95.7 95.2 96.3
细胞表型分析结果
流式细胞仪检测结果显示，最初外周血单个核细胞中CD56+CD3-所占的比例为9.26%，而NK免疫细胞在三种不同无血清培养基培养21ｄ时，NK细胞中CD56+CD3-所占比例分别为：第一组：71.94％；第二组：74.73％；第三组：86.75％，本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养NK的CD56+CD3-效应细胞效果优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（图3）。
细胞扩增检测结果
NK免疫细胞在三种不同无血清培养基培养21ｄ时，CD56+CD3-细胞的扩增倍数分别为：第一组：266.5；第二组：302.4；第三组：415.8。本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3-细胞的扩增倍数明显优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（表6）。
表6 三种不同无血清培养基培养NK细胞的扩增倍数检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
CD 56+ CD 3- 细胞扩增倍数 266.5 302.4 415.8
免疫细胞杀伤活性检测结果
NK免疫细胞在三种不同无血清培养基培养21ｄ时，NK细胞对K562杀伤活性分别为：第一组：63.8％；第二组：55.7％；第三组：78.4％。本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养NK细胞的杀伤活性优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（表7）。
表7 三种不同无血清培养基培养NK细胞杀伤活性检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
效靶比： 1 0 ： 1 （ % ） 63.8 55.7 78.4
③γδ细胞培养结果
细胞活率检测结果：
三种不同无血清培养基培养γδ细胞进行细胞活率检测，结果显示三组之间的细胞活率无差异（表8）。
表8 三个组γδ细胞的细胞活率检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
细胞活率（ % ） 98.5 98.9 98.2
细胞表型分析结果
流式细胞仪检测结果显示，最初外周血单个核细胞中CD3+TCRγδ+所占的比例为1.25%，而γδ免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时，γδ细胞中CD3+TCRγδ+所占比例分别为：第一组：94.81％；第二组：95.37％；第三组：96.31％，本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养γδ细胞效果与X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM相当（图4）。
细胞扩增检测结果
γδ免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时，CD3+TCRγδ+细胞的扩增倍数分别为：第一组：892.3；第二组：795.4；第三组：1157.6。本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养γδ细胞的扩增倍数明显优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（表9）。
表9 三种不同无血清培养基培养γδ+细胞的扩增倍数检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
CD3+TCR γδ+ 细胞扩增倍数 892.3 795.4 1157.6
免疫细胞杀伤活性检测结果
γδ免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时，γδ细胞对K562杀伤活性分别为：第一组：52.6％；第二组：48.7％；第三组：67.5％。本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养γδ细胞的杀伤活性优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（表10）。
表10 三种不同无血清培养基培养γδ细胞杀伤活性检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
效靶比： 1 0 ： 1 （ % ） 52.6 48.7 67.5
④CTL细胞培养结果
细胞活率检测结果：
三种不同无血清培养基培养CTL细胞进行细胞活率检测，结果显示三组之间的细胞活率相当（表11）。
表11 三个组CTL细胞的细胞活率检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
细胞活率（ % ） 98.7 99.6 98.2
细胞表型分析结果
流式细胞仪检测结果显示，最初外周血单个核细胞中CD3+CD8+所占的比例为33.4%，而CTL免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时， CD3+CD8+所占比例分别为：第一组：69.17％；第二组：75.50％；第三组：82.46％，本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养γδ细胞效果略优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™（图5）。
细胞扩增检测结果
CTL免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时，CD3+CD8+细胞的扩增倍数分别为：第一组：124.6；第二组：134.8；第三组：156.2。本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养CTL细胞的扩增倍数略优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（表12）。
表12 三种不同无血清培养基培养CTL细胞的扩增倍数检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
CD 3+ CD 8+ 细胞扩增倍数 124.6 134.8 156.2
免疫细胞杀伤活性检测结果
CTL免疫细胞在三种不同无血清培养基培养14ｄ时，CTL细胞对K562杀伤活性分别为：第一组：25.8％；第二组：26.4％；第三组：35.5％。本发明的免疫细胞无血清培养基诱导培养CTL细胞的杀伤活性优于X-VIVOTM 15和CTS™ AIM V™ SFM（表13）。
表13 三种不同无血清培养基培养CTL细胞杀伤活性检测结果
检测指标 第一组 第二组 第三组
效靶比： 1 0 ： 1 （ % ） 25.8 26.4 35.5
实施例5
细胞扩增检测结果。
本发明实施例2的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3+细胞（14d）、CD56+CD3-细胞（21d）、CD3+TCRγδ+细胞（14d）、CD3+ CD8+细胞（14d）的扩增倍数明显优于方案一的免疫细胞无血清培养基（表14）。
表14 不同方案无血清培养基培养免疫细胞的扩增倍数检测结果
检测指标 实施例 1 实施例 2
CD 56+ CD 3+ 细胞扩增倍数（ 1 4 d ） 7 78.2 869.3
CD 56+ CD 3- 细胞扩增倍数（ 21 d ） 415.8 6 53.7
CD3+TCRγδ+ 细胞扩增倍数（ 1 4 d ） 1157.6 2 318.5
CD 3+ CD 8+ 细胞扩增倍数（ 1 4 d ） 156.2 2 24.1
实施例6
免疫细胞杀伤活性检测结果。
本发明实施例3的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3+细胞（14d）、CD56+CD3-细胞（21d）、CD3+TCRγδ+细胞（14d）、CD3+ CD8+细胞（14d）的杀伤活性优于实施例2的免疫细胞无血清培养基（表15）。
表15 不同方案无血清培养基培养免疫细胞杀伤活性检测结果
检测指标 效靶比（ % ）： 1 0 ： 1 实施例 2 实施例 3
CD 56+ CD 3+ 细胞（ 1 4 d ） 69.2 77.6
CD 56+ CD 3- 细胞（ 21 d ） 7 9.1 8 5.3
CD3+TCRγδ+ 细胞（ 1 4 d ） 6 8.4 8 2.5
CD 3+ CD 8+ 细胞（ 1 4 d ） 3 5.9 5 1.7
实施例7
一种无血清培养基（实验组1），可应用于培养免疫细胞，其包括：包括以下成分：激素类、蛋白类、氨基酸类、维生素类、脂质类、无机盐类和添加剂。
所述激素类包括：1 mg/L重组人胰岛素和100 μg/L皮质醇。
所述蛋白类包括：1 g/L重组人血白蛋白和20 mg/L重组人转铁蛋白。
所述氨基酸类包括：50 mg/L L-精氨酸、200 mg/L L-胱氨酸、20 mg/L L-组氨酸、300 mg/L L-异亮氨酸、30 mg/L L-亮氨酸、300 mg/L L-赖氨酸、10 mg/L L-蛋氨酸、200mg/L L-苯丙氨酸、30 mg/L L-苏氨酸、50 mg/L L-色氨酸、100 mg/L L-酪氨酸、1000 mg/LL-缬氨酸、10 mg/L甘氨酸、100 mg/L L-丙氨酸、10 mg/L L-天冬酰胺、100 mg/L L-天冬氨酸、20 mg/L L-谷氨酸、100 mg/L L-脯氨酸、10 mg/L L-丝氨酸、1000 mg/L L-谷氨酰胺和30 mg/L N-乙酰-半胱氨酸。
所述维生素类包括：1 mg/L D-泛酸钙、10 mg/L氯化胆碱、1 mg/L叶酸、10 mg/L烟酰胺、1 mg/L盐酸吡哆醛、1mg/L核黄素、1 mg/L盐酸硫胺素、15mg/L肌醇、0.001 mg/L维生素B12、0.02 mg/L生物素、2 mg/L维生素C和20 mg/L维生素E。
所述脂质类包括：0.01 mg/L花生四烯酸、5 mg/L胆固醇、0.1 mg/L DL-α -生育酚乙酸酯、0.2 mg/L亚油酸、0.05 mg/L亚麻酸、0.2 mg/L肉豆蔻酸、0.05 mg/L油酸、0.2 mg/L棕榈油酸、0.05 mg/L棕榈酸和0.2 mg/L硬脂酸。
所述无机盐类包括：50 mg/L CaCl2、200 mg/L MgSO4、50 mg/L KCl、5000mg/LNaHCO3、1000mg/L NaCl、200 mg/L NaH2PO4、0.01 mg/L Na2SeO3•5H2O、3 μg/L CuSO4•5H2O、200 μg/L ZnSO4•7H2O、2000μg/L FeC6H5O7、0.1μg/L MnSO4•H2O、200μg/L Na2SiO3•9H2O、0.5μg/L (NH4)6Mo7O24、1 μg/L NH4VO3、0.05 μg/L NiSO4•6H2O、0.2 μg/L SnCI2、0.5 μg/LAICI3•6H2O、0.3μg/L AgNO3、0.5μg/L Ba(C2H3O2)2、0.2μg/L KBr、0.5μg/L CdCI2、5μg/LCoCI2•6H2O、0.1μg/L CrCI3、10μg/L NaF、0.1 μg/L GeO2、0.5μg/L KI、0.2 μg/L RbCI和5μg/L ZrOCI2•8H2O。
所述其它成分包括：500 mg/L 普朗尼克F68、50 mg/L吐温80、2 mg/L 2-巯基乙醇、10000 mg/L D-葡萄糖、1000 mg/L HEPES、200 mg/L丙酮酸钠、500 IU/L肝素。
培养基配制完成后，用pH计调节培养基在7.2-7.4之间，渗透压在260-320 mOsm/kg之间，0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存。
本实施例还提供了一种无血清培养基（实验组2），大致与实验组1相同，区别在于组分具有部分差异，差异如下：在实验组1配方的基础上添加5μg/L外消旋福多司坦盐酸。
本实施例还提供了一种无血清培养基（实验组3），大致与实验组2相同，区别在于组分具有部分差异，差异如下：在实验组2配方的基础上添加1500μg/L育亨宾。
细胞扩增检测结果：
本实施例7中实验组2的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3+细胞（14d）、CD56+CD3-细胞（21d）、CD3+TCRγδ+细胞（14d）、CD3+ CD8+细胞（14d）的扩增倍数均优于实验组1无血清培养基。实验组3的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3+细胞（14d）、CD56+CD3-细胞（21d）、CD3+TCRγδ+细胞（14d）、CD3+ CD8+细胞（14d）的扩增倍数均优于实验组2无血清培养基（表16）。
表16 不同实验组无血清培养基培养免疫细胞的扩增倍数检测结果
检测指标 实验组 1 实验组 2 实验组 3
CD 56+ CD 3+ 细胞扩增倍数（ 1 4 d ） 475.6 648.7 782.1
CD 56+ CD 3- 细胞扩增倍数（ 21 d ） 338.1 386.9 508.6
CD3+TCRγδ+ 细胞扩增倍数（ 1 4 d ） 825.5 1017.8 1285.4
CD 3+ CD 8+ 细胞扩增倍数（ 1 4 d ） 169.3 183.3 263.5
实施例8
一种无血清培养基（实验组1），可应用于培养免疫细胞，其包括：包括以下成分：激素类、蛋白类、氨基酸类、维生素类、脂质类、无机盐类和添加剂。
所述激素类包括：20 mg/L重组人胰岛素和10 μg/L皮质醇。
所述蛋白类包括：20 g/L重组人血白蛋白和1 mg/L重组人转铁蛋白。
所述氨基酸类包括：500 mg/L L-精氨酸、20 mg/L L-胱氨酸、180 mg/L L-组氨酸、30 mg/L L-异亮氨酸、300 mg/L L-亮氨酸、100 mg/L L-赖氨酸、100 mg/L L-蛋氨酸、50 mg/L L-苯丙氨酸、300 mg/L L-苏氨酸、5 mg/L L-色氨酸、1000 mg/L L-酪氨酸、100mg/L L-缬氨酸、100 mg/L甘氨酸、10 mg/L L-丙氨酸、100 mg/L L-天冬酰胺、10 mg/L L-天冬氨酸、200 mg/L L-谷氨酸、10 mg/L L-脯氨酸、100 mg/L L-丝氨酸、100 mg/L L-谷氨酰胺和300 mg/L N-乙酰-半胱氨酸。
所述维生素类包括：10 mg/L D-泛酸钙、1 mg/L氯化胆碱、10 mg/L叶酸、1 mg/L烟酰胺、10 mg/L盐酸吡哆醛、0.1 mg/L核黄素、10 mg/L盐酸硫胺素、2 mg/L肌醇、0.02 mg/L维生素B12、0.001 mg/L生物素、20mg/L维生素C和2 mg/L维生素E。
所述脂质类包括：0.05 mg/L花生四烯酸、1 mg/L胆固醇、1 mg/L DL-α -生育酚乙酸酯、0.05 mg/L亚油酸、0.2 mg/L亚麻酸、0.05 mg/L肉豆蔻酸、0.2 mg/L油酸、0.05 mg/L棕榈油酸、0.2 mg/L棕榈酸和0.05 mg/L硬脂酸。
所述无机盐类包括： 300mg/L CaCl2、20mg/L MgSO4、500mg/L KCl、500mg/LNaHCO3、10000mg/L NaCl、50 mg/L NaH2PO4、0.05 mg/L Na2SeO3•5H2O、0.5 μg/L CuSO4•5H2O、2000 μg/L ZnSO4•7H2O、200μg/L FeC6H5O7、0.5μg/L MnSO4•H2O、20μg/L Na2SiO3•9H2O、3μg/L (NH4)6Mo7O24、0.1 μg/L NH4VO3、0.2 μg/L NiSO4•6H2O、0.05 μg/L SnCI2、3 μg/L AICI3•6H2O、0.05μg/L AgNO3、5μg/L Ba(C2H3O2)2、0.05μg/L KBr、5μg/L CdCI2、0.5μg/LCoCI2•6H2O、0.5μg/L CrCI3、1μg/L NaF、1 μg/L GeO2、0.1μg/L KI、2 μg/L RbCI和0.5μg/LZrOCI2•8H2O。
所述其它成分包括：1500 mg/L 普朗尼克F68、10 mg/L吐温80、10 mg/L 2-巯基乙醇、1000 mg/L D-葡萄糖、10000 mg/L HEPES、20 mg/L丙酮酸钠、10000 IU/L肝素、500μg/L外消旋福多司坦盐酸、15μg/L育亨宾。
培养基配制完成后，用pH计调节培养基在7.2-7.4之间，渗透压在260-320 mOsm/kg之间，0.22μm滤器过滤除菌，密封，4℃避光保存。
本实施例还提供了一种无血清培养基（实验组2），大致与实验组1相同，区别在于组分具有部分差异，差异如下：在实验组1配方的基础上添加1600μg/Lμg/L布替萘芬。
本实施例还提供了一种无血清培养基（实验组3），大致与实验组2相同，区别在于组分具有部分差异，差异如下：在实验组2配方的基础上添加10μg/L萘替芬。
免疫细胞杀伤活性检测结果。
本实施例8中实验组2的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3+细胞（14d）、CD56+CD3-细胞（21d）、CD3+TCRγδ+细胞（14d）、CD3+ CD8+细胞（14d）的杀伤活性均优于实验组1无血清培养基。实验组3的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3+细胞（14d）、CD56+CD3-细胞（21d）、CD3+TCRγδ+细胞（14d）、CD3+ CD8+细胞（14d）的杀伤活性均优于实验组2无血清培养基。（表17）。
表17 不同实验组无血清培养基培养免疫细胞杀伤活性检测结果
检测指标 效靶比（ % ）： 1 0 ： 1 实验组 1 实验组 2 实验组 3
CD 56+ CD 3+ 细胞 51.8 59.9 65.5
CD 56+ CD 3- 细胞 50.4 68.4 75.2
CD3+TCRγδ+ 细胞 42.9 55.3 59.8
CD 3+ CD 8+ 细胞 28.7 35.7 39.6
实施例9
一种无血清培养基，大致与实施例1相同，区别在于组分具有部分差异，差异如下：在实施例1配方的基础上不添加900.0 mg/L普朗尼克F68。
细胞活率检测结果：
本发明实施例9的免疫细胞无血清培养基诱导培养CD56+CD3+细胞（14d）、CD56+CD3-细胞（21d）、CD3+TCRγδ+细胞（14d）、CD3+ CD8+细胞（14d）的细胞活性均低于实施例1的免疫细胞无血清培养基（表18）。
表18 不同无血清培养基培养免疫细胞的细胞活率检测结果
检测指标（ % ） 实施例 1 实施例 9
CD 56+ CD 3+ 细胞 9 8.8 92.4
CD 56+ CD 3- 细胞 96.3 92.7
CD3+TCRγδ+ 细胞 98.2 9 5.5
CD 3+ CD 8+ 细胞 98.2 90.9
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无血清培养基，其特征在于，其包括以下组分：激素类、蛋白类、氨基酸类、维生素类、脂质类、无机盐类和添加剂；
所述激素类包括以下组分：重组人胰岛素和皮质醇；
所述蛋白类包括以下组分：重组人血白蛋白和重组人转铁蛋白；
所述氨基酸类包括以下组分：L-精氨酸、L-胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺和N-乙酰-半胱氨酸；
所述维生素类包括以下组分：D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、肌醇、维生素B12、生物素、维生素C和维生素E；
所述脂质类包括以下组分：花生四烯酸、胆固醇、DL-α -生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、棕榈酸和硬脂酸；
所述无机盐类包括以下组分：CaCl2、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、NaH2PO4、Na2SeO3•5H2O、CuSO4•5H2O、ZnSO4•7H2O、FeC6H5O7、MnSO4•H2O、Na2SiO3•9H2O、(NH4)6Mo7O24、NH4VO3、NiSO4•6H2O、SnCI2、AICI3•6H2O、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCI2、CoCI2•6H2O、CrCI3、NaF、GeO2、KI、RbCI和ZrOCI2•8H2O；
所述添加剂包括以下组分：吐温80、2-巯基乙醇、D-葡萄糖、HEPES、丙酮酸钠和肝素。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述激素类包括的组分及其作用浓度如下：1~20mg/L 重组人胰岛素和1~100 μg/L皮质醇；
所述蛋白类包括的组分及其作用浓度如下：1~20 g/L重组人血白蛋白和1~20 mg/L重组人转铁蛋白；
所述氨基酸类包括的组分及其作用浓度如下：50~500 mg/L L-精氨酸、20~200 mg/LL-胱氨酸、20~180 mg/L L-组氨酸、30~300 mg/L L-异亮氨酸、30~300 mg/L L-亮氨酸、100~300 mg/L L-赖氨酸、10~100 mg/L L-蛋氨酸、50~200 mg/L L-苯丙氨酸、30~300 mg/L L-苏氨酸、5~50 mg/L L-色氨酸、100~1000 mg/L L-酪氨酸、100~1000 mg/L L-缬氨酸、10~100 mg/L甘氨酸、10~100 mg/L L-丙氨酸、10~100 mg/L L-天冬酰胺、10~100 mg/L L-天冬氨酸、20~200 mg/L L-谷氨酸、10~100 mg/L L-脯氨酸、10~100 mg/L L-丝氨酸、100~1000mg/L L-谷氨酰胺和30~300 mg/L N-乙酰-半胱氨酸；
所述维生素类包括的组分及其作用浓度如下：1~10 mg/L D-泛酸钙、1~10 mg/L氯化胆碱、1~10 mg/L叶酸、1~10 mg/L烟酰胺、1~10 mg/L盐酸吡哆醛、0.1~1mg/L核黄素、1~10 mg/L盐酸硫胺素、2~15mg/L肌醇、0.001~0.02 mg/L维生素B12、0.001~0.02 mg/L生物素、2~20mg/L维生素C和2~20 mg/L维生素E；
所述脂质类包括的组分及其作用浓度如下：0.01~0.05 mg/L花生四烯酸、1~5mg/L胆固醇、0.1~1 mg/L DL-α -生育酚乙酸酯、0.05~0.2mg/L亚油酸、0.05~0.2mg/L亚麻酸、0.05~0.2mg/L肉豆蔻酸、0.05~0.2mg/L油酸、0.05~0.2mg/L棕榈油酸、0.05~0.2mg/L棕榈酸和0.05~0.2mg/L硬脂酸；
所述无机盐类包括的组分及其作用浓度如下：50~300mg/L CaCl2、20~200mg/L MgSO4、50~500mg/L KCl、500~5000mg/L NaHCO3、1000~10000mg/L NaCl、50~200 mg/L NaH2PO4、0.01~0.05 mg/L Na2SeO3•5H2O、0.5~3 μg/L CuSO4•5H2O、200~2000 μg/L ZnSO4•7H2O、200~2000μg/L FeC6H5O7、0.1~0.5μg/L MnSO4•H2O、20~200μg/L Na2SiO3•9H2O、0.5~3μg/L (NH4)6Mo7O24、0.1~1 μg/L NH4VO3、0.05~0.2 μg/L NiSO4•6H2O、0.05~0.2 μg/L SnCI2、0.5~3 μg/L AICI3•6H2O、0.05~0.3μg/L AgNO3、0.5~5μg/L Ba(C2H3O2)2、0.05~0.2μg/L KBr、0.5~5μg/L CdCI2、0.5~5μg/L CoCI2•6H2O、0.1~0.5μg/L CrCI3、1~10μg/L NaF、0.1~1 μg/L GeO2、0.1~0.5μg/L KI、0.2~2 μg/L RbCI和0.5~5μg/L ZrOCI2•8H2O；
所述添加剂包括的组分及其作用浓度如下：10~50 mg/L吐温80、2~10 mg/L 2-巯基乙醇、1000~10000 mg/L D-葡萄糖、1000~10000 mg/L HEPES、20~200 mg/L丙酮酸钠、500~10000 IU/L肝素。
3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于，所述添加剂还包括普朗尼克F68，所述普朗尼克F68的作用浓度为500~1500 mg/L。
4.根据权利要求1~3任一项所述的无血清培养基，其特征在于，所述添加剂还包括：外消旋福多司坦盐酸、育亨宾、布替萘芬和萘替芬中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于，所述添加剂还包括：外消旋福多司坦盐酸和育亨宾，外消旋福多司坦盐酸的作用浓度为5~500μg/L，育亨宾的作用浓度为15~1500μg/L。
6.根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于，所述添加剂还包括：布替萘芬和萘替芬，布替萘芬的作用浓度为16~1600μg/L，萘替芬的作用浓度为10~300μg/L。
7.组合物在制备用于培养免疫细胞的无血清培养基中的应用，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1~6任一项所述的无血清培养基的组分。
8.如权利要求1~6任一项所述的无血清培养基在培养免疫细胞中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞来源于脐带血、外周血和骨髓中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞选自淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞中的任意一种；其中，所述淋巴细胞包括αβT细胞、γδT细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T细胞、B细胞、先天淋巴样细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞和调控性T细胞中的至少一种。
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