CN117384839A

CN117384839A - 一种nk细胞体外扩增方法

Info

Publication number: CN117384839A
Application number: CN202311107870.4A
Authority: CN
Inventors: 刘奇; 钟晨; 李文艺; 王健; 黄文林
Original assignee: Guangzhou Doublink Biological Products Co
Current assignee: Guangzhou Doublink Biological Products Co
Priority date: 2023-08-30
Filing date: 2023-08-30
Publication date: 2024-01-12

Abstract

本发明公开了一种NK细胞体外扩增方法，涉及细胞培养技术领域。NK细胞体外扩增方法，通过NK细胞培养体系进行培养，所述的NK细胞培养体系包括激活培养基和扩增培养基，所述的扩增培养基包括基础培养基和补剂，所述的补剂由900‑1000IU/mL的IL‑2、0.1‑3ng/mL的IL‑15和4‑6％灭活血浆组成。本发明的NK细胞体外扩增方法扩增速度较快，且具有较高的纯度，其对多种肿瘤细胞具有更强的杀伤活性。

Description

一种NK细胞体外扩增方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种NK细胞体外扩增方法。

背景技术

NK细胞是一类天然具有杀伤肿瘤细胞作用的免疫细胞，在先天性免疫和适应性免疫反应中都发挥着关键的作用，能够抵御由病毒感染或者恶性肿瘤引起的异常细胞。NK细胞与T、B淋巴细胞不同，NK细胞无需进行预先致敏就能够有效的识别并杀伤病毒感染的淋巴细胞和肿瘤细胞，使其成为肿瘤细胞免疫治疗的研究热点。然而NK细胞仅占外周血单个核细胞的5-20％，并且NK细胞的活性和数量会受到人体内环境的影响，进而影响其抗肿瘤免疫的作用。由于人体内NK细胞的数量、纯度和活性无法满足其临床应用的需要，阻碍了其大规模的临床应用。

目前有两种主流的NK细胞扩增的方案，一种以K562作为滋养细胞的扩增方案。中国专利CN114874986A中公开了一种采用K562细胞扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：采用重组慢病毒对K562细胞进行感染，感染时间为10-20h，进行克隆得到工程细胞株；采用钴-60辐照灭菌得到滋养细胞；采用外周血分离单个核细胞，然后加入至NK细胞完全培养基中重悬，加入滋养细胞混合均匀，置于培养箱中培养；培养至第3天时，离心弃掉上清液，加入相同体积的NK细胞完全培养基混合均匀，继续置于培养箱中培养；培养至第7天，补加1-2μg/mL IFN-γ和自体血浆；继续培养至第14天得到采用K562细胞扩增的NK细胞。但K562本身是白细胞瘤细胞，以K562作为滋养细胞的扩增方案存在潜在的致癌风险。

另一种NK细胞扩增的方案是以抗体包被结合细胞因子刺激的扩增方案。中国专利CN112877288A中公开了一种NK细胞培养体系及应用，所述的NK细胞培养体系包括：包被抗体、NK细胞激活因子、NK细胞基础培养基、NK细胞激活培养基和NK细胞扩增培养基。该发明利用所述的NK细胞培养体系，通过外周血单个核细胞分离，细胞活化、增殖等步骤制备NK细胞回输液，无需添加外源动物血清，也无需采用外源滋养层细胞，制备方法更安全，操作简单，成本低，适用于NK细胞的临床级生产。但该发明的NK细胞扩增培养方法的的扩增速率和NK细胞纯度较低，并且其杀伤活性较低。

因此，需要提供一种扩增速率较快、NK细胞纯度较高，对肿瘤细胞具有较强的杀伤活性的体外NK细胞的扩增培养方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种NK细胞体外扩增方法，扩增的NK细胞具有较快的增殖速度，具有较高的纯度，对多种肿瘤细胞具有更强的杀伤活性，解决了现有技术中扩增速度慢、纯度低和杀伤活性较差的问题。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种用于NK细胞体外扩增培养的NK细胞培养体系，所述的NK细胞培养体系包括激活培养基和扩增培养基，所述的扩增培养基包括基础培养基和补剂，所述的基础培养基选自NK MACS培养基、Lonza X-VIVO15培养基中的一种或多种；所述的补剂由900-1000IU/mL的IL-2、0.1-3ng/mL的IL-15和4-6％灭活血浆组成。

优选地，所述的补剂由950-1000IU/mL的IL-2、0.5-2ng/mL的IL-15和5％灭活血浆组成。

进一步优选地，所述的补剂由1000IU/mL的IL-2、1ng/mL的IL-15和5％灭活血浆组成。

优选地，所述的激活培养基包括NK MACS培养基和补剂，所述的补剂由5-10ng/mL的IL-12，40-60ng/mL的IL-18，40-60ng/mL的IL-15，900-1000IU/mL的IL-2，4-6％灭活血浆组成。

进一步优选地，所述的补剂由8-10ng/mL的IL-12，45-55ng/mL的IL-18，45-55ng/mL的IL-15，950-1000IU/mL的IL-2，5％灭活血浆组成。

再进一步优选地，所述的补剂由10ng/mL IL-12，50ng/mL IL-18，50ng/mL IL-15，1000IU/mL IL-2，5％灭活血浆组成。

又一方面，本发明提供了一种NK细胞的体外扩增培养方法，包括以下步骤：

(1)NK细胞体外分离；

(2)NK细胞激活培养：加入NK细胞激活培养基，使NK细胞密度为(0.1-5)×10⁶个/mL，转移至培养箱中激活培养24h-48h；

(3)NK细胞扩增培养：离心，去除上清，加入扩增培养基重悬细胞，使细胞密度为(0.1-5)×10⁶个/mL，进行培养。

优选地，步骤(1)中NK细胞体外分离包括以下步骤：

1)将血样离心上层血浆置于新的离心管中灭活，留上清备用；

2)在血样中加入PBS稀释血样；

3)将稀释后的血样加入到淋巴细胞分离液中；

4)离心，中间有一层白色细胞层，吸取白色细胞层置于新的离心管中；

5)在离心管中补满PBS，离心，弃上清，得NK细胞。

优选地，步骤1)中血样的来源为脐血或外周血。

优选地，步骤1)中离心的条件为室温300g离心10分钟。

优选地，步骤2)中PBS与血样的体积比为1:1。

优选地，步骤3)中血样与淋巴细胞分离液的体积比为1：1。

优选地，步骤4)中离心的条件为室温1200g离心10分钟。

优选地，步骤5)中离心的条件为室温300g离心10分钟。

优选地，步骤(2)中培养箱的温度为37℃。

优选地，步骤(2)中培养的时间为48h。

优选地，步骤(2)中加入NK细胞激活培养基，使NK细胞密度为1×10⁶个/mL。

优选地，步骤(2)中所述的激活培养基包括NK MACS培养基和补剂，所述的补剂由5-10ng/mL的IL-12，40-60ng/mL的IL-18，40-60ng/mL的IL-15，900-1000IU/mL的IL-2，4-6％灭活血浆组成。

进一步优选地，所述的补剂由10ng/mL IL-12，50ng/mL IL-18，50ng/mL IL-15，1000IU/mL IL-2，5％灭活血浆组成。

优选地，步骤(3)中离心的条件为300-1000g，离心的时间为5-10分钟；

进一步优选地，步骤(3)中离心的条件为300g，离心的时间为5分钟。

优选地，步骤(3)中去除上清后还包括洗涤细胞步骤，具体为用NK MACS培养基洗涤细胞2遍，去净诱导培养基中残留的细胞因子。

优选地，步骤(3)中培养的时间为8-10天。

优选地，步骤(3)中所述的扩增培养基包括基础培养基和补剂，所述的基础培养基选自NK MACS培养基、Lonza X-VIVO15培养基中的一种或多种；所述的补剂由900-1000IU/mL的IL-2、0.1-3ng/mL的IL-15和4-6％灭活血浆组成。

优选地，步骤(2)和步骤(3)中灭活血浆为自体灭活血浆。

进一步优选地，所述的自体灭活血浆的灭活方法为56℃灭活。

又一方面，本发明提供了上述的NK细胞培养体系在扩增NK细胞中的应用。

又一方面，本发明提供了一种NK细胞，所述的NK细胞是通过上述的体外扩增培养方法制备得到。

本发明的有益效果为：

(1)本发明的NK细胞体外扩增方法无需滋养细胞和抗体包被，仅通过细胞因子刺激即可在体外进行NK细胞扩增。

(2)本发明扩增的NK细胞可在9天增殖1000倍以上，且最终的NK细胞增殖倍数可达10⁵级别。

(3)与抗体包被扩增方案相比，本发明扩增的NK细胞在纯度上可稳定在90％以上，且无T细胞污染，无磁珠残留，同时其对多种肿瘤细胞具有更强的杀伤活性。

附图说明

图1为不同培养方式下NK细胞的扩增结果图。

图2为不同培养方式下NK细胞的纯度。

图3为不同培养方式下NK细胞的流式细胞术检测结果图。

图4为不同培养方式下NK细胞对K562的杀伤活性。

图5为不同培养方式下NK细胞对SKOV3细胞的杀伤活性。

图6为不同培养方式下NK细胞对HepG2细胞的杀伤活性。

图7为不同培养方式下NK细胞对OVCAR3细胞的杀伤活性。

图8为不同培养方式下NK细胞对NCI-H226细胞的杀伤活性。

图9为不同培养基、诱导时间、IL-15浓度对NK细胞纯度的影响结果图。

图10为不同培养基、诱导时间、IL-15浓度对NK细胞增殖的影响结果图。

图11为不同培养基、诱导时间、IL-15浓度对K562杀伤活性的影响。

上述附图中，*p＜0.5；**p＜0.1；***p＜0.01。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。

实验材料的购买厂家及货号：

NK MACS培养基：购自miltenyi公司，货号为130-114-429；

X-VIVO15培养基：购自Lonza公司，货号为02-060F。

实施例1NK细胞体外扩增培养

1、NK细胞体外分离

取40mL新鲜外周血液，利用StemCell RosetteSep^TMHuman NK isolation kit(货号15065)直接分离NK细胞，具体步骤如下：

1)在血样中加入50μL/mL RosetteSep^TMCocktail，上下颠倒混匀后，室温放置10min；

2)加入等体积的常温放置的1×PBS稀释血样；

3)在SepMate^TM-50(购自StemCell公司，货号为86450)淋巴细胞分离管中心加入15mL淋巴细胞分离液；

4)将稀释后的样本沿着管壁垂直加入到淋巴细胞分离管中，注意动作轻柔，避免直接将样本加入到分离管中心；

5)室温1200g离心10分钟，中间有一层白色细胞层，为分离得到的NK细胞；

6)将上层细胞转移到新的离心管中，注意不要将红细胞倒出；

7)室温300g离心10分钟，收集上清为50％血浆，56℃灭活保存于4℃或-20℃，用于后续NK细胞的激活及扩增；

8)在离心管中补满1×PBS，室温300g离心10分钟洗涤细胞；

9)弃上清，准备进行下一步NK细胞激活。

2、NK细胞激活培养

1)NK细胞激活培养基，其成分为：NK MACS培养基，加入补剂，10ng/mL IL-12，50ng/mL IL-18，50ng/mL IL-15，1000IU/mL IL-2，5％上述步骤7)收集的自体血浆；

2)加入适量的NK细胞激活培养基，使NK细胞密度约为1×10⁶个/mL，转移至37℃培养箱中，激活培养24h或48h。

3、NK细胞扩增培养

1)NK细胞扩增培养基配置，其成分为：

NK MACS完全培养基：NK MACS培养基，加入补剂，加1000IU/mL IL-2，5ng/mL IL-15，5％自体灭活血浆。

2)NK细胞诱导培养完成后，300g室温离心5分钟，去除上清，然后分别用常温的5mLNK MACS培养基洗涤细胞2遍，去净诱导培养基中残留的细胞因子。

3)分别加入适量的NK MACS完全培养基重悬细胞，使细胞密度约1×10⁶/mL。

4)每隔两天测细胞密度及传代，传代密度为0.5×10⁶个/mL，扩增培养8-10天。

对比例1

专利CN202110245100中采用的抗体包被法制备的NK细胞，下述中称为CTR NK。

实施例2不同方式培养下NK细胞的增殖特性

使用上述实施例1和对比例1中扩增的NK细胞进行如下检测。

NK细胞扩增倍数的检测方法包括以下步骤：

1)扩增培养第0天，细胞数量记为N0；

2)每次传代测细胞密度e及总体积V，总细胞数量N＝e×V，每次细胞传代当天的扩增倍数为n＝N/N0；

3)统计整个扩增周期扩增倍数n的变化曲线为图1所示。

NK细胞纯度的检测方法包括以下步骤：

1)取培养过程中的NK细胞1×10⁶个；

2)500g离心5min，去除上清，并用1×PBS洗涤2遍；

3)去除上清，然后加入200μL 1×PBS再次重悬NK细胞，加入2.5μL FITC anti-human CD3 antibody(Biolegend，货号为300406)及2.5μL APC anti-human CD56antibody(Biolegend，货号为304610)，室温避光孵育30min；

4)500g离心5min，去除上清，并用1×PBS洗涤2遍；

5)去除上清，加入500μL 1×PBS重悬细胞；

6)用Beckman Coulter DxFlex进行流式检测，CD3^-CD56+为NK细胞。

有无T细胞残留使用上面NK细胞纯度检测的方法，即无CD3阳性细胞。

实验结果：

实施例1和对比例1的NK细胞的扩增如图1-图3所示，从图中可以看出，相较于对比例1中采用的抗体包被法，实施例1扩增的NK细胞具有更高的扩增速率以及更高的NK细胞纯度(CD3-CD56+)，实施例1扩增的NK细胞纯度可维持在90％以上，且无T细胞残留，且在更短时间内即可获得回输所需要的NK细胞量，大大降低了整个治疗的时间长度，由原先14天降低至10天即可获得5E10 NK细胞进行回输。

实施例3不同方式培养下NK细胞的生物学活性—对K562细胞的杀伤活性

在不同效靶比下，实施例1和对比例1的NK细胞与K562细胞共孵育3h后的杀伤活性。

检测K562杀伤活性包括以下步骤：

1)取2×10⁵K562-GFP细胞(稳定表达GFP的K562细胞系)加入24孔板中，并加入IMDM培养基(普诺赛，货号PM150510)补充至总体积800μL；

2)按照不同效靶比，在相应培养孔中加入对应数量的NK细胞；

3)置于37℃培养箱共孵育3小时；

4)孵育结束后进行流式检测K562细胞的杀伤水平，利用凯基生物的细胞凋亡检测试剂盒(货号KGA1030-100)进行检测，步骤如下：

5)将共孵育结束的所有细胞(K562-GFP和NK)收集到EP管中，500g离心5min，去除上清，加入1×PBS洗涤一遍，去除上清后，加入试剂盒中的binding buffer 500μL重悬细胞；

6)加入5μL APC-Annexin V和5μL PI进行室温避光染色10-15min；

7)用Beckman Coulter DxFlex进行流式检测，选取FITC通道中阳性的K562-GFP细胞进行分析，即活细胞比例为FITC⁺APC^-PE^-通道的细胞比例，杀伤率为1-FITC⁺APC^-PE^-％。

实验结果：

实施例1和对比例1的NK细胞对K562细胞的杀伤活性如图4所示，从图中可以看出相较于对比例1中采用的抗体包被法，实施例1扩增的NK细胞具有对K562细胞更高杀伤活性。

实施例4不同方式培养下NK细胞对多种实体瘤细胞的杀伤活性

比较不同效靶比下，实施例1和对比例1的NK细胞与各实体瘤细胞共孵育6h后的杀伤活性。

检测实体瘤细胞SKOV3的杀伤活性的步骤为：

1)取2×10⁵SKOV3-GFP细胞(稳定表达GFP的SKOV3细胞系)加入24孔板中，并加入DMEM培养基(普诺赛，货号PM150210)补充至总体积800μL；

2)按照不同效靶比，在相应培养孔中加入对应数量的NK细胞；

3)置于37℃培养箱共孵育4小时；

4)孵育结束后进行流式检测SKOV3细胞的杀伤水平，利用凯基生物的细胞凋亡检测试剂盒(货号KGA1030-100)进行检测，步骤如下；

5)将共孵育结束的所有细胞(SKOV3-GFP和NK)收集到EP管中，500g离心5min，去除上清，加入1×PBS洗涤一遍，去除上清后，加入试剂盒中的binding buffer 500μL重悬细胞；

6)加入5μL APC-Annexin V和5μL PI进行室温避光染色10-15min；

用Beckman Coulter DxFlex进行流式检测，选取FITC通道中阳性的SKOV3-GFP细胞进行分析，即活细胞比例为FITC⁺APC^-PE^-通道的细胞比例，杀伤率为1-FITC⁺APC^-PE^-％。

检测实体瘤细胞NCI-H226的杀伤活性的步骤为：

1)取2×10⁵NCI-H226-GFP细胞(稳定表达GFP的NCI-H226细胞系)加入24孔板中，并加入DMEM培养基(普诺赛，货号PM150210)补充至总体积800μL；

2)按照不同效靶比，在相应培养孔中加入对应数量的NK细胞；

3)置于37℃培养箱共孵育4小时；

4)孵育结束后进行流式检测NCI-H226-GFP细胞的杀伤水平，利用凯基生物的细胞凋亡检测试剂盒(货号KGA1030-100)进行检测，步骤如下；

5)将共孵育结束的所有细胞(NCI-H226-GFP和NK)收集到EP管中，500g离心5min，去除上清，加入1×PBS洗涤一遍，去除上清后，加入试剂盒中的binding buffer 500μL重悬细胞；

6)加入5μL APC-Annexin V和5μL PI进行室温避光染色10-15min；

用Beckman Coulter DxFlex进行流式检测，选取FITC通道中阳性的NCI-H226-GFP细胞进行分析，即活细胞比例为FITC⁺APC^-PE^-通道的细胞比例，杀伤率为1-FITC⁺APC^-PE^-％。

检测实体瘤细胞OVCAR3的杀伤活性的步骤为：

1)取2×10⁵OVCAR3-GFP细胞(稳定表达GFP的OVCAR3细胞系)加入24孔板中，并加入DMEM培养基(普诺赛，货号PM150210)补充至总体积800μL；

2)按照不同效靶比，在相应培养孔中加入对应数量的NK细胞；

3)置于37℃培养箱共孵育4小时；

4)孵育结束后进行流式检测OVCAR3-GFP细胞的杀伤水平，利用凯基生物的细胞凋亡检测试剂盒(货号KGA1030-100)进行检测，步骤如下；

5)将共孵育结束的所有细胞(OVCAR3-GFP和NK)收集到EP管中，500g离心5min，去除上清，加入1×PBS洗涤一遍，去除上清后，加入试剂盒中的binding buffer 500μL重悬细胞；

6)加入5μL APC-Annexin V和5μL PI进行室温避光染色10-15min；

用Beckman Coulter DxFlex进行流式检测，选取FITC通道中阳性的OVCAR3-GFP细胞进行分析，即活细胞比例为FITC⁺APC^-PE^-通道的细胞比例，杀伤率为1-FITC⁺APC^-PE^-％。

检测实体瘤细胞HepG2的杀伤活性的步骤为：

1)取2×10⁵HepG2-GFP细胞(稳定表达GFP的HepG2细胞系)加入24孔板中，并加入DMEM培养基(普诺赛，货号PM150210)补充至总体积800μL；

2)按照不同效靶比，在相应培养孔中加入对应数量的NK细胞；

3)置于37℃培养箱共孵育4小时；

4)孵育结束后进行流式检测HepG2-GFP细胞的杀伤水平，利用凯基生物的细胞凋亡检测试剂盒(货号KGA1030-100)进行检测，步骤如下；

5)将共孵育结束的所有细胞(HepG2-GFP和NK)收集到EP管中，500g离心5min，去除上清，加入1×PBS洗涤一遍，去除上清后，加入试剂盒中的binding buffer 500μL重悬细胞；

6)加入5μL APC-Annexin V和5μL PI进行室温避光染色10-15min；

用Beckman Coulter DxFlex进行流式检测，选取FITC通道中阳性的HepG2-GFP细胞进行分析，即活细胞比例为FITC⁺APC^-PE^-通道的细胞比例，杀伤率为1-FITC⁺APC^-PE^-％。

实验结果：

实施例1和对比例1的NK细胞对实体瘤细胞的杀伤活性如图5-图8所示，相较于对比例1中采用的抗体包被法，实施例1扩增的NK细胞具有对实体瘤细胞SKOV3、NCI-H226、OVCAR3和HepG2更高的杀伤活性。

实施例5不同培养方式、培养基、诱导时间、IL-15浓度下NK细胞的增殖情况和生物学活性

实施例5中的NK细胞与实施例1的区别在于步骤3(NK细胞扩增培养中的扩增体系不同)，下述部分的NK细胞的诱导培养时间与实施例不同，其余皆相同，具体如下：

NK-MACS-24h-1ng/mL IL-15为NK MACS诱导培养24h后，扩增培养体系为NK MACS培养基，加入补剂，加1000IU/mL IL-2，1ng/mL IL-15，5％自体灭活血浆。

NK-MACS-24h-5ng/mL IL-15为NK MACS诱导培养24h后，扩增培养体系为NK MACS培养基，加入补剂，加1000IU/mL IL-2，5ng/mL IL-15，5％自体灭活血浆。

NK-MACS-48h-1ng/mL IL-15为NK MACS诱导培养48h后，扩增培养体系为NK MACS培养基，加入补剂，加1000IU/mL IL-2，1ng/mL IL-15，5％自体灭活血浆。

NK-MACS-48h-5ng/mL IL-15为NK MACS诱导培养48h后，扩增培养体系为NK MACS培养基，加入补剂，加1000IU/mL IL-2，5ng/mL IL-15，5％自体灭活血浆。

X-VIVO15-48h-1ng/mL IL-15为NK MACS诱导培养48h后，扩增培养体系为Lonza免疫细胞培养基X-VIVO15，加1000IU/mL IL-2，1ng/mL IL-15，5％自体灭活血浆。

X-VIVO15-48h-5ng/mL IL-15为NK MACS诱导培养48h后，扩增培养体系为Lonza免疫细胞培养基X-VIVO15，加1000IU/mL IL-2，5ng/mL IL-15，5％自体灭活血浆。

NK细胞扩增倍数的检测方法同实施例2。

检测K562杀伤活性的步骤同实施例3。

实验结果：

不同培养基、诱导时间、IL-15浓度对NK细胞纯度的影响如图9所示，不同培养基、诱导时间、IL-15浓度对NK细胞增殖的影响如图10所示，相对于对比例1的CTR NK，无论使何种培养基、IL-15浓度、诱导时间，激活后培养的NK细胞的增殖速度都大幅增加(10-100倍)；高浓度的IL-15反而会降低NK细胞的增殖速度，最终的细胞数量都是5ng/mL IL-15要低于1ng/mL，尤其对于NK-MACS-24h-5ng/mL IL-15组而言；诱导48h NK细胞的数量要高于诱导24h；X-VIVO15培养的NK细胞增殖速度要低于NK MACS。

不同培养基、诱导时间、IL-15浓度对NK细胞生物学活性的影响如图11所示，在所有效靶比下，本发明的HyperNK对K562的杀伤活性都远超对比例1的CTR NK；不同的IL-15浓度不影响HyperNK对于K562的杀伤活性；不同诱导时间对于HyperNK的杀伤活性并无影响；但X-VIVO15培养基培养的HyperNK细胞杀伤活性高于NK MACS培养基。

本发明中通过NK细胞激活培养基激活培养而产生的HyperNK细胞对比于专利CN202110245100培养产生的CTR NK细胞，在细胞增殖速度、K562杀伤活性以及多种实体瘤细胞的杀伤活性都具有显著的优势。

同时比较不同诱导培养时间对于HyperNK的影响，发现不同诱导培养时间对于HyperNK的杀伤活性无影响，但诱导48h的HyperNK增殖速度在D6以后要稍高于诱导24h，但其最终细胞总数都是在同一数量级(约1×10¹¹)。也比较了不同扩增培养基培养对于HyperNK增殖的影响，NK MACS培养基培养下的HyperNK的增殖速度更高，但是X-VIVO15培养基培养下的HyperNK细胞对K562的杀伤活性更强。

对比例

专利CN112391344A中公开的NK细胞的扩增培养方法，具体的效果比对分析如下：

1)本发明无需分离PBMC，直接用新鲜血液进行分选，更为便捷。

2)以40mL新鲜血样为例，对比专利从PBMC开始进行激活培养，激活培养总共需要7天，总体积为190mL激活培养基，所需额外添加1.9μg IL-12，15.2μg IL-15，19μg IL-18，对比专利还需要大量的CD16单克隆抗体(19μg)及HER2(850μg)单克隆抗体；而本发明用新鲜血液分离NK细胞后再进行激活培养，时间为2天，总体积约为3mL，所需额外添加0.03μg IL-12，0.15μg IL-15，0.15μg IL-18，无需其他单克隆抗体；由此在激活培养上本发明的成本就远低于对比专利。

3)对比扩增培养，对比专利的最优IL-15浓度为100ng/ml，本发明为1ng/μL，由此在扩增培养上成本也远低于对比专利。

4)对比专利在激活培养的过程中已将分离的灭活血浆用完，所以在扩增培养过程中无自体灭活血浆补充，导致其最终的增殖倍数仅约1000倍左右，远低于本发明的10⁵倍。

5)对比专利的方法培养的NK细胞纯度不稳定，该专利中也给出了其纯度范围为80-96％，纯度不高时会有大量T细胞存在，而本发明培养的NK细胞几乎无T细胞(～0.02％)存在，因此其对于同种异体供给更有优势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于NK细胞体外扩增培养的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的NK细胞培养体系包括激活培养基和扩增培养基，所述的扩增培养基包括基础培养基和补剂，所述的补剂由900-1000IU/mL的IL-2、0.1-3ng/mL的IL-15和4-6％灭活血浆组成。

2.根据权利要求1所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的基础培养基选自NKMACS培养基、Lonza X-VIVO15培养基中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的基础培养基为Lonza X-VIVO15培养基。

4.根据权利要求1所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的补剂由1000IU/mL的IL-2、1ng/mL的IL-15和5％灭活血浆组成。

5.根据权利要求1-4任一项所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的激活培养基包括NK MACS培养基和补剂，所述的补剂由5-10ng/mL的IL-12，40-60ng/mL的IL-18，40-60ng/mL的IL-15，900-1000IU/mL的IL-2，4-6％灭活血浆组成。

6.根据权利要求5所述的NK细胞培养体系，其特征在于，所述的补剂由10ng/mL IL-12，50ng/mL IL-18，50ng/mL IL-15，1000IU/mL IL-2，5％灭活血浆组成。

7.一种NK细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)NK细胞体外分离；

(2)NK细胞激活培养：加入权利要求1-6任一项所述的激活培养基，使NK细胞密度为(0.1-5)×10⁶/mL，转移至培养箱中激活培养24h-48h；

(3)NK细胞扩增培养：离心，弃上清，加入权利要求1-6任一项所述的扩增培养基重悬细胞，使细胞密度为(0.1-5)×10⁶个/mL，进行培养。

8.根据权利要求7所述的体外扩增培养方法，其特征在于，步骤(2)中激活培养的时间为48h。

9.根据权利要求7所述的体外扩增培养方法，其特征在于，步骤(3)中培养的时间为8-10天。

10.权利要求1-6任一项所述的NK细胞培养体系在扩增NK细胞中的应用。

11.一种NK细胞，其特征在于，所述的NK细胞是通过权利要求7-9任一项所述的体外扩增培养方法制备得到。