CN109402054A - 一种cd4+记忆性t淋巴细胞的扩增培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法。本发明通过在培养基中同时添加一定量的细胞因子IL‑2、IL‑7和IL‑21，并使培养过程中培养基中灭活自体血浆、细胞因子IL‑2、IL‑7和IL‑21保持在一定的浓度范围内，从而提升CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养效果，提高CD4+记忆性T淋巴细胞的纯度及功能性。本发明的扩增培养方法可很好的适用于CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养，能够诱导扩增出足够所需的细胞量，满足对该类T淋巴细胞体外扩增培养的需求，也因此采用本方法还可减少外周血的采集量。本发明方法成本相对较低，安全可靠，操作较为简单，便于推广使用。

Description

一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法。
背景技术
人外周血中含有多种免疫细胞，其中淋巴细胞是人体主要的免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞等，目前临床研究及应用上进行的免疫细胞治疗以T细胞为主，如嵌合抗原受体技术(CAR-T)或T细胞受体(TCR-T)技术。自体来源的T细胞由于没有免疫原性可直接回输进行肿瘤等疾病的治疗，同时其具有的记忆性特征在一定程度上还可以抑制疾病的复发。过继性免疫细胞治疗是指将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。过继性免疫细胞治疗是当前肿瘤免疫治疗中新兴的、具有显著疗效的一种治疗手段。其中，T细胞过继性免疫细胞治疗是现在国际上应用的最广泛、效果最显著的免疫治疗手段，其作用原理是利用体外扩增激活的特异性T细胞实施对抗原的杀伤功能。
特异性T细胞主要分为两种，CD4+T细胞和CD8+T细胞。在过继性免疫细胞治疗中，CD4+T细胞除了自身具有杀伤能力外，更可以辅助机体自身的免疫细胞以及共过继的免疫细胞，具有很强的泛用性，并能与CD8+T细胞相互补充。CD4+T淋巴细胞可以分为三个亚群，初始T淋巴细胞、效应性T淋巴细胞以及记忆性T淋巴细胞。
效应性T淋巴细胞细胞在体内存活寿命短，虽然有一定的清除效果，但无法达到长期治疗的效果，而记忆性T淋巴细胞则可以在体内维持自我更新，产生持久的杀伤效果，在免疫治疗中得到越来越多的重视。记忆性T淋巴细胞细胞在现在国际顶尖的免疫细胞治疗技术中常常作为基因工程的种子细胞进行修饰加工，增强其杀伤肿瘤细胞的能力。比如使用嵌合抗原受体技术(CAR-T)或T细胞受体(TCR-T)技术修饰记忆性T淋巴细胞，便可以获得杀伤性和持久性都很高的新型免疫细胞，进而应用于恶性肿瘤的治疗。
由于记忆性T淋巴细胞在人循环外周血中所占的比例较低，约占T淋巴细胞的2-4％，而即使采用流式细胞术进行分离，大约每250个PBMC细胞才能分离1个CD4+记忆性T淋巴细胞，而每500-1000个PBMC细胞才能分离1个CD8+记忆性T淋巴细胞细胞，因此，开发一种制作成本低，快速有效并且操作简单的分离和扩增CD4+记忆性T淋巴细胞已成为目前研究的重点。此外，现有的CD4+记忆性T细胞体外扩增培养方法面临的难题是在培养过程中CD4+T淋巴细胞会大量分化为CD4+效应性T淋巴细胞，因此扩增得到的细胞中CD4+记忆性T淋巴细胞的含量少，纯度低。
发明内容
本发明针对现有的CD4+记忆性T淋巴细胞体外扩增培养方法存在纯度较低，及CD4+T淋巴细胞容易分化为CD4+效应性T淋巴细胞的问题，提供一种可提高CD4+记忆性T淋巴细胞含量的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，包括以下步骤：
(1)将CD4+T淋巴细胞加入至包被了CD3抗体和CD28抗体培养瓶中，用T淋巴细胞培养基重悬，并按培养瓶内液体总体积5％的量添加灭活自体血浆，然后将培养瓶置于37℃及CO2体积浓度为5％的培养箱中培养24h。
优选的，在培养瓶内接种的CD4+T淋巴细胞的细胞密度为0.5×106/mL。
优选的，所述包被了CD3抗体和CD28抗体培养瓶的包被方法是：将含有CD3抗体和CD28抗体的包被液倒入培养瓶中，然后将培养瓶置于37℃的环境中孵育3h或置于4℃的环境中8h以上。
(2)向培养瓶内添加细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21，并将培养瓶置于37℃及CO2体积浓度为5％的培养箱中继续培养。
(3)在培养过程中，每隔两天向培养瓶内补加一次含灭活自体血浆、细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21的T淋巴细胞培养基，其中灭活自体血浆在该T淋巴细胞培养基中的体积百分比为5％。
优选的，上述扩增培养的总培养时长为14天。
优选的，上述步骤(2)和步骤(3)中，向培养瓶内添加或补加细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21至细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21的终浓度依次分别为500-1000IU/mL、300-1000IU/mL和200-1000IU/mL。
优选的，步骤(3)中，每次补加T淋巴细胞培养基时调节细胞密度为0.5-1.2×106/mL。
优选的，以上所述的T淋巴细胞培养基为GIBCO的AIM-V培养基。
以上所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，在步骤(1)前还包括从外周血中分选CD4+T淋巴细胞的步骤：
S1、将采集到的外周血进行灭火处理，然后离心分离并分别收集上层的血浆和下层的浓缩血细胞，接着用生理盐水稀释浓缩血细胞至原体积，为血液稀释液。
S2、将Ficoll分离液加入离心管的底部，然后将血液稀释液添加到Ficoll分离液上方形成上层液体，然后离心分离并收集离心管内的白膜层，接着用生理盐水洗涤白膜层并离心收集，得到外周血单个核细胞；所述Ficoll分离液与血液稀释液的体积比为1:2。
S3、从外周血单个核细胞中分选出CD4+T淋巴细胞。
优选的，采用CD4+磁珠在外周血单个核细胞中分选CD4+T淋巴细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过在培养基中同时添加一定量的细胞因子IL-2、IL-7和IL-21，并使培养过程中培养基中灭活自体血浆、细胞因子IL-2、IL-7和IL-21保持在一定的浓度范围内，以加快CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增速率而抑制其它细胞的扩增速率，从而提高CD4+记忆性T淋巴细胞的含量，提高CD4+记忆性T淋巴细胞的纯度及功能性。本发明的扩增培养方法可很好的适用于CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养，能够诱导扩增出足够所需的CD4+记忆性T淋巴细胞，满足对CD4+记忆性T淋巴细胞体外扩增培养的需求，也因此采用本方法还可减少外周血的采集量。本发明方法成本相对较低，安全可靠，操作较为简单，便于推广使用。
附图说明
图1为实施例提取得到的外周血单个核细胞中CD4+T淋巴细胞的百分比图；
图2为实施例中CD4+T淋巴细胞分选后，CD4+T淋巴细胞在总细胞中的百分比图；
图3为实施例中扩增培养14天后，CD4+记忆性T淋巴细胞在总细胞中的百分比图；
图4为对照例中扩增培养14天后，CD4+记忆性T淋巴细胞在总细胞中的百分比图；
图5为实施例和对照例扩增培养14天后的CD4+记忆性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性对比图。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
实施例
本实施例提供一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，包括外周血单个核细胞提取、CD4+T淋巴细胞分选和体外细胞扩增培养。具体如下：
一、外周血单个核细胞提取
1)采集健康志愿者的外周血，加入到含有肝素钠抗凝剂的离心管内，将外周血用移液器上下吹打混匀后，取样进行全血计数，然后进行离心(离心参数为500×g，离心时间为7min)，离心结束后，用移液器吸取上层淡黄色血浆层并转移到新的离心管内，将离心管置于56℃水浴箱内对血浆进行灭活30min；血浆灭活完成后进行离心(离心参数为900×g，离心时间10min)，取上层清液于新的离心管中，即为灭活自体血浆，置于2-8℃保存备用。
2)用移液器吸取上层淡黄色血浆层后，剩余的液体即为浓缩血细胞，用生理盐水稀释浓缩血细胞至原体积，即为血液稀释液。
3)将Ficoll分离液加入离心管的底部，将步骤2)中的血液稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为2:1，然后进行离心(离心参数为700×g，离心时间20min)，离心结束后，吸取离心管内的白膜层(外周血单个核细胞)，转移到50mL的离心管内并补加生理盐水至50mL，洗涤离心两次，收集外周血单个核细胞。
提取得到的外周血单个核细胞中，CD4+T淋巴细胞在总细胞中的比例为28.1％，如图1所示。
二、CD4+T淋巴细胞分选
使用Thermofisher公司的Dynabeads CD4 Positive Isolation Kit分选CD4+T淋巴细胞。
取1-4×107个外周血单个核细胞(PBMC)的细胞悬液(约100μL左右)于离心管中，加入4mL上述试剂盒中的Buffer1并混匀，将离心管置于磁力架上约1min，去上层清液。
加入100μL的Buffer1重悬磁珠，为洗涤磁珠，备用。
采用Buffer1重悬PBMC至密度为1×107/mL；每毫升PBMC中加入25μL洗涤磁珠，在2-8℃下孵育30min，放在摇床上倾斜旋转；将离心管放在磁力架上约2min，轻轻吸去上层清液；移开离心管，加入1mL的Buffer1，并用移液器吹打2-3次，放在磁力架上2min，弃去上层清液。重复上述步骤洗涤2次。
向离心管内加100μL上述试剂盒中的Buffer2重悬细胞，然后加入10μL的DETACHaBEAD洗脱液，在室温下孵育45min，使CD4+T淋巴细胞从磁珠上释放；将离心管放在磁力架上1min，将细胞悬液转移到新的试管中，向试管中加入500μL的Buffer2洗涤磁珠，洗涤2-3次，收集上层清液；向试管中加4mL的Buffer2，然后离心(离心参数为400×g，离心时间6min)，去除DETACHaBEAD洗脱液，用T淋巴细胞培养基重悬细胞，即为CD4+T淋巴细胞悬液，然后计数。
分选后，重悬液中CD4+T淋巴细胞在总细胞中的比例为96.8％，如图2所示。
三、体外细胞扩增培养
1)取适量CD4+T淋巴细胞悬液进行细胞计数及流式表型检测。
2)将CD4+T淋巴细胞用T淋巴细胞培养基重悬并计数，调整细胞密度为0.5×106/mL，并将重悬液添加到包被过CD3抗体和CD28抗体的培养瓶内以进行诱导CD4+记忆性T淋巴细胞培养。
包被了CD3抗体和CD28抗体培养瓶的包被方法是：将含有CD3抗体和CD28抗体的包被液倒入培养瓶中，然后将培养瓶置于37℃的环境中孵育3h或置于4℃的环境中过夜(8h以上)。
3)按培养瓶内液体总体积5％的量向培养瓶内添加灭活自体血浆。
4)将培养瓶置于37℃及CO2体积浓度为5％的培养箱中培养24h。培养24h后观察细胞状态，向培养瓶内添加细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21，使细胞因子IL-2的终浓度在500-550IU/mL的范围内，细胞因子IL-7的终浓度在700-750IU/mL的范围内，细胞因子IL-21的终浓度在450-500IU/mL的范围内。轻轻晃动培养瓶，混匀，培养瓶放置于37℃及CO2体积浓度为5％的培养箱中继续培养。
5)之后每隔2天向培养瓶内补加一次含灭活自体血浆、细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21的T淋巴细胞培养基；其中，灭活自体血浆在该T淋巴细胞培养基中的体积百分比为5％，调节细胞因子IL-2的终浓度在500-550IU/mL的范围内，细胞因子IL-7的终浓度在700-750IU/mL的范围内，细胞因子IL-21的终浓度在450-500IU/mL的范围内，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2-1.2×106/mL。
6)总共培养14天后，进行细胞计数、流式表型及体外杀伤活性检测。
扩增培养14天后，本实施例扩增培养的CD4+记忆性T淋巴细胞在总细胞中的比例为62.3％，如图3所示。
此外，以上述实施例为基础，还进行了以细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21的浓度为变量的实验1-4，研究细胞因子的存在对扩增培养CD4+记忆性T淋巴细胞的影响，具体情况如下：
实验1：如上述实施例的培养方法，但培养过程中，步骤4)和步骤5)时，向培养瓶内添加细胞因子IL-2、IL-7和IL-21，或向培养瓶内添加含这三种细胞因子及灭活自体血浆的T淋巴细胞培养基时，使细胞因子IL-2、IL-7和IL-21的终浓度分别在500-550IU/mL、300-350IU/mL、200-250IU/mL的范围内。扩增培养14天后，实验1扩增培养的CD4+记忆性T淋巴细胞在总细胞中的比例为50.1％。
实验2：如上述实施例的培养方法，但培养过程中，步骤4)和步骤5)时，向培养瓶内添加细胞因子IL-2、IL-7和IL-21，或向培养瓶内添加含这三种细胞因子及灭活自体血浆的T淋巴细胞培养基时，使细胞因子IL-2、IL-7和IL-21的终浓度分别在700-750IU/mL、700-750IU/mL、700-750IU/mL的范围内。扩增培养14天后，实验2扩增培养的CD4+记忆性T淋巴细胞在总细胞中的比例为58.3％。
实验3：如上述实施例的培养方法，但培养过程中，步骤4)和步骤5)时，向培养瓶内添加细胞因子IL-2、IL-7和IL-21，或向培养瓶内添加含这三种细胞因子及灭活自体血浆的T淋巴细胞培养基时，使细胞因子IL-2、IL-7和IL-21的终浓度分别在950-1000IU/mL、950-1000IU/mL、950-1000IU/mL的范围内。扩增培养14天后，实验3扩增培养的CD4+记忆性T淋巴细胞在总细胞中的比例为53.5％。
实验4：如上述实施例的培养方法，但培养过程中，步骤4)和步骤5)时，向培养瓶内添加细胞因子IL-2、IL-7和IL-21，或向培养瓶内添加含这三种细胞因子及灭活自体血浆的T淋巴细胞培养基时，使细胞因子IL-2、IL-7和IL-21的终浓度分别在500-550IU/mL、300-350IU/mL、950-1000IU/mL的范围内。扩增培养14天后，实验3扩增培养的CD4+记忆性T淋巴细胞在总细胞中的比例为51.8％。
对照例
本对照例采用常规扩增方法扩增培养CD4+记忆性T淋巴，包括步骤1-6，具体如下：
步骤1-3与实施例中体外细胞扩增培养中的步骤1)、2)、3)一致。
4)将培养瓶置于37℃及CO2体积浓度为5％的培养箱中培养24h。培养24h后观察细胞状态，向培养瓶内添加细胞因子IL-2，使细胞因子IL-2的终浓度在500-550IU/mL的范围内。轻轻晃动培养瓶，混匀，培养瓶放置于37℃及CO2体积浓度为5％的培养箱中继续培养。
5)之后每隔2天向培养瓶内补加一次含灭活自体血浆和细胞因子IL-2的T淋巴细胞培养基；其中，灭活自体血浆在该T淋巴细胞培养基中的体积百分比为5％，调节细胞因子IL-2的终浓度在500-1000IU/mL的范围内，并计数，补充培养基后使细胞密度保持在0.2～1.2×106/mL。
6)总共培养14天后，进行细胞计数、流式表型及体外杀伤活性检测。
扩增培养14天后，本对照例扩增培养的CD4+记忆性T淋巴细胞在总细胞中的比例为14.4％，如图4所示。
体外杀伤活性检测的方法如下：
取处于对数期生长的K562细胞株作为靶细胞，调整细胞密度为1×106/ml，加入0.2μM calcein-AM，37℃培养箱避光孵育30min。离心，收集细胞，洗涤细胞3次，用无血清培养基重悬，并调整细胞密度为4×105/ml，取培养14天的CD4+记忆性T淋巴细胞，加入到24孔培养板中，调整效靶比为20:1，设3个复孔，并设置相应的对照组，置于37℃培养箱中，共孵育6h。收集细胞，洗涤细胞2次，并用200μl缓冲液重悬，加入2μl 1mg/ml PI染色15min，洗涤去除多余染料，采用流式细胞仪检测细胞杀伤效率。
实施例和对照例扩增培养14天后的CD4+记忆性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性比较如图5所示(效应细胞：靶细胞＝20：1)，实施例扩增培养的CD4+记忆性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤率为54.8±0.57％，对照例扩增培养的CD4+记忆性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤率为35.3±1.13％。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (9)

1.一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将CD4+T淋巴细胞加入至包被了CD3抗体和CD28抗体的培养瓶中，用T淋巴细胞培养基重悬，并按培养瓶内液体总体积5％的量添加灭活自体血浆，然后将培养瓶置于37℃及CO2体积浓度为5％的培养箱中培养24h；
(2)向培养瓶内添加细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21，并将培养瓶置于37℃及CO2体积浓度为5％的培养箱中继续培养；
(3)在培养过程中，每隔两天向培养瓶内补加一次含灭活自体血浆、细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21的T淋巴细胞培养基，其中灭活自体血浆在该T淋巴细胞培养基中的体积百分比为5％。
2.根据权利要求1所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述扩增培养的总培养时长为14天。
3.根据权利要求1所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，向培养瓶内添加或补加细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21至细胞因子IL-2、细胞因子IL-7和细胞因子IL-21的终浓度依次分别为500-1000IU/mL、300-1000IU/mL和200-1000IU/mL。
4.根据权利要求1所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，步骤(1)中，在培养瓶内接种的CD4+T淋巴细胞的细胞密度为0.5×106/mL。
5.根据权利要求4所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，步骤(3)中，每次补加T淋巴细胞培养基时调节细胞密度为0.5-1.2×106/mL。
6.根据权利要求1所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述包被了CD3抗体和CD28抗体培养瓶的包被方法是：将含有CD3抗体和CD28抗体的包被液倒入培养瓶中，然后将培养瓶置于37℃的环境中孵育3h或置于4℃的环境中8h以上。
7.根据权利要求1-6任一项所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述的T淋巴细胞培养基为GIBCO的AIM-V培养基。
8.根据权利要求1-6任一项所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，步骤(1)前还包括从外周血中分选CD4+T淋巴细胞的步骤：
S1、将采集到的外周血进行灭火处理，然后离心分离并分别收集上层的血浆和下层的浓缩血细胞，接着用生理盐水稀释浓缩血细胞至原体积，为血液稀释液；
S2、将Ficoll分离液加入离心管的底部，然后将血液稀释液添加到Ficoll分离液上方形成上层液体，然后离心分离并收集离心管内的白膜层，接着用生理盐水洗涤白膜层并离心收集，得到外周血单个核细胞；所述Ficoll分离液与血液稀释液的体积比为1:2；
S3、从外周血单个核细胞中分选出CD4+T淋巴细胞。
9.根据权利要求8所述的CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述步骤S3中，采用CD4+磁珠在外周血单个核细胞中分选CD4+T淋巴细胞。
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