CN108103019A - 一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，包括如下步骤：S1，提取肿瘤细胞来源的自噬小体；S2，采集外周静脉血，并从中获取单个核细胞；S3，在所述单个核细胞中加入磷酸抗原唑来膦酸(Zoledronic acid，Zol)因子刺激诱导γδT细胞的扩增培养，获得γδT细胞；S4，将所述自噬小体和所述γδT细胞在预设时间内进行共培养，制备得到肿瘤特异性γδT细胞。本发明通过自噬小体和γδT细胞进行共培养，从而制备得到特异性γδT细胞，对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒活性明显强于常规方法及抗原制备的γδT细胞，且本发明所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产。

Description

一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞免疫学的技术领域，具体而言，涉及一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法。
背景技术
肿瘤(tumor)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。近年来随着生活方式的改变以及自然环境的恶化，加上医疗技术的提高，肿瘤检出人数呈上升趋势，肿瘤已成为严重威胁人类健康的重要疾病之一。
由于肿瘤具有较高的损害性和较高的病死率，对抗肿瘤的治疗手段的研究和应用一直是人们关注的焦点，肿瘤免疫治疗是在临床用于肿瘤治疗的第四大疗法，其中免疫细胞疗法在中国得到广泛的应用，目前国内开展最多的就是免疫细胞过继性回输疗法。泌尿系统肿瘤发病率和死亡率有逐年增长，由于早期筛查不利，中晚期治疗效果非常不理想，严重威胁人类生命健康的顽疾。目前对这些肿瘤尚缺少确实可行的预防手段，治疗仍以手术为主，迫切需求开发新型有效的肿瘤防治技术。
γδT细胞兼具抗原递呈能力和杀伤能力，是一种既能杀伤癌细胞、肿瘤干细胞，又能识别肿瘤抗原的免疫细胞。因此不仅可以用于肿瘤高危人群的预防保健，还可以通过泌尿肿瘤特异性抗原致敏具有抗原递呈功能的γδT细胞，进而加大其对肿瘤细胞的杀伤作用，用于中晚期肿瘤患者的治疗。
自噬(autophagy)是指在真核细胞中由双层膜包裹部分胞质以及细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体(autophagosome),并与内涵体(endosome)融合形成自噬内涵体(amphisomes),最后与溶酶体融合形成自噬性溶酶体(autophagolysosome),并降解所包裹的内容物的过程。自噬是以胞质内出现双层膜结构自噬小体为特征的一系列细胞“自我消化”过程，贯穿于正常细胞生长发育和生理病理过程。用蛋白酶体抑制剂、自噬诱导剂处理细胞后分离得到的自噬小体中含有较多短寿蛋白及核糖体错误编码产品。肿瘤来源的自噬小体(Tumor derived-autophagosomes，TDA)作为肿瘤抗原的有效载体，具有多种未知的抗原表位，与多肽或可溶性蛋白相比能诱导更有效的免疫应答。
目前，常规的γδT细胞培养方法对前列腺癌细胞毒活性不高，方法步骤复杂、成本高昂、工序多、条件不可控，且对于设备环境的要求较高、不易于大批量规模化的生产，给医药工作者的科研和医疗工作均带来不便。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，旨在解决常规的γδT细胞培养方法对前列腺癌细胞毒活性不高，方法步骤复杂、成本高昂、工序多、条件不可控，且对于设备环境的要求较高、不易于大批量规模化的生产，给医药工作者的科研和医疗工作均带来不便的缺陷。
有鉴于此，本发明提供了一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1，提取肿瘤细胞来源的自噬小体；
S2，采集外周静脉血，并从中获取单个核细胞；
S3，在所述单个核细胞中加入磷酸抗原Zol因子刺激诱导γδT细胞的扩增培养，获得γδT细胞；
S4，将所述自噬小体和所述γδT细胞在预设时间内进行共培养，制备得到肿瘤特异性γδT细胞。
优选地，所述S1包括：
S11，对肿瘤细胞进行培养，得到增殖肿瘤细胞；
S12，在所述增殖肿瘤细胞中加入自噬诱导剂、蛋白酶体抑制剂、溶酶体趋化剂，得到所述自噬小体。
优选地，所述S12之后，还包括：
S13，对所述自噬小体进行蛋白含量测定、形态鉴定和标志性膜蛋白质LC3B的表达情况鉴定，确定所述自噬小体的正确性。
优选地，所述S2包括：
S21，采集人的外周静脉血；
S22，将所述外周静脉血进行分离得到全血细胞；
S23，对所述全血细胞分离得到单个核细胞。
优选地，所述S3，包括：
S31，将所述单核细胞重悬于培养基中；
S32，加入第一预设浓度的磷酸抗原Zol因子，并加入rhIL-2将溶液调整至第二预设浓度，进行培养，得到γδT细胞。
优选地，所述培养基为含10％自体灭火血浆的无血清培养基。
优选地，所述第一预设浓度为1-10μg/mL；
所述第二预设浓度为500-1000IU/mL。
优选地，所述磷酸抗原Zol因子中的Zol终浓度为5μg/mL。
优选地，所述rhIL-2中的IL-2的终浓度为1000IU/mL。
优选地，所述自噬小体和所述γδT细胞进行共培养的所述预设时间为48小时。
本发明提供一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，包括如下步骤：S1，提取肿瘤细胞来源的自噬小体；S2，采集外周静脉血，并从中获取单个核细胞；S3，在所述单个核细胞中加入磷酸抗原Zol因子刺激诱导γδT细胞的扩增培养，获得γδT细胞；S4，将所述自噬小体和所述γδT细胞在预设时间内进行共培养，制备得到肿瘤特异性γδT细胞。本发明所提供的肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，通过自噬小体和γδT细胞进行共培养，从而制备得到特异性γδT细胞，与常规方法扩增的γδT细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强，对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒活性明显强于常规方法及抗原制备的γδT细胞，且本发明所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产，给医药工作者的科研和医疗工作均带来巨大的便利。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为经电镜鉴定自噬小体形态上为双层膜结构囊泡状；
图2为WB法鉴定自噬小体标志性膜蛋白质LC3B的表达情况；
图3为经流式细胞术检测培养自噬小体为抗原负载前(day9)体系中γδT细胞含量；
图4为经流式细胞术检测培养自噬小体为抗原负载后(day12)体系中γδT细胞含量(sample E1)；
图5为经流式细胞术检测培养自噬小体为抗原负载后(day12)体系中γδT细胞含量(sample E2)；
图6为经流式细胞术检测培养自噬小体为抗原负载后(day12)体系中γδT细胞含量(sample E3)；
图7为采用CCK-8检测试剂盒对获得的特异性γδT细胞进行细胞毒活性检测(n＝3，DUI145)；
图8为采用CCK-8检测试剂盒对获得的特异性γδT细胞进行细胞毒活性检测结果(n＝3，LNCap)；
图9为经负载肿瘤细胞来源的自噬小体的γδT细胞对不同肿瘤细胞系的细胞毒活性检测结果；
图10为特异性γδT细胞胞内因子IFN-γ水平检测结果(E1，CD3 PerCP-A)；
图11为特异性γδT细胞胞内因子IFN-γ水平检测结果(E1，Vgamma9 FIT-A)；
图12为特异性γδT细胞胞内因子IFN-γ水平检测结果(E2，CD3 PerCP-A)；
图13为特异性γδT细胞胞内因子IFN-γ水平检测结果(E2，Vgamma9 FIT-A)；
图14为特异性γδT细胞胞内因子IFN-γ水平检测结果(E3，CD3 PerCP-A)；
图15为特异性γδT细胞胞内因子IFN-γ水平检测结果(E3，Vgamma9 FIT-A)。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。
但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明提供一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1，提取肿瘤细胞来源的自噬小体；
上述，在本发明中，所选用的肿瘤细胞为前列腺癌细胞。
上述，需要理解的是，自噬小体是由双层膜将一小部分细胞质包围而成，其中被消化的物质是细胞质内含有的各种组成成分，如线粒体、内质网的碎片等，通过与溶酶体融合从而降解其内容物，是细胞液泡系的组成部分之一。也称，自噬溶酶体。在病理性萎缩变化下，自噬小体增多并使得心肌细胞和肝细胞等萎缩细胞胞质内可出现脂褐素颗粒。
S2，采集外周静脉血，并从中获取单个核细胞；
上述，在本发明中，所采集的的外周静脉血，均采自健康志愿者的外周静脉血。
上述，需要理解的是，外周血是除骨髓之外的血液，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞称为外周血干细胞，在二十一世纪初人类开始的生命方舟计划中首次提出外周血这一新概念。
正常人外周血中一般看不见幼稚的干细胞的,只存在有极少量的造血干细胞，其含量为0.01％左右。如果幼稚细胞的比例大幅增加，有可能是类白血病。正因为存在0.01％的造血干细胞，可利用细胞分离的技术(血细胞自动分离机)，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者以之代替骨髓而进行的干细胞移植，称为外周血干细胞移植。
上述，需要理解的是，外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。目前外周血单个核细胞主要的分离方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖－泛影葡胺)密度梯度离心法。
S3，在所述单个核细胞中加入磷酸抗原Zol因子刺激诱导γδT细胞的扩增培养，获得γδT细胞；
S4，将所述自噬小体和所述γδT细胞在预设时间内进行共培养，制备得到肿瘤特异性γδT细胞。
上述，在通过磷酸抗原Zol因子刺激诱导下获得γδT细胞，并通过与自噬小体的共培养，从而获得肿瘤特异性γδT细胞。
具体的，将提取的DU145细胞来源的自噬小体为抗原冲击γδT细胞，其使用终浓度为100μg/mL，于37℃，5％CO2培养箱培养24h后，再将负载混合多肽的γδT细胞与未负载多肽的γδT细胞(2:3)混合培养48h，收获特异性的γδT细胞。
细胞组成：CD3阳性表达率在80％以上，CD3+Vgamma9+细胞约在50％～90％。
本发明所提供的肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，通过自噬小体和单个核细胞进行共培养，从而制备得到特异性γδT细胞，与常规方法扩增的γδT细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强，对多种肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒活性明显强于常规方法及抗原制备的γδT细胞，且本发明所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产，给医药工作者的科研和医疗工作均带来巨大的便利。
优选地，所述S1包括：
S11，对肿瘤细胞进行培养，得到增殖肿瘤细胞；
上述，选取前列腺癌细胞进行培养，使用含10％FBS+100U/mL青霉素-链霉素的1640培养基，从而得到增殖肿瘤细胞。
S12，在所述增殖肿瘤细胞中加入自噬诱导剂、蛋白酶体抑制剂、溶酶体趋化剂，得到所述自噬小体。
上述，在增殖肿瘤细胞贴壁良好，密度适中后(以细胞单层均匀铺满培养瓶约80-90％的面积为准)，加入100nM雷帕霉素(自噬诱导剂)、200nM硼替佐米(蛋白酶体抑制剂)和10mM的NH4Cl(溶酶体趋化剂，阻止溶酶体与自噬小体的融合)处理18-24h后将细胞培养液上清倒入50mL离心管，1600rpm，10min。贴壁细胞用胰酶消化，1000r/min，离心10min，离心后沉淀细胞用盐水重悬，反复吹打后离心。将离心所得的上清液转移至新的离心管中，高速离心，12000rpm，30min。弃去上清，得到的沉淀主要成分即为自噬小体。
优选地，所述S12之后，还包括：
S13，对所述自噬小体进行蛋白含量测定、形态鉴定和膜标志性蛋白质LC3B的表达情况鉴定，确定所述自噬小体的正确性。
上述，将沉淀用PBS重悬，BCA法测定其蛋白含量，利用透射电子显微镜鉴定其形态，Western Blot鉴定其标志性膜蛋白质LC3B的表达情况。
上述，需要理解的是，PBS(全称Phosphate Buffered Saline)在医学词汇中表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养。主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等。
优选地，所述S2包括：
S21，采集人的外周静脉血；
采集健康人群的外周静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中。
S22，将所述外周静脉血进行分离得到全血细胞；
上述，在本发明中，通过离心机将含有肝素钠的抗凝管中的外周静脉血进行离心，获得血清和全血细胞。具体的，可采用超低温离心机对生化样品进行离心分离操作。
S23，对所述全血细胞分离得到单个核细胞。
上述，将全血细胞通过聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。
上述，需要理解的是，密度梯度区带离心法(简称区带离心法)，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：1、分离效果好，可一次获得较纯颗粒；2、适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；3、颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：1、离心时间较长；2、需要制备惰性梯度介质溶液；3、操作严格，不易掌握。
所述S3，包括：
S31，将所述单核细胞重悬于培养基中；
S32，加入第一预设浓度的磷酸抗原Zol因子，并加入rhIL-2将溶液调整至第二预设浓度，进行培养，得到γδT细胞。
所述培养基为含10％自体灭火血浆的无血清培的养基。
所述第一预设浓度为1-10μg/mL；
所述第二预设浓度为500-1000IU/mL。
所述磷酸抗原Zol因子中的Zol终浓度为5μg/mL。
所述rhIL-2中的IL-2的终浓度为1000IU/mL。
所述自噬小体和所述γδT细胞进行共培养的所述预设时间为48小时。
上述，所述培养基，在本发明中为含10％自体灭活血浆的AIM-V CTSTM培养基等商品化无血清培养基。
上述，收集的单个核细胞重悬于含10％自体灭活血浆的AIM-V CTSTM培养基等商品化无血清培养基中。
上述，调整细胞密度(1-2)×106/mL左右，加入1-10μg/mL的磷酸抗原Zol因子，并加入rhIL-2至终浓度500-1000IU/mL，最后转移入培养瓶内于37℃，5％CO2和饱和湿度的培养箱进行培养，得到γδT细胞。
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例：
本发明提供了一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，培养前列腺癌DU145细胞，通过因子诱导细胞产生自噬小体并提取鉴定，包括如下步骤：
1.前列腺癌细胞的培养，用含10％FBS+100U/mL青霉素-链霉素的MEM培养基进行培养，待细胞贴壁良好，密度适中后(以细胞单层均匀铺满培养瓶约80-90％的面积为准)，加入100nM雷帕霉素(自噬诱导剂)、100nM硼替佐米(蛋白酶体抑制剂)和10nM的NH4Cl(溶酶体趋化剂，阻止溶酶体与自噬小体的融合)处理18-24h后，收集细胞。
2.将细胞培养液上清倒入50mL离心管，1600r/min，离心10min。贴壁细胞用胰酶消化，1000r/min，离心10min，离心后沉淀细胞用盐水重悬，反复吹打后离心。将离心所得的上清转移至新的离心管中，高速离心，12000rpm，30min。弃去上清，得到的沉淀主要成分即为自噬小体，将沉淀用PBS重悬，BCA法测定其蛋白含量。
3.利用透射电子显微镜鉴定其形态；Western Blot鉴定其标志性膜蛋白质LC3B的表达情况。
结果显示：提取到的囊泡形态上为双层膜结构囊泡状(见图1)；WB法鉴定改囊泡表达自噬小体标志性膜蛋白质LC3B(见图2)，其中A、A1组是实验组，A是细胞培养上清，A1是细胞经反复吹打洗涤细胞上清中提取的自噬小体C、C1是阴性对照组，提取区别同实验组。
本实施例1是分离获得的健康志愿者外周血中的PBMCs并进行γδT细胞培养。包括以下步骤：
1.采集患者外周静脉血10mL，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为：400g/min，离心10min，吸取上层血浆层，血浆层再经1000g/min离心10min，取95％上清液，56℃灭活30min后离心备用；用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1∶2的比例加入离心管中，700g/min，离心20min，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速均为470g/min，离心7min，即得到PBMCs。
2.γδT细胞的诱导培养。具体步骤为：将实施例1步骤1中收集的悬浮细胞重悬于含10％自体灭活血浆的AIM-V CTSTM培养基等商品化无血清培养基中，调整细胞密度1.0×106/mL，并加入rhIL-2至终浓度1000IU/mL及磷酸抗原刺激Zol因子至终浓度为5μg/mL。连续培养至第14天，其中每2-3天补加含有终浓度为1000IU/mL IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(1-2)×106/mL。并在其培养的第5、7、9、12、14天进行免疫表型检测，步骤如下:
取各时间点的细胞，PBS洗涤，PBS重悬细胞并调整细胞密度为1×106/mL，每个检测管内加入50μl细胞悬液，加入荧光标记抗体(抗Vgamma9-FITC、CD4-PE、CD8-APC-H7、CD3-Percp)染色，避光孵育30min，用上述PBS洗涤，重悬稀释至400μl，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用Flow Plus软件分析。
3.特异性γδT细胞的培养。具体步骤为：根据实施步骤2中的表型检测结果，当体系中γδT细胞含量高达50％以上，采用100μg/mL的自噬小体与其共培养24h后，再将其与未进行负载抗原的γδT细胞混合(2:3)培养48h，进行特异性γδT细胞的培养。并对其免疫表型进行检测。
结果显示，在γδT细胞诱导培养第9天负载抗原前其CD3+Vgamma9+含量为88.0％，负载抗原后第12天时E1组的CD3+Vgamma9+含量高达90.1％，其E2组CD3+Vgamma9+含量为90.0％，E3组CD3+Vgamma9+含量高达89.7％，见图2-6。
对特异性细胞γδT细胞进行细胞毒活性检测。包括以下步骤：
1.取与负载自噬小体抗原共培养48h的γδT细胞，检测对前列腺癌细胞系LNCaP和DU145，乳腺癌MCF-7，结肠癌SW480细胞毒活性。
2.调整LNCaP的细胞密度为1×104/孔，DU145、MCF-7、SW480细胞密度均调整为5×103/孔，铺于96孔板，每孔100μl，按效靶比为10:1、20:1的比例加入不同组的效应细胞，各浓度均设置3复孔，并以未负载抗原肽的γδT细胞为对照组，同时设置单独靶细胞(肿瘤细胞)对照、单独效应细胞(负载抗原肽的γδT细胞和未负载抗原肽的γδT细胞)对照和单独培养基空白对照。
3.置于37℃、5％C02饱和湿度的培养箱内培养24h后，每孔加入10μl的CCK-8试剂，共孵育3h，然后用酶标仪于450nm波长处测定吸光度(OD)值。
4.根据公式：杀瘤率(％)＝[1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)]/(效应细胞组OD值)×100％，计算杀瘤效率。其中，公式中各OD值均为减去空白对照组OD值后的值。结果见图7-9。
结果显示，在不同比例效靶比下，未负载抗原的γδT细胞组与抗原负载的γδT细胞细胞组之间差异具有统计学意义(*P<0.01)，另与阳性对照相比，其具特异性更强。其次经负载肿瘤细胞来源的自噬小体的γδT细胞对多种肿瘤细胞系均有一定的杀伤能力，这说明γδT细胞经过改进的抗原方案培养后，占绝大部分比例的杀伤性细胞的细胞毒活性明显提高，从而使γδT细胞整体细胞毒活性也明显提高，说明本发明的以肿瘤细胞来源的自噬小体为抗原制备的γδT细胞有更好的治疗优势。
对特异性细胞γδT细胞进行胞内因子IFN-γ水平检测。包括以下步骤：
1.取各组用于体外杀伤实验的γδT细胞计数，1500rpm/min，离心3min。用无血清的RPMI 1640培养基重悬γδT细胞，稀释至4×106个/mL，每孔加入0.5mL混合均匀的γδT细胞；加PMA(50ng/mL)、Ionomycin(1μg/mL)、BFA(1μg/mL)，将24孔板放入二氧化碳培养箱内，37℃5％CO2，孵育5h。
2.将细胞分别移至1.5mL EP管中，1500r/min离心3min。用0.1mL1×PBS重悬，加入CD3-Percp，Vgamma-9-FITC抗体0.2μL，胞内的染料待破膜后再加。室温避光孵育20min，1500r/min离心3min。
3.加入0.2mL BD Cytofix/BD Cytoperm重悬细胞，室温避光孵育30min，1500r/min离心3min。加入0.2mL BD Perm/BD Wash，1500rpm 3min离心。加入胞内因子染料IFN-γ-PE，避光孵育20min，1500r/min离心3min。用0.2mL BD Perm/BD Wash洗两次，1500r/min离心3min。加入1×PBS重悬至0.5mL。
4.上机检测并分析。
结果显示，见图10-15：在细胞量一定的前提下，E2组的细胞内IFN-γ的含量最高，与其在体外对DU145和LNCaP细胞的杀伤能力最强是一致的。

Claims (10)

1.一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，提取肿瘤细胞来源的自噬小体；
S2，采集外周静脉血，并从中获取单个核细胞；
S3，在所述单个核细胞中加入磷酸抗原Zol因子刺激诱导γδT细胞的扩增培养，获得γδT细胞；
S4，将所述自噬小体和所述γδT细胞在预设时间内进行共培养，制备得到肿瘤特异性γδT细胞。
2.如权利要求1所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述S1包括：
S11，对肿瘤细胞进行培养，得到增殖肿瘤细胞；
S12，在所述增殖肿瘤细胞中加入自噬诱导剂、蛋白酶体抑制剂、溶酶体趋化剂，得到所述自噬小体。
3.如权利要求2所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述S12之后，还包括：
S13，对所述自噬小体进行蛋白含量测定、形态鉴定和标志性膜蛋白质LC3B的表达情况鉴定，确定所述自噬小体的正确性。
4.如权利要求1所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述S2包括：
S21，采集人的外周静脉血；
S22，将所述外周静脉血进行分离得到全血细胞；
S23，对所述全血细胞分离得到单个核细胞。
5.如权利要求1所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述S3，包括：
S31，将所述单核细胞重悬于培养基中；
S32，加入第一预设浓度的磷酸抗原Zol因子，并加入rhIL-2将溶液调整至第二预设浓度，进行培养，得到γδT细胞。
6.如权利要求5所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基为含10％自体灭火血浆的无血清培的养基。
7.如权利要求5所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述第一预设浓度为1-10μg/mL；
所述第二预设浓度为500-1000IU/mL。
8.如权利要求7所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述磷酸抗原Zol因子中的Zol终浓度为5μg/mL。
9.如权利要求7所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述rhIL-2中的IL-2的终浓度为1000IU/mL。
10.如权利要求1所述肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述自噬小体和所述γδT细胞进行共培养的所述预设时间为48小时。
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