CN103463631A - 一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗及其制备方法。本发明首次发现Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles作为一种具有佐剂功能的新型抗原载体，能够活化B淋巴细胞产生特异性抗体并有效提呈抗原，免疫小鼠能诱导特异性的细胞和体液免疫应答。并首次以Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles诱导B细胞产生肿瘤特异性抗体并有效提呈肿瘤抗原。由于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles是细胞自然外排成分，基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的疫苗在提高了免疫应答能力的基础上减少了对机体可能存在的危害，因此是一种非常有前景的新型抗原载体。

Description

一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于肿瘤疫苗研制技术领域，具体涉及为一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗及其制备方法。

背景技术

自噬(autophagy)是普遍存在的细胞生物学现象，是指胞浆组分及细胞器被包裹形成自噬小体(autophagosome)，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，最终实现胞内物质降解的过程。

大量研究结果显示：采用自噬抑制剂(3-AM、wortmannin)、siRNA技术下调自噬相关基因(Atg12)等方法抑制肿瘤细胞的自噬，则明显降低DC基于树突状细胞交叉提呈肿瘤抗原的免疫效果；反之，采用自噬诱导剂(rapamycin、NH₄CL)、饥饿等方法诱导肿瘤细胞产生细胞自噬，则明显增强DC交叉提呈的免疫效果----pAPC交叉提呈自噬小体源性抗原的效果明显强于肿瘤细胞和可溶性蛋白。提示：肿瘤细胞的细胞自噬及其形成的自噬小体(autophagosome)与pAPC的抗原提呈有直接的关系，利用自噬小体的抗原呈递功能可为肿瘤免疫治疗提供一种新策略。因此，肿瘤细胞的自噬小体是肿瘤抗原的有效载体。

依据肿瘤免疫学的基本原理，细胞免疫应答在抗肿瘤免疫应答中起着主要作用，但大多数肿瘤细胞表面缺乏免疫共刺激分子，自身无法激活初始T细胞，必须依赖专职抗原提呈细胞(pAPC)通过交叉提呈(cross-presentation)方式提呈肿瘤抗原并诱导特异性T细胞应答。然而，在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展。目前，基于树突状细胞（DC）的肿瘤疫苗被认为是最常见的肿瘤疫苗之一，已开展大量基础研究和临床试验。然而，研究试验中存在许多问题有待解决，包括DC来源、制备过程、DC的抗原负载、用量、使用频度、免疫途径和次数等，都大大的限制了DC的使用。如何更好的利用其他pAPC提呈肿瘤抗原成为目前关注的热点。

B细胞除介导体液免疫外也是重要的pAPCs。B细胞表面组成型表达MHC II类分子，白细胞介素-4刺激后表达增加；但必须通过抗原受体与抗原交联并由Th细胞提供协助之后才能激活协同刺激分子的表达。在胸腺依赖抗原诱导的抗体产生中起重要作用。由于血液中B细胞在白细胞的比例达到20%-30%，并且易于分离、制备。因此，利用B细胞有效提呈抗原将极大的促进肿瘤疫苗的发展。

佐剂(Adjuvant)又称免疫调节剂(Immuno-modulator)或免疫增强剂(Immune potentiator)，是指先于抗原或与抗原混合或同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用的一类物质。佐剂的种类繁多，其增强机体免疫应答的机理各不相同,可以增强抗原的免疫原性、免疫应答速度及耐受性,可调节抗体对抗原的亲和性与专一性,可刺激细胞介导的免疫,可促进胃肠黏膜对疫苗的吸收。近来发现，Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)在B细胞活化以及B细胞作为pAPCs过程中也发挥重要的佐剂作用，特别是在决定B细胞对特异抗原是产生免疫激活还是免疫耐受时，病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)与TLRs结合产生的信号是重要的开关。TLR不但识别外源性PAMP(如LPS、肽聚糖、脂肽和CpG等)，还可识别内源性损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)，如热休克蛋白(HSP90,HSP94)，钙网织蛋白(calreticulin)，高迁移率族蛋白B1(HMGB1)等，在B细胞增殖分化、产生抗体及类别转换等起调节作用。由于靶向肿瘤的蛋白及多肽的疫苗激发免疫应答的强度不够。因此，如何有效地利用PAMP、DAMP等TLR配体对多肽肿瘤疫苗的佐剂效应，越来越受到人们的关注。

发明内容

技术问题：本发明所要解决的技术问题，是提供一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗，及这种疫苗的制备方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

首先本发明提供一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗，这种B细胞疫苗能够提呈Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles所含有的肿瘤抗原。

本发明还提供这种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗的制备方法，方法按如下步骤制备：

1)Hepa1-6肝癌细胞的培养：

复苏冻存的Hepa1-6肝癌细胞，用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、5%(v/v)CO₂的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25%(w/v)胰蛋白酶消化传代；

2)Hepa1-6肝癌细胞的处理：

待步骤1)培养后的细胞待生长良好后，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，雷帕霉素、万珂和氯化铵的加入量分别为100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干预Hepa1-6肝癌细胞16小时，诱导Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles；

3)提取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles：

将步骤2)诱导后的细胞经离心得到沉淀，即为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles；

4)制备B细胞疫苗：

4a)取野生C57BL/6小鼠颈椎脱臼法处死，用75%酒精浸泡5min，放于解剖板上充分暴露腹腔，分离脾脏放入PBS磷酸缓冲盐中，用无菌磨载玻片将脾脏磨碎，经200目筛网滤过并收集脾脏单核细胞；

4b)将步骤4a)收集的脾脏单核细胞以红细胞裂解液裂解5min，PBS磷酸缓冲盐洗涤，1000rpm离心10min，收获脾脏单核细胞并制备成脾脏单核细胞悬液；

4c)将CD43Dynabeads(小鼠CD43阴选磁珠，英骏公司)放入15ml离心管，用分离缓冲液洗涤；

4d)取500ul4c)中洗涤过的dynabeads与4b)制备的单细胞悬液混匀中，室温孵育25min；

4e)加分离缓冲液，并吹打混匀dynabeads-脾细胞，放入磁场2min，上清液转移至另一离心管；

4f)重复步骤4e)，收取上清，1000rpm离心10min，沉淀即为收获的B细胞，之后RPMI-1640培养液重悬B细胞至2×10⁶个/ml；

4g)将制备好的B细胞与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles混合孵育6小时，得基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗。

这种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗的制备方法，步骤3)中，提取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles具体包含如下步骤：

3a)将Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles及培养液倒入离心管中，低速离心1200rpm，10min；

3b)将步骤3a)离心后的上清倒入超速离心管，高速离心12000rpm，30min，4℃；

3c)将步骤3a)离心后沉淀的细胞用磷酸盐缓冲液重悬，低速离心1200rpm，10min，将低速离心后的上清再次倒入另一超速离心管中，高速离心12000rpm，30min，4℃；

3d)将步骤3b)和3c)两次高速离心后得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，合并，12000rpm高速离心30min，4℃；

3e)弃步骤3d)得到的上清，沉淀即为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles，将沉淀用磷酸盐缓冲液重悬后分装，冻存于-20℃，备用。

有益效果：本发明首次发现提取自药物处理的Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles,这种肿瘤细胞来源的自噬小体-DRibbles作为一种能够交叉提呈抗原的新型载体，可募集更多的肿瘤抗原成分，同时其自身组织和结构特点可以作为佐剂诱导B细胞有效提呈肿瘤抗原并产生肿瘤特异性抗体，从而更有效地激发针对肿瘤的特异性T细胞应答，以清除肿瘤细胞。由于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles是细胞天然外排成分，因此基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗在提高免疫应答能力的基础上减少了对机体可能存在的危害，是一种非常有前景的新型肿瘤疫苗。

附图说明

图1为电镜观察Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的形态×10000。

图2为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体外诱导B细胞增殖以及IgM类抗体的分泌（一）。

图3为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体外诱导B细胞增殖以及IgM类抗体的分泌（二）。

图4为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体内诱导B细胞产生特异性抗体（一）。

图5为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体内诱导B细胞产生特异性抗体（二）。

图6为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体内诱导B细胞产生特异性抗体（三）。

图7为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体内诱导B细胞产生特异性抗体（四）。

图8为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体内诱导B细胞产生特异性抗体（五）。

图9为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体内诱导B细胞产生特异性抗体（六）。

图10为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles活化B细胞并介导特异性细胞免疫应答（一）。

图11为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles活化B细胞并介导特异性细胞免疫应答（二）。

图12为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles活化B细胞并介导特异性细胞免疫应答（三）。

图13为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles活化B细胞并介导特异性细胞免疫应答（四）。

图14为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles活化B细胞并介导特异性细胞免疫应答（五）。

图15为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles活化B细胞并介导特异性细胞免疫应答（六）。

图16为B细胞/OVA⁺DRibbles刺激初始CD8⁺T细胞增殖分化及产生干扰素（一）。

图17为B细胞/OVA⁺DRibbles刺激初始CD8⁺T细胞增殖分化及产生干扰素（二）。

图18为B细胞/OVA⁺Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles对E.G7荷瘤小鼠的治疗作用（一）。

图19为B细胞/OVA⁺Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles对E.G7荷瘤小鼠的治疗作用（二）。

图20为HMGB1拮抗物对Hepa1-6肝癌细胞自噬小体DRibble活化B细胞的影响（一）。

图21为HMGB1拮抗物对Hepa1-6肝癌细胞自噬小体DRibble活化B细胞的影响（二）。

图22为HMGB1拮抗物对Hepa1-6肝癌细胞自噬小体DRibble活化B细胞的影响（三）。

图23为HMGB1拮抗物对Hepa1-6肝癌细胞自噬小体DRibble活化B细胞的影响（四）。

图24为TLR2拮抗物对Hepa1-6肝癌细胞自噬小体DRibble活化B细胞的影响（一）。

图25为TLR2拮抗物对Hepa1-6肝癌细胞自噬小体DRibble活化B细胞的影响（二）。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：电镜观察Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的形态

将提取好的Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles12000rpm高速离心使其沉淀并压缩紧密，弃上清，Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles沉淀用2.5%(v/v)戊二醛固定，送电镜室进行处理，上镜观察Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的形态。

如图1所示：电镜下可见Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles为双层膜结构的小体，平均直径约为300nm-1μm(箭头所指)，证实有效募集了肝癌细胞的自噬小体。

实施例2：Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体外诱导B细胞增殖以及IgM类抗体的分泌

1.Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体外诱导B细胞增殖以及IgM类抗体的分泌

①Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles刺激B细胞增殖实验

取C57/BL6小鼠脾细胞，用CD43阴选磁珠分离小鼠脾脏B细胞，5uM CFSE标记B细胞。之后用10ug/ml Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles、Hep1-6细胞裂解液及10ug/mlLPS分别刺激CFSE标记的B细胞。5天后，1000rpm离心收集B细胞，流式细胞仪鉴定CFSE⁺B细胞的分裂及比例。

如图2所示，Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles刺激的B细胞5天后，能促进31.6%的B细胞分裂，而细胞裂解液刺激B细胞仅能促进7.1%的B细胞分裂。说明和细胞裂解液相比，Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles能有效促进B细胞的增殖。

②Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles促进B细胞分泌IgM

取C57/BL6小鼠脾细胞，用CD43阴选磁珠分离小鼠脾脏B细胞，用10μg/ml Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles、Hepa1-6细胞裂解液及10ug/ml LPS分别刺激脾细胞、B细胞。72h后，1000rpm离心收集细胞培养上清液，ELISA鉴定细胞培养上清液中IgM的水平。

如图3所示：和细胞裂解液相比，Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles刺激B细胞后，能有显著提高细胞培养上清液中IgM的水平。说明Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles能有效促进B细胞分泌IgM。

实施例3：Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles体内诱导B细胞产生特异性抗体

在第1、2、3天用Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles经尾静脉注射C57/BL6小鼠（30ug总蛋白/只），第七天眼眶采血，分离血清（-20℃冷冻保存）。

1.血清中IgM、IgG检测（ELISA法）

①用anti-mouse IgM或IgG（1：10000）包被96孔板，4℃过夜。

②用PBST（含0.5%吐温的磷酸缓冲盐PBS）洗板3次，每次3min。之后用2%的羊血清封闭液封闭，37℃，2h。

③PBST洗板3次。血清样本按（1：500，1：1000，1：2000…）进行倍比稀释，加入封闭好的96孔板内，37℃孵育1h。

④PBST洗板5次，加入HRP-antimouse-IgM或IgG（1：10000），37℃孵育1h。

⑤PBST洗板5次，加入TMB显色液，37℃孵育15min。

⑥加入H₂SO₄终止液，450nm测定OD值。

如图4、图5所示，Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles尾静脉注射小鼠能促进小鼠血清IgM和IgG的分泌。

2.用流式细胞术鉴定血清抗体肿瘤抗原特异性

①Ependorf管收集Hep1-6和B16F10细胞（1*10⁶），1000rpm离心10min，弃培养液。

②5%羊血清封闭30min（4℃），PBS洗2次，每次10min。

③血清样本按（1：500，1：1000，1：2000.….）进行倍比稀释，加入封闭好的Ependorf管中，37℃孵育1h。

④磷酸缓冲盐PBS洗2次，加入FITC标记的anti-mouse IgM或IgG（1：1000），37℃孵育1h。

⑤磷酸缓冲盐PBS洗2次，流式细胞仪鉴定。

如图6、图7所示，Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles尾静脉注射诱导小鼠分泌的IgM和IgG能与Hepa1-6肝癌细胞特异性结合，而不能与B16F10细胞结合。说明Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles诱导的抗体具有Hepa1-6肝癌抗原特异性。

3.免疫荧光法鉴定血清抗体肿瘤抗原特异性

①Hep1-6和B16F10细胞接种于96孔培养板内，待细胞贴壁后，弃培养液，丙酮4℃固定细胞15min。

②5%羊血清封闭1h（4℃），PBST洗板三次，每次3min。

③血清样本按（1：500，1：1000，1：2000….）进行倍比稀释，加入封闭好的96孔板内，37℃孵育1h。

④PBST洗板5次，加入FITC-antimouse-IgM或IgG（1：1000），37℃孵育1h。

⑤PBST洗板5次，DAPI进行细胞核染色。

⑥PBS洗板3次，荧光显微镜下观察。

如图8、图9所示，Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles尾静脉注射诱导小鼠分泌的血清IgM和IgG能与Hepa1-6肝癌细胞膜特异性结合，而不能与B16F10细胞膜结合。说明Hepa1-6-DRibbles诱导的抗体具有Hepa1-6肝癌抗原特异性。

实施例4：Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles活化B细胞并介导特异性细胞免疫应答

1.Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles促进B细胞的活化

取C57/BL6小鼠脾细胞，用CD43阴选磁珠分离小鼠脾脏B细胞，用10ug/ml Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles刺激B细胞。72h后，1000rpm离心收集B细胞，本别加入anti-mouse H2-Kb，I-Ab，CD40，CD86等单克隆抗体染色（4℃，30min），PBS洗2次。流式细胞仪鉴定上述MHC分子及共刺激分子的表达情况。

如图10所示：Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles刺激B细胞后，能有显著上调MHCⅠ、MHC Ⅱ、CD40和CD86的表达。说明Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles能有效促进B细胞的活化。

2.B细胞提呈Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles抗原诱导T细胞应答

①Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles（30μg/ml）经腹股沟淋巴结免疫BALB/C及C57/BL6小鼠，7天后，取小鼠淋巴结细胞(图11)。取野生型C57/BL6小鼠脾细胞，分离提取小鼠B细胞并与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles共孵育6h，收集B细胞，PBS洗3次。Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles免疫BALB/C及C57/BL6小鼠淋巴结细胞分别与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles、B细胞（与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles预孵育）共培养72h，收集细胞培养上清，ELISA检测干扰素-γ含量。

②取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles免疫的C57/BL6小鼠淋巴结细胞，分离CD4+T细胞和CD8+T细胞。采用尾静脉快速注射法，于实验的第1天给C57/BL6小鼠注射Flt3-L质粒，剂量为2～6μg/只，10天后，按照相同方法及剂量注射GM-CSF质粒，5天后收获小鼠脾脏细胞制备DC；分离提取野生型C57/BL6小鼠B细胞，将CD4+T、CD8+T细胞与B细胞、DC分别与按（1：1，1：0.3，1:0.1，1:0）不同比例混合，并加入10μg/mlHepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles共培养，72h后收集细胞培养上清，ELISA法检测细胞培养上清中的干扰素-γ的含量。

3.ELISA法测定细胞培养上清中干扰素-γ和白细胞介素-4（eBioscience ELISA kit）

①按说明书要求稀释捕获抗体(capture antibody)，以100ml/孔量包被96孔板，4℃过夜；

②弃去孔中液体，洗涤液洗5次(每孔>250ml)，每次1min，吸水纸上拍干；

③将5×的稀释液稀释至1×，每孔加入200ml，室温封闭1h；

④弃去孔中液体，洗涤液洗5次.用1×的稀释液按要求稀释标准品，按需要每孔加入100ml，做倍比稀释，以绘制标准曲线。每孔加入100ml细胞培养上清，室温孵育2h；

⑤弃去孔中液体，洗涤液洗5次。每孔加入100ml检测抗体(用1×稀释液按要求稀释)，室温孵育1h；

⑥弃去孔中液体，洗涤液洗5次。每孔加入100ml HRP标记的亲和素(用1×稀释液稀释按要求稀释)，室温孵育30min；

⑦在弃去孔中液体，洗涤液洗7次。每孔加入100ml显色液，室温孵育15min；

⑧每孔加入50ml终止液；450nm测OD值。根据标准品浓度绘制标准曲线，计算样品浓度。

如图12、图13、图14、图15所示：Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles能诱导C57/BL6和BALB/C淋巴结效应T细胞分泌INF-γ，而C57/BL6B细胞与DRibbles共孵育后仅能促进C57/BL淋巴结效应T细胞分泌INF-γ，不能促进BALB/C淋巴结效应T细胞分泌INF-γ。说明B细胞能摄取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles并能递呈DRibbles抗原给效应淋巴T细胞。B细胞与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体DRibble、CD4⁺T或CD8⁺T细胞共孵育，能显著促进CD4⁺T或CD8⁺T细胞分泌干扰素-γ。而B细胞与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体DRibble及CD4⁺T细胞共孵育，仅能促进CD4⁺T细胞分泌少量白细胞介素-4.上诉结果表明B细胞能摄取并递呈Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles抗原，并能诱导CD4⁺T细胞活化。

实施例5、Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibble的制备

1)Hepa1-6肝癌细胞的培养：

复苏冻存细胞，用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、5%(v/v)CO₂的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25%(w/v)胰蛋白酶消化传代；

2)Hepa1-6肝癌细胞的处理：

待步骤1)培养后的细胞贴壁良好，密度适中后，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，雷帕霉素、万珂和氯化铵的加入量分别为100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干预Hepa1-6肝癌细胞16小时，诱导Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles；

3)提取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles：

将步骤2)诱导后的细胞经离心得到沉淀，即为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles。

其中步骤3)中，提取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles具体包含如下步骤：

3a)将Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles及培养液倒入50ml离心管中，低速离心1200rpm，10min；

3b)将步骤3a)离心后的上清倒入圆底超速50ml离心管，高速离心12000rpm，30min，4℃；

3c)将步骤3a)离心后沉淀的细胞用PBS重悬，低速离心1200rpm，10min，将低速离心后的上清再次倒入另一圆底超速50ml离心管中，高速离心12000rpm，30min，4℃；

3d)将步骤3b)和3c)两次高速离心后得到的沉淀用PBS重悬，合并，12000rpm高速离心30min，4℃；

3e)弃步骤3d)得到的上清，沉淀即为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles，将沉淀用1ml PBS重悬后分装，冻存于-20℃，备用。

实施例6、基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗的制备

a)取野生C57BL/6小鼠颈椎脱臼法处死，用75%酒精浸泡5min，放于解剖板上充分暴露腹腔，分离脾脏放入PBS磷酸缓冲盐中，用无菌磨载玻片将脾脏磨碎，经200目筛网滤过并收集脾脏单核细胞；

b)将步骤4a)收集的脾脏单核细胞以红细胞裂解液裂解5min，PBS磷酸缓冲盐洗涤，1000rpm离心10min，收获脾脏单核细胞并制备成脾脏单核细胞悬液；

c)将CD43Dynabeads(Dynabeads mouse CD43,Invitrogen)放入15ml离心管，用分离缓冲液洗涤；

d)取500ul4c)中洗涤过的Dynabeads与4b)制备的单细胞悬液混匀中，室温孵育25min；

e)加分离缓冲液，并吹打混匀dynabeads-脾细胞，放入磁场2min，上清液转移至另一离心管；

f)重复步骤4e)，收取上清，1000rpm离心10min，沉淀即为收获的B细胞，之后RPMI-1640培养液重悬B细胞至2×10⁶个/ml；

g)将制备好的B细胞与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles混合孵育6小时，得基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗。

实施例7、基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗对肿瘤的治疗作用

纯化分离OT-I小鼠的CD8⁺T细胞作为OVA特异性初始CD8⁺T细胞，以负载含有模式抗原OVA的（OVA⁺）DRibbles小鼠B细胞作为pAPC体外刺激OT-I/CD8⁺T细胞，并以OVA⁺DRibbles单独刺激、B细胞/Lysate(OVA⁺)、DCs/OVA⁺DRibbles作为对照，流式细胞仪检测显示（图16）：B细胞/OVA⁺DRibbles能有效刺激初始CD8⁺T细胞增殖分化；随后以负载DRibbles B细胞作为pAPC免疫小鼠，并以B细胞、DCs/DRibbles作为对照，收获免疫小鼠淋巴细胞，再以DRibbles直接体外刺激，ELISA检测刺激细胞培养上清中干扰素-g显示（图17），B细胞/DRibbles免疫能诱导免疫应答；同时，以皮下接种E.G7细胞建立了小鼠皮下瘤模型，以淋巴结(首次免疫)+尾静脉注射(2次追加免疫)方式实施B细胞/DRibbles免疫，结果显示（图18、图19）：B细胞/DRibbles免疫对小鼠淋巴瘤有一定的治疗效果。上述实验结果提示：B细胞/DRibbles疫苗能诱导初始CD8⁺T细胞应答并对实体瘤具有一定的治疗作用。

实施例8、基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗对TLR的作用

如何发挥TLR的配体对TLR的佐剂作用是肿瘤疫苗研究的热点。我们首次发现肿瘤细胞自噬小体表面带有TLR2的配体HMGB1，通过对HMGB1阻断，会大大降低自噬小体对B细胞活化的佐剂作用（图20、图21、图22、图23）。进而我们又用TLR2的封闭抗体进行阻断实验，其结果也是大大降低自噬小体对B细胞活化的佐剂作用（图24、图25）。上述结果提示我们：我们提取的肿瘤疫苗自噬小体除了是抗原的有效载体之外，还具备佐剂的功能。其表面的HMGB1是激活TLR2通路的有效配体。

Claims (3)

1.一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗，其特征是这种B细胞疫苗含有Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-Dribbles。

2.一种如权利要求1所述的基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗的制备方法，其特征是该方法按如下步骤制备：

1)Hepa1-6肝癌细胞的培养：

复苏冻存的Hepa1-6肝癌细胞，用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、5%(v/v)CO₂的恒温培养箱中培养，每1～2天换液一次，常规0.25%(w/v)胰蛋白酶消化传代；

2)Hepa1-6肝癌细胞的处理：

待步骤1)培养后的细胞待生长良好后，加入雷帕霉素、万珂和氯化铵，雷帕霉素、万珂和氯化铵的加入量分别为100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L，干预Hepa1-6肝癌细胞16小时，诱导Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles；

3)提取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles：

将步骤2)诱导后的细胞经离心得到沉淀，即为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles；

4)制备B细胞疫苗：

4a)取野生C57BL/6小鼠颈椎脱臼法处死，用75%酒精浸泡5min，放于解剖板上充分暴露腹腔，分离脾脏放入PBS磷酸缓冲盐中，用无菌磨载玻片将脾脏磨碎，经200目筛网滤过并收集脾脏单核细胞；

4b)将步骤4a)收集的脾脏单核细胞以红细胞裂解液裂解5min，PBS磷酸缓冲盐洗涤，1000rpm离心10min，收获脾脏单核细胞并制备成脾脏单核细胞悬液；

4c)将CD43Dynabeads放入15ml离心管，用分离缓冲液洗涤；

4d)取500ul4c)中洗涤过的dynabeads与4b)制备的单细胞悬液混匀中，室温孵育25min；

4e)加分离缓冲液，并吹打混匀dynabeads-脾细胞，放入磁场2min，上清液转移至另一离心管；

4f)重复步骤4e)，收取上清，1000rpm离心10min，沉淀即为收获的B细胞，之后RPMI-1640培养液重悬B细胞至2×10⁶个/ml；

4g)将制备好的B细胞与Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles混合孵育6小时，得基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗。

3.根据权利要求2所述的一种基于Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles的B细胞疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3)中，提取Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles具体包含如下步骤：

3a)将Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles及培养液倒入离心管中，低速离心1200rpm，10min；

3b)将步骤3a)离心后的上清倒入超速离心管，高速离心12000rpm，30min，4℃；

3c)将步骤3a)离心后沉淀的细胞用磷酸盐缓冲液重悬，低速离心1200rpm，10min，将低速离心后的上清再次倒入另一超速离心管中，高速离心12000rpm，30min，4℃；

3d)将步骤3b)和3c)两次高速离心后得到的沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，合并，12000rpm高速离心30min，4℃；

3e)弃步骤3d)得到的上清，沉淀即为Hepa1-6肝癌细胞自噬小体-DRibbles，将沉淀用磷酸盐缓冲液重悬后分装，冻存于-20℃，备用。

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