CN114874984A - 一种采用植物提取物体外诱导扩增nk细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，向Cellgro基础培养基中加入OK‑432、IL‑2、IL‑15、IL‑21和复合中药提取物得到诱导培养基；向Cellgro基础培养基中加入rhGM‑CSF、rhIL‑4、复合中药提取物得到增殖培养基；无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，然后向其中加入Ficoll分离液，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；将所得外周血单个核细胞稀释，然后加入诱导培养基中重悬，加入anti‑CD137，培养2‑3h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加IL‑2、IL‑15和IL‑21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。

Description

一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明涉及NK细胞体外扩增技术领域，尤其涉及一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法。
背景技术
近年来，肿瘤的生物治疗已经成为肿瘤治疗领域研究的热点。NK细胞是一类独立的淋巴细胞群，NK细胞主要通过细胞毒活性而显示生物学效应，可直接杀伤肿瘤细胞、被病毒感染的细胞以及胞内寄生菌等。NK细胞可以识别自身正常细胞和异常组织细胞，其仅杀伤异常细胞而对宿主正常组织细胞没有细胞毒作用。此外，NK细胞通过分泌多种细胞因子，在免疫调节和某些免疫细胞分化中发挥重要作用。
NK细胞具有较广的抗瘤谱，NK细胞杀伤靶细胞的一个重要机制为：释放穿孔素和颗粒酶B引起靶细胞坏死或凋亡。NK细胞在体内接触到肿瘤细胞之后，通过胞吐将含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性物质释放，穿孔素通过聚合作用在靶细胞表面形成小孔，释放的颗粒酶B进入靶细胞，可通过多种不同途径激起细胞的死亡，如激起caspases的链锁反应，引起靶细胞DNA降解活动，然后裂解致使肿瘤细胞凋亡。
NK细胞是否能够在肿瘤治疗中发挥作用，最大的关键在于细胞的数量和对肿瘤细胞的杀伤能力。然而，NK细胞在体外增殖速度有限，数量上难以满足需要，杀伤活性也有待加强。
忍冬藤，为双子叶植物药忍冬科植物忍冬的茎叶，具有清热，解毒，通络的功效，主治温病发热，热毒血痢，传染性肝炎，痈肿疮毒，筋骨疼痛。文献(李丽萍等.牡丹皮、忍冬藤及泽兰抗肿瘤作用的实验研究[J],中药新药与临床药理,2000-10-30)公开了采用忍冬藤进行小鼠体内抑瘤实验及体外杀瘤细胞实验，忍冬藤抑瘤率>30％，IC50为7.31mg/L，95％的可信限为4.56-11.71mg/L。但目前还没有报道过忍冬藤对NK细胞增殖和杀伤活性的影响。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法。
一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：
S1、向Cellgro基础培养基中加入0.6-1.4μg/mL OK-432、450-550IU/mL IL-2、15-25ng/mL IL-15、45-55ng/mL IL-21和0.1-1μg/mL复合中药提取物得到诱导培养基；向Cellgro基础培养基中加入900-1100U/mLrhGM-CSF、450-550U/mL rhIL-4、0.1-1μg/mL复合中药提取物得到增殖培养基；
S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；
S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为1-5×105/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入4.5-5.5μg/mL anti-CD137，培养2-3h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加460-540IU/mL IL-2、15-25ng/mL IL-15和45-55ng/mL IL-21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。
优选地，S1中，复合中药提取物为忍冬藤和丹参的提取物。
忍冬藤，忍冬科植物忍冬的干燥茎枝。秋、冬二季采割，晒干。味甘，性寒。归肺、胃经。具有清热解毒，疏风通络的功效，用于温病发热，热毒血痢，痈肿疮疡，风湿热痹，关节红肿热痛。
丹参，为双子叶植物唇形科丹参的干燥根及根茎。味苦，性微寒。归心、肝经。具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功效。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，症瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。
优选地，S1中，忍冬藤与丹参的质量比为10：1-2。
优选地，S1中，IL-15和复合中药提取物的浓度比为18-22：300-700。
优选地，S1中，rhGM-CSF和rhIL-4的浓度比为950-1050：480-520。
优选地，S2中，外周血与DPBS的质量比为1：1.8-2.2。
优选地，S2中，Ficoll分离液与DPBS的质量比为1：6-10。
优选地，S3中，anti-CD137浓度为4.7-5.3μg/mL。
本发明的技术效果如下所示：
本发明通过向诱导培养基与增殖培养基中加入忍冬藤与丹参的复合中药提取物，其中忍冬藤本身对肿瘤具有抑制作用，配合丹参进行作用，并控制忍冬藤与丹参的配比为10：1-2，通过联合诱导NK细胞，申请人经过大量的试验发现可有效提高NK细胞增殖和杀伤能力。
而复合中药提取物配合IL-2可直接激活NK细胞，促进NK细胞增殖，并增强NK细胞分泌IFN-γ；而进一步配合IL-15上调NK细胞表面NKG2D受体表达，增强细胞毒性分子TRAIL和穿孔素的释放，提高其对肿瘤细胞裂解活性。
申请人经过大量试验发现，通过添加复合中药提取物，细胞数量提高了426倍，细胞杀伤活性达至80.18％。通过临床应用发现，本方法获得NK细胞用于治疗肿瘤患者之后，所有患者未出现严重不良反应，患者体力和食欲有明显改善。
附图说明
图1为实施例5和对比例的扩增倍数对比图。
图2为实施例5和对比例的IFN-γ含量对比图。
图3为实施例5和对比例对K562细胞杀伤活性的对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：
S1、向Cellgro基础培养基中加入0.6μg/mL OK-432、450IU/mL IL-2、15ng/mL IL-15、45ng/mL IL-21和0.1μg/mL复合中药提取物得到诱导培养基；
向Cellgro基础培养基中加入900U/mL rhGM-CSF、450U/mL rhIL-4、0.1μg/mL复合中药提取物得到增殖培养基；
上述复合中药提取物由忍冬藤、丹参按质量比为10：1混合进行乙醚提取得到；
S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，外周血与DPBS的质量比为1：1.8，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，Ficoll分离液与DPBS的质量比为1：6，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；
S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为1×105/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入4.5μg/mL anti-CD137，培养2h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加460IU/mLIL-2、15ng/mL IL-15和45ng/mL IL-21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。
实施例2
一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：
S1、向Cellgro基础培养基中加入1.4μg/mL OK-432、550IU/mL IL-2、25ng/mL IL-15、55ng/mL IL-21和1μg/mL复合中药提取物得到诱导培养基；
向Cellgro基础培养基中加入1100U/mL rhGM-CSF、550U/mL rhIL-4、1μg/mL复合中药提取物得到增殖培养基；
上述复合中药提取物由忍冬藤、丹参按质量比为10：2混合进行乙醚提取得到；
S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，外周血与DPBS的质量比为1：2.2，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，Ficoll分离液与DPBS的质量比为1：10，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；
S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为5×105/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入5.5μg/mL anti-CD137，培养3h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加540IU/mLIL-2、25ng/mL IL-15和55ng/mL IL-21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。
实施例3
一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：
S1、向Cellgro基础培养基中加入0.8μg/mL OK-432、520IU/mL IL-2、18ng/mL IL-15、52ng/mL IL-21和0.3μg/mL复合中药提取物得到诱导培养基；
向Cellgro基础培养基中加入1050U/mL rhGM-CSF、480U/mL rhIL-4、0.7μg/mL复合中药提取物得到增殖培养基；
上述复合中药提取物由忍冬藤、丹参按质量比为10：1.4混合进行乙醚提取得到；
S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，外周血与DPBS的质量比为1：2.1，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，Ficoll分离液与DPBS的质量比为1：7，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；
S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为4×105/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入4.8μg/mL anti-CD137，培养3h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加480IU/mLIL-2、23ng/mL IL-15和48ng/mL IL-21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。
实施例4
一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：
S1、向Cellgro基础培养基中加入1.2μg/mL OK-432、480IU/mL IL-2、22ng/mL IL-15、48ng/mL IL-21和0.7μg/mL复合中药提取物得到诱导培养基；
向Cellgro基础培养基中加入950U/mL rhGM-CSF、520U/mL rhIL-4、0.3μg/mL复合中药提取物得到增殖培养基；
上述复合中药提取物由忍冬藤、丹参按质量比为10：1.8混合进行乙醚提取得到；
S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，外周血与DPBS的质量比为1：1.9，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，Ficoll分离液与DPBS的质量比为1：9，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；
S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为2×105/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入5.2μg/mL anti-CD137，培养2h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加520IU/mLIL-2、17ng/mL IL-15和52ng/mL IL-21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。
实施例5
一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：
S1、向Cellgro基础培养基中加入1μg/mL OK-432、500IU/mL IL-2、20ng/mL IL-15、50ng/mL IL-21和0.5μg/mL复合中药提取物得到诱导培养基；
向Cellgro基础培养基中加入1000U/mL rhGM-CSF、500U/mL rhIL-4、0.5μg/mL复合中药提取物得到增殖培养基；
上述复合中药提取物由忍冬藤、丹参按质量比为10：1.6混合进行乙醚提取得到；
S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，外周血与DPBS的质量比为1：2，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，Ficoll分离液与DPBS的质量比为1：8，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；
S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为3×105/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入5μg/mL anti-CD137，培养2.5h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加500IU/mLIL-2、20ng/mL IL-15和50ng/mL IL-21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。
对比例
一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：
S1、向Cellgro基础培养基中加入1μg/mL OK-432、500IU/mL IL-2、20ng/mL IL-15、50ng/mL IL-21得到诱导培养基；
向Cellgro基础培养基中加入1000U/mL rhGM-CSF、500U/mL rhIL-4得到增殖培养基；
S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，外周血与DPBS的质量比为1：2，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，Ficoll分离液与DPBS的质量比为1：8，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；
S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为3×105/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入5μg/mL anti-CD137，培养2.5h；然后加入增殖培养基培养至第4天，补加500IU/mLIL-2、20ng/mL IL-15和50ng/mL IL-21；培养到第7天，扩瓶培养；培养至第14天获得扩增的NK细胞。
采用实施例5和对比例的方法扩增NK细胞，配制0.4％台盼蓝溶液，调节其pH值至7.0～7.2，取第14天培养的细胞。取50μLNK细胞悬液，加入50μl台盼蓝混合，细胞染色4min，细胞计数板计数细胞总数量。
如图1所示，采用实施例5的方法扩增NK细胞能大幅提高扩增倍数，这是由于实施例5采用复合中药提取物配合IL-2，可直接激活NK细胞，促进NK细胞增殖。
采用实施例5和对比例的方法扩增NK细胞，对第14天的细胞分泌因子IFN-γ的含量进行测定。如图2所示，采用实施例5的方法扩增NK细胞能大幅提高IFN-γ的含量，这是由于实施例5采用复合中药提取物配合IL-2，可直接激活NK细胞，增强NK细胞分泌IFN-γ。
采用96孔平底培养板，设实验孔、单纯效应细胞孔、单纯靶细胞孔各3个，并设空白孔。于实验孔及单纯靶细胞孔，加入K562。在实验孔及单纯效应细胞孔中分别加入实施例1和对比例培养14天的NK细胞，效靶比设为1：1、1：10、1：20和1：50四组，培养24h。加入20μLWST，继续培养4h，酶标仪检测OD值。
杀伤活性(％)＝[1-(实验组OD值-单纯效应细胞组OD值)×单纯靶细胞OD值]×100％。
如图3所示，采用实施例5的方法可有效提高NK杀伤能力。这是由于复合中药提取物配合IL-2和IL-15，激活NK细胞，促进NK细胞增殖，并增强NK细胞分泌IFN-γ，而且上调NK细胞表面NKG2D受体表达，增强细胞毒性分子TRAIL和穿孔素的释放，提高其对肿瘤细胞裂解活性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、向Cellgro基础培养基中加入0.6-1.4μg/mL OK-432、450-550IU/mL IL-2、15-25ng/mL IL-15、45-55ng/mL IL-21和0.1-1μg/mL复合中药提取物得到诱导培养基；
向Cellgro基础培养基中加入900-1100U/mL rhGM-CSF、450-550U/mL rhIL-4、0.1-1μg/mL复合中药提取物得到增殖培养基；
S2、无菌采集外周血，向外周血中加入DPBS进行稀释，然后向其中加入相对密度为1.077的Ficoll分离液，离心，洗涤得到外周血单个核细胞；
S3、将所得外周血单个核细胞稀释至浓度为1-5×105/mL，然后加入诱导培养基中重悬，加入4.5-5.5μg/mL anti-CD137，培养2-3h；
然后加入增殖培养基培养至第4天，补加460-540IU/mL IL-2、15-25ng/mL IL-15和45-55ng/mL IL-21；
培养到第7天，扩瓶培养；
培养至第14天获得扩增的NK细胞。
2.根据权利要求1所述采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，S1中，复合中药提取物为忍冬藤和丹参的提取物。
3.根据权利要求2所述采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，S1中，忍冬藤与丹参的质量比为10：1-2。
4.根据权利要求1所述采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，S1中，IL-15和复合中药提取物的浓度比为18-22：300-700。
5.根据权利要求1所述采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，S1中，rhGM-CSF和rhIL-4的浓度比为950-1050：480-520。
6.根据权利要求1所述采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，S2中，外周血与DPBS的质量比为1：1.8-2.2。
7.根据权利要求1所述采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，S2中，Ficoll分离液与DPBS的质量比为1：6-10。
8.根据权利要求1所述采用植物提取物体外诱导扩增NK细胞的方法，其特征在于，S3中，anti-CD137浓度为4.7-5.3μg/mL。
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