CN113318141B - 砂引草提取物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了砂引草提取物在制备防治由肠道病毒感染引起的疾病的药物中的应用。本发明发现本发明的砂引草提取物用于制备抗肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型感染的药物的新用途。砂引草提取物在细胞水平、分子水平和动物实验中都具有抑制肠道病毒感染的作用。

Description

砂引草提取物的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种砂引草提取物的应用。

背景技术

肠道病毒是一类无包膜的含单股正链RNA的病毒，是许多人类和动物疾病的病原体，包括肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CVA16)、柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus A6，CVA6)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus，PV)等，可引起诸如手足口病、脊髓灰质炎等多种疾病，导致手足口部位疱疹和炎症、脑膜炎、急性骨髓灰白质炎、心血管疾病等多种疾病，严重时将导致死亡。肠道病毒在全球范围内流行，已经成为严重危害公众健康的问题。

目前，临床上主要通过支持治疗和对症治疗的方法控制由肠道病毒感染引起的疾病，使用广谱常规抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦等抑制病毒活性，以及通过免疫调节物如干扰素、免疫球蛋白及糖皮质激素发挥免疫保护作用。由于广谱药物的使用会导致耐药病毒株的出现，而目前缺乏与常规抗病毒药物具有不同靶点的新型抗病毒药物。而天然药物因具备许多化学药物所不具备的优点，如价格低廉、无污染、毒副作用低、资源丰富和疗效显著等，有潜力用于治疗肠道病毒感染疾病。截至目前，已经有相当一部分中草药、民族药被开发出来并应用于抗病毒领域，且效果显著。值得关注的是，草药中的有效成分的联合使用在提高抗病毒疗效方面起到至关重要的作用。然而，种类繁多，资源丰富，分布广阔的蒙药在新药研发方面并不多，导致很多蒙药的价值没有得到实现。因此，急需研制与开发用于预防或治疗由肠道病毒感染引起的疾病的药物。

草药抗病毒途径能够分成直接与间接抗病毒途径两种，一些草药还能够同时兼具该两种途径。前者就是中医药中的“祛邪”，主要体现在中药成分对病毒传播过程进行抑制从而起到抗病毒效果。后者也就是中医中的“扶正”，主要体现在对机体免疫力进行有效调节，激活机体功能，实现病毒抵抗。

砂引草是紫草科砂引草属砂引草Tournefortia sibirica Linnaeus的全草，蒙文名浩吉格热额布苏、额日古勒根其其格，异名紫丹草、挠挠糖。收载于《内蒙古植物药志》等，其味苦、性寒，具有清热解毒、排脓、敛疮、杀粘等功效，主治瘰疬、疮疡溃破、久不收口、皮肤湿疹。砂引草为多年生草本，主产东北、河北、河南、山东、陕西、甘肃、宁夏等省区。蒙古、朝鲜及日本有分布。根据现代国内外相关文献报道可知，

目前关于砂引草的研究仅局限于其挥发油的检测、多糖提取工艺、化学成分和抗炎活性。利用响应面分析法对砂引草多糖的浸提条件进行优化是可行的。采用水蒸汽蒸馏法提取砂引草挥发油，用气相色谱-质谱(GC-MS)技术分析鉴定其挥发油成分，用NISTO2质谱库检索确认各色谱峰的成分，并应用面积归一化法测定各种成分的相对质量分数。结果显示，从砂引草挥发油中共分离出78个组分，鉴定出58种化合物，其中含量最高为植醇，占32.23％，且含有多种萜类，如假紫罗兰酮、法尼醇、金合欢醇、香叶基香叶醇、角鲨烯等，共占39.97％。常规柱色谱法从砂引草中分离得到木质素类成分messerchmidin及其乙酯和黄酮苷类成分(2S)-dihydrooroxylin A 7-O-[b-D-apiosyl(1fi2)]-b-D-glucoside、2”-O-乙酰基-7-O-甲基维他命、5-羟基-7-甲氧基-8-C-β-葡萄糖基黄酮、菠菜素3-O-b-吡喃葡萄糖苷和9’-甲氧基脱氢二癸二烯醇4-O-b-D-吡喃葡萄糖苷，其中一些化合物可抑制促炎剂LPS刺激的RAW 264.7细胞中的细胞因子NO、TNF-α和IL-6的水平，进一步提示砂引草具有抗炎作用。

发明内容

鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种砂引草提取物的应用，本发明的砂引草提取物能防治由肠道病毒感染引起的疾病。

本发明提供了砂引草提取物在制备防治由肠道病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

优选的，所述肠道病毒为肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型。

优选的，所述由肠道病毒感染引起的疾病包括疱疹性咽颊炎和/或手足口病。

优选的，所述防治包括抑制肠道病毒的核酸复制、抑制肠道病毒的蛋白合成、降低肠道病毒滴度、降低肠道病毒对宿主的感染或降低肠道病毒感染宿主的死亡率。

优选的，所述砂引草提取物包括砂引草醇提物、砂引草水提物、砂引草挥发油、砂引草石油醚提取物、砂引草二氯甲烷提取物、砂引草乙酸乙酯提取物和砂引草正丁醇提取物中的一种或多种。

优选的，所述砂引草醇提物的制备方法包括：砂引草和95％乙醇混合，浸泡，加热回流提取，过滤，即得；

所述砂引草水提物的制备方法包括：砂引草和水混合，浸泡，加热回流提取，过滤，即得；

所述砂引草挥发油的制备方法包括：砂引草和水混合，浸泡，用挥发油提取器加热回流提取，即得。

优选的，所述

砂引草石油醚提取物的制备方法包括：将砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，合并上层石油醚萃取液，干制，得到砂引草石油醚提取物；

所述砂引草二氯甲烷提取物的制备方法包括：将砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，取下层水萃取液加入二氯甲烷，合并下层二氯甲烷萃取液，干制，得到砂引草二氯甲烷提取物。

优选的，所述砂引草乙酸乙酯提取物的制备方法包括：将砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，取下层水萃取液加入二氯甲烷，合并上层萃余液加入乙酸乙酯，分层后合并上层乙酸乙酯萃取液，干制即得；

所述砂引草正丁醇提取物的制备方法包括：砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，取下层水萃取液加入二氯甲烷，合并上层萃余液加入乙酸乙酯，合并下层萃余液加入正丁醇，分层后合并上层正丁醇萃取液，干制，得到砂引草正丁醇提取物。

本发明提供了一种预防或治疗由肠道病毒感染引起的疾病的药物，由包括砂引草和/或砂引草提取物和药学上可接受的辅料。

与现有技术相比，本发明提供了砂引草提取物在制备防治由肠道病毒感染引起的疾病的药物中的应用。本发明发现本发明的砂引草提取物用于制备抗肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型感染的药物的新用途。砂引草提取物在细胞水平、分子水平和动物实验中都具有抑制肠道病毒感染的作用。

具体实施方式

本发明提供一种砂引草提取物的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了砂引草提取物在制备防治由肠道病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

本发明所述肠道病毒包括肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型。

本发明所述由肠道病毒感染引起的疾病包括但不限于疱疹性咽颊炎和/或手足口病。

本发明所述防治包括抑制肠道病毒的核酸复制、抑制肠道病毒的蛋白合成、降低肠道病毒滴度、降低肠道病毒对宿主的感染或降低肠道病毒感染宿主的死亡率。

按照本发明，所述砂引草提取物优选包括砂引草醇提物、砂引草水提物、砂引草挥发油、砂引草石油醚提取物、砂引草二氯甲烷提取物、砂引草乙酸乙酯提取物和砂引草正丁醇提取物中的一种或多种；最优选为砂引草醇提物和砂引草石油醚提取物；特别优选为砂引草石油醚提取物。

在本发明中，所述砂引草醇提物的制备方法包括：砂引草和95％乙醇混合，浸泡，加热回流提取，过滤，即得。

其中，本发明砂引草和95％乙醇的比例优选为1：(9～10)；更优选为1:10；所述加热回流提取的时间优选为2～6h；更优选为3～5h，最优选为4h。所述提取次数为2～3次。所述过滤优选为采用纱布过滤，更优选为采用4层纱布过滤。然后滤液优选采用减压蒸馏去除溶剂。

在本发明中，所述砂引草水提物的制备方法包括：砂引草和水混合，浸泡，加热回流提取，过滤，即得。

其中，本发明砂引草和水的比例优选为1：(9～10)；更优选为1:10；所述加热回流提取的时间优选为4～6h；最优选为4h。所述提取次数为2～3次。所述过滤优选为采用纱布过滤，更优选为采用4层纱布过滤。然后滤液优选采用减压蒸馏去除溶剂。

在本发明中，所述砂引草挥发油的制备方法包括：砂引草和水混合，浸泡，用挥发油提取器加热回流提取，即得。

其中，本发明砂引草和水的比例优选为1：(9～10)；更优选为1:10；所述挥发油提取器加热回流提取的时间优选为6～8h；最优选为8h。

在本发明中，砂引草石油醚提取物的制备方法包括：将砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，合并上层石油醚萃取液，干制，得到砂引草石油醚提取物。

本发明所述砂引草醇提物与水混合的质量比优选为5:(3～5)；砂引草醇提物与每次加入石油醚的质量体积比为5:(3～5)，(g/mL)。本发明所述萃取的次数优选为25～30次。

在本发明中，所述砂引草二氯甲烷提取物的制备方法包括：将砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，取下层水萃取液加入二氯甲烷，合并下层二氯甲烷萃取液，干制，得到砂引草二氯甲烷提取物。

本发明所述砂引草醇提物与每次加入二氯甲烷的质量体积比为5:(3～5)，(g/mL)。

每次萃取后静置10min以上。本发明所述萃取的次数优选为25～30次。

在本发明中，所述砂引草乙酸乙酯提取物的制备方法包括：将砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，取下层水萃取液加入二氯甲烷，合并上层萃余液加入乙酸乙酯，分层后合并上层乙酸乙酯萃取液，干制即得。

每次萃取后静置10min以上。本发明所述萃取的次数优选为25～30次。

本发明所述砂引草醇提物与每次加入乙酸乙酯的质量体积比为5:(3～5)，(g/mL)。

在本发明中，所述砂引草正丁醇提取物的制备方法包括：砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，取下层水萃取液加入二氯甲烷，合并上层萃余液加入乙酸乙酯，合并下层萃余液加入正丁醇，分层后合并上层正丁醇萃取液，干制，得到砂引草正丁醇提取物。

每次萃取后静置10min以上。本发明所述萃取的次数优选为25～30次。

本发明所述砂引草醇提物与每次加入正丁醇的质量体积比为5:(3～5)，(g/mL)。

本发明提供了一种预防或治疗由肠道病毒感染引起的疾病的药物，由包括砂引草和/或砂引草提取物和药学上可接受的辅料。

按照本发明，所述砂引草提取物优选包括砂引草醇提物、砂引草水提物、砂引草挥发油、砂引草石油醚提取物、砂引草二氯甲烷提取物、砂引草乙酸乙酯提取物和砂引草正丁醇提取物中的一种或多种；最优选为砂引草醇提物和砂引草石油醚提取物；特别优选为砂引草石油醚提取物。

本发明对于上述提取物以及制备方法上述已经有了清楚的描述，在此不再赘述。

本发明对于所述药物的剂型不进行限定，本领域技术人员熟知的粉剂、片剂、颗粒剂、注射剂等均可。

本发明对于所述药学上可接受的辅料不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。

本发明人在进行肠道病毒感染的抑制实验中，发现砂引草提取物对由肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型引起的细胞病变效应有抑制作用，且细胞毒性较低。

在进行肠道病毒71型感染抑制机制研究的实验中，发现砂引草提取物能够通过抑制肠道病毒71型的RNA复制和蛋白的合成从而抑制病毒感染。

本发明人发现，砂引草石油醚提取物在肠道病毒71型感染过程中对病毒蛋白含量有明显抑制作用。

此外，砂引草石油醚提取物在肠道病毒71型对新生乳鼠感染过程中具有显著的保护效果。因此砂引草石油醚提取物可以成为抗肠道病毒71型感染候选药物，进而开发成为用于制备用于预防或治疗由肠道病毒感染引起的疾病的药物。

本发明提供了砂引草提取物用于制备用于预防或治疗受试者中的由肠道病毒感染引起的疾病的药物的新用途。

本发明发现本发明的砂引草提取物用于制备抗肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型感染的药物的新用途。砂引草提取物在细胞水平、分子水平和动物实验中都具有抑制肠道病毒感染的作用。

本发明提供了一种治疗由肠道病毒感染引起的疾病的方法，包括给予上述药物和/或砂引草提取物。

本发明对于所述给予的具体方式可以为口服或注射。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种砂引草提取物的应用进行详细描述。

本发明所检测砂引草提取物的均为混合物，除非另外说明，实施例中使用的各种仪器和试剂均为普通市售品，实施例5所述的1日龄Balb/c乳鼠为Balb/c孕鼠生产后24h内的子代，孕鼠购于长春生物制品所。

实施例1：砂引草各级提取物的制备方法

(1)砂引草醇提物

取砂引草500g，加10倍量95％乙醇(5000mL)浸泡4-6小时，加热回流提取4小时，提取3次，合并提取液。使用4层纱布过滤后，将滤液用旋转蒸发仪减压回收溶剂，待95％乙醇回收完，晾干，即得砂引草的95％乙醇提取物。

(2)砂引草水提物

取砂引草500g，加10倍量水(5000mL)浸泡4-6小时，加热回流提取4小时，提取3次，合并提取液。使用4层纱布过滤后，将滤液用旋转蒸发仪减压回收溶剂，待水回收完，晾干，即得砂引草的水提取物。

(3)砂引草挥发油

取砂引草500g，加10倍量水(5000mL)浸泡4-6小时，用挥发油提取器加热回流8小时，即得砂引草挥发油提取物。

(4)砂引草石油醚提取物

取砂引草500g，加10倍量95％乙醇(5000mL)浸泡4-6小时，加热回流提取4小时，共提取3次，合并提取液。使用4层纱布过滤后，将滤液用旋转蒸发仪减压回收溶剂，待95％乙醇回收完，晾干，即得砂引草的95％乙醇提取物。取砂引草的95％乙醇提取物50g，加入300-500mL水，制成混悬液，放入分液漏斗，每次加300-500ml石油醚，放置10分钟以上，待分层后取上层石油醚层萃取液，反复萃取25-30次，合并所有石油醚萃取液并回收，晾干即得砂引草石油醚萃取物。

(5)砂引草二氯甲烷萃取物

取砂引草500g，加10倍量95％乙醇(5000mL)浸泡4-6小时，加热回流提取4小时，共提取3次，合并提取液。使用4层纱布过滤后，将滤液用旋转蒸发仪减压回收溶剂，待95％乙醇回收完，晾干，即得砂引草的95％乙醇提取物。取砂引草的95％乙醇提取物50g，加入300-500mL水，制成混悬液，放入分液漏斗，每次加300-500ml石油醚，放置10分钟以上，待分层后取石油醚层萃取液，反复萃取25-30次，合并所有石油醚萃取液并回收，晾干即得砂引草石油醚萃取物。石油醚萃取后的下层水混悬液继续加入二氯甲烷，每次加300-500ml二氯甲烷，放置10分钟以上，待分层后取下层二氯甲烷层萃取液，反复萃取25-30次，合并所有二氯甲烷萃取液并回收，晾干即得砂引草二氯甲烷萃取物。

(6)砂引草乙酸乙酯萃取物

取砂引草500g，加10倍量95％乙醇(5000mL)浸泡4-6小时，加热回流提取4小时，共提取3次，合并提取液。使用4层纱布过滤后，将滤液用旋转蒸发仪减压回收溶剂，待95％乙醇回收完，晾干，即得砂引草的95％乙醇提取物。取砂引草的95％乙醇提取物50g，加入300-500mL水，制成混悬液，放入分液漏斗，每次加300-500ml石油醚，放置10分钟以上，待分层后取石油醚层萃取液，反复萃取25-30次，合并所有石油醚萃取液并回收，晾干即得砂引草石油醚萃取物。石油醚萃取后的下层水混悬液继续加入二氯甲烷，每次加300-500ml二氯甲烷，放置10分钟以上，待分层后取下层二氯甲烷层萃取液，反复萃取25-30次，合并所有二氯甲烷萃取液并回收，晾干即得砂引草二氯甲烷萃取物。二氯甲烷萃取后的上层水混悬液继续加入乙酸乙酯，每次加300-500ml乙酸乙酯，放置10分钟以上，待分层后取上层乙酸乙酯萃取液，反复萃取25-30次，合并所有乙酸乙酯萃取液并回收，晾干即得砂引草乙酸乙酯萃取物。

(7)砂引草正丁醇萃取物

取砂引草500g，加10倍量95％乙醇(5000mL)浸泡4-6小时，加热回流提取4小时，共提取3次，合并提取液。使用4层纱布过滤后，将滤液用旋转蒸发仪减压回收溶剂，待95％乙醇回收完，晾干，即得砂引草的95％乙醇提取物。取砂引草的95％乙醇提取物50g，加入300-500mL水，制成混悬液，放入分液漏斗，每次加300-500ml石油醚，放置10分钟以上，待分层后取石油醚层萃取液，反复萃取25-30次，合并所有石油醚萃取液并回收，晾干即得砂引草石油醚萃取物。石油醚萃取后的下层水混悬液继续加入二氯甲烷，每次加300-500ml二氯甲烷，放置10分钟以上，待分层后取下层二氯甲烷层萃取液，反复萃取25-30次，合并所有二氯甲烷萃取液并回收，晾干即得砂引草二氯甲烷萃取物。二氯甲烷萃取后的上层水混悬液继续加入乙酸乙酯，每次加300-500ml乙酸乙酯，放置10分钟以上，待分层后取上层乙酸乙酯萃取液，反复萃取25-30次，合并所有乙酸乙酯萃取液并回收，晾干即得砂引草乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取后的下层水混悬液继续加入正丁醇，每次加300-500ml正丁醇，放置10分钟以上，待分层后取上层正丁醇萃取液，反复萃取25-30次，合并所有正丁醇萃取液并回收，晾干即得砂引草正丁醇萃取物。

实施例2：砂引草提取物的细胞毒性和对由肠道病毒71型引起细胞病变效应的抑制作用

取对数生长期的RD细胞，以3×10⁴个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24小时。RD细胞在37℃和5％CO₂下培养，使用的培养液为含有双抗(浓度为100U/mL的青霉素-链霉素溶液)的补充有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液(简称为10％FBS-DMEM，FBS(胎牛血清)和DMEM均购自美国Sigma公司)。

在检测砂引草各级提取物的细胞毒性时，吸掉原细胞培养液，向各孔中加入100μl含不同浓度的砂引草提取物的补充有2％胎牛血清的DMEM细胞培养液(简称为2％FBS-DMEM)，药物的终浓度在结果中有标示，同时设置加入100μLDMEM–2％FBS的细胞对照组，每个浓度同时设置3个平行，并放至CO₂恒温培养箱中进行感染，在5％CO₂、37℃的条件下进行细胞培养；等到48h后，在每孔中加入10μLCCK-8细胞活性检测试剂(购自美国博士德公司)，37℃条件下反应1h，检测450nm下细胞的吸光度；根据所测得的细胞吸光度值，吸光度值的大小反映细胞的活性。细胞毒效应用CC₅₀(细胞存活率为50％时的药物浓度)表示，细胞存活率＝药物组细胞吸光度值/细胞对照组细胞吸光度值×100％；根据不同浓度的药物对每孔细胞毒性分别算出存活率为50％时的药物浓度，用半数抑制浓度CC₅₀表示；

在检测砂引草各级提取物对由肠道病毒71型(EV71)引起细胞病变效应的抑制作用时，吸掉原细胞培养液，在加入50μl肠道病毒71型(基因型EV71-C4b，GengBank编号KJ508817)感染之前，向各孔细胞中分别加入50μl含不同浓度的砂引草提取物的2％FBS-DMEM细胞培养液，终浓度在结果中有标示；同时加入50μLEV71活病毒(感染复数为0.05)，同时设置未加入EV71活病毒感染的细胞对照组及未用药物处理的病毒对照组，每个浓度设置3个平行孔，于CO₂恒温培养箱，5％CO₂、37℃的条件下进行培养；48h后，每孔加入10μLCCK-8细胞活性检测试剂(购自美国博士德公司)，室温下反应1h，如上述方法测定450nm下的吸光度。

在检测砂引草各级提取物对由柯萨奇病毒A16型(CVA16)引起细胞病变效应的抑制作用时，吸掉原细胞培养液，在加入50μl柯萨奇病毒A16型(基因型CVA16-B1，GengBank编号KF055241.1)感染之前，向各孔细胞中分别加入50μl含不同浓度的砂引草提取物的2％FBS-DMEM细胞培养液，终浓度在结果中有标示；同时加入50μLCVA16活病毒(感染复数MOI＝0.05)，同时设置未加入CVA16活病毒感染的细胞对照组及未用药物处理的病毒对照组，每个浓度设置3个平行孔，于CO₂恒温培养箱，5％CO₂，37℃的条件下进行培养；48h后，每孔加入10μLCCK-8细胞活性检测试剂(购自美国博士德公司)，室温下反应1h，如上述方法测定450nm下的吸光度。

药物对病毒引起的细胞病变效应抑制率＝(药物组细胞吸光度值-病毒对照组细胞吸光度值)/(细胞对照组细胞吸光度值-病毒对照组细胞吸光度值)×100％；根据不同浓度的药物对每孔细胞病变效应抑制率分别算出抑制率为50％时的药物浓度，用半数抑制浓度EC₅₀表示；

独立实验重复两次，结果取两次平均值。

实验结果如下：

表1砂引草各提取物对由EV71引起的RD细胞病变效应的抑制率

表2砂引草石油醚提取物对RD细胞的细胞毒性

表3砂引草石油醚提取物对由EV71感染引起的RD细胞病变效应的抑制率

表4砂引草石油醚提取物对由CVA16感染引起的RD细胞病变效应的抑制率

通过以上结果可以得到如下结论，砂引草石油醚提取物在对由肠道病毒71型感染引起的RD细胞病变效应的有效抑制浓度下，细胞毒性较小。砂引草石油醚提取物对由肠道病毒71型引起的RD细胞病变效应具有明显的抑制作用，最优抑制率为97.25％；对由柯萨奇病毒A16型引起的RD细胞病变效应同样具有明显的抑制作用，最优抑制率为95.62％。因此，砂引草石油醚提取物可以成为抗多种肠道病毒感染的候选药物，进而开发成为用于制备用于预防或治疗由肠道病毒感染引起的疾病的药物。

实施例3：砂引草石油醚提取物对肠道病毒71型核酸复制的抑制作用

在考察砂引草石油醚提取物对肠道病毒71型核酸复制作用实验中，将RD细胞接种24孔板中进行细胞培养，当细胞密度达到80％左右时开始进行实验；用移液器将细胞培养上清液全部吸弃后，在孔板中分别加入500μL砂引草石油醚-2％FBS-DMEM溶液处理细胞，使其终浓度为：250μg/ml；同时加入500μLEV71(感染复数MOI＝1)2％FBS-DMEM溶液，并以化合物木犀草素作为阳性对照组，使其浓度为50μM；同时设置未加入EV71感染的细胞对照组及未用药物处理的病毒对照组，每个浓度设置3个平行孔。置于CO₂恒温培养箱中，在5％CO₂、37℃的条件下进行培养；16h后，每孔中加入250μL Trazol裂解细胞(购自北京全式金公司)，按照说明书指导下使用病毒检测用RNA提取试剂盒(购自北京全式金公司)及One Step

PrimeScript^TMRT-PCR Kit II(购自日本TaKaRa公司)提取并定量检测细胞和上清液中EV71 RNA含量。独立实验重复两次，结果取两次平均值。

实验结果如下：

表5砂引草石油醚提取物对EV71核酸复制的抑制作用

通过以上结果可以得到如下结论，砂引草石油醚提取物在肠道病毒71型感染过程中对病毒核酸含量有明显抑制作用。

实施例4：砂引草石油醚提取物对肠道病毒71型蛋白合成的抑制作用

在考察砂引草石油醚提取物对肠道病毒71型蛋白合成作用实验中，借助EV71–Luciferase报告假病毒作为病毒基因组编码蛋白质表达水平的测量依据。该EV71–Luciferase报告假病毒具有完整的病毒衣壳，但其基因组中删除了P1基因区，取而代之的是荧光素酶Luciferase基因，读码框与EV71基因组一致。该EV71–Luciferase报告假病毒能够正常感染宿主细胞，可以正常转录病毒基因组、表达病毒蛋白，荧光素酶Luciferase将随之表达，之后定量检测荧光素酶Luciferase表达水平即可反映病毒基因组编码蛋白质的表达水平。将RD细胞接种到96孔板中进行细胞培养，当细胞密度达到80％左右时开始进行实验；用移液器将细胞上清液全部吸弃，在孔板中分别加入50μL砂引草石油醚-DMEM-2％FBS溶液处理细胞，使其终浓度为：250μg/ml；同时加入50μL预先包装好的EV71-Luciferase假病毒(感染复数为0.5)DMEM-2％FBS溶液，并以化合物木犀草素作为阳性对照组，使其浓度为50μM，每个浓度设置3个平行。最后放到CO₂恒温培养箱中，在5％CO₂、37℃的条件下进行培养；16h后，每孔中加入100μL Luciferase荧光底物，转移至多孔板，测定细胞的Luciferase荧光值，荧光值的大小反映EV71-Luciferase蛋白合成能力。

同时设置未加入EV71-Luciferase感染的细胞对照组及未用药物处理的病毒对照组，除了加入的物质不同以外，其他操作同上。独立实验重复两次，结果取两次平均值。

实验结果如下：

表6砂引草石油醚提取物对EV71蛋白合成的作用

通过以上结果可以得到如下结论，砂引草石油醚提取物在肠道病毒71型感染过程中对病毒蛋白含量有明显抑制作用。

实施例5：砂引草石油醚提取物降低肠道病毒71型子代病毒产量

取对数生长期的RD细胞，以2.5×10⁵个/孔的密度接种于24孔培养板，培养24h。RD细胞在37℃和5％CO₂下培养，使用的培养液为含有双抗(浓度为100U/mL的青霉素-链霉素溶液)的10％FBS-DMEM。吸掉原细胞培养液，各孔细胞分别加入500μl含有不同浓度的砂引草石油醚提取物的2％FBS-DMEM细胞培养液，使砂引草石油醚提取物的终浓度为：250μg/ml，每个样品三个复孔，同时加入EV71感染(感染复数为0.2)，培养细胞16h，收集细胞上清液。同时还设置了仅加入肠道病毒71型进行感染的病毒对照和不加入病毒感染的细胞对照组，除了加入的物质不同以外，其他操作同上。

取对数生长期的RD细胞，以3×10⁴个/孔的密度接种于96孔培养板，培养24h。RD细胞在37℃和5％CO₂下培养，使用的培养液为含有双抗(浓度为100U/mL的青霉素-链霉素溶液)的10％FBS-DMEM。吸掉原培养液，各孔中加入100μl含有不同稀释度的上述细胞上清液的2％FBS-DMEM细胞培养液，每个梯度8个复孔，并向各孔中补充100ul 2％FBS-DMEM；继续培养细胞7天，观察细胞病变孔数，采用Reed-Muench法计算法测定病毒滴度。独立实验重复两次，结果取两次平均值。

实验结果如下：

表7砂引草石油醚提取物对EV71子代病毒产量的作用

通过以上结果可以得到如下结论，砂引草石油醚提取物对肠道病毒71型子代病毒产量具有明显的降低作用，可以将子代病毒滴度降低3个数量级(大于1000倍)。

实施例6：砂引草石油醚提取物抑制肠道病毒71型对新生乳鼠的感染

将1日龄Balb/c乳鼠进行分组：安慰剂组(攻毒后给予安慰剂PBS治疗)，攻毒后灌胃给予砂引草石油醚提取物治疗组(0.8mg/g体重)，攻毒后灌胃给予砂引草石油醚提取物治疗组(0.26mg/g体重)，不攻毒组(注射PBS代替病毒，灌胃PBS代替治疗)，每组10-12只。用无菌胰岛素注射器向乳鼠颅内注射20ul致死量的肠道病毒71型病毒液(1500000TCID₅₀)；随后，于感染后连续6天(第0天到6天)以直接灌胃的方式给药20ul安慰剂或不同剂量的砂引草石油醚提取物；将乳鼠放置鼠笼内，给予母鼠及水和食物，自由采食母乳喂养；从第0天开始连续观察16天，每天记录乳鼠死亡数量，考察第16天的乳鼠死亡率。

实验结果如下：

表8砂引草石油醚提取物治疗对肠道病毒71型感染新生乳鼠的保护作用

通过以上结果，可得到如下结论，砂引草石油醚提取物能够有效降低由肠道病毒71型感染新生乳鼠所致的死亡率；最优剂量为灌胃0.8mg/g体重砂引草石油醚提取物，能够将乳鼠死亡率由100％降低至30.0％。

证明砂引草石油醚提取物对肠道病毒71型的在新生乳鼠上的感染具有明显的保护作用；从动物模型方面进一步证明了砂引草石油醚提取物能有效抑制肠道病毒71型感染；因此，砂引草石油醚提取物可以成为抗肠道病毒71型感染候选药物，进而开发成为用于制备用于预防或治疗由肠道病毒感染引起的疾病的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.砂引草提取物在制备防治由肠道病毒感染引起的疾病的药物中的应用; 所述肠道病毒为肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型;

所述砂引草提取物为砂引草石油醚提取物；

所述砂引草石油醚提取物的制备方法包括：砂引草和95%乙醇混合，浸泡，加热回流提取，过滤，得到砂引草醇提物；将砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，合并上层石油醚萃取液，干制，得到砂引草石油醚提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述由肠道病毒感染引起的疾病包括疱疹性咽颊炎和/或手足口病。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治包括抑制肠道病毒71型的核酸复制、抑制肠道病毒71型的蛋白合成、降低肠道病毒71型的滴度、降低肠道病毒71型对宿主的感染或降低肠道病毒71型感染宿主的死亡率。

4.一种预防或治疗由肠道病毒感染引起的疾病的药物，其特征在于，包括砂引草提取物和药学上可接受的辅料；所述肠道病毒为肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型;

所述砂引草提取物为砂引草石油醚提取物；

所述砂引草石油醚提取物的制备方法包括：砂引草和95%乙醇混合，浸泡，加热回流提取，过滤，得到砂引草醇提物；将砂引草醇提物与水混合得到混悬液，加入石油醚萃取，合并上层石油醚萃取液，干制，得到砂引草石油醚提取物。