CN109288864A - 一种用于卵巢癌的car-nk细胞缓释剂的制备及应用 - Google Patents

一种用于卵巢癌的car-nk细胞缓释剂的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于卵巢癌的CAR‑NK细胞缓释剂的制备及应用。本发明中CAR‑NK细胞缓释剂通过以下方法获得：采集患者外周血，洗涤离心得外周血单个核细胞，培养外周血单个核细胞7天后得NK细胞，并用BUHZOU慢病毒进行转染扩增，得CAR‑NK细胞；同时制备白细胞介素‑2纳米颗粒；最后将CAR‑NK细胞悬液、白细胞介素‑2纳米颗粒、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液混合得CAR‑NK细胞缓释剂。本发明提供的CAR‑NK细胞缓释剂制备方法简单，制得的缓释剂更纯净，不易发生免疫排斥反应，同时缓释剂中细胞的分散性好，避免了细胞团聚，并且对癌细胞的杀伤活性显著提高。

Description

一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备及应用。
背景技术
卵巢癌(Ovarian cancer，OC)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，死亡率占妇科恶性肿瘤的第二位。由于卵巢癌发病隐匿，组织学类型较多，缺乏早期诊断方法，手术和放疗疗效不佳，卵巢癌患者的五年生存率较低，已成为严重威胁患者生命的恶性疾病。
OC传统的手术、化疗和放疗虽然能缓解病情，但超过60％的患者初次治疗缓解后仍然会出现肿瘤的复发、转移。免疫治疗作为肿瘤生物治疗的一种，现今已表现出了巨大的潜力。
NK细胞是固有免疫系统中的淋巴细胞，主要来源于骨髓CD34+淋巴细胞。NK细胞无需抗原致敏和MHC限制即可识别并且杀伤肿瘤细胞，同时NK细胞又可以分泌多种细胞因子和趋化因子，调节获得性免疫应答，是连接固有免疫应答和获得性免疫应答的桥梁，因此在抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫应答中起重要作用；白细胞介素-2、IL-12、IFN-α、TNF-α以及白细胞调节素(leukoregulin,LR)对NK细胞的活化和分化有正调节作用，体外培养时加入上述细胞因子可明显提高NK的杀伤活性。NK细胞因其特殊的靶细胞识别机制、广谱抗肿瘤能力等优势，通过CAR修饰的NK细胞有望增强其靶向抗肿瘤的能力。
中国专利申请CN 108300698 A公开了一种CAR-NK细胞及其制备方法与应用，该发明是通过合成CAR序列后将其整合进慢病毒目的载体质粒中，得到目的质粒，再将目的质粒与293T细胞混合并进行培养，收集病毒液，浓缩，得目的质粒的病毒浓缩液；然后收集自体血浆以及外周血单个核细胞PBMC，用活化培养基调整细胞密度并进行细胞培养；转移到新的细胞培养袋中继续培养，并补充增殖培养基；培养完毕后得到NK细胞；最后在NK细胞中加入目的质粒的病毒浓缩液进行孵育，得到CAR-NK细胞。该发明制得的CAR-NK细胞具有较强的因子分泌能力和抑瘤能力，且制备CAR-NK细胞的转染方法高效、稳定。但是该方法中需要建立目的质粒从而增加了制备的难度，同时并未提及该细胞的具体使用方法。
中国专利申请CN 107557335 A公开了一种针对小细胞肺癌的Car-NK细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：采集患者外周血并通过Ficoll法分离NK细胞；将人外周血单个核细胞置于NK培养基中，调整细胞浓度后置于培养箱中连续培养48-72h，收集贴壁细胞；将细胞加入至NK培养基中，继续培养12-15d，每3d补充一次培养液；将慢病毒对NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-NK细胞；制备小细胞肺癌细胞制剂。该方法操作简单，但是其制备的细胞制剂并不能使细胞良好的存活，从而导致制备的细胞制剂效果较差。
目前针对CAR-NK细胞的制备方法大都是通过病毒的转染获得，但是对于获得的细胞如何有效的应用仍缺乏深入探索，使CAR-NK细胞的应用受到限制。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备及应用。本发明提供的CAR-NK细胞缓释剂中细胞分散均匀，不易团聚，注射时不会导致凝血状况的发生，同时该CAR-NK细胞缓释剂具有因子缓释的效果，使得细胞存活率高，细胞杀伤能力更强，是一种高效的卵巢癌治疗的生物制剂。
一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，包括以下步骤：
S1采集患者外周血，加入磷酸缓冲盐溶液稀释，将稀释后的外周血加入装有Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中离心，吸取上层血浆层与Ficoll交界面的白膜层，得白膜层细胞；
S2将步骤S1所得白膜层细胞用磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，离心后得外周血单个核细胞；
S3将步骤S2所得外周血单个核细胞用无血清RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为1-3×106/mL，得细胞重悬液；
S4将步骤S3所得细胞重悬液与灭活自体血浆混合，得待接种细胞悬液，并加入浓度为为10～100μg/mL的CD137L单抗、100～500μg/mL的HER2单抗、60～100IU/mL的白细胞介素-2、100～200IU/mL的白细胞介素-15、20～60IU/mL的白细胞介素-21；随后将所述待接种细胞悬液接种至24孔培养板中，且保持每孔待接种细胞悬液体积为2mL，在37℃、5％CO2培养箱中常规培养，每隔36～48h半量更换培养液，培养7天后得NK细胞；
S5将步骤S4所得NK细胞用BUHZOU慢病毒进行转染并扩增培养，得CAR-NK细胞，将细胞消化离心后加入无血清RPMI1640培养液重悬，得CAR-NK细胞悬液；
S6将质量浓度为2％-8％的壳寡糖水溶液和浓度300-900U/mL的白细胞介素-2水溶液混合后超声，得白细胞介素-2纳米颗粒溶液；
S7将步骤S5所得CAR-NK细胞悬液、步骤S6所得白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液混合得CAR-NK细胞缓释剂。
进一步地，所述步骤S1中所述外周血与磷酸缓冲盐溶液的体积比为1：1.5；所述稀释后的外周血与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为1:1；所述离心条件为600～800g转速，离心时间为20～30min。
进一步地，所述步骤S2中所述离心条件为，第一次洗涤后离心用800g转速、离心时间为10min，第二次洗涤后离心用400g转速、离心时间为10min。
进一步地，所述步骤S4中所述细胞重悬液与灭活自体血浆的体积比为4:1-19:1，所述待接种细胞悬液与CD137L单抗、HER2单抗、白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21的体积比为100：1：1：2：1：2；所述培养液为含60IU/mL白细胞介素-2、500μg/mL HER2单抗和10％体积的灭活自体血浆的RPMI1640培养液。
进一步地，所述步骤S5中离心条件为400g转速、离心时间为10min，所述CAR-NK细胞悬液浓度为5-8×106/mL。
进一步地，所述步骤S6中所述壳寡糖溶液和白细胞介素-2水溶液的体积比为10：12-25，所述超声条件为100-150w超声10-25分钟。
进一步地，所述步骤S6所述葡萄糖溶液的浓度为300-600ug/mL、丹参素钠水溶液的浓度为30-70ug/mL、谷氨酰胺水溶液的浓度为100-300ug/mL、普兰尼克溶液的浓度为50-70ug/mL；其中CAR-NK细胞悬液、白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液的体积比为0.5-2：0.1-0.3：3-5：0.05-0.15：0.2-0.4：0.05-0.15。
更进一步地，所述葡萄糖溶液的浓度为500ug/mL、丹参素钠水溶液的浓度为50ug/mL、谷氨酰胺水溶液的浓度为200ug/mL、普兰尼克溶液的浓度为60ug/mL；其中CAR-NK细胞悬液、白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液的体积比为1：0.2：4：0.1：0.3：0.1。
另外，本发明的另一目的在于提供一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法制备的CAR-NK细胞缓释剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明提供的CAR-NK细胞缓释剂中CAR-NK细胞的获得方法简单，并且没有外源血清的引入，使制剂更加纯净，不易发生免疫排斥反应。
2、本发明提供的CAR-NK细胞缓释剂中添加了白细胞介素-2纳米颗粒，使得白细胞介素-2能在CAR-NK细胞缓释剂中持续释放，从而有效提高CAR-NK细胞的杀伤活性。
3、本发明提供的CAR-NK细胞缓释剂中添加了普兰尼克F127和丹参素钠，实验发现两者的联用能有效提高细胞的分散性，有效避免细胞的团聚，同时使得CAR-NK细胞缓释剂对癌细胞的杀伤活性显著提高。
具体实施方式
为了更好理解本发明的实质，以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法
S1采集患者外周血，加入1.5倍体积磷酸缓冲盐溶液稀释，将稀释后的外周血加入装有Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中700g转速离心25min，吸取上层血浆层与Ficoll交界面的白膜层，得白膜层细胞；
S2将步骤S1所得白膜层细胞用磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，第一次洗涤后用800g转速离心10min，第二次洗涤后用400g转速离心10min，得外周血单个核细胞；
S3将步骤S2所得外周血单个核细胞用无血清RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为2×106/mL，得细胞重悬液；
S4将步骤S3所得细胞重悬液与灭活自体血浆混合，细胞重悬液与灭活自体血浆体积比为12:1，得待接种细胞悬液，并加入浓度为50μg/mL CD137L单抗、300μg/mL HER2单抗、70IU/mL白细胞介素-2、150IU/mL白细胞介素-15、40IU/mL白细胞介素-21，所述待接种细胞悬液与CD137L单抗、HER2单抗、白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21的体积比为100：1：1：2：1：2，随后将所述待接种细胞悬液接种至24孔培养板中，且保持每孔待接种细胞悬液体积为2mL，在37℃、5％CO2培养箱中常规培养每隔40h半量更换含60IU/mL白细胞介素-2、500μg/mL HER2单抗和10％体积灭活自体血浆的RPMI1640培养液，培养7天后得NK细胞；
S5将步骤S4所得NK细胞用BUHZOU慢病毒进行转染并扩增培养，得CAR-NK细胞，将细胞消化400g转速离心10min后加入无血清RPMI1640培养液重悬，得浓度为7×106/mL的CAR-NK细胞悬液；
S6称取一定质量的壳寡糖溶于去离子水中配成质量体积百分比3％的壳寡糖溶液，将白细胞介素-2溶于去离子水中，配制浓度700U/mL白细胞介素-2水溶液，将壳聚糖溶液和白细胞介素-2水溶液按体积比10：17混合后120w超声15分钟，得白细胞介素-2纳米颗粒溶液；
S7将葡萄糖溶于去离子水中制得浓度为500ug/mL葡萄糖溶液、将丹参素钠溶于去离子水中制得浓度为50ug/mL丹参素钠水溶液、将谷氨酰胺溶于去离子水中制得200ug/mL谷氨酰胺水溶液、将普兰尼克F127溶于去离子水中制得60ug/mL普兰尼克F127溶液，然后将步骤S5所得CAR-NK细胞悬液、步骤S6所得白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液按体积比为1：0.2：4：0.1：0.3：0.1混合得CAR-NK细胞缓释剂。
实施例2一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法
S1采集患者外周血，加入1.5倍体积磷酸缓冲盐溶液稀释，将稀释后的外周血加入装有Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中600g转速离心30min，吸取上层血浆层与Ficoll交界面的白膜层，得白膜层细胞；
S2将步骤S1所得白膜层细胞用磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，第一次洗涤后用800g转速离心10min，第二次洗涤后用400g转速离心10min，得外周血单个核细胞；
S3将步骤S2所得外周血单个核细胞用无血清RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为1×106/mL，得细胞重悬液；
S4将步骤S3所得细胞重悬液与灭活自体血浆混合，细胞重悬液与灭活自体血浆体积比为4:1，得待接种细胞悬液，并加入浓度为10μg/mL CD137L单抗、100μg/mL HER2单抗、100IU/mL白细胞介素-2、100IU/mL白细胞介素-15、20IU/mL白细胞介素-21，所述待接种细胞悬液与CD137L单抗、HER2单抗、白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21的体积比为100：1：1：2：1：2，随后将所述待接种细胞悬液接种至24孔培养板中，且保持每孔待接种细胞悬液体积为2mL，在37℃、5％CO2培养箱中常规培养每隔36h半量更换含60IU/mL白细胞介素-2、500μg/mL HER2单抗和10％体积灭活自体血浆的RPMI1640培养液，培养7天后得NK细胞；
S5将步骤S4所得NK细胞用BUHZOU慢病毒进行转染并扩增培养，得CAR-NK细胞，将细胞消化400g转速离心10min后加入无血清RPMI1640培养液重悬，得浓度为5×106/mL的CAR-NK细胞悬液；
S6称取一定质量的壳寡糖溶于去离子水中配成质量体积百分比8％的壳寡糖溶液，将白细胞介素-2溶于去离子水中，配制浓度300U/mL白细胞介素-2水溶液，将壳聚糖溶液和白细胞介素-2水溶液按体积比10：12混合后100w超声25分钟，得白细胞介素-2纳米颗粒溶液；
S7将葡萄糖溶于去离子水中制得浓度为300ug/mL葡萄糖溶液、将丹参素钠溶于去离子水中制得浓度为30ug/mL丹参素钠水溶液、将谷氨酰胺溶于去离子水中制得100ug/mL谷氨酰胺水溶液、将普兰尼克F127溶于去离子水中制得50ug/mL普兰尼克F127溶液，然后将步骤S5所得CAR-NK细胞悬液、步骤S6所得白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液按体积比为0.5：0.3：3：0.15：0.2：0.15混合得CAR-NK细胞缓释剂。
实施例3一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂
S1采集患者外周血，加入1.5倍体积磷酸缓冲盐溶液稀释，将稀释后的外周血加入装有Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中800g转速离心20min，吸取上层血浆层与Ficoll交界面的白膜层，得白膜层细胞；
S2将步骤S1所得白膜层细胞用磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，第一次洗涤后用800g转速离心10min，第二次洗涤后用400g转速离心10min，得外周血单个核细胞；
S3将步骤S2所得外周血单个核细胞用无血清RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为3×106/mL，得细胞重悬液；
S4将步骤S3所得细胞重悬液与灭活自体血浆混合，细胞重悬液与灭活自体血浆体积比为19:1，得待接种细胞悬液，并加入浓度为100μg/mL CD137L单抗、500μg/mL HER2单抗、60IU/mL白细胞介素-2、100IU/mL白细胞介素-15、20IU/mL白细胞介素-21，所述待接种细胞悬液与CD137L单抗、HER2单抗、白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21的体积比为100：1：1：2：1：2，随后将所述待接种细胞悬液接种至24孔培养板中，且保持每孔待接种细胞悬液体积为2mL，在37℃、5％CO2培养箱中常规培养每隔48h半量更换含60IU/mL白细胞介素-2、500μg/mL HER2单抗和10％体积灭活自体血浆的RPMI1640培养液，培养7天后得NK细胞；
S5将步骤S4所得NK细胞用BUHZOU慢病毒进行转染并扩增培养，得CAR-NK细胞，将细胞消化400g转速离心10min后加入无血清RPMI1640培养液重悬，得浓度为8×106/mL的CAR-NK细胞悬液；
S6称取一定质量的壳寡糖溶于去离子水中配成质量体积百分比2％的壳寡糖溶液，将白细胞介素-2溶于去离子水中，配制浓度900U/mL白细胞介素-2水溶液，将壳聚糖溶液和白细胞介素-2水溶液按体积比10：25混合后150w超声10分钟，得白细胞介素-2纳米颗粒溶液；
S7将葡萄糖溶于去离子水中制得浓度为600ug/mL葡萄糖溶液、将丹参素钠溶于去离子水中制得浓度为30ug/mL丹参素钠水溶液、将谷氨酰胺溶于去离子水中制得100ug/mL谷氨酰胺水溶液、将普兰尼克F127溶于去离子水中制得70ug/mL普兰尼克F127溶液，然后将步骤S5所得CAR-NK细胞悬液、步骤S6所得白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液按体积比为2：0.1：5：0.05：0.2：0.05混合得CAR-NK细胞缓释剂。
实施例4一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂
S1采集患者外周血，加入1.5倍体积磷酸缓冲盐溶液稀释，将稀释后的外周血加入装有Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中750g转速离心25min，吸取上层血浆层与Ficoll交界面的白膜层，得白膜层细胞；
S2将步骤S1所得白膜层细胞用磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，第一次洗涤后用800g转速离心10min，第二次洗涤后用400g转速离心10min，得外周血单个核细胞；
S3将步骤S2所得外周血单个核细胞用无血清RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为2.5×106/mL，得细胞重悬液；
S4将步骤S3所得细胞重悬液与灭活自体血浆混合，细胞重悬液与灭活自体血浆体积比为15:1，得待接种细胞悬液，并加入浓度为30μg/mL CD137L单抗、250μg/mL HER2单抗、80IU/mL白细胞介素-2、150IU/mL白细胞介素-15、30IU/mL白细胞介素-21，所述待接种细胞悬液与CD137L单抗、HER2单抗、白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21的体积比为100：1：1：2：1：2，随后将所述待接种细胞悬液接种至24孔培养板中，且保持每孔待接种细胞悬液体积为2mL，在37℃、5％CO2培养箱中常规培养每隔38h半量更换含60IU/mL白细胞介素-2、500μg/mL HER2单抗和10％体积灭活自体血浆的RPMI1640培养液，培养7天后得NK细胞；
S5将步骤S4所得NK细胞用BUHZOU慢病毒进行转染并扩增培养，得CAR-NK细胞，将细胞消化400g转速离心10min后加入无血清RPMI1640培养液重悬，得浓度为6×106/mL的CAR-NK细胞悬液；
S6称取一定质量的壳寡糖溶于去离子水中配成质量体积百分比6％的壳寡糖溶液，将白细胞介素-2溶于去离子水中，配制浓度400U/mL白细胞介素-2水溶液，将壳聚糖溶液和白细胞介素-2水溶液按体积比10：13混合后140w超声10分钟，得白细胞介素-2纳米颗粒溶液；
S7将葡萄糖溶于去离子水中制得浓度为400ug/mL葡萄糖溶液、将丹参素钠溶于去离子水中制得浓度为40ug/mL丹参素钠水溶液、将谷氨酰胺溶于去离子水中制得200ug/mL谷氨酰胺水溶液、将普兰尼克F127溶于去离子水中制得55ug/mL普兰尼克F127溶液，然后将步骤S5所得CAR-NK细胞悬液、步骤S6所得白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液按体积比为0.5：0.3：3：0.12：0.25：0.1混合得CAR-NK细胞缓释剂。
对比例1一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法
所述卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，对比例1中步骤S7中未添加丹参素钠水溶液。
对比例2一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂
所述卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，对比例2中步骤S7中未添加普兰尼克F127溶液。
对比例3一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂
所述卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，对比例3中步骤S7中未添加丹参素钠水溶液和普兰尼克F127溶液。
对比例4一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂
所述卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，对比例4中步骤S7用游离白细胞介素-2代替白细胞介素-2纳米颗粒溶液。
试验例一、卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂对卵巢癌CAOV3细胞的抑制作用
1、试验材料：
实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4制备的CAR-NK细胞缓释剂。
2、试验方法：
将对数生长期的卵巢癌CAOV3细胞1×104个接种于12孔板，待细胞贴壁后，将细胞分为实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、和空白对照组，其中实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、对比例1组、对比例2组、对比例3组和对比例4组分别加入实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的CAR-NK细胞缓释剂，空白对照组未做任何处理，然后将孔板至于37℃恒温细胞培养箱中培养3天，通过MTT法测细胞活性，以检测CAR-NK细胞缓释剂对卵巢癌CAOV3细胞的抑制作用。
3、试验结果：试验结果如表1所示。
表1卵巢癌CAOV3细胞活性
从表1的结果可以看出，空白对照组中卵巢癌CAOV3细胞的活性为100％，实施例1组中卵巢癌CAOV3细胞的活性只有37％，说明实施例1制得的CAR-NK细胞缓释剂对卵巢癌CAOV3细胞具有显著的抑制杀伤作用；并且实施例2组、实施例3组和实施例4组中卵巢癌CAOV3细胞的活性也只有45％、42％和43％；。而对比例1组和对比例2组中卵巢癌CAOV3细胞的活性为69％和65％，明显高于各实施例组，并且对比例3组的巢癌CAOV3细胞活性高达76％，因为对比例3组中没有添加丹参素钠水溶液和普兰尼克F127溶液，因此对卵巢癌CAOV3细胞的抑制作用明显降低。在对比例4组的卵巢癌CAOV3细胞的活性为62％，与实施例1相比，其对卵巢癌CAOV3细胞的抑制作用明显降低，说明纳米颗粒的应用也能提高CAR-NK细胞缓释剂对卵巢癌CAOV3细胞的抑制作用。
综上所述，说明丹参素钠水溶液和普兰尼克F127溶液的联用起到了意想不到的卵巢癌CAOV3细胞抑制作用，并且白细胞介素-2纳米颗粒溶液的添加也能提高CAR-NK细胞缓释剂对卵巢癌CAOV3细胞的抑制作用，并且实施例1的抑制作用最为优越，为本发明的最佳实施例。

Claims (9)

1.一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1采集患者外周血，加入磷酸缓冲盐溶液稀释，将稀释后的外周血加入装有Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中离心，吸取上层血浆层与Ficoll交界面的白膜层，得白膜层细胞；
S2将步骤S1所得白膜层细胞用磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，离心后得外周血单个核细胞；
S3将步骤S2所得外周血单个核细胞用无血清RPMI1640培养液重悬，调整细胞浓度为1-3×106/mL，得细胞重悬液；
S4将步骤S3所得细胞重悬液与灭活自体血浆混合，得待接种细胞悬液，并加入浓度为为10～100μg/mL的CD137L单抗、100～500μg/mL的HER2单抗、60～100IU/mL的白细胞介素-2、100～200IU/mL的白细胞介素-15、20～60IU/mL的白细胞介素-21；随后将所述待接种细胞悬液接种至24孔培养板中，且保持每孔待接种细胞悬液体积为2mL，在37℃、5％CO2培养箱中常规培养，每隔36～48h半量更换培养液，培养7天后得NK细胞；
S5将步骤S4所得NK细胞用BUHZOU慢病毒进行转染并扩增培养，得CAR-NK细胞，将细胞消化离心后加入无血清RPMI1640培养液重悬，得CAR-NK细胞悬液；
S6将质量浓度为2％-8％的壳寡糖水溶液和浓度300-900U/mL的白细胞介素-2水溶液混合后超声，得白细胞介素-2纳米颗粒溶液；
S7将步骤S5所得CAR-NK细胞悬液、步骤S6所得白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液混合得CAR-NK细胞缓释剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中所述外周血与磷酸缓冲盐溶液的体积比为1：1.5；所述稀释后的外周血与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为1:1；所述离心条件为600～800g转速，离心时间为20～30min。
3.根据权利要求1所述的一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述离心条件为：第一次洗涤后离心用800g转速、离心时间为10min，第二次洗涤后离心用400g转速、离心时间为10min。
4.根据权利要求1所述的一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中所述细胞重悬液与灭活自体血浆的体积比为4:1-19:1，所述待接种细胞悬液与CD137L单抗、HER2单抗、白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21的体积比为100：1：1：2：1：2；所述培养液为含60IU/mL白细胞介素-2、500μg/mL HER2单抗和10％体积的灭活自体血浆的RPMI1640培养液。
5.根据权利要求1所述的一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中离心条件为400g转速、离心时间为10min，所述CAR-NK细胞悬液浓度为5-8×106/mL。
6.根据权利要求1所述的一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中所述壳寡糖溶液和白细胞介素-2水溶液的体积比为10：12-25，所述超声条件为100-150w超声10-25分钟。
7.根据权利要求1所述的一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S6所述葡萄糖溶液的浓度为300-600ug/mL、丹参素钠水溶液的浓度为30-70ug/mL、谷氨酰胺水溶液的浓度为100-300ug/mL、普兰尼克溶液的浓度为50-70ug/mL；其中CAR-NK细胞悬液、白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液的体积比为0.5-2：0.1-0.3：3-5：0.05-0.15：0.2-0.4：0.05-0.15。
8.根据权利要求7所述的一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液的浓度为500ug/mL、丹参素钠水溶液的浓度为50ug/mL、谷氨酰胺水溶液的浓度为200ug/mL、普兰尼克溶液的浓度为60ug/mL；其中CAR-NK细胞悬液、白细胞介素-2纳米颗粒溶液、葡萄糖溶液、丹参素钠水溶液、谷氨酰胺水溶液、普兰尼克F127溶液的体积比为1：0.2：4：0.1：0.3：0.1。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种用于卵巢癌的CAR-NK细胞缓释剂的制备方法制备的CAR-NK细胞缓释剂在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
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